Ecologie des Systèmes Aquatiques
Etude de la dynamique des Escherichia coli dans les rivières du bassin de la Seine
Tamara Garcia-Armisen
Thèse présentée pour l’obtention du diplôme de Docteur en Sciences
Directeur de thèse: Dr. Pierre Servais
Année académique 2005-2006
Université Libre de Bruxelles
Ecologie des Systèmes Aquatiques
Etude de la dynamique des Escherichia coli dans les rivières du bassin de la Seine
Tamara Garcia-Armisen
Thèse présentée pour l’obtention du diplôme de Docteur en Sciences
Directeur de thèse: Dr. Pierre Servais
Année académique 2005-2006
« En cette journée mondiale de l’eau, prenons la résolution d’en faire plus pour que tous les êtres humains disposent d’eau salubre. Et réaffirmons notre volonté de mieux gérer les ressources en eau de notre planète, qui sont la clef de notre survie et d’un développement durable au XXIe siècle »
Kofi Annan.
Journée mondiale de l’eau, 22 mars 2005
Abstract
The purpose of our study was to describe the dynamics of E. coli in the rivers of the Seine watershed. This watershed is characterized by a poor microbiological water quality due to an important population density, industrial activities and intensive agriculture. The main objectives of our study were to obtain field microbiological data describing the system and to understand the underlying mechanisms in order to build a model able to describe and predict the fate of the fecal bacteria at the scale of the whole watershed. This model was built in order to help management of microbiological water quality.
To be able to describe and modelize the fate of fecal bacteria at the scale of such a large and complex system, it was first necessary to identify and quantify the sources of contamination and to be able to describe the processes affecting these bacteria once discharged to the rivers.
The quantification of E. coli in the natural aquatic systems through the traditional culture-based techniques has been strongly questioned during the last years because they have a long response delay (24 to 48 h) and they do not take into account the viable but not culturable bacteria (VBNC) which nevertheless could represent a health thread. For this reason we developed in this study two alternative methods: the direct (without passing through a cultivation step) measurement of the β-D-glucuronidase activity and a fluorescent in situ hybridization with an E. coli specific probe coupled with a viability test. The first has the main advangate to give a very rapid evaluation of the E. coli content of the water while the second one was able to enumerate VBNC E. coli.
The study of the sources of contamination of the rivers revealed the predominance, in this anthropogenicised watershed, of the point sources (effluents from wastewater tretament plants). Diffuse sources soil leaching and surface runoff) may nevertheless be locally important and have also be quantified. The influence of the land use on these diffuse sources has been quantified demonstrating that soil leaching and surface runoff of grazed areas was mainly responsible of fecal contamination in rural areas.
influence the fate of this kind of bacteria in the aquatic systems. A linear regression was found between the percentage of particle-associated E. coli and the SM content of the water. Settling velocities of particle-associated E. coli were determined. The mortality rate of E. coli was analysed following various perspectives: the river order, the attachment of E. coli to particles, the importance of the cultivability loss in the disappearance of these bacteria and the importance of protozoan grazing. The results confirmed the importance of grazing and showed that the abondance of free living E.
coli bacteria decreased two times more rapidly than particle-associated E. coli. In the Seine river, we showed that the net loss of culturable E. coli was 1.5 time higher than the net loss of viable E. coli. Finally, no relationship was found between mortality rate and river order.
These results have been used to build two models CF-SENEQUE and CF-SiAM-3D which describe E. coli dynamics respectively for the whole Seine river watershed and for the Seine for the estuary. Comparisons model calcultaions with field data of fecal coliforms abundances showed that these models correctly simulated the longitudinal distribution of fecal colifoms in the main rivers of the Seine watershed and in the estuary. These models were used to test the impact on the microbiological water quality of various scenarii of wastewater management .
Table des matières
Ce mémoire de thèse se présente sous la forme d’un document en deux parties.
La première partie est constituée d’un texte en français qui reprend, après une mise en contexte de l’étude, une introduction générale et une définition des objectifs, un résumé des principaux résultats obtenus divisés en quatre chapitres suivis d’une conclusion générale.
La seconde partie du document reprend le texte intégral de chacune des huit publications issues de ce travail.
Partie I : Etude de la dynamique des Escherichia coli dans les rivières du bassin de la Seine
I. Contexte général de l’étude ... 4
II. Introduction générale... 6
II.1. La qualité microbiologique des eaux de surface – un enjeu majeur. ...6
II.2. L’évaluation de la qualité microbiologique des eaux - les germes indicateurs de contamination fécale...7
II. 3. Les normes de qualité microbiologique des eaux ...12
III. Objectifs et plan de la thèse ... 16
IV. L’énumération des coliformes et des E. coli dans les eaux - aspects méthodologiques ... 20
IV.1. Les méthodes d’énumération basées sur la mise en culture. ...20
IV. 2. La problématique des bactéries fécales non cultivables...21
IV. 3. Les méthodes moléculaires...24
IV. 4. Développement d’une méthode d’hybridation in situ couplée à un critère de viabilité pour l’énumération des E. coli dans les eaux de surface et les eaux usées ...27
IV. 5. Mesure directe de l’activité β-D-glucuronidasique...28
IV. 6. Intérêt et limites de la méthode DVC-FISH et de la mesure de l’activité GLU...30
V. Les apports de bactéries fécales aux rivières ... 34
V.1. Les sources de contamination fécale des eaux de surface ...34
V.1.1. Sources ponctuelles...34
V.1.2. Sources diffuses...36
V.2. Les apports de bactéries fécales par les effluents des stations d’épuration ...37
V.3. Les apports de bactéries fécales par ruissellement et lessivage des sols ...38
V.4. Contribution respective des apports ponctuels et diffus de bactéries fécales dans le bassin de la Seine...39
V.5. Les sources de contamination fécale des eaux de l’estuaire de Seine ...40
VI. Étude des processus contrôlant le devenir des bactéries fécales en rivière.42 VI.1. Les principaux processus affectant le devenir des bactéries fécales en rivière ...42
VI.1.1. Description des principaux processus...42
VI.1.2. L’importance de l’attachement des bactéries fécales aux matières en suspension ...45
VI.2. La mortalité des bactéries fécales dans les eaux du bassin de la Seine...46
VI.3. Les E. coli attachés aux MES : importance et devenir ...48
VII. Modélisation du devenir des E. coli dans les rivières. ... 50
VII. 1. Modélisation du devenir des bactéries fécales en rivière...50
VII.1.1. Etat de l’art...50
VII.1.2. Prise en compte des sources de bactéries fécales dans les modèles....54
VII.1.3. Modélisation des processus affectant le devenir des bactéries fécales dans les milieux aquatiques....55
VII. 2. Développement d’un module décrivant la dynamique des bactéries fécales en rivières ...57
VII. 2.1. Le modèle CF-SENEQUE pour le bassin de la Seine...58
VII. 2.2. Le modèle CF-SiAM-3D de l’estuaire de Seine...60
VII.3. Validations des modèles et élaboration des scénarios...61
VII.3.1. Le modèle CF-SENEQUE...61
VII.3.2. Le modèle CF-SiAM-3D...62
VIII. Conclusions et perspectives ... 66
IX. Références Bibliographiques ... 70
Partie II : Publications scientifiques
Publication 1 : Enumeration of viable E. coli in rivers and wastewaters by fluorescent in situ hybridization. Garcia-Armisen, T. and Servais, P. Journal of Microbiological Methods, 2004, 58:269– 279.
Publication 2: An early warning method to detect faecal contamination of river waters.
Servais, P., Garcia-Armisen, T., Lepeuple, A.S. and Lebaron, P. Annals of Microbiology, 2005, 55 (2): 67-72.
