UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI
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FACULTE DES SCIENCES AGRONOMIQUES
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ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI
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FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES
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Master en Normes et Contrôle de Qualité des Produits Agroalimentaires
SUJET DE RECHERCHE:
MEMOIRE REDIGE ET SOUTENU PAR : Essi Kekeli M. KOKUTSE
Le 14 Juin 2017
Superviseur : Composition du jury
Prof. Victor B. ANIHOUVI Président : Prof. Paulin AZOKPOTA Professeur Titulaire (CAMES) Rapporteur : Prof. Victor B. ANIHOUVI
Examinateur 1 : Prof. Générose DALODE Examinateur 2 : Dr. Sylvain DABADE
EVALUATION DES PROPRIETES PHYTOCHIMIQUES ET
ANTIMICROBIENNES DE CINQ EPICES ET HERBES AROMATIQUES COURAMMENT UTILISEES AU BENIN
Année académique : 2015-2016
CERTIFICATION
Nous certifions que le présent travail intitulé « Evaluation des propriétés phytochimiques et antimicrobiennes de cinq épices et herbes aromatiques couramment utilisées au Bénin » a été réalisé et soutenu par Mlle Essi Kekeli M. KOKUTSE, à la Faculté des Sciences Agronomiques de l’Université d’Abomey-Calavi, dans le cadre du Master inter facultaire en Normes et Contrôle de Qualité des Produits Agroalimentaires, sous notre supervision.
Le Superviseur
Prof. Victor B. ANIHOUVI Professeur Titulaire (CAMES)
DEDICACES
A toute ma famille
REMERCIEMENTS
Nous exprimons notre profonde gratitude à tous ceux qui, de près ou de loin, ont contribué à la réalisation de ce travail. Nous tenons particulièrement à remercier :
- Le Professeur Victor ANIHOUVI, notre superviseur, pour sa rigueur scientifique, sa disponibilité et sa patience
- Les responsables du Master en Normes et Contrôle de Qualité des Produits Agroalimentaires, les Professeurs Joseph D. HOUNHOUIGAN et Issaka YOUSSAO ABDOU KARIM
- Le Professeur Fernand GBAGUIDI, responsable du Laboratoire de Chimie Pharmaceutique et Chimie Organique
- Mme Opportune AKPO-DJENONTIN, doctorante à la FSA avec qui ce travail a été réalisé, pour l’appui scientifique, le soutien et les conseils
- Tout le personnel des différents laboratoires où nous avons effectué nos analyses - Le Professeur Paulin AZOKPOTA pour l’orientation
- Les Professeurs Kouami KOKOU et Adzo D. KOKUTSE pour tous les conseils, la disponibilité et le soutien
- Les docteurs Hope SOUNOUVOU, Habib TOUKOUROU, Alban HOUNGBEME et Philippe SESSOU pour les appuis scientifique et technique, et les conseils tout au long de ces travaux
- Les docteurs et doctorants pour l’appui scientifique tout au long de ces travaux
- Nos collègues du Master en Normes et Contrôle de Qualité des Produits Agroalimentaires et du Laboratoire de Sciences des Aliments
- Mme Celia FIOGBE pour l’accueil et le soutien
RESUME
La présente étude vise à évaluer l’activité antimicrobienne des extraits non volatils et des huiles essentielles de cinq épices et herbes aromatiques (EHA) couramment utilisées au Bénin. A cet effet, des échantillons de deux herbes aromatiques : le basilic africain (Ocimum gratissimum), les feuilles de laurier (Laurus nobilis) et de trois épices : le clou de girofle (Sygyzium aromaticum), le gingembre (Zingiber officinale) et l’ail (Allium sativum) ont été testés. Le criblage phytochimique a été réalisé par la méthode basée sur les réactions de coloration et de précipitation différentielles. La composition chimique des huiles essentielles des EHA obtenues par hydrodistillation a été déterminée par la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CG-SM). L’activité antimicrobienne a été évaluée par la détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) et la Concentration Minimale Bactéricide ou Fongicide (CMB ou CMF). Les extraits au dichlorométhane, aqueux, hydroéthanolique et les huiles essentielles desdites espèces végétales ont été testés sur la croissance in vitro de Salmonella Typhi R 30951401, Escherichia coli O157: H7 ATCC 27844, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Penicillium sp et Aspergillus versicolor par la technique de microdilution et ensemencement sur milieu gélosé. Les rendements d’extraction varient de 0,8 ± 0,2% à 29,3 ± 0,1 pour les extraits non volatils et de 0,1±0,0% à 3,1 ± 0,2 % pour les huiles essentielles. Le screening phytochimique a révélé la présence d’anthocyanes, de mucilages, de tanins, d’alcaloïdes, de flavonoïdes et une absence de composés cyanogéniques, de dérivés anthracéniques libres et des hétérosides. La caractérisation chimique des huiles essentielles a révélé la présence de composés majeurs tels que le diallyl disulfide (44,1%) et le diallyl trisulfide (26,9%) dans Allium sativum ; l’eugénol (76,1%) et l’isocaryophyllène (20,6%) dans Sygyzium aromaticum, le 1,8 cinéole (26,2%) et le camphène (15,3%), dans Zingiber officinalis ; l’eugénol (51,9%) et le β-pinène (24,8%) dans Laurus nobilis ; le thymol (41,2%), le tert-Butanol (17%) et l’O-Cymene (16,5%) dans Ocimum gratissimum. Les CMI varient de 0,3 à 10 mg/mL pour les extraits non volatils et de 0,2 à 1,2 mg/mL pour les huiles essentielles. Les CMB varient de 2,5 mg/mL à 10mg/mL pour les extraits non volatils et de 1,2 mg/mL à 10 mg/mL pour les huiles essentielles. Les extraits hydroalcooliques testés en combinaison ont montré un effet bactéricide. Ces épices et herbes aromatiques investiguées peuvent donc être utilisées pour protéger les denrées alimentaires de l’altération microbienne.
Mots-clés : Epices, Herbes aromatiques, Composition phytochimique, Concentration Minimale Inhibitrice, Concentration Minimale Bactéricide, Concentration Minimale Fongicide.
ABSTRACT
This study aims to assess the antimicrobial activity of extracts and essential oils of five spices and aromatic herbs (SAH) commonly used in Benin. Thus, samples of two aromatic herbs: African basil (Ocimum gratissimum), laurel (Laurus nobilis) and three spices: clove (Sygyzium aromaticum), ginger (Zingiber officinalis) and garlic (Allium sativum) were investigated. The secondary metabolites of SAH were detected by the method based on colouring and precipitation differential reactions. The chemical composition of the essential oils extracted by hydrodistillation was determined with gas chromatography mass spectrometry method. The antimicrobial activity of extracts and essential oils were evaluated by the determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), Minimum Bactericidal or Fungal Concentration (MBC or MFC). The antibacterial and antifungal activity of extracts and essential oils were assessed on Salmonella Typhi R 30951401, Escherichia coli O157: H7 ATCC 27844, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Penicillium sp and Aspergillus versicolor using microplates method. The extraction yields varied from 0.8 ± 0.2% to 29.3 ± 1 for the extracts and from 0.1
± 0% to 3.1 ± 0.2% for the essential oils. The phytochemical screening revealed the presence of anthocyanins, mucilages, tanins, alcaloïds, flavonoïds and an absence of cyanogenic components, anthracenics and cardiotonics. The chemical composition of essential oil revealed the presence of some major compounds : disulfid diallyl (44.1%) and trisulfid diallyl (26.9%) in Allium sativum ; eugenol (76.1%) and isocaryophyllene (20.6%) in Sygyzium aromaticum, 1,8 cineole (26.2%) and camphene (15.3%) in Zingiber officinalis ; eugenol (51.9%) and β-pinene (24.8%) in Laurus nobilis; thymol (41.2%), tert-Butanol (17%) and O-Cymene (16.5%) in Ocimum gratissimum. MIC ranging between 0.3 and 10 mg/mL and between 0.2 and 1.2 mg/mL were obtained for the extracts and essential oils, respectively. MBC varied from 2.5 mg/mL to 10 mg/mL for extracts and from 1.2 mg/mL to 10 mg/mL for essential oils. Moreover, the hydroethanolic extracts used in combination demonstrated bactericide effect. Spices and aromatic herbs investigated could be used to preserve foods from microbial spoilage.
