Effet expérimental de la température sur le fractionnement et le turnoverisotopique chez Gammarus aequicauda (Martynov, 1931).

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Effet expérimental de la température sur le fractionnement et le turnover isotopique chez Gammarus aequicauda (Martynov, 1931).

Auteur : Valmalette, Romane

Promoteur(s) : Lepoint, Gilles; Michel, Loïc Faculté : Faculté des Sciences

Diplôme : Master en océanographie, à finalité approfondie Année académique : 2019-2020

URI/URL : http://hdl.handle.net/2268.2/9866

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Effet expérimental de la température sur le fractionnement et le turnover isotopiques chez

Gammarus aequicauda (Martynov, 1931).

Romane VALMALETTE

En vue de l’obtention du grade de Master en Océanographie, à

finalité.

Promoteurs : Dr Gilles LEPOINT et Dr Loïc MICHEL

Année : 2019-2020

Université de Liège Faculté des sciences

Département biologie, écologie et évolution Laboratoire océanographie biologique

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Remerciements

Au terme de la rédaction de ce mémoire, je tenais à remercier toutes les personnes qui m’ont aidé dans la réalisation de ce projet. Tout d’abord, merci au laboratoire d’océanographie de Liège de m’avoir accueilli au sein de son équipe et de m’avoir permis de réaliser ce projet.

Je tiens particulièrement à remercier le Dr. Gilles Lepoint, promoteur de ce mémoire, sans qui ce projet n’aurait jamais abouti. Je lui exprime ma plus grande gratitude pour sa confiance, sa patience, ses nombreux conseils, son implication dans ce travail et sa gestion dans ce contexte si particulier de crise sanitaire. Sans lui, aucune manipulation n’aurait été portée à terme.

Je voudrais également remercier Dr Loïc Michel, co-promoteur de ce mémoire, pour sa patience, ses conseils et son aide, notamment dans lors du traitement des données. A Mr Cédric Delforge également, technicien du laboratoire d’océanographie, pour sa gentillesse et son montage du dispositif de respirométrie. A Mlle Mathilde Godefroid, doctorante à l’Université Libre de Bruxelles, pour ses explications sur le principe de la respirométrie.

De plus, je remercie toute la promotion de Master océanographie qui m’a accueillie chaleureusement, soutenu dans mon travail et avec qui j’ai partagé des moments inoubliables.

Enfin, je tiens à remercier ma famille et mon compagnon, qui m’ont soutenue pendant toutes mes années d’étude.

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Table des matières

Remerciements ... 1

Résumé ... 4

Avant-propos ... 5

Introduction ... 6

I- Fractionnement et turnover isotopique ... 6

1) Isotope stable ... 6

2) Fractionnement isotopique ... 6

3) Turnover ... 10

4) Métriques biologiques (métabolisme, oxygène, taux de survie) ... 11

II-Description de l’espèce étudiée : ... 11

1) Systématique ... 11

2) Biologie de l’espèce... 12

3) Ecologie de l’espèce ... 14

4) Influence de la température ... 17

5) Intérêt d’utilisation des gammares comme matériel biologique ... 18

III- Objectif de l’étude ... 18

Matériels et méthodes ... 19

1) Matériel biologique ... 19

2) Design expérimental ... 19

3) Isotope stable ... 21

4) Analyses de respirométrie ... 22

5) Traitement des données ... 25

Calcul du turnover isotopique... 25

Calcul du fractionnement isotopique ... 25

Tests statistiques ... 26

Résultats ... 27

1) Mortalité ... 27

2) Données isotopiques ... 28

Composition de la nourriture ... 28

Rapport C/N... 29

Compositions isotopiques et turnovers ... 30

Fractionnements et turnover isotopiques ... 34

3) Respirométrie ... 35

4) Relations isotopie-biologie ... 36

Sexe vs compositions isotopiques ... 36

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Masse vs compositions isotopiques ... 36

Discussion ... 39

Protocole et méthodologie ... 39

1) Choix du Krill E. superba ... 39

2) Coprophagie et cannibalisme ... 40

Influence de la température ... 41

1) Facteur d’enrichissement trophique (TEF) ... 41

2) Optimum de température ... 45

Conclusion... 49

Annexes ... 51

Bibliographie ... 52

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Résumé

Cette étude vise à mettre au point un protocole expérimental afin d’observer l’influence de la température sur les compositions isotopiques chez Gammarus aequicauda (Martynov, 1931) et ainsi améliorer les connaissances sur les variations de fractionnement et turnover isotopiques du carbone, de l’azote et du soufre chez cette espèce. Pour cela, les gammares ont été élevés à quatre températures différentes : 15.5, 21.5, 25.2 et 27.5°C, pendant 4 à 8 semaines selon le traitement thermique et nourris au krill Euphausia superba. La variabilité de la composition et des fractionnements isotopiques du krill montre que la nourriture est influencée par la température. De plus, la température modifie significativement les valeurs de Δ¹³C, Δ¹⁵N et Δ³⁴S chez G. aequicauda, témoignant les modifications physiologiques des amphipodes selon la température. Notre expérience a montré que l’optimum de température chez cette espèce est à environ 20°C. En effet, une augmentation du taux de respiration, de la croissance et donc du taux d’assimilation et d’excrétion des individus a été observé jusqu’à 25.2°C, température critique au-delà de laquelle les gammares luttent contre le stress thermique. Ses résultats prouvent que G. aequicauda est une espèce idéale dans ce cadre expérimental de par sa résistance et sa sensibilité face aux variations thermiques. Toutefois, il est nécessaire d’améliorer le protocole expérimental pour permettre de confirmer nos hypothèses, en réduisant les incertitudes des mesures liées notamment à la source alimentaire.

This study aims to develop an experimental design to observe the effect of temperature on isotopic composition of G. aequicauda (Martynov, 1931), and also enhance our knowledges about discrimination factor and isotopic turnover of carbon, nitrogen and sulfur for this species. For that, G.

aequicauda were reared under four temperatures: 15.5, 21.5, 25.2 et 27.5°C, for 4 to 8 weeks depending on the thermal treatment, and were fed with krill Euphausia superba. The variability of krill’s discrimination factors shows that the source food of Gammarids is affected by temperature.

Moreover, the temperature significatively modify the Δ¹³C, Δ¹⁵N and Δ³⁴S values of G. aequicauda attesting to physiological modifications on amphipods according to temperature. A thermal optimum at 20°C was shown in our study. Indeed, an increasing of respiration rate, growth and also assimilation and excretion rate were observed until 25.2°C, critical temperature beyond which Gammarids struggles against heat stress. These results demonstrate that G. aequicauda is a great species for this kind of study because of its good resistance and sensibility facing thermal variations. However, the experimental design must be improved to confirm our hypothesis by reducing uncertainties about food sources.

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Avant-propos

Les analyses isotopiques sont régulièrement utilisées en écologie, notamment en écologie trophique, puisque la composition isotopique d’un consommateur reflète la composition isotopique de son régime alimentaire. Cependant, les isotopes stables vont réagir de manière différente lors des réactions physico-chimiques métaboliques à cause de leur différence de masse atomique. Le résultat de cette différence est appelé fractionnement isotopique et correspond à la différence de compositions isotopiques des tissus d’un animal et celles de sa nourriture. L’étude du fractionnement et du turnover isotopique (ou renouvellement des tissus) est essentielle pour comprendre : les interactions entre des consommateurs et leur régime alimentaire, le métabolisme d’un organisme, les différentes voies métaboliques, etc.