Publication 3: β-D-glucuronidase activity assay to assess viable Escherichia coli abundance in freshwaters. Garcia-Armisen, T., Lebaron, P. and Servais, P. Letters in Applied Microbiology, 2005, 40: 278–282
Publication 4: Respective contributions of point and non point sources of E. coli and Enterococci in a large urbanised watershed (the Seine river, France). Garcia- Armisen, T. and Servais, P. Journal of Environmental Management, 2007, 82: 512-518.
Publication 5: Sources of faecal contamination in the Seine estuary (France). Garcia- Armisen, T., Touron, A., Petit, F. and Servais, P. Estuaries, 2005, 28(4): 627–
633.
Publication 6: Partitioning and fate of particle associated-E. coli in river waters. Garcia- Armisen, T. and Servais, P. Water Environment Research, submitted in January 2007.
Publication 7: Fecal bacteria in the rivers of the Seine drainage network (France): Sources, fate and modelling. Servais, P., Garcia-Armisen, T., George, I. and Billen, G. Science of the Total Environment, in press, January 2007.
Publication 8: Modelling fecal coliforms dynamics in the Seine estuary (France). Garcia- Armisen, T., Thouvenin, B. and Servais, P. Water Science and Technology, 2006, 54(3): 177-184.
Partie I.
Etude de la dynamique des Escherichia coli dans les rivières du bassin de la Seine
I. Contexte général de l’étude
Les chiffres publiés par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) en 2004 révèlent que chaque année 1.8 million de personnes dont 90% d’enfants de moins de cinq ans, vivants pour la plupart dans les pays en voie de développement, meurent de maladies diarrhéiques. Or, à l’echelle mondiale, 88% des maladies diarrhéiques sont imputables à la mauvaise qualité de l’eau de boisson et à un assainissement insuffisant des eaux usées. L’eau est devenue un enjeu stratégique mondial dont la gestion doit impérativement s'intégrer dans une perspective politique de développement durable. Certains affirment en effet qu’elle sera, au troisième millénaire, un enjeu de guerres comme le pétrole l’a été et l’est encore aujourd’hui.
Pour ces raisons, l’Organisation des Nations Unies (ONU) a déclaré la période 2005-2015 décennie internationale d’action sur le thème ‘L’eau, source de vie’ et en conséquence a décidé d’accorder davantage d’importance aux problèmes relatifs à l’eau. Quelques-uns des thèmes centraux de cette décennie seront, entre autres : la pénurie d’eau, l’accès à l’assainissement, la prévention des catastrophes, la pollution des eaux superficielles, l’eau et les femmes et la gestion intégrée des ressources en eau.
Bien qu’essentielles et pertinentes pour tout citoyen responsable, nous n’aborderons pas ici toutes ces questions, nous nous focaliserons sur certains aspects, strictement scientifiques, que posent la gestion de cette ressource dans une perspective de protection de la santé.
Nous considérons que cette gestion doit impérativement se baser sur une connaissance approfondie du fonctionnement des écosystèmes aquatiques. Un aspect important de qualité du milieu aquatique est la qualité microbiologique des eaux de surface. Celle-ci est affectée par la contamination directe ou indirecte du milieu aquatique par des matières fécales humaines et animales contenant de hautes teneurs en micro-organismes entériques. Parmi ces micro- organismes entériques (bactéries, virus, protozoaires parasites) certains sont pathogènes pour l’homme; lorsqu’ils sont véhiculés par le milieu aquatique, ils peuvent donc être source de maladies que l’on qualifie alors «d’origine hydrique ». L’identification et la quantification des apports de ces micro-organismes entériques vers les systèmes aquatiques ainsi que leur capacité de survie dans un milieu auquel ils ne sont pas adaptés, constituent donc des questions centrales pour comprendre le risque sanitaire lié aux diverses utilisations des eaux de surface et
élaborer des stratégies de gestion et de surveillance appropriées. Le travail présenté ici s’inscrit dans ce contexte très général puisqu’il porte sur les méthodologies d’énumération, les sources, la dynamique dans les eaux de surface et la modélisation de cette dynamique pour une espèce particulière de bactérie d’origine fécale, Escherichia coli.
II.INTRODUCTION GÉNÉRALE
II. Introduction générale
II.1. La qualité microbiologique des eaux de surface – un enjeu majeur.
Les baies et les ports, les fleuves et les rivières ont été à l’origine du développement des plus grandes et des plus belles villes : Paris, Londres, La Havane, Amsterdam, Venise, New York, Shanghai, Sidney et bien d’autres sans oublier Bruxelles née d’un marché au confluent de la Senne et du Maalbeek. Les fleuves ou rivières baignant ces villes ont servi comme source d’eau pour la consommation, pour l’hygiène et la recréation, comme moyen de transport pour les activités commerciales, mais aussi comme moyen d’évacuation des déchets.
Progressivement néanmoins, l’augmentation de la densité de population et de la taille des villes associée à une augmentation de la consommation de matières premières diverses par les ménages, l’artisanat et l’industrie ont conduit à un volume et une nature de déchets que les eaux de surface n’ont plus pu épurer naturellement. Une intervention humaine spécifiquement orientée vers une intensification et une amélioration des processus physiques, chimiques et biologiques impliqués dans l’épuration naturelle des eaux a donc du être mise en œuvre. Bien que largement empiriques au début, ces interventions sont de plus en plus fondées sur une connaissance toujours plus fine des mécanismes naturels et des technologies disponibles.
Parmi les nombreux polluants que les eaux usées domestiques et le lessivage des sols apportent dans les milieux aquatiques, les bactéries d’origine fécale, en nombre considérable, représentent une menace pour la santé du fait des espèces pathogènes qu’elles comprennent.
C’est lors des grandes épidémies de choléra et de fièvres typhoïdes et paratyphoïdes du XIXème siècle que l’origine hydrique de ces maladies a été établie et que l’on commença à s’intéresser à la contamination microbiologique des eaux de surface et aux moyens d’y remédier.
En cent ans, l’évolution quantitative et qualitative de l’assainissement en Europe a été très importante mais certains problèmes de contamination microbiologique des fleuves et rivières subsistent.
Une façon d’améliorer la qualité des eaux de surface, d’une manière générale, et la qualité microbiologique en particulier, consiste à pratiquer des traitements d’épuration des eaux usées.
Il serait trop long de décrire ici l’histoire de l’assainissement, nous nous contenterons du seul exemple du traitement des eaux usées en région parisienne. En 1885 on inaugura à Paris la réforme dite : « tout à l’égout, rien dans la Seine » avec l’évacuation par les égouts de la
totalité des déchets liquides, ménagers, fécaux, urinaires et de lavage des rues vers un champ d’épandage à Achères, commune à l’époque rurale située à une vingtaine de kilomètres du centre de Paris. Le but de cet épandage était, d’une part, l’épuration des eaux par infiltration dans le sol et d’autre l’amendement des sols. En 2005, la station d’épuration d’Achères traite les effluents de plus de six millions d’habitants et est la plus grosse station d’épuration d’Europe. Le traitement y comprend une décantation primaire, un traitement biologique par boues activées et un traitement final de clari-flocculation. Cette filière de traitement réussit à abattre plus de 90% des bactéries fécales mais les effluents traités constituent néanmoins encore une source importante de contamination fécale pour la Seine. En effet, après le rejet de ces eaux usées traitées, la qualité microbiologique du fleuve diminue significativement comme nous le verrons dans ce travail.
Si la piètre qualité microbiologique des eaux de rivières ne constitue pas un danger considérable pour la santé publique en France, il en va tout autrement dans la plupart des pays en voie de développement notamment d’Amérique Latine et d’Asie où le développement de mégalopoles de plus de dix millions d'habitants débouche sur une explosion de la pollution bactérienne dans les cours d’eaux environnants. Cette dégradation de la ressource, liée à un accès limité à la distribution d’eau potable est dans ces pays à l’origine d’une très importante létalité.
