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Submitted on 2 Jun 2020
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Purification et caractérisation des protéines de réserve du lin
Roberta Lupi, Véronique Solé-Jamault, Madissone Bonté, Olivier Galet, Gilbert Deshayes, Sandra Denery, Colette Larre
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Roberta Lupi, Véronique Solé-Jamault, Madissone Bonté, Olivier Galet, Gilbert Deshayes, et al..
Purification et caractérisation des protéines de réserve du lin. colloque national du réseau français de biologie des graines (GRAINES 2019), May 2019, Angers, France. 1p., 2019. �hal-02738230�
Version preprint
Comment citer ce document :
Lupi, R., solé-Jamault, V., Bonté, M., Galet, O., Deshayes, G., Denery, S., Larre, C. (Auteur de correspondance) (2019). Purification et caractérisation des protéines de réserve du lin .
Presented at colloque national du réseau français de biologie des graines (GRAINES 2019), Angers, FRA (2019-05-21 - 2019-05-23). 1p.
Purification et caractérisation des protéines de réserve du lin
Roberta Lupi
1,
Véronique Solé-Jamault1, Madissone Bonté1, Olivier Galet2, Gilbert Deshayes1, Sandra Denery1,Colette Larré
11 INRA, UR 1268 Biopolymères Interactions Assemblages, F-44300 Nantes 2 Groupe Avril – 11 rue de Monceau – 75008 Paris
Le lin cultivé en France est principalement utilisé pour ses fibres. Certaines variétés sont cependant valorisées par leurs graines qui peuvent être triturées pour fournir de l’huile de lin essentiellement à usage non alimentaire mais également intéressante d’un point de vue nutritionnel pour sa richesse en acides gras de type oméga 3. Le tourteau qui en résulte est très généralement utilisé en alimentation animale. Ces variétés occupent seulement quelques milliers d’hectares actuellement. Avec une teneur en protéines de 18- 20 %, la graine de lin pourrait constituer une source de protéines végétales utilisable en tant qu’ingrédient alimentaire. Sa composition en acides aminés est comparable à celle du soja, mais à la différence des protéines de soja les propriétés nutritionnelles des protéines de lin ont été peu étudiées. Ses protéines de réserve sont de type globulines et albumines appelées aussi linine (12S) et conlinine (2S).
INTRODUCTION
N° Protéine (Linum) ou meilleur homologue PMexp
(Da)
PMthéo
(Da)
1 CRU3_BRANA Cruciferin CRU1 OS=Brassica napus Q2XSW6_SESIN 11S globulin isoform 4
50000 56400 52599 2 CRU3_BRANA Cruciferin CRU1 OS=Brassica napus
Q2XSW6_SESIN 11S globulin isoform 4
47000 56400 52599 3 Q9AUD2_SESIN 11S globulin OS=Sesamum indicum OX=4182 PE=2 SV=1 34000 56500 4 Q8LPD3_LINUS Conlinin OS=Linum usitatissimum OX=4006 GN=cnl2 PE=2 SV=1 20000 18899 5 A0RZJ4_LINUS Oleosin high molecular weight isoform OS=Linum usitatissimum 18000 18899
6 Q8LPD3_LINUS Conlinin OS=Linum usitatissimum 12000 18899
7 Q8LPD3_LINUS Conlinin OS=Linum usitatissimum 10000 18999
L’isolat 1 obtenu par voie industrielle est peu soluble, l’ajout de sels ou des modifications de pH impactent peu sa solubilité. La présence de SDS 2% et de réducteur permet d’augmenter légèrement la solubilité de l’isolat 1.
L’électrophorèse comme l’HPLC en Gel
filtration montre que cet isolat 1 ne contient pas de protéines de type 12S sous leurs formes
solubles en conditions non dénaturantes
Afin d’obtenir une fraction 12S native, nous avons comparé 2 méthodes d’élimination du mucilage des graines avant leur séchage, broyage et
délipidation à froid:
1. Lavage extensif des graines avec de l’eau à 40°C pour obtenir l’isolat2 2. Ajout d’enzymes pectinolytiques à pH 4,5 à 40°C pour obtenir l’isolat3
Isolat1 Isolat 2 Isolat3 Isolat1 Isolat 2 Isolat3
1 2 3 4 5 6 7 8
9
Electrophorèse SDS PAGE des isolats obtenus par différentes voies
___ Isolat1 ___ Isolat2 ___ Isolat3
12S
2S
HPLC Gel filtration des isolats obtenus par différentes voies sur Superose 6 10/300, 0,5 ml/min, Tris HCl pH 8,5, NaCl 0,5M
Les profils électrophorétiques des isolats 2 et 3 font apparaître un plus grand nombre de bandes entre 20 et 50 kDa. L’analyse HPLC montre l’apparition d’un pic majeur élué avant le pic de 2S. Les 2 conditions d’extraction permettent d’obtenir des isolats contenant les deux protéines majoritaires du lin, 12S et 2S, sous forme soluble.
Liste des protéines identifiées à partir de bandes extraites d’un gel d’électrophorèse. Les N° correspondent aux chiffres indiqués en jaune sur le gel ci-dessus. PMexp et PMthéo poids moléculaires expérimentaux et théoriques. Banque d’interrogation : UniProt
restreinte à Viridiplantae. Analyse avec X!tandemPipeline.
METHODES
RESULTATS
CONCLUSIONS
L’isolat1 d’origine industriel est riche en conlinine (2S), la fraction 12S y est faiblement représentée et probablement dénaturée.
Les 2 modes d’extraction ont permis d’obtenir les fractions 12S et 2S sous une forme soluble et dans des proportions décrites dans la littérature.
Les analyses protéomiques n’ont pas permis d’identifier des protéines 12S de lin mais par homologie des 12S de colza et de sésame ce qui explique aussi la reconnaissance de certaines bandes de 12S par un anticorps monoclonal dirigé contre les 12S de colza.
La masse moléculaire moyenne des 12S en conformation hexamérique est de 292 kDa, celle des 2S varie entre 12 et 37 kDa en fonction de la méthode de préparation suggérant la formation de dimères ou l’absorption de petites molécules.
Masse moléculaire des protéines calculés en sortie d’une chromatographie d'exclusion (SEC) couplée avec la mesure de la
diffusion de la lumière laser.
Les auteurs remercient SOFIPROTEOL pour le financement de PRODIAL soutenu par le FASO.
12S 2S
Mn (kDa) (%) Mn (kDa) (%)
Isolat1 - 12,3 0,6
Isolat2 292,1 0,9 24,9 9,7
Isolat3 292,8 0,6 37,2 1,1
Notre travail vise à l’obtention à partir de graines de lin et la caractérisation des fractions protéines linine (12S) et conlinine (2S) afin d’étudier leurs propriétés nutritionnelles.
L’analyse SEC-MALS permet d’estimer la masse molaire des protéines avec son incertitude. Selon leur préparation, les protéines 2S sont mesurées avec des
masses allant de 12,3 kDa à 30 kDa alors qu’elles sont théoriquement à 16,7 kDa sous leur forme mature.
WesternBlot avec un anticorps spécifique des 12S de colza (14H10F6)
Des protéines 12S du lin sont reconnues par un anticorps monoclonal spécifique des 12S de colza avec cependant une moindre
intensité. Les masses moléculaires observées sont légèrement différentes de celles des 12S de colza que ce soit en conditions réduites où seule une bande aux environs de 18 kDa est observée que en conditions natives avec
plusieurs bandes entre 30 et 50 kDa.
colette.larre@inra.fr