L’utilisation de l’espèce Gammarus aequicauda est courante dans les études en écologie, notamment pour les études concernant les herbiers de Posidonia oceanica. Grâce à la plasticité écologique de ces amphipodes face aux paramètres abiotiques, sa facilité d’élevage et son abondance dans les milieux naturels, G. aequicauda est régulièrement utilisée en écotoxicologie, en écologie ou en aquaculture comme une espèce modèle.

Le but de nos expériences est de mieux comprendre les variabilités des fractionnements et turnovers isotopiques du carbone, de l’azote et du soufre chez G.

aequicauda et d’apporter de nouvelles connaissances dans l’utilisation des isotopes stables en écologie trophique.

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Introduction

I- Fractionnement et turnover isotopique 1) Isotope stable

Les isotopes sont des éléments chimiques de même nature ayant un nombre différent de neutrons dans le noyau, ce qui induit une différence de masse atomique. Cette différence de masse n’induit aucune modification des caractéristiques physico-chimiques générales mais influe sur la vitesse de réaction dans lesquelles sont impliqués les isotopes. Les isotopes sont dits stables lorsqu’ils ne se désintègrent pas au cours du temps (non radioactifs) (Peterson and Fry, 1987). Les principaux isotopes utilisés dans les études en écologie trophique sont les isotopes du carbone, de l’azote et du soufre. La différence de masse entre ces isotopes et la variation de leur comportement lors des réactions vont encourager une différence de composition isotopique entre les différents compartiments biologiques. Les analyses isotopiques sont des outils très intéressants pour étudier : les sources d’énergies et les relations trophiques entre les organismes d’un écosystème (DeNiro and Epstein, 1978, Adams and Sterner, 2000, McCutchan et al., 2003, Newsome et al., 2007), pour connaitre les régimes alimentaires des organismes (Tieszen et al., 1983, Caut et al., 2009, Bunn et al, 2013), pour observer les stratégies alimentaires au cours des saisons (Bosley et al., 2002), pour évaluer la santé d’un écosystème (Layman et al., 2007), comme traceur écologique (Lepoint et al., 2004), comme biomarqueur pour évaluer la contamination d’un milieu par un polluant (Zhu et al., 2016) ou pour étudier l’habitat d’un organisme (Sherwood and Rose, 2005, Como et al., 2012).

2) Fractionnement isotopique

La composition isotopique d’un consommateur reflète la partie assimilée de son régime alimentaire. Pendant un repas, la nourriture sert de ressource énergétique et, lors d’un transfert énergétique dans le corps du consommateur, de nombreuses réactions chimiques ont lieu. Le fractionnement isotopique est la différence entre les comportements d’un ou plusieurs isotopes lors d’une réaction physico-chimique ou biochimique, due à la différence de masse entre les différents isotopes d’un élément chimique. En effet, l’énergie de liaison entre deux isotopes lourds est plus importante qu’entre deux isotopes légers. La demande énergétique

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nécessaire à former ou dissocier des molécules contenant des isotopes lourds sera plus importante qu’avec des molécules contenant des isotopes légers (DeNiro and Epstein, 1978).

L’utilisation des isotopes stables repose sur le fait que ces processus de fractionnement, multiples et divers, induisent des changements de compositions isotopiques au sein de la matière organique. Ces changements de compositions peuvent potentiellement permettre de distinguer isotopiquement différentes sources de nourriture d’un animal. La composition isotopique d’un consommateur étant, entres autres, le résultat du mélange isotopique pondéré de ces sources de nourriture, il est parfois possible de retracer le régime alimentaire grâce à l’analyse isotopique du carbone, de l’azote et du soufre. Le métabolisme, variable selon les organismes, est également un processus induisant des changements de la composition isotopique entre les tissus d’un animal et sa nourriture. On note Δ l’écart relatif des rapports isotopiques entre les tissus d’un animal et sa nourriture. Ce delta correspond au résultat net de l’ensemble de processus de fractionnement ayant lieu au sein d’un organisme et est nommé facteur d’enrichissement trophique (Trophic enrichment factor ou TEF). Si Δ est négatif alors le résultat net de fractionnement est en faveur de l’isotope léger, on dit alors qu’il y a un enrichissement en isotope léger. Si Δ est positif alors le résultat net des fractionnements est en faveur de l’isotope lourd (Fry, 2006, Tcherkez, 2010). L’étude de ces TEF est essentielle à l’application des isotopes stables en écologie trophique et fait l’objet du présent travail.

Le fractionnement isotopique peut être variable selon les organismes, leur milieu de vie, leur régime alimentaire, leur âge et stade de croissance, les tissus que l’on étudie, etc. Tous ces paramètres influencent notamment le métabolisme et les voies cataboliques chez un consommateur.

a/ Isotopes du carbone

Le carbone existe sous deux formes isotopiques stables : ¹²C et ¹³C. Le carbone est principalement présent sous forme ¹²C (à 98,89%) contre 1.11% sous forme ¹³C. L’étude des isotopes du carbone permet de connaitre le régime alimentaire d’un organisme, de déterminer les sources de production primaire et la/les source(s) en carbone d’un organisme. On observe généralement un faible enrichissement en ¹³C (noté Δ¹³C) le long de la chaîne alimentaire, de l’ordre de 0-1‰ (DeNiro and Epstein, 1978). Cet enrichissement peut être différents entre les organismes, notamment chez les herbivores et omnivores, à cause de la variabilité des

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ressources végétales. La photosynthèse est le processus chimique qui intègre le carbone à la base de la chaîne trophique. Mais les organismes autotrophes peuvent utiliser différentes sources de carbone. Par exemple, les plantes C3 marines utilisent principalement les bicarbonates comme source de carbone. Or les bicarbonates ont des valeurs de ¹³C plus haute que celle du CO2 dissous (DeNiro and Epstein, 1978, Lepoint et al., 2004, Fry et al., 2006).

De plus, les variations de cet enrichissement en ¹³C peuvent être liées à la biologie et à la physiologie des organismes. Par exemple, les invertébrés avec un squelette carbonaté ont une composition isotopique du carbone typique du fait de l’utilisation préférentielle du ¹²C pour la fabrication de leurs carbonates. C’est pourquoi la valeur de Δ¹³C de ces organismes est plus faible que celle de la plupart des autres organismes (McCutchan et al., 2003). Il a également été montré que la valeur de Δ¹³C a tendance à augmenter avec l’âge de l’organisme (De Niro and Epstein, 1978). Il existe également une différence de composition isotopique entre les différents types de tissus d’un organisme, à cause, d’une part, de leurs différentes compositions moléculaires, mais aussi des différentes voies métaboliques nécessaires à leur synthèse. Par exemple, les lipides sont appauvris en ¹³C par rapport aux protéines et aux carbonates. C’est pourquoi les poils (i.e. kératine) ont une valeur de δ¹³C plus haute que celle du cerveau, du muscle, du foie et que la graisse montre une valeur de δ¹³C la plus basse (McCutchan et al., 2003, Tiezen et al., 1983).

b/ Isotope de l’azote

L’azote existe sous deux formes isotopiques stables : ¹⁴N et ¹⁵N. L’azote est principalement présent sous forme ¹⁴N (99,64%) contre seulement 0,36% sous forme ¹⁵N.