II.2. L’évaluation de la qualité microbiologique des eaux - les germes indicateurs de contamination fécale
Les micro-organismes pathogènes responsables des maladies hydriques sont très nombreux et variés. Le Tableau 1 reprend une liste des principaux agents pathogènes responsables de maladies d’origine hydrique.
Actuellement et malgré le développement des méthodes moléculaires, il n’est toujours pas possible de détecter de manière exhaustive, dans un échantillon d’eau, l’ensemble des micro- organismes présents. Il est également impossible de baser la surveillance de la qualité de l’eau sur la détection des germes pathogènes eux-mêmes pour les raisons suivantes (Straub and Chandler, 2003): la très grande variété et diversité des micro-organismes pathogènes qui peuvent être présents dans l’eau (virus, bactéries, protozoaires,…), la faible abondance de chaque espèce de pathogène (nécessité de concentrer de très grands volumes d’eau pour les
II.INTRODUCTION GÉNÉRALE
détecter), l’inexistence de méthodes standardisées et rapides pour la détection de tous ces micro-organismes pathogènes.
Tableau 1. Principaux groupes et genres d’agents pathogènes responsables de maladies d’origine hydriques. (modifié d’après Gerba (1996) par Straub et Chandler (2003))
L’évaluation de la qualité microbiologique des eaux est en conséquence basée sur le concept de germes dits "indicateurs". Ces indicateurs (ou bactéries indicatrices de contamination) n'ont pas nécessairement par eux-mêmes un caractère pathogène, mais leur présence indique l'existence d'une contamination par des matières fécales et leur abondance est une indication du niveau de risque de présence de micro-organismes pathogènes. Un bon indicateur est par définition une espèce ou un groupe de bactéries qui présente certaines caractéristiques. Celles-ci sont reprises dans le Tableau 2.
Tableau 2. Caractéristiques d’un indicateur idéal de contamination fécale (Rose et al., 2004) Propriété Caractéristique d’un indicateur
Pathogénicité Pas pathogène
Occurrence Présent en même temps que les pathogènes, absent en absence de contamination fécale Survie Taux de survie similaire à celui des pathogènes
Reproduction Ne se reproduit pas dans les eaux naturelles
Inactivation Inactivé par les différents traitements au même niveau que les pathogènes Source La seule source dans les eaux naturelles est la contamination fécale Coût Méthodes de détection bon marché, rapides et faciles à mettre en œuvre.
Différents groupes de bactéries sont utilisés comme indicateurs de contamination fécale dans différents pays et sous différentes juridictions. Les coliformes totaux et fécaux ont été très longtemps les principaux indicateurs de contamination fécale mais aujourd’hui, Escherichia coli et les entérocoques intestinaux sont reconnus comme plus appropriés (Edberg et al., 2000;
Fewtrell and Bartram, 2001) et proposés pour remplacer les coliformes dans certaines normes de qualité microbiologique des eaux. Il est cependant important de comprendre les potentialités et les limitations de ces différents indicateurs. Quelques caractéristiques des indicateurs les plus couramment utilisés sont présentées ci dessous :
• Coliformes Totaux (CT). La pertinence de ce groupe comme indicateur est aujourd’hui fortement contestée du fait que toutes les espèces inclues dans les CT ne sont pas spécifiques de la flore intestinale des animaux à sang chaud. En effet, certaines espèces sont d’origine tellurique ou aquatique et sont capables de se développer dans l’environnement aquatique (Baleux et Troussellier, 1989; Lemarchand et al., 2004 ; Tallon et al., 2005)
• Coliformes Fécaux (CF) (aussi appelés Coliformes Thermotolérants). Les CF constituent un sous-groupe des CT capables de se développer à 44 °C. Les CF sont considérés comme plus appropriés comme indicateurs de contamination fécale que les CT. Ce groupe est majoritairement constitué de Escherichia coli mais comprend aussi des Klebsiella, des Enterobacter et des Citrobacter. Certains auteurs ont rapporté la présence de ces dernières espèces dans des eaux sans qu’aucune contamination fécale ne soit suspectée (Baudizsova, 1997; McLellan et al., 2001; Gauthier et Archibald, 2001).
• E. coli. De nombreuses études ont montré que cette espèce était généralement associée à une source fécale (Bej et al., 1990; Edberg et al., 2000; Leclerc et al., 2001 ; Leclercq et al., 2002;
II.INTRODUCTION GÉNÉRALE
Mc Lellan et al., 2001; Dogan-Halkman et al., 2003; Tallon et al., 2005). Aujourd’hui E.coli est considéré comme le meilleur indicateur d’une contamination récente du milieu aquatique par du matériel fécal humain ou d’animaux à sang chaud (Edberg et al., 2000). Cependant quelques études (Carrillo et al., 1985; Rivera et al., 1988; Bermudez and Hazen, 1988) suggèrent qu’en milieux tropicaux certaines souches de E. coli puissent faire partie de la flore autochtone des rivières ; cette espèce ne serait donc pas un indicateur idéal de contamination fécale en milieux tropicaux.
• Entérocoques Intestinaux. Ce groupe est aussi considéré comme un bon indicateur spécifique de la contamination fécale. Plusieurs études ont montré que l’abondance des entérocoques intestinaux était mieux corrélée à l’apparition de maladies gastro-intestinales chez les baigneurs fréquentant des plages aux eaux contaminées que l’abondance des CT ou CF (Cabelli et al., 1982, 1989 ; Ferley et al., 1989). Le fait que les entérocoques intestinaux survivent plus longtemps dans le milieu naturel que les E. coli peut constituer un avantage de ce groupe si l’on cherche à identifier une contamination fécale ancienne (Pommepuy et al., 1992; Edberg et al., 1997).
Définition des indicateurs utilisés dans cette étude :
Les CF ou coliformes thermotolérants. Ils sont définis comme des bactéries aérobies et anaérobies facultatives, gram négatives, non sporulantes, en forme de bâtonnet, oxydase négative, capables de se multiplier en présence de sels biliaires et de tensioactifs. Ils fermentent le lactose avec production d’acide et de gaz mesurables en 48 h à 44-44.5°C. Dans certains tests, l’activité de la β-D-galactosidase est utilisée pour détecter les CF.
E. coli. Ce sont des CF qui produisent de l’indole a partir du tryptophane, ils sont méthyl +, acetoïne -, citrate-, KCN- et possèdent une glutamate décarboxylase. Les E. coli possèdent l’enzyme β-D- glucuronidase; l’activité de cette enzyme est considérée comme spécifique et la détection de celle-ci est utilisée dans certaines méthodes d’énumération des E. coli.
Entérocoques intestinaux. Ils constituent un sous-groupe des Streptocoques fécaux ; ce sont des bactéries gram positives, catalases -, en forme de cocci. Ils peuvent être définis comme des microorganismes capables de se développer entre 10 et 45 °C à pH 9,6 et dans 6.5% de NaCl. Ou comme des microorganismes capables de se développer en aérobiose et d’hydrolyser le 4- methylumbeliferyl β -D Glucoside en présence d’acétate de thallium, acide nalidixique et 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride (TTC).
