Modification d’acides aminés et de protéines en milieux aqueux sous faisceau d'ions

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Modification d’acides aminés et de protéines en milieux

aqueux sous faisceau d’ions

Nicolas Ludwig

To cite this version:

(2)

ÉCOLE DOCTORALE DE PHYSIQUE ET CHIMIE-PHYSIQUE

Institut Pluridisciplinaire Hubert Curien, UMR 7178, CNRS

THÈSE

présentée par :

Nicolas LUDWIG

Soutenance le: 12 Octobre 2018

pour obtenir le grade de :

Docteur de l’Université de Strasbourg

Discipline/ Spécialité

: Chimie-Physique/ Radiolyse

Modification d’acides aminés et de

protéines en milieu aqueux sous

faisceau d’ions

THÈSE dirigée par :

M BARILLON Rémi Professeur, Université de Strasbourg RAPPORTEURS :

Mme HOUEE-LEVIN Chantal Professeur, Université de Paris-Sud 11

M FROMM Michel Professeur, Université de Franche-Comté

AUTRES MEMBRES DU JURY :

M BALDACCHINO Gérard Chercheur CEA, CEA Paris-Saclay

Mme HELLWIG Petra Professeur, Université de Strasbourg

M RAFFY Quentin Maitre de Conférences, Université de Strasbourg

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·

•

·

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I. Physique des ions accélérés

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(23)

S = !"#_"$=%&₊'()_,_-*./ &0₂,11/

3

4Z+5+6%L476

Z)88 = Z 9: ! exp%&_<_>;<₀. ?@ /A

L476%= LB476 C ZLD476 C Z3LD476 C E F LB476 F ln &GHIJ_K / !%_NM_H!%O₃C %termes%relativistes476

(24)

7

7 7

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(27)

(28)

3) Quantification des dégâts sous faisceau d’ions

h)jo = :qqw,yz_# %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% (1-5)

!

(29)

(30)

(31)

(32)

II. Radiolyse de l’eau

A. Evolution temporelle de la radiolyse de l’eau

1) L’étape physique

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Ž3•%•K‘%Ž3••’C%“; Ž3•%‘%Ž•K 3•”

·

(34)

(35)

•

(36)

(37)

£ □

□ ○

(38)

B. Effets de TEL du rayonnement sur la radiolyse de l’eau

1) Influence de la densité de dépôt d’énergie

!pour!! !pour! ¤! !pour! £!pour!

(39)

2) Hypothèse de l’ionisation multiple et production de O2 et de

HO2•/O2•- primaire à fort TEL

(40)

(41)

C. Radiolyse de solution diluée en milieu aéré

1) Influence de l’oxygène sur la radiolyse de l’eau

(42)

(43)

ª“¢’_C%•₃•; _‘%ª“3’_C%•₃ ª“3’_C%Ž₃_•₃_‘%ª“¢’_C%Ž••_%%

!

(44)

A. Phénomènes de radiolyse à l’échelle cellulaire

(45)

(46)

(47)

(48)

B. De la radiolyse d’une cellule aux dégradations des biomolécules

1) Composition moléculaire d’une cellule

2) Les protéines, les cibles statistiques et fonctionnelles

Composition moléculaire Pourcentage massique

(49)

3) Interactions directes ou indirectes du rayonnement

(50)

A. Structure et composition des protéines

(51)

(52)

7 ·

π

· 7

!!

(53)

B. Mécanismes de dégradation des protéines

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(55)

«

•

(56)

7

(57)

«

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C. Modifications structurelles et conséquences biologiques

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(63)

I. Expériences d’irradiation

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(65)

¬w4-6 = ®4S-6 w

¯° ± exp%4!S-6!

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C. Techniques de dosimétrie mises en œuvre.

1) Mesure du courant par cavité de Faraday

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(71)

A. Plateforme ACACIA, Van de Graaff 4MV

(72)

(73)

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,5 1,5 2,5 3,5 P e rt e d 'e n e rg ie d a n s 12 µ m d e My la r (M e V)

(74)

3) Comparaison des mesures de fluences

A. Heavy Ion Medical Accelerator in Chiba (HIMAC)

0,00E+00

1,00E+08 2,00E+08 3,00E+08

Mesure 1 Mesure 2 Mesure 3 Mesure 4

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(81)

III. Supports et montages d’irradiation sous faisceau d’ions

A. Irradiation de solutions diluées

(82)

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(86)

B. Irradiation de gels de protéines

1) Contraintes d’échantillonnage

·

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3) Irradiations à hautes énergies.

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A. Césium 137

7

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(91)

V. Tableau récapitulatif

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I. Principe, scavenging avec 3CCA

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(95)

´µ•_{C Ír};_{%‘%%Írµ´}•;_%% Írµ´•;_C%Ír;_{‘ Ír}

3•;%C%´µ;% Ír3•;%C%Ír3•;‘%Ír¢;C%Ír;

2) Les sondes du radical hydroxyle par capture

t =%_kº: !