L’étude des isotopes de l’azote permet de déterminer : les différences sources de nourriture d’un consommateur, la position trophique d’un organisme ou d’une population dans un réseau alimentaire, le taux d’assimilation de l’azote par un consommateur. On observe un enrichissement en ¹⁵N (noté Δ¹⁵N) le long de la chaine trophique de l’ordre de 3 à 4‰

(Layman et al., 2012). Le fractionnement isotopique de l’azote chez un consommateur est principalement dû aux phénomènes d’excrétion/assimilation. Comme l’excrétion est en faveur des isotopes légers, le consommateur sera enrichi en isotopes lourds. Cet enrichissement est variable selon les consommateurs et leur mécanisme d’excrétion et d’assimilation. Par exemple, les organismes ammonotéliques montrent une valeur de Δ¹⁵N inférieure à celle des organismes urotéliques (Vanderklift and Ponsard, 2003). Il a également été observé qu’une

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valeur plus grande de Δ¹⁵N peut attester d’une faible qualité nutritionnelle des ressources alimentaires consommées (Adams and Stener, 2000). En effet, chez Daphnia magna, une nourriture de faible qualité nutritionnelle induit une digestion, assimilation, une croissance et un turnover isotopique plus lent, ce qui mène au catabolisme des protéines et une forte perte de ¹⁴N par excrétion. En revanche, chez certains macrodétritivores, ce Δ¹⁵N est limité, montrant une absence de fractionnement lorsque la nourriture est particulièrement pauvre en azote (Vanderklift and Ponsard, 2003), comme les feuilles mortes de posidonies (Remy et al., 2017). L’enrichissement en azote varie également selon l’état physiologique des organismes.

Lors d’une période de jeun, la balance apport azoté/excrétion est déséquilibré et la perte de

14N par excrétion n’est plus compensée par l’apport azoté d’un repas. Alors, la valeur de Δ¹⁵N sera de plus en plus proche d’une valeur de TEF du recyclage de déchets (Adams and Stener, 2000).

c/ Isotope du soufre

Le soufre existe principalement sous quatre formes isotopiques stables : ³²S (95.02%), ³⁴S (4.21%), ³³S à (0.75%) et ³⁶S à (0.02%) (Jardine et al., 2005). L’étude des isotopes du soufre permet de comprendre le régime alimentaire d’un organisme et de déterminer les sources de soufre à la base des chaines trophiques. En effet, le rapport isotopique du soufre varie considérablement entre les producteurs primaires mais semble peu changer le long de la chaîne trophique. Néanmoins, plus un consommateur a un régime alimentaire riche en soufre organique, plus l’enrichissement isotopique en soufre sera important. Mais il semblerait que la relation entre consommation et enrichissement en ³⁴S ne soit pas linéaire et que le Δ³⁴S varie en fonction de la composition en protéines des différentes ressources d’un régime alimentaire (McCutchan et al, 2003). Les analyses isotopiques du soufre permettent également de distinguer à quel l’environnement appartient un organisme. En effet, les puits de soufre dans les écosystèmes varient fortement d’un milieu benthique à un milieu pélagique ou d’un milieu marin à terrestre. Cette composition isotopique du soufre se reflète chez les organismes (Layman et al., 2012). Les valeurs de δ³⁴S des végétaux aquatiques sont plus élevées que celles des végétaux terrestres (entre 2‰ et 6‰) (Peterson and Fry, 1987).

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3) Turnover

Un organisme vivant accumule de l’énergie par le biais de l’alimentation. Pour maintenir son métabolisme basal et avoir une croissance optimale, il lui est nécessaire de s’alimenter.

On peut définir trois métabolismes (ou processus énergétiques) principaux : 1-l’assimilation (de la nourriture aux réserves), 2- la dissipation (des réserves aux organes actifs), et 3- la croissance (des réserves aux cellules). Chacun de ces flux métaboliques sont régulés par des processus cataboliques et anaboliques. Les réactions cataboliques mènent à un fractionnement isotopique généralement en faveur des isotopes légers. C’est pourquoi les réserves sont enrichies en isotopes lourds. L’augmentation du métabolisme basal et des réserves énergétiques permettent d’augmenter le turnover. Le turnover (ou renouvellement tissulaire) est mesuré par le taux avec lequel la composition isotopique de la nourriture est incorporée dans les tissus du consommateur. C’est la somme des croissances et du catabolisme tissulaire.

L’étude du turnover dans les analyses isotopiques donne des renseignements temporels sur le régime alimentaire, mais aussi sur la vitesse de croissance et du métabolisme d’un organisme.

Le TEF est lié au turnover par le biais du taux de croissance, qui reflète directement l’état des réserves énergétiques et donc de l’alimentation (Lefèvre and Dubois, 2016, Franssen et al., 2016). Par exemple, le Δ¹⁵N des animaux en croissance est inférieur à celui des animaux en faible croissance ou à croissance stagnante (Xia et al., 2013).

Le turnover est variable selon le tissu étudié : le turnover du foie est plus rapide que celui du muscle ou de la fourrure. Cela signifie que l’étude isotopique du foie donnera une information sur les quelques jours précédant l’étude, tandis que l’analyse du muscle donnera des informations sur une plus longue échelle temporelle. C’est pourquoi l’étude d’un tissu à faible turnover peut être nécessaire pour comprendre le régime alimentaire d’un organisme sur le long terme, même après un changement d’alimentation (Tiezen et al., 1983). Le turnover est également fortement impacté par les paramètres environnementaux. On a observé une influence significative de la saisonnalité, corrélée avec des changements de température et de régime alimentaire. Par exemple, les turnovers chez les arthropodes sont plus rapides à haute température. Chez les ectothermes, le turnover est généralement plus lent due une demande en énergie plus faible et des réactions biochimiques réduites par rapport aux endothermes (Bosley et al, 2002).

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4) Métriques biologiques (métabolisme, oxygène, taux de survie)

Les mesures de métabolisme reflètent le taux de croissance et l’activité interne de l’organisme. Chez les gammares, on observe des différences de taux métaboliques entre les espèces, d’une part liée à la différence intraspécifique de l’osmorégulation et donc des conditions environnementales comme la salinité, mais liées également aux différentes stratégies de ventilation et de respiration des organismes qui sont liées aux variations de température (Prato and Biandolino, 2009). En effet, la température a tendance à faire augmenter la consommation d’oxygène d’un organisme. L’espèce Gammarus aequicauda semble avoir un métabolisme standard plus élevé que l’espèce Gammarus insensibilis, mais plus bas que l’espèce cousine d’eau douce Gammarus pulex (Shokri et al., 2019). Les mesures de respiration, soit la consommation en oxygène, peuvent donc refléter le métabolisme d’un organisme. En effet, chez les crustacés, la synthèse de protéine est le processus énergétique le plus important dans la consommation en oxygène (Whiteley et al., 2001). L’activité respiratoire et la consommation en oxygène sont des métriques facilement mesurables en laboratoire et permettent d’avoir une bonne estimation du métabolisme de l’animal testé.