Key-words: Spices, Aromatic herbs, Phytochemical composition, Minimum Inhibitory Concentration, Minimum Bactericidal Concentration, Minimum Fungal Concentration.
TABLE DES MATIERES
CERTIFICATION ...i
REMERCIEMENTS ... iii
ABSTRACT ... v
LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS ... viii
LISTE DES FIGURES ... x
LISTE DES PHOTOS ... x
Introduction ... 2
1- Synthèse bibliographique ... 5
1.1-Généralités sur les épices et les herbes aromatiques ... 5
1.1.1-Clarification conceptuelle ... 6
1.1.1.1-Epices………6
1.1.1.2-Herbes aromatiques ... 6
1.1.2-Description botanique ... 6
1.2-Composition chimique des épices et des herbes aromatiques ... 11
1.2.1-Extraits non volatils ...11
1.2.1.1-Notion d’extraits non volatils ...11
1.2.1.2-Techniques d’extraction ...11
1.2.2-Huiles essentielles ...11
1.2.2.1-Notion d’huiles essentielles ...11
1.2.2.2-Techniques d’extraction des huiles essentielles ...12
1.3-Utilisation des épices et des herbes aromatiques dans le monde ... 13
1.3.1-Usages en agroalimentaire ...13
1.3.2-Usages en pharmacopée ...14
1.4-Flore microbienne des épices et des herbes aromatiques ... 14
1.5-Activité antimicrobienne des épices et des herbes aromatiques... 15
1.6-Importance socio-économique des épices et des herbes aromatiques au Bénin ... 17
1.6.1-Les épices couramment utilisées au Bénin ...17
1.6.2-Les herbes aromatiques couramment utilisées au Bénin ...18
1.7-Transformation des épices et des herbes aromatiques ... 19
1.8-Caractéristiques des souches étudiées ... 21
1.8.1- Bactéries ...21
1.8.2- Champignons ...21
2-Matériel et méthodes ...23
2.1-Cadre de l’étude ... 23
2.2-Matériel d’étude ... 23
2.3-Méthodes ... 24
2.3.1-Extraction des huiles essentielles et des composés non volatils ...24
2.3.2-Caractérisation des huiles essentielles et des extraits non volatils ...26
2.3.3-Etude in vitro des activités antimicrobiennes des extraits testés individuellement ...31
2.3.3.1 Préparation des solutions d’extraits à tester ...31
2.3.4-Etude in vitro des activités antimicrobiennes des extraits testés en association ...34
2.3.5-Analyses statistiques ...35
3.1- Rendement d’extraction ... 37
3.1-Phytoconstituants des épices et herbes aromatiques étudiées ... 38
3.2-Caractérisation chimique des huiles essentielles des épices et des herbes aromatiques étudiées ... 41
3.3.1-Composition chimique de l’huile essentielle d’Allium sativum ...41
3.3.2-Composition chimique de l’huile essentielle extraite de Sygyzium aromaticum ...42
3.3.3-Composition chimique de l’huile essentielle extraite de Zingiber officinale ...42
3.3.4-Composition chimique de l’huile essentielle extraite de Laurus nobilis ...43
3.3.5-Composition chimique de l’huile essentielle d’Ocimum gratissimum. ...44
3.4-Activités antibactériennes et antifongiques des extraits d’épices et d’herbes aromatiques testées individuellement……….45
3.4.1-Cas des extraits non volatils ...45
3.4.2-Cas des extraits volatils ...51
3.5-Etude in vitro des activités antibactériennes et antifongiques des extraits d’épices et d’herbes aromatiques testés en association ... 52
Conclusion et perspectives ...56
LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS
ATCC : American Type Culture Collection
CBRST : Centre Béninois de Recherche Scientifique et Technique
CG-SM : Chromatographie en Phase Gazeuse couplée à la Spectrométrie de Masse CMB : Concentration Minimale Bactéricide
CMF : Concentration Minimale Fongicide CMI : Concentration Minimale Inhibitrice EHA : Epices et Herbes Aromatiques FAST : Faculté des Sciences et Techniques FSA : Faculté des Sciences Agronomiques FSS : Faculté des Sciences de le Santé
IREMPT : Institut de Recherche et d’Expérimentation en Médecine et Pharmacopée Traditionnelle
LSA : Laboratoire de Sciences des Aliments
NIST : National Institute of Standards and Technology
NCQPA : Normes et Contrôle de Qualité des Produits Agroalimentaires
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Epices couramment utilisées au Bénin ...17
Tableau 2: Herbes aromatiques régulièrement utilisées au Bénin. ...18
Tableau 3 : Type de combinaisons d’extraits testées ...34
Tableau 4 : Rendements (%) des extraits non volatils et des huiles essentielles ...38
Tableau 5 : Composition phytochimique des épices et des herbes aromatiques étudiées ...40
Tableau 6 : Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) des extraits non volatils et des huiles essentielles sur la souche Staphylococcus aureus ...47
Tableau 7 : Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) des extraits non volatils et des huiles essentielles sur la souche Salmonella Typhi ...47
Tableau 8 : Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) des extraits non volatils et des huiles essentielles sur la souche Escherishia coli ATCC 25922 ...48
Tableau 9: Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) des extraits non volatils et des huiles essentielles sur la souche Escherishia coli O157:H7 ...48
Tableau 10 : Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) des extraits non volatils et des huiles essentielles sur la souche Penicillium sp...49
Tableau 11 : Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) des extraits non volatils et des huiles essentielles sur la souche Aspergillus versicolor ...49
Tableau 12 : Récapitulatif des extraits non volatils et des huiles essentielles ayant une Concentration Minimale Bactéricide ou Fongicide sur les souches investiguées ...50
Tableau 13 : Rapport Concentration Minimale Bactéricide ou Fongicide/Concentration Minimale Inhibitrice des extraits non volatils et des huiles essentielles sur les souches sur les souches investiguées ...51
Tableau 14 : Concentration Minimale Bactéricide (CMB) ou Fongicide (CMF) des extraits testées en combinaison sur les souches investiguées ...53
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Procédé de transformation des épices et herbes aromatiques...20
Figure 2 : Composition chimique de l’huile essentielle d’Allium sativum ...41
Figure 3 : Composition chimique de l’huile essentielle de Sygyzium aromaticum ...42
Figure 4 : Composition chimique de l’huile essentielle de Zingiber officinale ...43
Figure 5 : Composition chimique de de l’huile essentielle de Laurus nobilis ...44
Figure 6 : Composition chimique de l’huile essentielle d’Ocimum gratissimum ...45
LISTE DES PHOTOS Photo 1 : Bulbe d’Allium sativum ... 7
Photo 2 : Boutons floraux de Syzygium aromaticum ... 8
Photo 3 : Rhizome de Zingiber officinale ... 9
Photo 4 : Feuilles de Laurus nobilis ...10
Photo 5 : Feuilles d’Ocimum gratissimum ...10
Photo 6 : Dispositif d’extraction de type Clevenger ...24
Introduction
Introduction
L’altération d’un produit alimentaire peut avoir de plus ou moins graves conséquences. Ces conséquences varient de la modification de la qualité du produit lui faisant perdre ainsi ses propriétés organoleptiques ou sa valeur marchande à des cas d’affections alimentaires avec des effets adverses sur la santé du consommateur (Benzouai et al., 2015). De nos jours, l’industrie alimentaire est de plus en plus confrontée aux problèmes de contamination microbiologique des denrées alimentaires. Dans le même temps, les risques d’allergies, de cancer et d’asthme liés à l’utilisation des additifs synthétiques sont croissants (Peter, 2006). Il s’avère donc indispensable de recourir à des alternatives naturelles parmi lesquelles l’utilisation des épices et des herbes aromatiques pour lutter contre la prolifération des contaminants microbiologiques des aliments.