Par ailleurs, des études récentes ont mis en évidence le fait que l’abondance de bactéries indicatrices en général n’était pas bien corrélée à la présence de virus pathogènes (Grabow et al., 2001; Baggi et al., 2001; Noble and Fuhrman, 2001). Les bactériophages et plus particulièrement les coliphages ont été proposés comme des indicateurs spécifiques pour les virus entériques. Les bactériophages sont des virus qui infectent des bactéries ; ceux qui infectent en particulier E. coli et les autres coliformes sont appelés des coliphages. Trois groupes sont actuellement testés comme indicateurs: les coliphages somatiques, les coliphages anti-mâle à ARN ou phages F-RNA (qui se lient aux pili sexuels des bactéries F+) et les phages infectant Bacteroides fragilis. Cette approche est en plein développement mais des limitations pour l’usage des coliphages comme indicateurs subsistent: (i) de nombreux paramètres influencent le devenir des coliphages dans les milieux naturels (densité des bactéries hôtes, et des phages eux mêmes, température, pH, etc.) et peu d’informations pertinentes existent à ce sujet ; (ii) ils sont présents en nombre très variable et leur abondance n’a pas été démontrée comme ayant un rapport avec l’apparition d’infections et (iii) finalement les analyses sont encore très chères et nécessitent une étape de concentration. (Ashbolt et al., 2001). Une collaboration internationale (Projet virobathe) vise à établir des normes pour l’énumération des virus dans les eaux à usage récréatif.
Enfin, certains auteurs (Lemarchand et al., 2004; Harwood et al., 2005) proposent une évaluation de la qualité microbiologique des eaux basée sur l’énumération simultannée de plusieurs indicateurs complémentaires.
Comme E. coli est presque unanimement considéré comme le meilleur indicateur de contamination fécale (au moins pour les eaux douces), nous avons décidé de l’utiliser comme modèle de bactérie fécale dans ce travail. Néanmoins dans certaines parties de ce travail, les entérocoques intestinaux et les CF ont aussi été quantifiés. Comme les CF sont encore aujourd’hui un paramètre normatif de la qualité microbiologique des eaux, ils offrent l’avantage d’être à certains endroits mesurés régulièrement depuis parfois de nombreuses années ; il existe donc pour ce paramètre des bases de données importantes qu’il est intéressant d’exploiter par exemple pour la validation de modèles (voir chapitre VII). Dans les rivières du bassin de la Seine qui sont le site d’étude de notre travail, les abondances de E. coli et de CF sont bien corrélées (Figure 1) et les E. coli représentent en moyenne 77 % des CF.
II.INTRODUCTION GÉNÉRALE
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0 2 4 6 8
Log (CF/100ml)
Log (E. coli/100ml)
Figure 1. Régression linéaire en coordonnées Log-Log entre le nombre de coliformes fécaux et le nombre de E. coli dans des rivières du bassin de la Seine.
Log (E. coli /100ml) = 0.915 Log (CF/100 ml) + 0.047 (r2= 0.90, n= 167, p<0.001) II. 3. Les normes de qualité microbiologique des eaux
Pour un niveau de contamination microbiologique donné, le risque sanitaire dépend de l’usage qui est fait de l’eau. L’eau qui est directement consommée, qui est utilisée comme ressource dans une usine de production d’eau potable, qui sert pour l’hygiène, la baignade ou pour d’autres activités récréatives nautiques, ou encore qui est utilisée pour l’irrigation des cultures n’expose évidemment pas aux mêmes risques sanitaires. De ce fait, des normes différentes ont été établies pour chacun de ces usages.
Les études épidémiologiques permettent de faire le lien entre l’exposition à un facteur donné et l’incidence d’infections dues à cette exposition. Elles donnent une estimation du risque en fonction d’un niveau d’exposition ou dose (dans le cas des maladies d’origine hydrique, une abondance d’indicateurs) et peuvent donc être utilisées pour définir des normes appropriées.
Les études épidémiologiques qui conduisent à la définition de normes doivent être de la plus grande rigueur de façon à entraîner l’adhésion à ces normes. Néanmoins ce type d’étude ne donne qu’une estimation statistique d’une relation risque/facteur contrairement à d’autres méthodes expérimentales, mais elles sont souvent pour diverses raisons (éthiques, logistiques,
financières, etc…) les seules accessibles. Les limites méthodologiques des études épidémiologiques sont généralement atteintes lorsqu’il s’agit de mesurer de très faibles changements du risque, ce qui implique le traitement d’échantillons trop vastes pour être accessibles.
Des études épidémiologiques sont à l’origine des normes pour la réutilisation des eaux usées (WHO, 1989) et de la norme pour les eaux à usage récréatif (WHO, 1998) contrairement aux normes pour l’eau de boisson qui sont basées sur le principe de précaution (absence totale d’indicateurs de contamination fécale) (Blumenthal et al., 2001).
Pruss (1998) présente une revue des études épidémiologiques disponibles concernant les eaux à usage récréatif. Sur 22 études identifiées seulement 7 concernaient les eaux douces (Stevenson, 1953; Cabelli et al., 1982; Dufour, 1984; Seyfried et al., 1985; Lightfoot, 1989; Ferley et al., 1989; Fewtrell et al., 1992). Cette revue met en évidence une forte corrélation entre l’abondance d’indicateurs et l’occurrence de maladies gastro-intestinales et montre que E. coli est le meilleur indicateur de risque sanitaire pour les eaux douces.
Pour un usage donné de l’eau, les normes n’ont aucune raison d’être identiques partout dans le monde. En effet, des facteurs locaux influencent le risque que constitue un niveau de contamination donné. Ce sont, entre autres : (i) le background génétique et immunologique de la population, ce dernier étant lui-même corrélé à la prévalence d’infections diverses dans cette population et à l’écologie microbienne de la région considérée; (ii) le type de pathogènes présents et leur proportion par rapport aux indicateurs et (iii) la différence de survie des microorganismes d’origine fécale dans des milieux aquatiques différents. Pour illustrer cette diversité au niveau des normes, le tableau 3 reprend diverses normes pour différents usages de l’eau dans différentes régions du monde. Il faut noter qu’aujourd’hui le niveau des normes est en général établi partout dans le monde sur base d’études épidémiologiques conduites seulement en régions tempérées et dont les résultats ne sont probablement pas directement transposables à d’autres régions comme les régions tropicales ; il semble aujourd’hui important de lancer des études épidémiologiques spécifiques à chaque région pour y garantir la pertinence des normes de qualité microbiologique.
Même si des critiques peuvent être émises sur la manière dont ces normes ont été établies et sur leur réelle signification sanitaire, personne peut nier l’utilité de leur caractère préventif. Une meilleure gestion du risque sanitaire associé à l’eau nécessite de poursuivre les études
II.INTRODUCTION GÉNÉRALE
épidémiologiques afin de mieux appréhender la relation entre la présence des indicateurs et l’apparition de maladies mais nécessite aussi d’approfondir l’étude de l’écologie des germes indicateurs et pathogènes dans le milieu aquatique naturel. Notre travail s’inscrit tout à fait dans cette dernière problématique.
Tableau 3. Normes microbiologiques de la qualite de l’eau pour divers usages et pour différentes régions du monde (d’après Salas (1998) dans le protocole Annapolis (WHO, 1999))
III.OBJECTIFS ET PLAN DE LA THÈSE
III. Objectifs et plan de la thèse
L’objectif à long terme du travail présenté ici était de développer un modèle de la dynamique des bactéries fécales dans un milieu naturel récepteur tel que les rivières. Pour ce travail de modélisation ainsi que pour les travaux expérimentaux nécessaires au développement du modèle, nous avons choisi comme site d’étude les rivières du bassin de la Seine ainsi que l’estuaire de Seine. Nous avons, par ailleurs, choisi de porter notre attention sur une espèce particulière de bactéries entériques, les Escherichia coli car ils sont aujourd’hui considérés comme le meilleur indicateur de contamination fécale récente des eaux (Edberg et al., 2000).