II-Description de l’espèce étudiée : 1) Systématique

Gammarus aequicauda (Martynov 1931) est un amphipode appartenant à la famille des gammaridae. Les gammares sont reconnaissables à la forme de leur corps arqué et comprimé latéralement, leur donnant une allure de petite virgule (Bellan-Santini et al., 1982). G.

aequicauda est une espèce présente dans le bassin méditerranéen depuis la formation du Parathétys (Hupalo et al., 2019). Elle est commune dans divers environnements côtiers méditerranéens, y compris des eaux saumâtres ou au contraire hyper saline. G. aequicauda est très proche morphologiquement de G. insensibilis dont elle se distingue par la présence de pigmentation dorsale, d’une asymétrie des somites de l’urosome et de la taille des soies qui sont toujours plus longues que les épines (Janssen et al., 1979). Ces deux espèces proviendraient de la même lignée phylogénétique ayant progressivement divergée due aux phénomènes d’allopatrie au cours de la formation de la Méditerranée et de la Mer Noire au

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début du Miocène, mais également à cause de la dispersion limitée des larves et des juvéniles (Hupalo et al., 2019, Bianchi et al., 2012).

2) Biologie de l’espèce

a/Morphologie

Gammarus aequicauda est un animal de petite taille (environ 15 mm au stade adulte).

Comme chez tous les malacostracés, le corps est décomposé en trois parties distinctes (Figure 2) : la première partie est délimitée par la tête composée d’un acron et de cinq métamères. La deuxième partie appelée péréion est segmenté en huit métamères. La troisième partie, le pléon, est composée de six métamères et d’un telson. Les antennules et les antennes, plus petites que les antennules, sont portées par l’acron, ainsi que deux yeux non pédonculés. Les gammares possèdent deux types de pattes : des pattes locomotrices et les gnathopodes servant à la reproduction et/ou à la nutrition. On retrouve deux types de pattes locomotrices chez les amphipodes nommées selon leur insertion sur le corps. Les gammares sont munis de cinq paires de péréiopodes qui servent, d’une part, à se mouvoir dans l’eau, mais également à respirer en créant un courant d’eau au travers des branchies, et de cinq paires de pléiopodes portées par le pléon. Chez G. aequicauda, les appendices sont porteurs d’épines et de soies.

Figure 1 : Photos de deux spécimens de Gammarus aequicauda observés à la loupe binoculaire, grossissement x10. A gauche : mâle adulte, à droite : femelle adulte.

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On peut également distinguer chez cette espèce une légère pigmentation rouge sur certaines parties du corps (Bellan-Santini et al., 1982).

b/Croissance

Il n’y a pas de phase planctonique chez les gammares. Les juvéniles sont incubés par la femelle dans une structure spéciale appelée marsupium. Lorsque les juvéniles sont libérés dans le milieu, ils mesurent entre 1.1 et 1.3mm de long. Après seulement 24-48h, les juvéniles muent pour la première fois. Leur deuxième mue se déroule au 5^ème jour du cycle de vie, la troisième, le 9-10^ème jour, puis continue à la même fréquence jusqu’à leur 5^ème mue. Le 20^ème jour, les gammares ont une taille comprise entre 2.2 et 2.5mm. Après ce stade, il est très compliqué d’observer les phénomènes de mue puisque les exuvies sont très rapidement consommées. Il a été démontré que la croissance chez les gammares n’est pas strictement linéaire : le taux de croissance est plus rapide pendant le stade juvénile puis ralentit après un point de cassure défini comme le moment de la maturité sexuelle de l’individu (Longo et al., 2016). Ce point de cassure serait aux alentours du 90^ème jour du cycle de vie chez G.

aequicauda, où le taux de croissance atteint les 0.21mg/jour (Porcu et Tachliasacchi-Masala, 1983). Une fois mature sexuellement, les gammares peuvent entamer les processus de

Figure 2 : Schéma d'un gammare mâle appartenant à l'espèce Gammarus aequicauda. ant : antennule, Ant : antenne, Gn : gnathopode, Exp : exopodite, Per : péréiopode, Plp : pléiopode, T : telson, Ur : uropode. Les métamères sont numérotés selon les trois parties du corps. Le péréion est entouré de bleu, le pléon est entouré de mauve.

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reproduction. Chez l’espèce G. aequicauda, les mâles font environ 14.5mm, tandis que les femelles, légèrement plus petite, font environ 12mm.

d/Dimorphisme sexuel et reproduction

On peut remarquer un dimorphisme sexuel important chez les gammares. Premièrement, les femelles sont généralement plus petites que les mâles comme décrit précédemment. Chez G. aequicauda, il semblerait également que les femelles aient moins de soies que les mâles.

D’un point de vue morphologie, on peut observer plusieurs organes spécifiques à la reproduction. Contrairement à la femelle, le mâle possède un calcéole, petit élément des antennes servant au toucher, à la chémoréception des hormones et à la détection d’onde (Figure 1). Cette pièce sensitive est essentielle pour la recherche active du partenaire sexuelle pendant les périodes de reproduction. De plus, chez les mâles, les gnathopodes sont plus développés puisque ces appendices, munis d’une épine (Figure 1), servent à s’accrocher au thorax de la femelle pendant les périodes pré copulatoires. Cette période pré copulatoire s’observe par des comportements d’amplexus. En effet, les femelles ne sont propices à la fécondation qu’à un court lapse de temps après le processus de mue. Pour que la fécondation soit un succès, les mâles doivent donc former un amplexus avec la femelle. Pendant toute cette période pré copulatoire, le mâle ne se nourrit plus et focalise son énergie sur la nage. La femelle, quant à elle, doit se nourrir et se défendre des attaques des mâles libres. Les œufs sont produits par la femelle pendant la période d’inter mue, lorsque l’oviducte est le plus flexible. Ils sont fécondés par le mâle ce qui met fin à l’amplexus. Les œufs sont ensuite incubés dans la chambre incubatrice de la femelle pendant toute la durée du développement.

Grâce à cette chambre incubatrice située entre ses pattes antérieures, les femelles assurent un gardiennage des œufs améliorant leur succès reproducteur (Janssen et al., 1979, Bellan- Santini et al., 1982, Prato et al, 2013).

3) Ecologie de l’espèce

a/Habitat

Gammarus aequicauda est largement répandu en mer Méditerranée et en Mer Noire, mais également sur les côtes Atlantiques (Christodoulou et al., 2013, Remy et al.2017). On le

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retrouve principalement dans les eaux marines à saumâtres, au niveau de la zone intertidale (de 0 à 20 m) et est abondant dans les eaux peu profondes là où la nourriture est accessible.

Ces amphipodes sont des espèces dites euryhalines, soit des espèces vivant dans des environnements de salinité très variable, y compris des eaux hyper salines ou saumâtres.