En effet, l’utilisation des épices et herbes aromatiques est connue dans divers domaines:
alimentaire, pharmaco-thérapeutique, parfumerie, cosmétique. Dans l’industrie agroalimentaire, les épices et les herbes aromatiques sont utilisées non seulement pour améliorer la qualité organoleptique des aliments mais aussi comme conservateurs, pour empêcher le développement des microorganismes responsables de l’altération des aliments (Peter, 2004 ; Tassou et al., 2004).
En effet, les épices et les herbes aromatiques sont d’excellentes sources de composés phénoliques (Collin, 2006). Par conséquent, elles possèdent un effet inhibiteur sur la croissance de plusieurs bactéries et champignons et permettent ainsi de protéger les denrées contre la dégradation microbienne (Shan et al., 2007). Plusieurs travaux ont montré que les extraits des épices et des herbes aromatiques ont un effet inhibiteur sur la croissance de plusieurs bactéries et champignons responsables des maladies d’origine alimentaire (Bassolé et al., 2001 ; Sartoratto et al., 2004 ; Sessou et al., 2012 ; Gupta et al., 2013 ; Radaelli et al., 2016).
Au Bénin, les épices et les herbes aromatiques ont une importance socio-économique avérée (Akpo Djènontin. et al., 2016). Plusieurs épices et herbes aromatiques dont l’oignon (Allium cepa), le piment (Capsicum spp), le clou de girofle (Sygyzium aromaticum), le gingembre (Zingiber officinale), l’ail (Allium sativum), l’anis (Pimpinella anisum), le basilic africain (Ocimum gratissimum) et les feuilles de laurier (Laurus nobilis) sont régulièrement utilisées au Bénin (Akpo Djènontin et al., 2016). Elles sont utilisées non seulement pour améliorer la qualité organoleptique des aliments mais aussi à des fins thérapeutiques (Akpo Djènontin et al., 2016).
Par ailleurs, elles pourraient être utilisées à des fins de conservation (Sessou et al., 2012a ; Sessou
et al.,2013). Ainsi, face aux différents cas d’affections alimentaires liées à la mauvaise conservation des denrées alimentaires, est-il possible de préserver ces aliments par l’utilisation des épices et des herbes aromatiques ayant des propriétés antimicrobiennes avérées ? Existe-t-il une diversité de composés actifs dans les extraits des épices et des herbes aromatiques ? Les extraits des épices et des herbes aromatiques sont-ils plus actifs individuellement qu’en association ?
Le présent travail vise à évaluer les propriétés phytochimiques et antimicrobiennes des épices et des herbes aromatiques couramment utilisées au Bénin. De façon spécifique, il s’agit de :
- caractériser les composés actifs présents dans les extraits non volatils et les huiles essentielles des épices et des herbes aromatiques objets de l’étude ;
- déterminer les Concentrations Minimales Inhibitrices desdits extraits et huiles essentielles testés individuellement et en association ;
- déterminer les Concentrations Minimales Bactéricides ou Fongicides desdits extraits et huiles essentielles testés individuellement et en association.
De ces objectifs découlent les hypothèses suivantes :
- Les composés actifs sont plus présents dans les extraits non volatils que dans les huiles essentielles ;
- Les Concentrations Minimales Inhibitrices des extraits des épices et des herbes aromatiques sont plus élevées individuellement qu’en association ;
- Les Concentrations Minimales Bactéricides des extraits des épices et des herbes aromatiques sont plus élevées prises individuellement qu’en association.
Synthèse bibliographique
Mémoire Master NCQPA| Kekeli KOKUTSE 5
1- Synthèse bibliographique
1.1- Généralités sur les épices et les herbes aromatiques
Les épices et les herbes aromatiques (EHA) désignent «l’une quelconque des diverses parties aromatiques provenant des feuilles, des fleurs et d'autres parties de plantes utilisées pour conférer un arôme ou une saveur aux aliments» (Codex Alimentarius, 1991). Les épices et les herbes aromatiques font partie des additifs alimentaires les plus utilisés dans les préparations culinaires à travers le monde (Hashem et Alamri, 2010). D’origine végétale, les épices et les herbes aromatiques contiennent des substances organiques volatiles appelées arômes, et sont utilisés non seulement pour améliorer la texture, donner de la saveur, de l’arôme ou de la couleur aux aliments, aux boissons mais aussi pour prolonger leur durée de conservation (Peter 2004; Codex Alimentarius 2014; Radaelli et al., 2016). Les épices et les herbes aromatiques jouent d’autres rôles très importants. Elles contiennent des vitamines (A, B, C) et de minéraux (Ca, P, Na, K, Fe) (Green et al., 2012). Elles constituent d’excellentes sources d’antioxydants et préviennent ainsi les réactions de dégradation oxydative dans les aliments (Shylaja et Peter, 2004). Elles possèdent aussi des propriétés médicinales. Elles renferment des molécules bioactives qui ont un intérêt en pharmacologie. Elles sont utilisées dans la lutte contre diverses maladies tel que le cancer, le diabète, l’arthrite, l’asthme, les maladies cardiovasculaires (Peter, 2004). En outre, elles possèdent des propriétés antimicrobiennes et assurent le contrôle de la croissance microbienne dans les aliments (Tassou et al., 2004). Elles renferment des composés qui permettent de lutter contre une large gamme de bactéries, de champignons et de contrôler ainsi la croissance microbienne dans les aliments (Tassou et al., 2004). Les épices et les herbes aromatiques constituent de ce fait une alternative naturelle aux additifs chimiques (Shylaja et Peter, 2004).
Elles sont par ailleurs d’excellents répulsifs des insectes. Les poudres, les extraits, les huiles essentielles, les oléorésines des épices et des herbes aromatiques sont très actifs contre les insectes nuisibles des récoltes (Peter, 2004). De plus, elles sont très utilisées dans la parfumerie, les cosmétiques, les soins du corps et de beauté. Certaines d’entre elles sont également utilisées pour des rituels religieux (Peter, 2001).
1.1.1- Clarification conceptuelle 1.1.1.1- Epices
Denrées précieuses dès l’antiquité, les épices sont des substances végétales qui proviennent de nombreuses parties de la plante : l’arille (le macis), l’écorce (la cannelle), les fruits (le piment), les baies (le poivre noir), les bourgeons (clou de girofle), les bulbes (l’ail), les rhizomes (gingembre, curcuma), les racines, les graines (la moutarde), les stigmates (le safran), les gousses (la vanille), la résine (l’asafoetida) (Codex Alimentarius, 2014). Elles désignent les parties d’une plante aromatique, exception faite aux feuilles (Peter, 2001).
1.1.1.2- Herbes aromatiques
Les herbes aromatiques peuvent être définies comme les feuilles des plantes aromatiques. Elles sont utilisées sous forme fraîche ou séchées, entières ou émincées (Peter, 2001).
1.1.2- Description botanique
Les épices et les herbes aromatiques constituent un groupe important de végétaux. Elles appartiennent au sous-embranchement des Angiospermes et sont réparties dans différentes familles végétales.
Allium sativum L.
Nom vulgaire : Ail Nom local (Fon) : Ayo
Originaire d’Asie centrale, l’ail (Allium sativum L.) est une plante vivace monocotylédone, à feuilles plates et étroites. De 30 à 100 cm de hauteur, l’ail appartient à la famille des Liliacées ou Alliacées. Ses bulbes (Photo1) sont utilisés à des fins médicinales et surtout en tant qu’épice.