Les travaux présentés ici ont été menés dans le cadre de deux grands programmes français interdisciplinaires de recherche en environnement dans lesquels le laboratoire d’Ecologie des Systèmes Aquatiques participe aux travaux sur la qualité microbiologique des eaux: le programme PIREN-Seine (Meybeck et al., 1998); http://www.sisyphe.jussieu.fr/internet/piren/) qui porte sur l’ensemble du bassin de la Seine et le programme Seine-Aval (http://seine- aval.crihan.fr/) qui porte spécifiquement sur l’estuaire de Seine. Le bassin hydrographique de la Seine (Figure 2) couvre une superficie d’environ 78600 km2 où se concentrent 30% de la population française, 40% de l’activité économique et 50% du trafic fluvial français. Il est un des plus densément peuplé d’Europe avec en moyenne 195 habitants. km-2 distribués de façon inégale (de 50 hab.km-2 dans les parties amont du bassin à plus de 4000 hab.km-2 à Paris). La haute densité de population du bassin de la Seine et les activités agricoles intenses (les terres arables représentent 51% du bassin et les zones d’élevage 17%) qui s’y déroulent impliquent des apports très importants de micro-organismes d’origine fécale. Ceci a considérablement dégradé la qualité microbiologique de la plupart des rivières du bassin. La restauration et/ou la conservation de la qualité microbiologique des eaux est très importante car les eaux de rivières sont couramment utilisées dans le bassin pour la production d'eau potable. Ainsi, en Ile-de- France, une part dominante de l'eau potable est produite à partir des eaux de la Seine, la Marne et l'Oise. D'autre part, dans le cadre de la prise de conscience écologique générale de ces dernières années, divers mouvements citoyens militent en faveur d’une amélioration de la qualité microbiologique des eaux de ces rivières, amélioration dont l’avantage le plus évident serait de retrouver la possibilité d’y pratiquer des activités récréatives telles que la baignade.
A
B
Figure 2. Cartes du bassin de la Seine : (A) Usage du sol; (B) Réseau hydrographique (SIG PIREN-Seine).
III.OBJECTIFS ET PLAN DE LA THÈSE
L’énumération des E. coli dans les eaux se fait habituellement en utilisant des méthodes de microbiologie classique basées sur la mise en culture des bactéries. Il est aujourd’hui reconnu que ces méthodes sont loin d’être parfaites. On peut leur reprocher notamment de ne pas prendre en compte des bactéries stressées de par les conditions rencontrées dans le milieu aquatique et qui ont perdu leur pouvoir de multiplication dans ou sur les milieux utilisés pour leur énumération mais ont conservé certaines activités métaboliques. Les méthodes de mise en culture présentent également l’inconvénient de nécessiter un temps de réponse de 24 à 48 h ce qui exclut de les utiliser pour effectuer du monitoring en temps réel. Dans ce travail, nous avons contribué au développement et à la validation de nouvelles méthodologies d’énumération des E. coli dans les eaux, plus rapides et plus performantes que les méthodologies classiques. Ce travail fait l’objet du chapitre VI de ce mémoire ainsi que des trois premières publications reprises dans la seconde partie de ce document.
Pour comprendre et pouvoir modéliser le comportement des E. coli dans les rivières, il était nécessaire de quantifier les apports de ce type de bactéries vers les rivières. Ces apports peuvent être soit ponctuels comme les rejets des effluents traités des stations d’épuration des eaux usées (STEPs), soit diffus lorsqu’ils résultent du ruissellement et du lessivage des sols en zone rurale. Un effort de recherche a été accompli pour la quantification de ces apports. Ce travail fait l’objet du chapitre V et des publications 4 et 5 reprises dans la seconde partie de ce document.
L’identification et la quantification des processus conduisant à la diminution de l’abondance des bactéries fécales en aval d’un site d’apport important ainsi que l’identification des facteurs de contrôle de ces processus sont également nécessaires au développement d’un modèle de la dynamique des bactéries fécales en rivières. L’importance de ces processus est discutée dans le chapitre VI du travail. La publication 6, reprise dans la seconde partie de ce document, décrit une étude de l’importance de l’attachement des E. coli aux matières en suspension (MES) dans l’eau des rivières et de l’impact de cet attachement sur leur devenir dans l’environnement aquatique. La publication 7 qui constitue une synthèse des travaux accomplis par le laboratoire d’Ecologie des Systèmes Aquatiques sur la qualité microbiologique des eaux du bassin de la Seine dans le cadre du programme PIREN-Seine reprend aussi une présentation de quelques
uns des principaux résultats obtenus sur les processus affectant le devenir des bactéries fécales dans les rivières du bassin.
Un module décrivant la dynamique des bactéries fécales en rivières a été conçu sur base des connaissances expérimentales acquises. Ce module a été couplé à un modèle écologique de qualité de l’ensemble des rivières du bassin de la Seine, le modèle SENEQUE (Ruelland et Billen, 2004). Le modèle couplé est dès lors capable de prédire la concentration en bactéries fécales pour toutes les conditions hydrologiques dans toutes les rivières du bassin de la Seine.
Par ailleurs, le module décrivant la dynamique des bactéries fécales a également été couplé à un modèle décrivant l’hydrodynamique et le transport des particules dans l’estuaire de Seine : le modèle SiAM-3D (Cugier et Le Hir, 2002). Ce couplage permet de prédire la distribution des bactéries fécales le long de l’estuaire de Seine dans toutes les conditions hydrologiques.
Une fois validés, ces modèles peuvent être des outils précieux de gestion de la qualité du milieu aquatique et d'aide à la décision en matière d'assainissement. Les travaux de modélisation sont présentés dans le chapitre VII. La publication 7 présente quelques-uns des principaux résultats de modélisation dans les rivières du bassin. La publication 8 présente, pour sa part, les travaux de modélisation de la qualité microbiologique des eaux de l’estuaire de Seine.
IV.ASPECTS MÉTHODOLOGIQUES
IV. L’énumération des coliformes et des E. coli dans les eaux - aspects méthodologiques
IV.1. Les méthodes d’énumération basées sur la mise en culture.
Les méthodes traditionnelles pour l’énumération des bactéries fécales sont basées sur la mise en culture de celles-ci. Bien que, ces dernières années, nombre de publications aient proposé des méthodes alternatives aux méthodes classiques d’énumération des bactéries fécales dans les eaux de surface, ces dernières sont néanmoins encore utilisées de manière systématique pour le contrôle en routine de la qualité microbiologique des eaux et sont toujours les seules reprises dans les normes.
Deux grands types de méthodes basées sur la mise en culture sont régulièrement utilisés : - La détermination du nombre le plus probable (NPP) : des dilutions décimales de
l’échantillon sont inoculées dans une série de tubes contenant un milieu de culture liquide spécifique. La loi de Poisson permet de calculer le NPP sur base de la proportion de tubes positifs dans chaque dilution.
- La méthode de filtration sur membrane (MF) : un volume défini de l’échantillon est filtré et la membrane est incubée sur un milieu gélosé spécifique. Différents milieux et conditions d’incubation (temps et température) peuvent être utilisés selon le type de bactéries fécales recherché (Rompré et al., 2002). Le résultat s’exprime en UFC (unité formant colonie) par unité de volume.
Pour l’énumération des coliformes et des E.coli, les milieux spécifiques classiques utilisés pour la détermination du NPP ou des UFC possèdent du lactose et un indicateur pour identifier la production d’acide. Ils contiennent aussi des détergents et/ou des sels biliaires pour inhiber la croissance des gram + et des levures. Le milieux liquide spécifique le plus utilisé en France pour l’énumération des coliformes dans l’eau est le bouillon lactosé au vert brillant. Les milieux gélosés spécifiques les plus utilisés pour l’énumération des coliformes sont: le milieu m-Endo et le milieu lactosé TTC-Tergitol. Le milieu mTEC est souvent utilisé pour l’énumération des E. coli. Dans notre étude, le milieu lactosé TTC-Tergitol, qui est le milieu normalisé en France, a été utilisé pour le dénombrement des CF (voir le protocole détaillé dans la publication 2).