Néanmoins, il a été montré que la température agissait sur la tolérance de G. aequicauda face à la salinité. Plus les températures sont élevées, moins les individus seront tolérants à des salinités élevées (Sornom et al., 2010). On les trouve aussi bien en milieux eutrophes (lac saumâtres, estuaires) qu’en milieux côtiers oligotrophes (Prato et Biandolino, 2009, Hupalo et al., 2019).

b/Dynamique des populations

La dynamique de la population chez G. aequicauda est saisonnière. Le cycle de vie de cette espèce est donc fortement lié aux deux facteurs abiotiques de la photopériode et de la température (Sutcliffe, 2010). Au printemps, la population est constituée d’adultes de grande taille, chargés en réserves lipidiques, et de quelques juvéniles. Cette saison marque le début de la première période de reproduction de l’année. Les gammares sont des espèces itéropares et le nombre de cycles reproductifs par femelle est corrélé avec la taille de celle-ci. En été, la cohorte des juvéniles produite lors des reproductions de printemps atteint sa maturité sexuelle.

Leur cycle de vie est court et accéléré par la hausse des températures estivales. En été, la population de gammare est donc composée d’individus plus petits, avec une majorité de femelles et ce jusqu’en automne, saison qui correspond à la deuxième grande période de reproduction. Alors, au début de l’hiver, la population de gammare est composée d’individus de petite taille, avec une majorité de mâles. Ces individus vont grandir tout au long de l’hiver en stockant des réserves lipidiques jusqu’à obtenir leur taille maximale au début du printemps pour recommencer un nouveau cycle de reproduction. Pendant les périodes hivernales, la reproduction continue mais au ralenti. Chez certains gammares, le métabolisme reproducteur se met en diapause. Le cycle de reproduction est donc clairement influencé par les saisons, puisque c’est le prolongement de la photopériode et la hausse des températures qui déclenche la sortie en diapause (Janssen et al., 1979, Neuparth et al., 2002, Pöckl et al., 2003, Prato et al, 2003, Stucliffe, 2010).

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c/Régime alimentaire

Les gammares ont en général une grande plasticité de régime alimentaire. Ils sont herbivores, omnivores, carnivores et/ou détritivores. Ils occupent l’un des maillons principaux de la chaine alimentaire. C’est le cas de l’espèce G. aequicauda. Cette espèce est présente dans les herbiers méditerranéens et, surtout, dans les accumulations de macrophytodétritus.

Dans ces environnements, G. aequicauda se nourrit de Posidonia oceanica (phanérogame marine) morte, de macroalgues, mais également des épiphytes et de l’épifaune présente sur les plantes ou algues marines. Dans ces milieux, les gammares jouent un rôle clé dans le transfert de la matière organique de l’herbier aux niveaux tropiques plus élevés (Mancinelli and Rossi, 2002, Lepoint et al. 2006, Remy et al., 2017). En effet, les décomposeurs améliorent la qualité de la nourriture puisqu’ils réduisent le rapport carbone /nutriments et diminuent ainsi l’effet du « nutriment-limitant » dans le système marin (Cross et al., 2005). Il a été montré que l’espèce d’eau douce G. pulex possède des enzymes endogènes digestives dans l’hépatopancréas capables de dégrader la cellulose et les composés phénoliques très résistants à la digestion. Chez cette espèce, contrairement à d’autres détritivores, les enzymes sont endogènes et ne résulte pas d’endosymbiontes ce qui prouve que les gammares sont adaptés à la dégradation de la litière (Zimmer et Bartholmé, 2003). Il est envisageable que G.

aequicauda possède également ces capacités digestives en l’absence d’endosymbiose, régulées par les cycles de mues (Trevisan et al., 2014). De plus, il a été observé que les amphipodes détritivores préfèrent consommer de la nourriture ayant déjà été colonisée par une communauté bactérienne puisque ces dernières dégradent la cellulase et les composés phénoliques ce qui rend la nourriture plus attractive pour les gammares (Zimmer et al., 2003).

L’espèce G. aequicauda peut également être carnivore. Shadrin et al. (2020) ont montré que G. aequicauda consommait quotidiennement des proies animales, comme le cladocère Moina salina ou d’autres crustacés, dans des environnements en présence ou l’absence d’herbiers marins, et participe au contrôle de ces populations.

Il a également été observé chez les amphipodes de nombreux comportements de cannibalisme et de coprophagie. Les proies animales enrichies en matière lipidique et protéique sont de meilleure qualité nutritive et permettent une meilleure croissance des consommateurs. La coprophagie chez les gammares occupe une place très importante dans le comportement alimentaire. Cela permet de compenser la faible qualité nutritionnelle de la litière en ingérant des aliments plus digestes. La coprophagie permet aussi d’accélérer le cycle

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biologique grâce à la reminéralisation rapide des nutriments dans le milieu (Zimmer and Topp, 2002).

4) Influence de la température

La température est considérée comme un des paramètres essentiels dans le fonctionnement des processus physiologiques comme la respiration, le métabolisme, la croissance, la fécondité et affecte aussi la survie de l’individu, des populations, de la biodiversité et de la biogéographie d’une espèce. Les gammares sont des organismes ectothermes ; ils sont donc sensibles à la variation de température. Malgré une certaine plasticité thermique, leur métabolisme est négativement modifié face à des hausses de températures trop forte. Des températures trop importantes provoquent une hausse des mortalités, de l’activité de ventilation et de locomotion, de la demande en oxygène, une diminution de la fécondité et donc un déséquilibre du compromis survie/reproduction (Wijnhouen et al., 2003, Maazouzi et al., 2011, Rotvit et Jacobsen, 2013, Foucreau et al., 2015, Semsar-Kazerouni et Verberk, 2018). Il en est de même pour des températures trop faibles vont retarder, voire stopper, le cycle reproducteur, l’alternance saisonnière de l’entrée en dormance et le métabolisme interne (Issartel et al., 2005). Chez G. aequicauda, l’optimum de température est situé entre 18 et 20°C (Prato et al., 2008).

De nombreux processus d’adaptation ont été observés chez les gammares. Par exemple, les espèces de gammares vivants dans les régions polaires produisent plus d’ions actifs transporteurs de protéines, ce qui provoque une hyper–osmorégulation (Rastrick and Whiteley, 2013). Dans les régions froides, les gammares ont également une composition chimique plus riche en carbone que les gammares des régions tempérées qui est directement lié à leur enrichissement en lipide (Ikeda, 2013). A l’opposé, l’acclimatation à des températures plus chaudes permet aux gammares de mieux supporter les hausses de température, d’avoir une demande oxygène plus basse et de mieux supporter le manque d’oxygène (Sensar-Kazerouni and Verberk, 2018). Ces observations peuvent indiquer une stratégie écologique des gammares face à la variation de la température, et permettrait de prédire la survie de ces espèces face au changement climatique global.