L’ail est également cultivé à des fins commerciales. Il possède des propriétés thérapeutiques.
C’est un excellent hypotenseur, anticancérigène et hypoglicémiant (Al-Snafi, 2013). Il possède des propriétés antioxydantes et antibiotiques (Meriga et al., 2012). L’ail, très riche en composés soufrés est aussi une source de glucides, de vitamines et de minéraux (Pandey, 2001 ; Al-Snafi, 2013).
Photo 1: Bulbe d’Allium sativum
Syzygium aromaticum L.
Nom vulgaire : Clou de girofle Nom local (Fon) : Atinkin Gbadotà
Le giroflier (Syzygium aromaticum L.), jadis Eugenia caryophyllata Thunb. est un arbre à feuilles persistantes fortement aromatique (20 m de hauteur au maximum) de la famille des Myrtacées.
C’est une plante dicotylédone à feuilles opposées, oblongues, originaire de l’Indonésie. Les boutons floraux appelés clou de girofle, sont cueillis avant leur ouverture et séchés. Le clou de girofle (Photo 2), utilisé comme épice est également connu pour ses propriétés antiseptique, antiparasitaire, antispasmodique et antalgique. C’est un excellent stimulant. Il favorise l’expulsion des gaz. Il est riche en nutriments tels que les protéines, les vitamines et les minéraux (Nurdjannah et Bermawie, 2001). Le clou de girofle est une excellente source de composés antimicrobiens, antioxydants, antiviraux. Son huile essentielle est utilisée comme insecticide dans l’agriculture (Nurdjannah et Bermawie, 2001; Cortés-Rojas et al. 2014).
Photo 2 : Boutons floraux de Syzygium aromaticum
Zingiber officinale Rosc.
Nom vulgaire : Gingembre Nom local (Fon) : Dotè
Le gingembre (Zingiber officinale Rosc.) est une plante pérenne monocotylédone à feuilles lancéolées et à fleurs en épis blanches ou jaunes de 30 à 100 cm de haut. Originaire de l’Asie du Sud-Est, le gingembre (Photo 3) est une plante herbacée qui appartient à la famille des Zingibéracées et à l’ordre des Zingibérales. Son rhizome, fortement aromatique, est connu en tant qu’épice et est l’un des remèdes les plus utilisés au monde. Le gingembre régularise la biosynthèse du cholestérol et contrôle ainsi l’obésité (Vasala, 2001). Il possède des propriétés antimicrobiennes et antioxydantes (Singh et al., 2008). Il est utilisé comme antiseptique, anti- inflammatoire, anti cancérigène et stimulant. Il calme également la toux, lutte contre les troubles circulatoires, digestifs et les vomissements. Le gingembre est par ailleurs, une source de glucide, de vitamines et de minéraux (Vasala, 2001 ; Akoachere et al., 2002).
Photo 3 : Rhizome de Zingiber officinale
Laurus nobilis L.
Nom vulgaire : Laurier Nom local (Fon) : Loriéman
Le laurier (Laurus nobilis L.) est un arbre aromatique à feuilles lancéolées vert foncé, à petites fleurs jaunes et à baies noires d’environ 15 à 20 m de haut. Cette plante dicotylédone appartient à la famille des Lauracées. Elle est utilisée pour ses feuilles et son huile essentielle. Connues en cuisine comme herbe aromatique, les feuilles de laurier (Photo 4) sont utilisées pour régulariser la glycémie, soigner les troubles de l’appareil digestif, faciliter la digestion et l’assimilation des aliments (Kumar et al., 2001).
Photo 4 : Feuilles de Laurus nobilis
Ocimum gratissimum L.
Nom vulgaire : Basilic africain Nom local (Fon) : Tchioyo, Tchiayo
Ocimum gratissimum L. est une plante dicotylédone de la famille des Lamiacées. Les feuilles (Photo 5) sont utilisées contre les infections, l’hypertension, l’épistaxis, le paludisme (N’guessan et al., 2009). Les plantes de la famille des Lamiacées constituent d’excellentes sources d’antioxydants (Peter, 2004).
Photo 5 : Feuilles d’Ocimum gratissimum
1.2- Composition chimique des épices et des herbes aromatiques 1.2.1- Extraits non volatils
1.2.1.1- Notion d’extraits non volatils
Un extrait de plante aromatique est la solution qui recueille une partie des principes actifs de la plante soumise à un traitement avec un solvant (eau, éther, alcool etc) qui en retire les principes solubles (Djeddi, 2012).
1.2.1.2- Techniques d’extraction
Diverses techniques sont utilisées pour l’obtention des extraits non volatils :
La décoction : Elle consiste à placer la plante dans de l’eau froide. L’ensemble est porté à ébullition pendant un temps variable en fonction de la plante (Loubaki et al., 1999 ; Djeddi, 2012).
L’infusion : Elle consiste à mettre une plante dans de l’eau bouillante pendant un temps variable (Djeddi, 2012).
La macération : Elle consiste à mettre la plante dans un liquide (eau, alcool, huile etc…) froid pendant un temps dépendant de la nature de la plante (Bolou et al, 2011).
1.2.2- Huiles essentielles
1.2.2.1- Notion d’huiles essentielles
L’huile essentielle se définit comme le « produit odorant, généralement de composition complexe, obtenu à partir d’une matière première végétale botaniquement définie, soit par entraînement à la vapeur d’eau, soit par distillation sèche, soit par un procédé mécanique approprié sans chauffage. L’huile essentielle est le plus souvent séparée de la phase aqueuse par un procédé physique n’entraînant pas de changement significatif de sa composition » (AFSSAPS, 2008). Les huiles essentielles sont synthétisées par plusieurs familles de végétaux dont les Lauraceae, Rutaceae, Apiaceae, Piperaceae, Myrtaceae, Geraniaceae, Hyperycaceae, Poaceae (Peter, 2001). Les huiles essentielles se forment dans un grand nombre de plantes comme sous- produits du métabolisme secondaire et peuvent être localisées dans tous les types d’organes végétaux : feuilles (laurier, basilic africain, citronnelle …), racines (vétiver), rhizome (gingembre, curcuma), graines (anis), bulbes (ail), boutons floraux (clou de girofle) etc…
(AFSSAPS, 2008 ; Djeddi, 2012). Elles sont synthétisées et accumulées dans des structures histologiques spécialisées telles que les papilles épidermiques, les poils sécréteurs, les canaux sécréteurs, les poches, les vacuoles. Elles sont volatiles à température ambiante. Les huiles essentielles jouent divers rôles fonctionnels dans la plante. Elles interagissent sur les espèces qui partagent le même espace en ayant un effet toxique sur la germination de la graine de ces espèces. Elles ont un effet attractif favorisant la pollinisation et la dispersion des grains de pollen.
Elles permettent par ailleurs de protéger la plante contre les attaques des nuisibles (Djeddi, 2012).
1.2.2.2- Techniques d’extraction des huiles essentielles
Il existe plusieurs techniques d’extraction des huiles essentielles. Le choix du procédé d’extraction dépend de la nature du matériel végétal.
Extraction à la vapeur
C’est un procédé utilisant l’entraînement des substances aromatiques par la vapeur. Le matériel végétal est soumis à l’action de la vapeur d’eau. La vapeur hétérogène (d’eau et d’huile) est ensuite condensée dans le réfrigérant et l'huile essentielle est séparée de l’eau après décantation (AFSSAPS 2008 ; Herzi, 2013).