Pour augmenter la spécificité et diminuer le temps de réponse des méthodes basées sur la mise en culture, des propriétés enzymatiques des coliformes et des E. coli sont aujourd’hui exploitées. La détection de l’activité de la β-D-galactosidase (une enzyme spécifique des coliformes) et celle de la β-D-glucuronidase (une enzyme spécifique des E. coli) sont utilisées pour mettre en évidence la présence de ces bactéries. Des substrats chromogéniques et fluorogéniques ont été incorporés dans les milieux de culture ; l’hydrolyse de ces substrats par les enzymes spécifiques donne lieu à des produits colorés ou fluorescents qui permettent une détection aisée de l’activité enzymatique ciblée (Manafi, 2000). Quelques milieux de culture basés sur ces propriétés enzymatiques permettent la détection simultanée des coliformes et des E. coli.
La connaissance des propriétés enzymatiques de ces bactéries a également permis de développer l’approche dite “defined substrate technique” (Edberg et al., 1991) : Elle consiste à fournir comme seul substrat dans le milieu, un composé nécessitant l’activité enzymatique ciblée pour pouvoir être utilisé ; seul le groupe de bactéries ciblé peut donc croître. Une méthode normalisée (ISO 1899-1) et miniaturisée est aujourd’hui utilisée pour l’énumération des E. coli pour le contrôle de routine de la qualité microbiologique des eaux en France. Dans cette méthode NPP miniaturisée, une microplaque de 96 puits contenant un substrat fluorogénique pouvant être hydrolysé par la β-D-glucuronidase est utilisé. Chaque puit est inoculé avec des dilutions décimales de l’échantillon d’eau. Les puits positifs sont énumérés sous illumination UV et le NPP est calculé. Cette méthode de dénombrement des E. coli a été utilisée dans ce travail (voir le protocole détaillé dans la publication 1).
IV. 2. La problématique des bactéries fécales non cultivables
A l’origine de l’utilisation des méthodes basée sur la mise en culture, on considérait que la différence entre bactéries «mortes» et bactéries «vivantes » s’exprimait par la capacité de ces cellules à se multiplier ou pas dans ou sur des milieux et dans des conditions considérées optimum pour leur croissance. Aujourd’hui, on sait pertinemment que la frontière entre la vie et la mort d’une bactérie ne peut être définie par cet unique et simple concept.
En effet, depuis le courant des années 1980, d’importants développements méthodologiques très variés ont permis de mettre en évidence l’existence d’une proportion importante de bactéries présentes dans les milieux aquatiques naturels qui n’étaient pas capables de se
IV.ASPECTS MÉTHODOLOGIQUES
développer dans les milieux de culture (bactéries non cultivables) mais présentaient certaines caractéristiques qui démontraient leur activité ou leur viabilité. Diverses méthodes sont utilisées pour évaluer l’activité ou la viabilité des bactéries (Kell et al., 1998 ; Keer and Birch, 2003): mesures de l’intégrité cellulaire comme l’intégrité membranaire ou le potentiel de membrane, mesures d’activités métaboliques comme l’utilisation d’un substrat ou la synthèse de protéines, la détection d’une activité respiratoire ou d’une activité enzymatique ou encore la détection de synthèse d’ARNm ou d’ARNr. Les bactéries présentant certaines activités mais incapables de se multiplier en culture ont été intitulées « Bactéries Viables mais Non Cultivables », ou VBNC (Colwell et al., 1985; Grimes and Colwell, 1986; Rollins and Colwell, 1986; Roszak and Colwell, 1987). Certains auteurs (Kell et al., 1998 ; Joux and Lebaron, 2000) ont proposé l’utilisation du terme ANC (Actives Non Cultivables) comme plus approprié que le terme VNBC pour décrire ces bactéries vu que la « viabilité » dont on parle est souvent définie par la mesure de certaines propriétés cellulaires qui ne sont pas forcement en relation avec la capacité de ces cellules à se reproduire. Cet état VBNC ou ANC a été mis en évidence pour des bactéries autochtones du milieu aquatique mais aussi pour diverses bactéries entériques dans le milieu aquatique (Colwell et al., 1985; Grimes et Colwell, 1986; Roszak et Colwell, 1987).
L’habitat naturel des E. coli est l’intestin des animaux à sang chaud qui offre un environnement à température constante et élevée (37 °C) et des concentrations élevées en substrats organiques aisément assimilables comme les acides aminés et les sucres, tous facteurs favorables au développement bactérien (Savageau, 1983). Une fois rejetées dans le milieu naturel, ces bactéries se trouvent confrontées à des conditions défavorables telles que la limitation en nutriments, le stress osmotique, de faibles températures et des variations de pH ainsi que face à de multiples prédateurs. Une partie de ces bactéries peuvent survivre à ces conditions défavorables en entrant dans l’état VBNC (Kjelleberg et al., 1993 ; Smith et al. 1994; Ravel et al., 1995; Trousselier et al. 1998 ; Rozen and Belkin, 2001 ; Oliver, 2005).
En effet, de nombreuses publications montrent qu’après leur introduction dans un milieu aquatique naturel, les bactéries fécales perdent assez rapidement leur faculté de croître dans ou sur les milieux spécifiques utilisés pour leur dénombrement mais conservent beaucoup plus longtemps certaines activités métaboliques (Roszak et al., 1984 ; Colwell et al., 1985 ; Grimes and Colwell, 1986 ; Barcina et al., 1989; Pommepuy et al., 1996 ; Bjergbaek and Roslev, 2005;
Lleo et al., 2005 ; Oliver et al., 2005). Différentes études ont, par ailleurs, suggéré que ces bactéries actives mais non cultivables pouvaient conserver leur pathogénicité (Colwell et al., 1985; Smith et al., 1994; Ravel et al., 1995; Pommepuy et al., 1996 ; Rozen and Belkin, 2001;
Pruzzo et al., 2002; Maalej et al., 2004). Si les bactéries entériques VBNC présentes dans les milieux aquatiques sont effectivement capables de « ressusciter » de ce stade « dormant » et de se reproduire le risque sanitaire serait alors systématiquement sous-estimé par les méthodes de dénombrement par mise en culture (Ravel et al., 1995; Huq et al., 2000).
Aujourd’hui, le concept de bactéries VBNC fait encore l’objet de débats passionnés sur la signification exacte de cet état (Oliver, 1993, 2005; Joux and Lebaron, 1997 ; Kell et al., 1998 ; McDougald et al., 1998). Deux visions divergentes s’opposent (Mc Dougald et al., 1998 ; Winfield and Groisman, 2003). La première présente l’état VBNC comme une stratégie de survie, et donc un processus actif qui conduit à une différenciation. Cette hypothèse veut que cet état soit réversible et que dans certaines conditions ces cellules « ressuscitent » et soient capables de se reproduire. L’autre vision présente cet état comme une étape irréversible conduisant vers la mort. Ces cellules seraient capables de maintenir certaines activités métaboliques ou respiratoires pendant un temps limité mais ne seraient pas capables de
« ressusciter ».
De nombreuses études ont tenté d’induire une « ressuscitation », celle ci serait la meilleure mesure d’une réelle viabilité (Nilsson et al., 1991; Roszak et al., 1984 ; Roth et al., 1988 ; Evdokimova et al., 1994; Oliver and Bockian, 1995 ; Ravel et al., 1995). Dans la plupart de ces études, la « ressuscitation » n’a été possible que sur les cultures qui sont restées dans l’état VBNC pour de courtes périodes de temps (McDougald et al., 1998). D’autres auteurs contestent ces résultats en suggérant que la croissance observée était due à quelques cellules cultivables présentes en abondance inférieure à la limite de détection de la méthode d’énumération par mise en culture utilisée (Morgan et al., 1991 ; Weichart et al., 1997 ; Bogosian et al., 1996 et 1998)
L’intérêt croissant pour le développement de nouvelles méthodes de dénombrement spécifiques capables de détecter les bactéries fécales dans l’état VBNC dans les eaux de surface découle tout naturellement de ce qui précède.