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5) Intérêt d’utilisation des gammares comme matériel biologique

Les G. aequicauda sont des espèces présentes en abondance en faibles profondeurs et faciles à prélever dans le milieu naturel. Il est également facile d’en élever en laboratoire grâce à leur plasticité écologique et leur cycle de vie assez court (de l’ordre de quelques mois). De plus, les gammares sont résistants à la pollution et aux situations de stress tout en y restant sensibles. C’est pour ces raisons que les amphipodes sont utilisés dans la recherche en toxicologie et en écotoxicologie, et en particulier G. aequicauda pour les expériences en milieux saumâtres, marins et hyper salins, et peuvent également être utilisés comme bioindicateurs dans le monitoring côtier (Porcu et Tagliasacchi-Masala, 1983, Kunz et al., 2016). Par exemple, des études ont été menées sur des populations de gammares en laboratoire pour comprendre l’influence de la contamination du milieu par le cuivre. Il semblerait que le cuivre ait un effet négatif sur la croissance, la reproduction et la respiration des gammares, qui semblent être ralenties et retardées. Par exemple, le cuivre interfère dans l’osmorégulation dans les branchies ce qui réduit la capacité respiratoire (Kedwards et al., 1996). Néanmoins, les observations montrent que les gammares sont capables de résister grâce à des mécanismes de détoxification au niveau de leur cellules hépatiques (Correira et al, 2002, Prato et al, 2008, Prato et al., 2013, Dalhoff et al., 2018). D’autres polluants ont également induit une réduction de l’activité enzymatique, aussi influencée par la température, et provoque alors une diminution du comportement de nourrissage (Dedourge-Geffard et al., 2009).

III- Objectif de l’étude

Les gammares sont des espèces très étudiées à ce jour. Leur biologie, physiologie, écologie sont très bien documentées. De nombreuses études ont montré l’importance du facteur température sur le cycle biologique des gammares. Les analyses isotopiques ont permis de mieux comprendre quelle place occupent les gammares dans la chaîne alimentaire, notamment pour l’espèce Gammarus aequicauda vivant en Méditerranée. Néanmoins, aucune donnée n’est encore disponible sur l’effet d’un paramètre abiotique, comme la température sur la composition isotopique de cette espèce. Il est intéressant d’étudier l’influence de la température sur le turnover isotopique chez ces organismes, soit la durée de vie de l’animal

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intégrée dans ses tissus, afin de comprendre les stratégies écologiques et physiologiques de G.

aequicauda face à la pression abiotique de la température.

Notre travail a pour but de mettre en place un protocole expérimental permettant d’observer la variation des fractionnements et des turnovers isotopiques du carbone, de l’azote et du soufre chez G. aequicauda afin de mieux comprendre les causes de variabilité de ces paramètres chez les consommateurs. Ces connaissances sont nécessaires afin d’améliorer l’application des isotopes stables en écologie trophique et ainsi comprendre le lien entre physiologie et écologie chez G. aequicauda.

Matériels et méthodes

1) Matériel biologique

Les spécimens de Gammarus aequicauda utilisés dans le cadre de ce protocole expérimental ont été élevés en aquarium dans de l’eau de mer (500L) d’une salinité de 38, avec une photopériode 12 :12h et une variation de température homologue à celle de la mer Méditerranée (12°-26°C). Les individus échantillonnés pour le protocole ont été acclimatés à 17°C. G. aequicauda est la seule espèce d’amphipode présente dans l’aquarium. Les spécimens à l’origine de l’élevage ont été prélevés dans le port de la station biologique de STARESO (Université de Liège) dans la Baie de Calvi (Corse, France) en novembre 2013.

Les gammares ont été élevés en présence de la litière de posidonies provenant de la même station d’échantillonnage que les gammares. Aucune autre source de nourriture n’a été volontairement fournie à l’élevage. Cependant, les spécimens de G. aequicauda se nourrissent régulièrement de micro et macro algues qui se développent sur les parois de l’aquarium due à l’intensité de l’éclairage artificiel. Des individus charognards et prédateurs sont également présents dans l’aquarium de réserve puisque les populations ne sont pas contrôlées.

2) Design expérimental

L’expérimentation s’est déroulée entre le 17-18 mars 2020 et le 12 mai 2020. Quatre traitements de température ont été testés pour l’espèce Gammarus aequicauda ; soit à 15.5°C,

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21.5°C, 25.2°C et 27.5°C. Tous les gammares ont été nourris ad libitum avec du krill Euphausia superba provenant du commerce. L’ajout de krill était effectué entre une et deux fois par semaine selon la consommation observée. La nourriture non consommée est retirée.

Pour chaque traitement de température, six microcosmes (1L) ont été mis en place afin de permettre la réplication (Figure 2). Dix gammares ont été placés dans chaque microcosme rempli d’eau de mer provenant de l’aquarium d’élevage. Les gammares ont été échantillonnés aléatoirement, sans distinction de taille, âge, ni de sexe. Les microcosmes ont ensuite été placés dans des bacs en plastique rigide contenant de l’eau douce thermostatisée à la température de test. Six microcosmes contenant uniquement de l’eau sont également dans le bain afin de disposer d’une réserve d’eau à température lors des changements d’eau. L’eau des microcosmes est renouvelée à 100% une à deux fois par semaine dont une fois lors des prélèvements. Le bac thermostatisé à 15.5°C est muni d’un refroidisseur de marque Tesco.

Les bacs thermostatisés à 21.5, 25.2 et 27.5°C sont munis d’une résistance chauffante d’aquarium. Tous les bacs sont pourvus d’une pompe pour l’homogénéisation de la température. La température a été mesurée en continu à l’aide de senseurs (HOBO Pendant Temp/Light, 8K2, PRESEK, Germany) (précision ± 0.2°C). Les bacs, munis de couvercle, sont restés fermés pendant la durée de l’expérience pour empêcher le développement algal, limiter l’évaporation et la perte excessive de chaleur et donc assurer un meilleur contrôle de la température. Les gammares ont été élevés dans le noir, dans une eau à 38 de salinité.

Figure 2 : Schéma du protocole expérimental d’élevage de Gammarus aequicauda. L’eau pointillée représente l’eau salée. L’eau unie représente l’eau douce. Le traitement à 15°C est muni d’un refroidisseur + pompe. Les traitements chauffés sont munis d’une pompe de circulation et d’une résistance électrique. Tous les bacs sont contrôlés par un senseur de température.

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Au début de l’expérience (t0), vingt Gammarus aequicauda de l’aquarium d’élevage ont été échantillonnés aléatoirement. Par la suite, un amphipode par microcosme a été échantillonné chaque semaine jusqu’à épuisement de nombre de gammare disponible excepté pour les prélèvements : t1 (24/03/2020) des microcosmes n°2, n°3, n°4 du traitement à 25°C et des microcosmes n°1 et 3 du traitement à 27.5°C où les individus fraîchement morts ont été récoltés. Le temps de l’expérience a donc été variable selon les traitements de température (Table 1). La mortalité a été très forte dès les premiers jours d’expérience pour le traitement T°25.2 et T°27.5. De plus, des prélèvements de krill Euphausia superba et des analyses isotopiques ont été effectués au court de notre expérience afin de vérifier la variabilité de la composition isotopique de la nourriture. Trois prélèvements de krill ont été effectués à t0, t1 et t2, puis quatre autres prélèvements de krill provenant des mécrocosmes ont été réalisés, soit du krill provenant d’un milieu à 15.5°C, 21.5°C, 25.2°C et 27.5°C.