Extraction par hydro-distillation
C’est l’une des variantes de l’entraînement à la vapeur. Au cours de ce procédé, la matière végétale est immergée dans un ballon rempli d’eau que l’on porte ensuite à l’ébullition. La matière végétale est donc en contact direct avec l’eau bouillante. La vapeur d’eau et l’huile essentielle libérée par la matière végétale se condensent dans le réfrigérant en formant un mélange non miscible. L’huile essentielle est ensuite récupérée après décantation (Herzi, 2013 ; Samate, 2002).
Extraction par distillation sèche
Elle consiste à chauffer la matière végétale sans addition d’eau, ni de solvants organiques.
L’huile essentielle est obtenue après condensation. Cette technique d’extraction est généralement utilisée pour l’extraction des bois, écorces et racines (AFSSAPS, 2008).
Extraction par expression à froid
Elle ne s’applique qu’aux fruits d’agrumes par des procédés mécaniques à température ambiante de 25°C ± 2°C en raison de la sensibilité à la chaleur de leurs huiles essentielles. Aucune source de chaleur n’est utilisée. Par action mécanique (compression, perforation, abrasion) sur toute la surface du fruit, les poches sécrétrices se rompent et leur contenu est récupéré. Après élimination des déchets solides, l’huile essentielle est séparée de la phase aqueuse par centrifugation ou décantation (Samate 2002 ; AFSSAPS, 2008 ; Herzi 2013).
Par ailleurs, il existe des méthodes innovantes d’extraction des huiles essentielles telles que l’hydro-distillation assistée par ultrasons, l’extraction assistée par micro-ondes, l’extraction par fluide supercritique etc (Herzi 2013).
1.3- Utilisation des épices et des herbes aromatiques dans le monde
La plupart des épices et des herbes aromatiques sont originaires de la région méditerranéenne.
Leur consommation varie en fonction des habitudes alimentaires de chaque région. Elles sont utilisées depuis l’Egypte et la Rome Antiques à diverses fins : assaisonnement, aromatisation, conservation, embaumement, antidotes contre les poisons, fabrication d’encens, fabrication de parfums et de produits cosmétiques etc (Ravindran et Pillai, 2004). Les épices et les herbes aromatiques, par leurs propriétés multiples et variées, sont utilisées dans différents secteurs notamment en agroalimentaire et en pharmacopée.
1.3.1- Usages en agroalimentaire
Les épices et les herbes aromatiques renferment plusieurs composés (eugénol, thymol, gingérol, carvacrol etc) responsables des différents arômes (Peter, 2006). Par conséquent, elles jouent un rôle important comme aromatisants des aliments et des boissons. Le clou de girofle est utilisé pour aromatiser les boissons telles que le « Vermouth » (Peter, 2004). La coriandre intervient dans l’aromatisation du « Gin » (Peter, 2004). Par ailleurs, les épices et les herbes aromatiques sont riches en pigments tels que les caroténoïdes, flavonoïdes, curcumine, chlorophylle, responsables de la couleur conférée aux aliments. Ainsi, certaines épices comme le paprika, le curcuma, le safran sont plus utilisées comme colorants naturels (Peter, 2004). Les épices et les herbes aromatiques sont d’excellents antioxydants. Elles préviennent les réactions d’oxydation
des aliments et prolongent leur durée de conservation. De plus, elles renferment des substances antimicrobiennes. Leur utilisation ou celle de leurs extraits (huiles essentielles, extraits aqueux…) permet de contrôler la croissance microbienne dans les aliments et les boissons (Shylaja et Peter, 2004). Elles sont donc utilisées comme conservateurs naturels des aliments et boissons (Tassou, 2004). Toutefois, leur utilisation peut avoir des effets secondaires comme la réduction du sel, du sucre et l’amélioration de la texture (Peter, 2004).
1.3.2- Usages en pharmacopée
Depuis l’Antiquité et les temps médiévaux, les épices et les herbes aromatiques sont connues pour leurs propriétés médicinales. Elles sont très utilisées en médecine traditionnelle notamment dans la médecine traditionnelle indienne. Elles renferment des principes actifs ayant des propriétés thérapeutiques et sont utilisées sous forme d’infusions, décoctions, thés, jus, sirops, teintures, cataplasmes, compresses, huiles, baumes, poudres (Ravindran et Pillai, 2004). Ainsi, l’aromathérapie est de plus en plus utilisée pour le traitement de plusieurs maladies. Le romarin, la cardamone, l’eucalyptus sont très riches en eucalyptol. Utilisé en massage, l’eucalyptol stimule les fibres sensitives en induisant une relaxation et une baisse de la perception de la douleur (Li, 2006). La curcumine du curcuma (Curcuma longa) permet de lutter contre l’Alzheimer (Collin, 2006 ; Li, 2006). Les extraits du romarin (Rosmarinus officinalis) sont efficaces contre le rhumatisme. L’oignon (Allium cepa) est un excellent aphrodisiaque, expectorant, hypoglycémiant et stimulant (Li, 2006). Par ailleurs, les épices et les herbes aromatiques sont très riches en antioxydants. Par conséquent, elles permettent de lutter contre les maladies cardiovasculaires, l’arthérosclérose et de réduire le taux de cholestérol dans l’organisme (Shylaja et Peter, 2004 ; Collin, 2006).
1.4- Flore microbienne des épices et des herbes aromatiques
Comme la plupart des produits agricoles, les épices et les herbes aromatiques sont exposées à la contamination microbienne. Cette contamination est liée au manque d’hygiène dans la chaîne alimentaire notamment aux étapes de production, de transformation, de stockage et de distribution des produits (Codex Alimentarius, 2014). Ainsi, les sources de contamination des épices et des herbes aromatiques sont diverses : l’air, le sol, les techniques de récolte, le stockage,
les manipulations, le conditionnement (Hashem et Alamri, 2010). On note dans les épices et les herbes aromatiques la présence de bactéries pathogènes sporulées (Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum) ainsi que des formes végétatives non sporulées (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, surtout Salmonella spp.), des moisissures productrices d’aflatoxines (Aspergillus flavus et Aspergillus parasiticus), d’ochratoxines (Aspergillus ochraceus, Aspergillus carbonarius, Penicillium verrucosum) et de stérigmatocystine (Aspergillus versicolor , Aspergillus ustus, Eurotium herbariorum ) ( Banerjee et Sarkar, 2003 ; Kocic-Tanackov et al., 2007 ; Codex Alimentarius, 2014). Bien que les épices et les herbes aromatiques soient utilisées en petites quantités dans les aliments, elles peuvent être à l’origine de nombreux cas d’affections alimentaires notamment des toxi-infections à Salmonella (Zweifel et Stephan, 2012). En effet, à cause de sa haute tolérance à la dessiccation, Salmonella peut survivre pendant longtemps dans les épices et les herbes aromatiques séchées (Zweifel et Stephan, 2012).
Par ailleurs, les champignons sont les contaminants biologiques les plus abondants dans les épices et les herbes aromatiques. La contamination fongique survient souvent lorsque le séchage des épices et des herbes aromatiques a été mal réalisé ou le stockage s’est fait dans un environnement très humide (Dimic et al., 2008). Les champignons qui contaminent les produits agricoles sont répartis en deux groupes écologiques : les moisissures du champ et les moisissures du stockage (Aziz et al., 1998). Certains de ces champignons sont connus comme étant de potentiels producteurs de mycotoxines tels que les aflatoxines, l’ochratoxine et la stérigmatocystine qui sont mutagènes, tératogènes, immunosuppresseurs et hépato-cancérogène (Hashem et Alamri, 2010).