IV.ASPECTS MÉTHODOLOGIQUES
IV. 3. Les méthodes moléculaires
Les méthodes moléculaires de détection de bactéries fécales (pathogènes et indicateurs) ont été l’objet d’un important travail de recherche durant les dernières années. Les méthodes moléculaires présentent l’avantage d’être rapides, spécifiques ; elles ne nécessitent pas d’étape de mise en culture mais présentent l’inconvénient d’être chères. De plus, certaines ne font pas toujours la distinction entre les bactéries vivantes et mortes.
Etant donné leur capacité à détecter des bactéries présentes en très faible nombre dans les échantillons d’eau, de nombreux travaux ont été consacrés à l’identification et à la quantification directe de pathogènes, faisant donc l’économie de l’énumération des indicateurs.
Dans cette courte revue bibliographique sur les méthodes moléculaires, nous nous limiterons à présenter celles utilisées pour l’énumération des indicateurs en général et des E. coli en particulier.
Méthodes immunologiques. Ces méthodes sont basées sur la spécificité de la reconnaissance antigène/anticorps ; les deux techniques les plus importantes sont l’ELISA et l’Immunofluorescence. L’ELISA manque de sensibilité et de spécificité pour les échantillons naturels dans lesquels il y a un nombre très élevé de bactéries non-cibles et une concentration importante en particules qui interfèrent avec la réaction (Rompré et al., 2002).
L’immunofluorescence permet jusqu’à l’identification d’une cellule unique dans un échantillon environnemental (Campbell, 1993) ; mais ces méthodes donnent parfois un nombre élevé de faux positifs (Hubner et al., 1992) et ne donnent aucune information sur l’état physiologique des bactéries.
PCR (polimerase chain reaction). Cette méthode permet d’amplifier un fragment cible d’ADN par une réplication cyclique. L’amplification exponentielle du fragment cible permet de détecter un nombre relativement faible d’organismes cibles dans un échantillon. Ce fragment cible doit être spécifique de l’espèce recherchée. Le gène uid A qui code pour l’enzyme β-D- glucuronidase (spécifique de E. coli) et sa région de régulation uid R ont été utilisés avec succès pour la détection des E. coli dans les eaux (Bej et al., 1991; Tsai et al., 1993 ; Fricker and Fricker, 1994; Juck et al., 1996; Iqbal et al., 1997).
La PCR multiplex qui implique l’amplification simultanée de différentes séquences a été utilisée par Bej et al. (1991) pour détecter différentes bactéries fécales comme les CT, E. coli,
Salmonella spp. et Shigella spp. La Nested PCR, qui consiste à effectuer deux PCRs consécutives la seconde étant réalisée avec des primers localisés à l’intérieur du premier fragment amplifié, a été utilisée par Juck et al. (1996) pour détecter des E. coli à des concentrations très faibles. La PCR in situ inclut la fixation cellulaire et la perméabilisation, et permet aux composants de la réaction de rentrer dans la cellule, les produits de PCR marqués avec un fluorochrome peuvent être détectés par un système d’analyse d’images. Tani et al.
(1998) ont développé un protocole de PCR in situ pour la détection de E. coli.
D’autres protocoles de PCR visent à quantifier le nombre de molécules cibles dans un échantillon, c’est le cas de la PCR compétitive. Dans ce type de protocole, on ajoute dans l’échantillon une quantité connue d’une séquence quasi identique (compétiteur) à la séquence cible et on compare la quantité de produits de PCR des deux séquences, on peut ainsi quantifier l’abondance de la bactérie cible. La «PCR en temps réel» (Real Time PCR) est également une PCR quantitative, elle se base sur la détection et la quantification d’un rapporteur fluorescent. Le signal fluorescent augmente proportionnellement à la quantité de produit d’amplification pendant la phase exponentielle; le temps nécessaire à atteindre un niveau donné de fluorescence est une mesure de la quantité initiale de la séquence cible présente dans l’échantillon.
Pour étudier la dynamique des E. coli en rivières, les méthodes basées sur la PCR présentent le désavantage majeur de ne donner aucune information sur l’état physiologique des bactéries cibles. Si le matériel génétique cible est intact, les bactéries mortes seront comptabilisées.
FISH (Fluorescent in situ hybridisation): Cette méthode se base sur la détection par une sonde oligonucléotidique marquée d’une séquence cible spécifique au sein d’une cellule intacte. Ces cellules sont énumérées le plus souvent par microscopie à épifluorescence mais peuvent l’être avec une meilleure sensibilité par cytométrie en phase solide (Lemarchand et al., 2001). Les séquences cibles doivent être spécifiques du micro-organisme, espèce ou groupe recherché.
Cette technique groupe les avantages des méthodes moléculaires (précision, rapidité, pas de nécessité de culture) avec l’information visuelle donnée par la microscopie. Elle permet en même temps l’identification, la visualisation et la quantification de cellules cibles au sein d’un échantillon (Moter and Gobel, 2000).
Les séquences utilisées en microbiologie comme cibles pour le FISH se trouvent souvent dans l’ ARN ribosomial 16S. Ce segment est génétiquement stable et la structure du domaine
IV.ASPECTS MÉTHODOLOGIQUES
présente des séquences conservées au cours de l’évolution et d’autres variables qui permettent de faire la différence entre espèces (Amann et al., 1990, 1995). Ces séquences étant en grand nombre de copies dans les cellules (Woese, 1987), la sensibilité de la méthode en est améliorée.
Diverses sondes spécifiques pour l’ARNr de E. coli ont été développées (Tableau 4).
Tableau 4. Séquences développées pour l’identification de E. coli dans l’environnent (modifié d’après Rompré et al. (2002)).
Sonde Séquence 5’-3’ Cible (ARNr) References
EC1531 CACCGTAGTGCTCGTCATCA 23S, 1531-1550
Poulsen et al., 1994 COLINSITU GAGACTCAAGATTGCCAGTATCAG ARNr 16S, 637-
660
Regnault et al., 2000 PNA probe GCAAAGCAGCAAGCTC ARNr 16S, 71-86 Prescott and Fricker, 1999
La sonde Colinsitu (Regnault et al., 2000) montre une excellente spécificité pour E. coli et semble appropriée pour l’usage dans des échantillons d’eaux naturelles.
Le contenu en ARNr peut être considéré comme un indicateur de l’état physiologique des cellules bactériennes (Amann et al., 1995; Wallner et al., 1995). Cet aspect qui peut être exploité pour des études écologiques, pose un problème pour l’application de la méthode pour la détection des E. coli dans les échantillons d’eaux naturelles. En effet, les conditions de stress rencontrées par les bactéries fécales dans les eaux naturelles font que leur contenu en ARN ribosomial est faible, entraînant une faible fluorescence après marquage par une sonde moléculaire et donc une difficulté de visualisation en microscopie (Amann et al., 1995, Lebaron et al., 1997).
Une solution pour palier ce problème peut être d’utiliser des systèmes permettant d’accroître le signal de fluorescence comme un système d’amplification du signal à la tyramide (TSA) qui se base sur la capacité du complexe streptavidine-peroxidase de se fixer à une sonde spécifique liée à la biotine (Lebaron et al., 1997). D’autres auteurs ont proposé de coupler le FISH avec une étape de « Direct Viable Count » (DVC) (Kogure et al., 1979). La procédure DVC consiste à incuber les bactéries dans un milieu riche en présence d’antibiotiques qui inhibent la division cellulaire ; à la suite de cette incubation, les cellules actives sont allongées ce qui permet de les distinguer des inactives. Cette élongation des cellules actives s’accompagne d’un
accroissement du contenu en ARNr sans changer le nombre de bactéries. Ce couplage offre donc le double avantage de faciliter la détection des bactéries après marquage par une sonde moléculaire fluorescente et de permettre la seule énumération des cellules actives (cellules présentant une activité métabolique dans les conditions d’incubation en présence du milieu riche de la procédure DVC). Ce couplage des méthodes DVC et FISH a été utilisé avec succès pour l’énumération des entérobactéries dans l’eau (Baudart et al., 2002, 2005). Dans le cadre de cette thèse, nous avons appliqué un protocole DVC-FISH pour l’énumération des cellules de E. coli viables dans les eaux de rivières et les eaux usées ; ceci fait l’objet de la section suivante.