Les échantillons sont placés dans des flacons en verre et séchés à l’étuve (50°C, 48H). Au total, 180 gammares ont étééchantillonnés dans le cadre de cette expérience.

3) Isotope stable

Les amphipodes ont été pesés à l’aide d’une balance Mettler Toledo (précision au µg). Si la masse de l’individu est trop importante pour une mesure au spectromètre de masse (> 3 mg MS), l’individu est broyé en une poudre homogène à l’aide d’un pilon en Teflon pour pouvoir effectuer un sous-échantillonnage (de l’ordre de 2.5 mg) lors la mise en cupule. Dans chaque cupule en étain, 2 mg d’oxyde de tungstène (WO, Elementar) est ajouté pour améliorer la combustion lors des analyses isotopiques. Les mesures isotopiques du carbone, de l’azote et de soufre ont été réalisées à l’aide de spectromètre de masse isotopique IRMS (IsoPrime 100, Isoprime, U.K.), couplé à un analyseur élémentaire (EA, Vario MICRO cube, Elementar,

Date n° prélèvements T°15,5 T°21,5 T°25,2 T°27,5

17/03/2020 T0

24/03/2020 T1 6 ind. 6 ind. 17 (dont 14 morts) 13 (dont 10 morts)

30/03/2020 T2 6 ind. 6 ind. 9 (dont 3 morts). 6 ind.

06/04/2020 T3 6 ind. 6 ind. 5 ind. 6 ind.

13/04/2020 T4 6 ind. 6 ind. 5 ind. 6 ind.

20-21 et 22/04/2020 T5 6 ind. 6 ind. 5 ind. /

27/05/2020 T6 4 ind. 6 ind. / /

04/05/2020 T7 7 ind. 5 ind. 2 ind. /

13/05/2020 T8 / 4 ind. / /

20 individus

Table 1 : Effectif des prélèvements pour les analyses isotopiques des G. aequicauda de quatre traitements de température 15.5°C, 21.5°C, 25.2°C et 27.5°C. Au total, l’expérience à 15.5°C et 25.2°C ont duré 45 jours, l’expérience à 21.5°C a duré 57 jours et l’expérience à 27.5°C a duré 26 jours.

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Allemagne). Les rapports isotopiques sont exprimés en notation delta δ (en ‰) selon l’équation : δX = 𝑅é𝑐ℎ𝑎𝑛𝑡𝑖𝑙𝑙𝑜𝑛−𝑅𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟𝑑

𝑅𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟𝑑 × 1000. (Coplen, 1996, Coplen and Krouse, 1998).

Où X représente soit ¹³C, ¹⁵N ou ³⁴S. Réchantillon correspond au rapport ¹³C/¹²C, ¹⁵N/¹⁴N ou

34S/³²S de l’échantillon à étudier et Rstandard aux rapports isotopiques des standards internationaux CaCO3 (Vienna Pee Dee Belemnite) pour le carbone, l’air atmosphérique pour l’azote et le soufre de la météorite du Cañyon Diablo pour le soufre. Les mesures isotopiques sont calibrées à l’aide des références certifiées IAEA-C6 pour le carbone (10,8 ± 0,2‰) ; IAEA-N1 (0,4 ± 0,2‰) et IAEA-N2 pour l'azote (20,4 ± 0,2‰) ; IAEA-S1 pour le soufre (- 0,3‰). L’acide sulfanilique est utilisé comme standard élémentaire. Au cours de notre analyse, un écart-type de 0.62% pour le carbone, 1.4% pour l’azote et 0.24% pour le soufre a été mesuré pour les compositions élémentaires et un écart-type de 0.11‰ pour δ¹³C, 0.42‰

pour δ¹⁵N et 0.36‰ pour δ³⁴S pour les réplicats a été mesuré pour les compositions isotopiques.

4) Analyses de respirométrie

Les mesures de respiration ont été réalisées en fin d’expérimentation (Table 2) sur six individus pour chaque traitement de température, soit un individu par microcosme, excepté : le traitement T°27.5 où deux individus proviennent du microcosme n° 4 pour compenser l’arrêt du microcosme n°3, et le traitement T°25.2 où deux individus proviennent du microcosme n°1 pour compenser l’arrêt du microcosme n°6. Les individus prélevés pour la réalisation des tests respirométriques sont utilisés ultérieurement pour les analyses isotopiques.

Les amphipodes testés ont été placés individuellement dans une chambre en verre de 4mL, placée dans une étuve réglée à la température test (15.5°C, 21.5°C, 25.2°C et 27.5°C).

Date Effectifs Remarques

T°15,5 22/04/2020 6 indiv /

T°21,5 21/04/2020 6 indiv /

T°25,2 20/04/2020 6 indiv 2 indiv du micorcosme n°1 T°27,5 13/04/2020 6 indiv 2 indiv du micorcosme n°4

Table 2 : Effectif de prélèvement des G. aequicauda des quatre traitements de température 15°C, 20°C, 25°C et 30°C pour la réalisation des tests de respirométrie.

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Les chambres sont remplies avec l’eau des microcosmes d’élevage et filtrée avec un filtre de 0.45µm afin de limiter au maximum les biais de la respiration bactérienne (Rovit and Jacobsen, 2013). Une homogénéisation de la chambre a été réalisée en continu grâce à une micropuce magnétique et un agitateur externe. La micropuce placée à l’intérieur du flacon de 4mL est protégée par une crépine en maille rigide pour éviter que le gammare testé ne soit importuné pendant l’expérience. Cette agitation permet d’homogénéiser la concentration d’oxygène dans l’entièreté de la chambre et limite la formation de bulle. Les gammares ont été acclimatés 10-15 minutes avant de démarrer la prise de mesure. Les chambres sont pesées à vide, puis après remplissage et ajout du gammare, qui lui, est pesé après égouttage en fin d’expérience, ceci afin de pouvoir rapporter les taux de respiration de chaque individu à sa masse. La salinité a été mesurée avant l’expérience. Chaque session de prise de données comporte un blanc, mesurant la respiration bactérienne, et trois chambres avec gammare.

L’expérience se déroule dans le noir pour limiter la production phytoplanctonique. La consommation d’oxygène est mesurée grâce à des capteurs d’oxygène : pastilles de 2 mm de diamètre placées à l’intérieur de la chambre (oxygen sensor spot Pst3, PreSens). Des fibres optiques placées devant la pastille envoient un signal lumineux permettant de mesurer, de manière non destructrice, la concentration en oxygène dans la chambre grâce à la réaction fluorescente de la pastille par rapport à la concentration en oxygène dans le milieu. Une mesure a été prise toutes les 5 secondes pendant 45 minutes avec l’appareil de mesure PreSens OXY-4-SMA, 4 canaux. En parallèle, une cinquième chambre est placée dans les mêmes conditions expérimentales et sert à mesurer la température pendant toute la durée de l’expérience. Le design expérimental est représenté dans la figure 3.