1.5- Activité antimicrobienne des épices et des herbes aromatiques
Les épices et les herbes aromatiques renferment des composés chimiques possédant des activités antimicrobiennes. Les constituants des huiles essentielles ou extraits des épices et herbes aromatiques sont actifs contre une large gamme de bactéries et de champignons (Shylaja et Peter, 2004). En effet, les huiles essentielles du piment de Guinée (Xylopia aethiopica) et des feuilles du thé de Gambie (Lippia multiflora) ont des propriétés antibactériennes sur des souches de staphylocoques et de Escherichia coli (Bassolé et al., 2001). Les extraits de cannelle (Cinnammomum zeylanicum) ont montré une activité antifongique sur six souches de
champignons (Aspergillus flavus, Aspergillus tamari, Fusarium poae, Fusarium verticilloides, Penicillium citrinum et Penicillium griseofulvum) isolés du fromage béninois «Wagashi» (Sessou et al., 2012). Au Brésil, l’étude des huiles essentielles des épices et herbes aromatiques dont le romarin (Rosmarinus officinalis), le basilic (Ocimum basilicum), la marjolaine (Origanum marjorana), le thym (Thymus vulgaris), l’anis (Pimpinella anisum), la menthe poivrée (Mentha piperita) a révélé une activité bactéricide de ces huiles sur Clostridium perfringens (Radaelli et al., 2016). L’activité biologique des extraits dépend de leur composition chimique. L’inhibition observée est due aux dommages causés à l’intégrité membranaire qui affectent le pH et l’homéostasie de la membrane des microorganismes (Shylaja et Peter, 2004).
La mise en évidence de l’effet bactériostatique ou bactéricide d’un extrait est réalisée par la détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) et de la Concentration Minimale Bactéricide ou Fongicide (CMB ou CMF). La Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) est définie comme la plus petite concentration de l’extrait pour laquelle on n’observe aucune croissance des bactéries ou des champignons (Yaye et al., 2011) dans les conditions optimales.
La Concentration Minimale Bactéricide ou Fongicide (CMB ou CMF) est la plus petite concentration de l’extrait pour laquelle on n’observe aucune colonie microbienne (99,99% de destruction) dans les conditions optimales (Mamadou et al., 2014).
L’évaluation de l’activité antimicrobienne des extraits se fait par plusieurs méthodes :
- La méthode de dilution consiste à faire croître des bactéries sur des milieux de culture solides (Kwazou et al., 2009) ou liquides dans lesquelles les extraits se trouvent diluées à des concentrations dégressives successives afin de déterminer la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI). Dans le cas de la méthode en milieu liquide, les dilutions successives peuvent se faire dans des tubes à essai (macro dilution broth method) (Dah- Nouvlessounon et al., 2015) ou dans des microplaques (microdilution broth method) (Yehouenou et al., 2010 ; Agbankpe et al., 2016).
- La méthode de diffusion représentée par la méthode de disque (ou aromatogramme) et qui consiste à déposer un disque imprégné d’une quantité donnée d’extrait sur une gélose uniformément ensemencée par une suspension de la souche microbienne à étudier. Après incubation, les colonies se développent à la surface de la gélose laissant des zones vierges autour du disque appelées zone d’inhibition (Zaika, 1988).
- La méthode de puits consiste à mesurer la diffusion radiale de l’extrait à partir d’un puits en donnant une zone d’inhibition. La solution d’extrait est déposée dans un cylindre découpé dans la gélose. La gélose est au préalable ensemencée par la suspension microbienne (Shan et al., 2007).
1.6- Importance socio-économique des épices et des herbes aromatiques au Bénin
Au Bénin, les épices et les herbes aromatiques sont utilisées à diverses fins. Elles sont utilisées non seulement dans les préparations culinaires mais aussi à des fins thérapeutiques, conservatrices et cosmétiques. Elles sont utilisées sous plusieurs formes : fraîches ou séchées, moulues, mélange de plusieurs épices et herbes aromatiques (Akpo-Djènontin et al., 2016).
1.6.1- Les épices couramment utilisées au Bénin
Plusieurs épices sont utilisées individuellement ou en association avec des fréquences et des formes d’utilisation qui varient en fonction des groupes socio-culturels (Tableau 1) (Akpo- Djènontin et al., 2016). Toutefois, les épices couramment utilisées sont le piment (Capsicum sp), le gingembre (Zingiber officinalis), l’ail (Allium sativum), le poivre (Piper nigrum), l’oignon (Allium cepa), l’anis (Pimpinella anisum), le poivron doux (Capsicum annuum), la noix de muscade (Myristica fragrans), le clou de girofle (Sygyzium aromaticum ou Eugenia caryophyllus) et le piment de Guinée (Xylopia aethiopica) (Akpo-Djènontin et al., 2016).
Tableau 1 : Epices couramment utilisées au Bénin
Nom communs Noms locaux (Fon) Noms scientifiques
Ail* Ayo Allium sativum
Anis* Plèplè Pimpinella anisum
Cannelle Canelle Cinnamomum zeylanicum
Cumin Hâ Cumynum cyminum
Piment de Guinée* Kpédjlélékun Xylopia aethiopica
Anis étoilé Etoîle Illicium verum
Gingembre* Dotè Zingiber officinalis
Nom communs Noms locaux (Fon) Noms scientifiques
Clou de girofle* Atinkin Gbadotà Eugenia caryophyllus
Muscade Salikun Myristica fragrans
Oignon * Mansa ou ayomassa Allium cepa
Piment* Takin Capsicum sp
Poivre* Linlinkun Piper nigrum
Poivron Poivlon Capsicum annuum
Faux muscadier Sasagbakun Monodora myristica
Aneth Sokounnou Anethum gravealens
Thym Thein Thymus vulgaricus
Source : Akpo-Djènontin et al. (2016)
* : Epices les plus utilisées
1.6.2- Les herbes aromatiques couramment utilisées au Bénin
Les herbes aromatiques les plus utilisées au Bénin sont le basilic africain (Ocimum gratissimum) et le laurier (Laurus nobilis). La menthe (Mentha aquatic), le céléri (Apium graveolens) le thé de Gambie (Lippia multiflora) et le romarin (Rosmarinus officinalis) sont moins utilisés (Tableau 2) (Akpo-Djènontin et al., 2016).
Tableau 2: Herbes aromatiques régulièrement utilisées au Bénin.
Source : Akpo-Djènontin et al. (2016)
* : Herbes aromatiques les plus utilisées
Noms communs Noms locaux (Fon) Noms scientifiques
Basilic africain* Tchiayo / Tchioyo Ocimum gratissimum
Céléri Céléri Apium graveolens
Citronnelle Teaman Cymbopogon citrates
Laurier* Lauriéman Laurus nobilis
Menthe Manti Mentha aquatic
Persil Persil Petroselinum crispum
Romarin Romarin Rosmarinus officinalis
Thé de Gambie Aglala Lippia multiflora
1.7- Transformation des épices et des herbes aromatiques
Les épices et les herbes aromatiques sont utilisées sous plusieurs formes : fraîches ou séchées, moulues, mélange de plusieurs épices et herbes aromatiques (Akpo-Djènontin et al., 2016). Le procédé de transformation des épices et des herbes aromatiques, regroupe plusieurs opérations dont le triage, le séchage, le blanchiment, la mouture et le conditionnement (Figure 1) (Akpo- Djènontin et al., 2016).
Conditionnement
Mouture Conditionnement
Conditionnement
Conditionnement
Etiquetage
Piment en poudre conditionné
Triage
EHA triées EHA rejetées
Blanchiment
Séchage au soleil
Piment blanchi EHA séchées
Séchage au soleil Mouture Additifs
(Variables)
Piment séché EHA en poudre
EHA fraîches
EHA conditionnées en en sachets EHA en poudre conditionnées
en bouteilles de verre / sachets en plastique
Piment entier séché Additifs
Figure 1 : Procédé de transformation des épices et herbes aromatiques Source : Akpo-Djènontin et al. (2016)
EHA : Epices et Herbes aromatiques
1.8- Caractéristiques des souches étudiées 1.8.1- Bactéries
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus est une bactérie Gram positif, asporulée. Ce sont des coques aéro- anaérobie facultative, catalase positive, coagulase positive et halotolérant. C’est une espèce pathogène à l’origine des infections de la peau, les furoncles, les cellulites, les pneumonies etc.