(96)

(97)

A. L’acide 3-coumarine carboxylique

(98)

(99)

II. Méthode expérimentale

(100)

(101)

C. Quantification de la 7OH-3CCA

(102)

2) Analyses en ligne

3) Analyses par HPLC-Fluo 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 Fl u or e scenc e r e la ti v e d e l a 7O H -3C CA . Ex ci ta ti on : 38 0n m Emis si on : 45 0n m

Concentration en 3CCA (mol/L)

(103)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 0 2 4 6 8 10 In te n si té d e f lu or e scenc e

Temps de rétention (minutes) 3CCA

Autres produits : 8OH-3CCA, ...

(104)

4) Calcul des rendements de production du radical hydroxyle hÁÃ•4mÎl Ï@ 6 =ÐÃÁ•Ñ Ò %= DBB 'ÇÓ%× ÐÓÃÁ;¢ÔÔÕÑ Ò hÁÃ•4esp :qqeV@ 6 = ÖÇÈ¦ × :qØ%× %h_ÁÃ•4mÎl Ï@ 6 hÁÃ•!! [HO•]! [7OH-3CCA!]!_!!!_! D!

III. Détermination des rendements de production du radical

hydroxyle

(105)

(106)

1) Mesure des rendements intégraux sous protons

(107)

(108)

(109)

(110)

(111)

C. Effets de la nature des particules sur les rendements de production en radical hydroxyle

(112)

(113)

(114)

IV. Conclusion

(115)

(116)

(117)

I. Etat de l’art de la radiolyse de la phénylalanine

A. La phénylalanine parmi les acides aminés

(118)

B. La L-Phénylalanine

(119)

•

A. Radiolyse de la phénylalanine

(120)

!

(121)

(122)

(123)

Ù

(124)

(125)

II. Méthode expérimentale

A. Irradiation de solutions diluées de phénylalanine

(126)

(127)

(128)

·

(129)

·

(130)

C. Analyses post-irradiation HPLC-DAD-Fluo-CAD-MS

(131)

(132)

(133)

(134)

(135)

y = 3 310x R² = 1 y = 1,03E+09x R² = 9,98E-01 0,00E+00 5,00E+05 1,00E+06 1,50E+06 2,00E+06 2,50E+06 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

0,00E+00 1,00E-03 2,00E-03

A ir e UV 27 0n m Ch ib a A ir e UV 27 0n m , Str a sb ou rg

Concentration de phénylalanine (mol/L) UV 270nm Strasbourg

UV 270nm Chiba

Aire UV270 Stras/Corona Aire FluoStras_G10/Corona Produits Masse molaire Conversion Erreur Conversion Erreur

(136)

III. Résultats et discussion

A. Mesures intégrales et rendements différentiels 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 0 10 20 30 40 50

Conc

e

n

tr

a

ti

on

(µ

M

)

Temps après l'irradiation (heure)

2,5-dopa

(137)

(138)

(139)

3) Rendements différentiels avec ions de basses énergies

(140)

(141)

(142)

4) Rendements avec des ions de hautes énergies et gamma

(143)

·

B. Première hydroxylation : production des tyrosines

(144)

(145)

(146)

•

(147)

C. Production de dimères

•

(148)

D. Formation de la 2,5-dopa

(149)

2) Mécanisme de formation de la 2,5-dopa

(150)

(151)

•

(152)

•

(153)

ù

E. Mécanismes de seconde hydroxylation

(154)

•

Íilan%Úes%attaÛues%´µ• _=%

(155)

IV. Conclusion

•

(156)

(157)

(158)

(159)

(160)

(161)

I. La myoglobine : structure et propriétés

A. Choix de la myoglobine comme cible

·

(162)

B. De la structure primaire à la structure tertiaire

(163)

C. Le site actif : l’hème

(164)

(165)

(166)

(167)

•

(168)

D. L’apomyoglobine

II. Etude des effets indirects de l’irradiation de la myoglobine

(169)

(170)

B. Méthode expérimentale

(171)

(172)

2) Préparation et purification des protéines cibles

(173)

(174)

(175)

(176)

(177)

(178)

(179)

Position dans la séquence

Polypeptide de digestion de la Myoglobine

Masse moléculaire + H

(180)

(181)

C. Etude phénoménologique de la radiolyse de la myoglobine par des protons

(182)

(183)

(184)

(185)

(186)

•

(187)

•

(188)

(189)

3) Effets de la radiolyse sur les chaines latérales

•_.!

(190)

(191)

(192)

(193)

D. Effets de la nature de la particule

(194)

(195)

(196)

(197)

F. Conclusion intermédiaire

·

(198)

III. Etude des effets directs de l’irradiation de la myoglobine

A. Développement des gels et caractérisation 1) Produits chimiques utilisés

≥ ≥ ≥ ≥

(199)

ε

(200)