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Les mesures sont intégrées dans le logiciel PreSens measurement studio 2. Le taux de respiration est calculé en pondérant la masse de l’individu testé, la salinité de l’eau et la température du milieu, soit par les paramètres influençant directement la dissolution du gaz et l’assimilation du gaz par l’organisme. Les calculs sont détaillés ci-dessous :

La consommation de l’oxygène est calculée pour chaque gammare à partir des mesures de concentration d’oxygène dans la chambre :

(1) [O2]consommé [µmol.h^-1] = Ppartielle . ([𝑂𝑥]𝑐𝑜𝑛𝑠𝑜 [%.𝐿−1].𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑒𝑎𝑢

100 ) . 0,2095. α. 10⁶. ¹

22.414

Le coefficient de salinité α et la pression partielle Ppartielle sont corrigées par la température à chaque pas de temps. Les constantes sont données de calibration du logiciel de mesure PreSens. Le volume de l’eau de la chambre, nécessaire au calcul de (1), est recalculé pour chaque chambre à chaque test, en suivant le calcul suivant :

(2) Volume eau (L) = (chambre totale (eau + gammare)) – (chambre vide) – (poids frais gammare)

Un taux de respiration est ensuite calculé par gammare selon la formule (3).

Figure 3 : Schéma du protocole expérimental des mesures de respirométrie. Les chambres en verre sont placées dans une étuve réglée à la température test d’élevage.

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(3) MO2 [µmol.heure^-1.g^-1] = ⁽𝑝𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑠𝑝𝑖𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 – 𝑝𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑠𝑝𝑖𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑢 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟ô𝑙𝑒) 𝑝𝑜𝑖𝑑𝑠 𝑓𝑟𝑎𝑖𝑠 𝑔𝑎𝑚𝑚𝑎𝑟𝑒

Les pentes de respiration sont calculées selon les résultats des consommations d’oxygène par gammare à chaque pas de temps, obtenus grâce à la formule (1).

5) Traitement des données Calcul du turnover isotopique

Le calcul du turnover isotopique (c), exprimé en jour^-1, dépend du temps de demi-vie (t), exprimé en jours, qui correspond au temps nécessaire pour que la composition isotopique du carbone, de l’azote et du soufre chez un consommateur atteigne une valeur médiane entre celle avant et celle après un changement alimentaire (Bosley et al., 2002). La composition isotopique d’un organisme tend à un équilibre asymptotique avec le temps. Le calcul du turnover se fait grâce à la courbe de décroissance exponentielle ci-dessous (Tieszen et al., 1983) :

𝛿𝑋𝑡 = 𝛿𝑋𝑓 + (𝛿𝑋0 − 𝛿𝑋𝑓)𝑒^−𝑐𝑡

Où δXt représente δ¹³C, δ¹⁵N ou δ³⁴S au temps t, δXf représente δ¹³C, δ¹⁵N ou δ³⁴S à l’équilibre asymptotique, δX0 représente δ¹³C, δ¹⁵N ou δ³⁴S au début de l’expérience (t0). Le calcul du temps de demi-vie est nécessaire pour déterminer le turnover isotopique. Le temps de demi-vie est le :

𝑡 (1

2) = ln 0.5 𝑐

Où t(1/2) représente au temps de demi-vie du carbone, de l’azote ou de soufre, exprimé en jour, et c correspond au turnover isotopique, exprimé en jour^-1.

Calcul du fractionnement isotopique

Le calcul du fractionnement isotopique (Δ) se fait grâce à la formule ci-dessous :

∆𝑋 = 𝛿𝑋𝑐𝑜𝑛𝑠𝑜𝑚𝑚𝑎𝑡𝑒𝑢𝑟 − 𝛿𝑋𝑠𝑜𝑢𝑟𝑐𝑒

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où X représente ¹³C, ¹⁵N ou ³⁴S. δXconsommateur correspond à la composition isotopique (δ¹³C, δ¹⁵N ou δ³⁴S) du consommateur à l’équilibre. δXsource correspond à la composition isotopique (δ¹³C, δ¹⁵N ou δ³⁴S) de la source à l’équilibre. ΔX, exprimé en ‰, est la différence entre les compositions isotopiques d’un consommateur et de ces sources alimentaires. Si aucune valeur de δ n’approche l’asymptote, alors celle-ci est obtenue par le calcul de la moyenne des valeurs de δ pour les derniers prélèvements de l’expérience.

Tests statistiques

Tous les tests statistiques ont été réalisé sur le logiciel R (V3.6.2 : R Core Team, 2019).

Après avoir calculé les courbes de survie pour chaque traitement de température, un test de Log-rank a été réalisé grâce aux packages survival (version 3.2-3, Therneau T, 2020) et survminer (version 0.4.8, Kassambara et al., 2020) afin de déterminer l’influence de la température sur la mortalité des gammares (seuil α=0.05).

Des ANOVAS 2 facteurs ont été réalisées pour montrer l’influence du temps et de la température sur les compositions isotopiques en carbone, azote et soufre chez G. aequicauda et chez le krill E. superba. L’autocorrélation des données a été vérifiées avec un test de Durbin watson (seuil α=0.05). La normalité et l’homoscédasticité des données ont été vérifiées par un test de Shapiro et Bartlett respectivement (seuil α=0.05). Un test post-hoc de Tukey HSD a été effectué en cas de significativité des résultats.

Un test ANOVA 1 facteur a été réalisé pour montrer l’influence de la température sur les taux de respiration chez G. aequicauda. La normalité et l’homoscédasticité des données ont été vérifiées par un test de Shapiro et Bartlett respectivement (seuil α=0.05). Un test post-hoc de Tukey HSD a été effectué en cas de significativité des résultats.

Un ACP a été réalisé grâce aux packages FactoMineR (version 2.3, Husson et al., 2020) et factoextra (version 1.0.7, Kassambara and Mundt, 2020) afin de comprendre l’influence des paramètres biologiques sur les compositions isotopiques et de mettre en évidence les corrélations entre les variables chez les gammares élevés à différentes températures.

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Résultats

1) Mortalité

Le taux de mortalité a été calculé pour tous les traitements de température (Figure 4) à chaque pas de temps. Durant les 7 premiers jours d’expérimentation, le plus grand taux de mortalité a été observé dans les traitements aux plus hautes températures, avec 48.4% de mortalité à 27.5°C. Une partie de cette mortalité correspond à la perte de 2 et 3 microcosmes complets dans les traitements à 25.2 et 27.5°C respectivement. Dans les traitements à 27.5°C restants la mortalité est de 40%. La plus faible mortalité a été observée dans le traitement à 15.5°C. Pour limiter ces trop fortes mortalités dans les traitements chauds, le renouvellement d’eau a été réalisé deux fois par semaine. A partir de t2, la mortalité du traitement à 27.5°C est de 10.7%, 31.6% à t3.

De la reproduction a également été observée dans les quatre traitements de température au cours de l’expérience. Les juvéniles observés lors de l’expérience n’ont pas été pris en compte sur les 28 premiers jours de l’expérience. Au-delà de cette date, les juvéniles ayant atteint leurs tailles adultes ont été compris dans les comptages et certains juvéniles ont été échantillonnés dans le traitement à 21.5°C. Les plus grosses activités de reproduction (i.e.

accouplements, présence de juvéniles) ont été observées dans les traitements à 21.5°C et 25.2°C (Annexe 3).

Figure 4 : Courbes de survie en fonction du temps de G. aequicauda élevé à quatre traitements de températures différentes.