Staphylococcus aureus produit des entérotoxines à l’origine des toxi-infections alimentaires (Houngbèmè, 2014).
Salmonella Typhi
Salmonella Typhi est une bactérie Gram négatif, aéro-anaérobie, asporulée, pathogène causant des infections et qui appartient à la famille des Entérobacteriaceae. Son pouvoir pathogène est dû à sa capacité entéro-invasive et la synthèse d’endotoxine (Boko, 2012).
Escherishia coli
E. coli est une bactérie Gram négatif, aéro-anaérobie facultative de la famille des Entérobacteriaceae. Le sérotype E. coli O157 : H7 produit des shigatoxines ou des vérocytotoxines à l’origine des diarrhées et colites hémorragiques (Dufour, 2008).
1.8.2- Champignons
Aspergillus versicolor
Aspergillus versicolor est une moisissure mésophile, filamenteuse connue pour être un contaminant des produits agricoles en champ ou en stockage. Il produit des métabolites secondaires toxiques, la stérigmatocystine. Cette toxine carcinogène, provoque des nécroses du foie et des reins chez les mammifères (Kwazou et al., 2009).
Penicillium sp
Les Penicillium sont des moisissures filamenteuses. Ces champignons sont responsables de nombreuses dégradations. Certaines espèces sont utilisées en industrie pour la fabrication fromage et la production de la pénicilline. Cependant, certaines espèces peuvent produire des mycotoxines très dangereuses (Nguefack et al., 2009).
Matériel et méthodes
2- Matériel et méthodes 2.1- Cadre de l’étude
L’extraction de l’huile essentielle des épices et des herbes aromatiques s’est déroulée au Laboratoire de Chimie Pharmaceutique et Chimie Organique de l’Unité de Formation et de Recherche (UFR) en Pharmacie de la Faculté des Sciences de la Santé (FSS) de l’Université d’Abomey-Calavi.
La préparation des extraits non volatils et le criblage phytochimique ont été effectués à l’Institut de Recherche et d’Expérimentation en Médecine et Pharmacopée Traditionnelle (IREMPT) du Centre Béninois de Recherche Scientifique et Technique (CBRST) à Porto- Novo.
Les tests antimicrobiens ont été réalisés dans le Laboratoire de Sciences des Aliments de la Faculté des Sciences Agronomiques (FSA) de l’Université d’Abomey-Calavi.
2.2- Matériel d’étude
Matériel végétal
Deux herbes aromatiques : les feuilles de basilic africain (Ocimum gratissimum), les feuilles de laurier (Laurus nobilis) et trois épices : le clou de girofle (Sygyzium aromaticum), le gingembre (Zingiber officinale), l’ail (Allium sativum) ont été utilisés pour cette étude. Les échantillons d’épices et d’herbes aromatiques objets de l’étude ont été achetés au marché de Dantokpa à Cotonou. Leur provenance et leur identité ont été confirmées par l’Herbier National.
Matériel biologique
Six souches microbiennes dont quatre souches bactériennes et deux souches fongiques ont été utilisées pour les essais. Il s’agit de Salmonella Typhi R 30951401, Escherichia coli O157:H7 ATCC 27844, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Penicillium sp et Aspergillus versicolor. Les souches bactériennes ont été fournies par le Laboratoire de Biologie et de Typage Moléculaire en Microbiologie de la Faculté des Sciences et Techniques (FAST) de l’Université d’Abomey-Calavi. Les souches fongiques ont été fournies par le Laboratoire de Microbiologie et de Contrôle de Qualité des Denrées Alimentaires de l’Université de Lomé.
2.3- Méthodes
2.3.1- Extraction des huiles essentielles et des composés non volatils
Prétraitement des épices et des herbes aromatiques
Les épices et les herbes aromatiques utilisées ont été séchées à l’ombre dans une salle à une température de 25°C ± 2°C pendant 14 jours (Bourkhiss et al., 2009 ; Noumi et al., 2011).
Avant le séchage, l’ail a été épluché et le gingembre découpé en de fines lamelles. Après séchage, ils ont été moulus à l’aide d’un broyeur de laboratoire. Les poudres d’épices et d’herbes aromatiques ainsi obtenues sont utilisées pour les différentes extractions.
Extraction des huiles essentielles
Dispositif d’extraction
L’extraction de l’huile essentielle des épices et des herbes aromatiques a été faite par hydrodistillation, à l’aide de l’appareil de type Clevenger. L’appareil comprend un ballon à fond rond, à col rodé reposant dans un chauffe ballon, un dispositif de condensation composé d’un réfrigérant avec un renflement en forme de boule permettant la décantation de l’huile essentielle et un robinet (Photo 6) (Pharmacopée Européenne, 2002).
Photo 6 : Dispositif d’extraction de type Clevenger
Chauffe ballon
Ballon contenant le matériel végétal Dispositif de condensation
Réfrigérant à boules
Robinet Bouchon
Renflement en forme de boule
Procédé d’extraction
Dans un ballon, 100 g de matière végétale sont immergés dans 200 ml d’eau distillée.
L’ensemble est porté à ébullition pendant environ 4 h et le distillat obtenu constitué d’huile essentielle et d’eau est transvasé dans une ampoule à décanter. Après décantation, on obtient deux phases : l’une organique (l’huile essentielle) et l’autre aqueuse. L’huile essentielle est recueillie à l’aide d’une pipette et pesée pour la détermination des rendements. L’huile essentielle obtenue est conservée à une température de 4°C dans un flacon en verre brun hermétiquement fermé (AFSSAPS, 2008).
Extraction des composés non volatils
L’extraction des principes actifs a été effectuée par macération. Cette opération a consisté à laisser la poudre du matériel végétal en contact avec le solvant pendant 72 h (Djeddi, 2012).
Trois types de solvants : le dichlorométhane, l’eau et le mélange eau-éthanol (50 : 50, v/v) ont été utilisés pour chacune des 5 échantillons, soit 15 extraits préparés.
Procédé d’extraction
Cinquante (50) g de poudre de chaque épice et herbe aromatique sont mises en solution dans 500 ml de solvant (eau-éthanol 96° ; 50:50, V/V) pour les extraits hydro-éthanoliques, eau pour les extraits aqueux et dichlorométhane pour les extraits au dichlorométhane). Le mélange est laissé sous agitation continue pendant 72 h et le macérât obtenu est filtré trois fois successivement sur du coton hydrophile. Ensuite, le filtrat a été évaporé à 40°C à l’aide d’un rotavapor pour les extraits au dichlorométhane. Les extraits hydroalcooliques et aqueux ont été séchés à 40°C à l’étuve. Le résidu obtenu est pesé pour la détermination du rendement d’extraction (Adjou et Soumanou, 2013).
Le rendement d’extraction (R) est exprimé en pourcentage par rapport à la matière sèche selon la formule suivante :
(%) = ⁄ × Avec :
Me = masse de l’extrait obtenu,
Ms = masse de poudre d’épices ou d’herbes aromatiques utilisée.
2.3.2- Caractérisation des huiles essentielles et des extraits non volatils
Criblage phytochimique des composants actifs des extraits
Le criblage phytochimique a été utilisé pour déterminer les principales classes de métabolites secondaires des épices et herbes aromatiques étudiées. C’est une analyse chimique qualitative basée sur des réactions de coloration ou de précipitation spécifique à chaque classe de principes actifs. Le criblage phytochimique a été réalisé selon la méthode décrite par Houghton et al. (1998). Les classes de métabolites suivants ont été recherchés à savoir :
Les alcaloïdes
Elle s’est faite grâce à deux tests :
Test général en milieu acide
A 5 g de poudre d’épices ou herbes aromatiques, on a ajouté 25 mL d’acide chlorhydrique dilué à 5%. Le mélange est macéré pendant 24 h. A 1 mL du filtrat recueilli, l’on a ajouté 5 gouttes de réactif de Mayer. En cas de présence d’alcaloïdes, on a observé un précipité jaune dans le tube.
Extraction des alcaloïdes
A 5 g de poudre d’épices ou herbes aromatiques, on a ajouté 5 mL d’ammoniaque à 50%. A ce mélange, l’on a ajouté 25 mL d’éther chloroformique et puis on a laissé macérer pendant 24 h dans un flacon muni d’un couvercle. Le filtrat est ensuite séché sur du sulfate sodique anhydre Au filtrat séché, on a ajouté 5 mL d’acide chlorhydrique à 5% et 5 gouttes de réactif de Dragendorff. En cas de présence d’alcaloïdes, on a observé un précipité orange dans le tube.
Les composés polyphénoliques.
Dans un erlenmeyer, on a introduit 5 g de poudre d’épices ou d’herbes aromatiques auxquels on a ajouté 100 mL d’eau distillée bouillante. Le mélange est laissé pendant 15 min sous agitation continue, puis filtré. Ce filtrat réparti en 6 portions a servi aux recherches ci-après :
Les tanins
A la première portion du filtrat, l’on a ajouté quelques gouttes de chlorure ferrique à 1%.
L’observation d’une coloration bleu-foncée, verte ou noire a indiqué la présence des tanins.
Les tanins catéchiques
A 30 mL de la seconde portion l’on a ajouté 15 mL de réactif de Stiasny, puis chauffé le mélange au bain-marie à 90°C pendant 15 min. L’apparition d’un précipité rose indique la présence des tanins catéchiques.
Les tanins galiques
Après récupération du filtrat, celui-ci a été saturé d’acétate sodique additionné de quelques gouttes de chlorure ferrique à 1%. Une teinte bleue ou noire a indiqué la présence de tanins galiques.
Les flavonoïdes
A 5 mL de la troisième portion, l’on a ajouté 5 mL d’alcool chlorhydrique et une pincée de poudre de magnésium : c’est la réaction de la cyanidine, dite réaction de Shinoda.
L’apparition d’une coloration orangée, rouge ou violette a indiqué la présence de flavonoïdes.
Les anthocyanes
L’on a additionné quelques gouttes d’acide chlorhydrique à 5% à 1 mL de la quatrième portion. Ce mélange est ensuite alcalinisé par ajout de quelques gouttes d’ammoniaque à 50%. Une coloration rouge qui s’accentue et vire au bleu-violacé ou verdâtre a indiqué la présence d’anthocyanes.
Les leucoanthocyanes
A 5 mL de la dernière portion, l’on a ajouté 5 mL d’alcool chlorhydrique. Le mélange est ensuite chauffé pendant 15 min au bain marie à 90°C. L’observation d’une coloration rouge cerise ou violacée a indiqué la présence de leucoanthocyanes.
Les dérivés quinoniques
Dans un erlenmeyer, on a mélangé 2 mL d’acide chlorhydrique à 5% et 2 g de poudre d’épices ou d’herbes aromatiques. A ce mélange, on a ajouté 20 mL de chloroforme et l’ensemble est laissé sous agitation continue pendant 24 h. Après macération, on a ajouté 5 mL d’ammoniaque au mélange : c’est la réaction de Born-Trager. Une coloration rose ou rouge violacée a indiqué une réaction positive.
Les saponosides
Un décocté de 1 g de poudre d’épices ou herbes aromatiques est préparé pendant 30 min dans 100 mL d’eau distillée sous ébullition modérée. Le filtrat est ensuite refroidi puis ajusté à 100 mL et réparti dans 10 tubes à essai en série géométrique à raison de 1/10ème de la concentration du décocté. Après ajustement à 10 ml avec de l’eau distillée et 30 agitations en 15 s, le tube est laissé au repos pendant 15 min. La hauteur de la mousse est mesurée. Si elle est ≥ 1 cm dans l’un des tubes, la dilution dans ce tube est l’indice de mousse cherché.
Les triterpénoïdes et les stéroïdes
Pour cette recherche, on a mélangé 1 g de poudre et 10 mL d’alcool éthylique à 70°C. A ce mélange, on a ajouté 10 mL d’eau distillée puis 2 mL d’acétate de plomb à 10% à volume égal (v/v). Après 15 min, 2 mL de solution de phosphate sodique à 10% sont ajoutés au filtrat. Le filtrat est ensuite recueilli dans une ampoule à décanter et extrait à trois reprises avec 5 mL de chloroforme (CHCl3). Les solutions chloroformiques sont séchées sur du sulfate de sodium puis divisées en deux portions :
la première portion est solubilisée avec quelques gouttes d’acide acétique. Au mélange obtenu, on a ajouté 3 mL d’un mélange d’anhydride acétique-acide sulfurique. L’apparition d’une coloration violette, bleue ou verte a indiqué la présence de triterpénoïdes.
à la deuxième portion, l’on a ajouté 2 gouttes d’une solution alcoolique d’acide dinitrobenzoïque et 2 gouttes d’hydroxyde de sodium à 1N. L’apparition d’une coloration rouge pourpre ou rouge au vin a indiqué la présence de stéroïdes.
Les dérivés cyanogéniques
A 15 mL d’eau distillée, on a ajouté 2 g de la poudre d’épices ou d’herbes aromatiques puis bouché immédiatement et laissé en macération pendant 1 heure. Le col de l’erlenmeyer est recouvert de papier imbibé d’acide picrique et on a chauffé pendant quelques minutes.
L’apparition d’une coloration marron a indiqué le dégagement de cyanure d’hydrogène.
Les mucilages
L’on a introduit 1 mL de décocté à 10% dans un tube à essai puis ajouté 5 mL d’alcool absolu. L’apparition d’un précipité floconneux a indiqué la présence de mucilage après 10 min.
Les coumarines
A 20 mL d’éther, on a ajouté 1 g de poudre d’épices ou d’herbes aromatiques puis bouché immédiatement l’erlenmeyer et laissé en macération pendant 24 h. Le filtrat a été ajusté à 20 mL avec l’éther. Cinq mL de filtrat ont été évaporés dans une capsule à l’air libre. Au résidu obtenu, on a ajouté 2 mL d’eau chaude et réparti la solution obtenue dans deux tubes à essai.
Dans l’un des tubes, l’on a ajouté 0,5 mL d’ammoniaque à 25%. Le second tube représente le témoin. On a observé ensuite la fluorescence des deux tubes à essai à 365 nm. Une fluorescence intense dans le tube test a indiqué la présence de coumarines.
Les composés réducteurs
Le décocté à 10% est obtenu par ébullition modérée pendant 3 min d’un mélange de 50 mL d’eau distillée et de 5 g de poudre. Après refroidissement, le filtrat est ajusté à 50 mL avec de l’eau distillée. Cinq mL de filtrat sont introduits dans un tube à essai. Après chauffage au bain-marie à 90°C pendant quelques minutes, l’on a ajouté 1 mL de réactif de Fehling (liqueur de Fehling A + liqueur de Fehling B à volume égal). Le filtrat est ensuite réchauffé pendant quelques minutes. L’observation d’un précipité rouge vif a indiqué la présence de composés réducteurs.
Les dérivés anthracéniques
Les anthracéniques libres
A 1 g de poudre, on a ajouté 10 mL de chloroforme et on a chauffé pendant 3 min au bain- marie à 90°C. Après filtration à chaud, le mélange est complété à 10 mL avec le chloroforme.
A 1 mL de l’extrait chloroformique, on a additionné 1 mL d’ammoniaque dilué à 1/2 puis agité. L’apparition d’une coloration rouge plus ou moins intense a indiqué la présence d’anthracéniques libres.