IV. 4. Développement d’une méthode d’hybridation in situ couplée à un critère de viabilité pour l’énumération des E. coli dans les eaux de surface et les eaux usées
L’objectif de cette partie du travail était de développer une méthode permettant d’énumérer en rivières des cellules de E. coli viables. Cette méthode (DVC-FISH) résulte du couplage de la procédure « Direct Viable Count » (DVC) (Kogure et al., 1979) et de l’hybridation in situ avec une sonde oligonucléotidique fluorescente (FISH) spécifique d’E. coli. Dans ce travail, les antibiotiques utilisés dans la procédure DVC sont l’acide nalidixique et la ciprofloxacine ; la sonde moléculaire « Colinsitu » spécifique d’un segment de l’ARN 16s ribosomal de E. coli (Regnault et al., 2000) marquée par le fluorochrome CY3 a été utilisée. Les cellules hybridées ont été énumérées par microscopie à épifluorescence. Le développement et l’application de ce protocole à des eaux de rivières et usées font l’objet de la publication 1 de la seconde partie du document.
Les résultats obtenus montrent que le seuil de détection de la méthode se situe aux environs de 3000 E. coli viables parmi un grand nombre de bactéries non fécales avec une précision identique à celle des dénombrements par les méthodes basées sur la mise en culture (Figure 1 de la publication 1). Cependant, cette limite est dependante du volume d’échantillon filtré (100 ml dans le cas de la Figure 1 de la publication 1), donc pour etre plus precis on pourrait dire que la limite de detection est de 3000 E.coli sur le filtre. En dessous, de cette valeur, les dénombrements n’offrent plus une précision et une reproductibilité suffisante. Les dénombrements effectués dans les eaux de rivières et les eaux usées par la méthode DVC-FISH donnent systématiquement des concentrations de E. coli supérieures à celles obtenues avec une
IV.ASPECTS MÉTHODOLOGIQUES
méthode de mise en culture (méthode NPP miniaturisée) (Figure 3 de la publication 1). Le ratio entre ces deux comptages (DVC-FISH/NPP) augmente quand l’abondance des E.coli cultivables diminue. Si on considère comme VBNC les E. coli détectables par la méthode DVC-FISH et pas par la mise en culture, cela signifie que la proportion des E. coli viables mais non cultivables (VBNC) est plus grande dans les environnements peu contaminés (Figure 4 de la publication 1). Nous avons fait l’hypothèse que des conditions plus stressantes (stress nutritionnel, effet de la lumière) rencontrées dans les milieux les moins contaminés sont responsables de la plus grande fraction de VBNC. Pour tester cette hypothèse nous avons inoculé une eau minérale stérile avec une souche d’E. coli. La décroissance de la concentration initiale d’E. coli a été suivie par les deux méthodes (Figure 5 de la publication 1). Les résultats obtenus confirment que les conditions stressantes rencontrées dans ce microcosme induisent l’apparition d’E. coli VBNC, détectables avec la méthode DVC-FISH mais pas par la méthode de mise en culture. Finalement, nous avons établi un profil longitudinal de la concentration des E. coli le long de la Seine après le rejet d’eaux très contaminées en provenance de la station d’épuration d’Achères (Figure 6 de la publication 1). Les résultats montrent que la fraction des E. coli VBNC augmente quand le temps de résidence augmente.
Le travail réalisé a montré que la méthode DVC-FISH est un bon outil pour étudier l’abondance des E. coli viables dans le milieu naturel et que, dans certains environnements aquatiques, l’abondance des E. coli est sous-estimée de manière très importante par les méthodes de mise en culture utilisées pour le contrôle de routine ce qui est interpellant du point de vue sanitaire.
IV. 5. Mesure directe de l’activité β-D-glucuronidasique
La mesure de l’activité de la β-D-glucuronidase des E. coli sans passage par une étape de mise en culture des échantillons a été proposée comme alternative aux dénombrements par mise en culture dans les eaux côtières (Fiksdal et al., 1994). Par la suite, des travaux menés dans notre laboratoire ont permis de proposer un protocole standardisé pour son utilisation dans des eaux douces (George et al., 2000). La méthode consiste à filtrer un échantillon d’eau (en général 100 ml), à incuber le filtre dans un tampon à pH optimal (6.9) et à température optimale (44 °C) en présence du substrat fluorogène (4-méthylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUGlu) en concentration saturante et à mesurer l’apparition de la fluorescence au cours du temps (George
et al., 2000). L’apparition de la fluorescence est due à la methylumbelliferone (MUF) résultant de l’hydrolyse du substrat MUGlu par la β-D-glucuronidase des E. coli et est proportionnelle à la quantité d’enzymes présentes dans l’échantillon qui est elle même proportionnelle au nombre des E. coli dans l’échantillon. Ce protocole permet de mesurer l’activité β-D- glucuronidasique (activité GLU) en 30 minutes. Par ailleurs, George et al. (2002) ont développé quelques arguments suggérant que la mesure de l’activité GLU permet de détecter l’activité de E. coli qui ne seraient pas cultivables.
La mesure directe de l’activité GLU avec le type de protocole décrit ci-dessus a été appliquée avec succès à divers types d’échantillons : eaux de mer, eaux douces et eaux usées (George et al., 2000, 2001a, 2001b, 2002, 2004; Farnleitner, 2001; Caruso et al., 2002). Ces différents travaux ont tous montré une corrélation significative entre le Log de l’activité GLU et celui de l’abondance en coliformes fécaux dénombrés sur gélose. Plus récemment, Farnleitner et al.
(2002) dans des travaux menés sur des rivières polluées ont montré une relation entre le Log de l’activité GLU et celui de l’abondance des E.coli dénombrés sur gélose.
La rapidité, la simplicité du protocole expérimental et un coût équivalent à celui des méthodes de dénombrement sur gélose ont permis de proposer la mesure de l’activité GLU comme une méthode rapide pour un contrôle en temps réel de la qualité microbiologique des eaux. La publication 2 présente les travaux menés dans le cadre de cette thèse sur la validation de la mesure de l’activité GLU comme un système « early warning » de détection de la pollution fécale en eaux douces.
Dans ce travail, nous avons confirmé sur plus de 150 échantillons d’eau de rivières du bassin de la Seine très différemment contaminés les corrélations significatives précédemment décrites entre le Log de l’activité GLU et le Log de l’abondance en CF (dénombrement sur milieu gélosé) et de E. coli (NPP estimé par la méthode microplaque) (Figures 2 et 3 de la publication 2). Nous avons également montré que la reproductibilité de la méthode enzymatique était meilleure que celle des méthodes basées sur la mise en culture testées dans cette étude. Les équations des régressions linéaires Log-Log établies permettent de calculer un nombre de CF ou d’E. coli à partir d’une valeur de l’activité glucuronidasique. Ces valeurs d’abondance calculées peuvent être comparées aux normes ce qui est une exigence des gestionnaires des milieux aquatiques. Nous avons montré que l’activité GLU pouvait être très utile pour une surveillance en temps réel des eaux d’entrée d’une usine de production d’eau potable ; la
IV.ASPECTS MÉTHODOLOGIQUES
méthode permettant une détection très rapide des pics de pollution microbienne et donc une éventuelle adaptation du traitement de potabilisation (Figure 4 de la publication 2). Un suivi longitudinal de la qualité microbiologique des eaux de la Seine a par ailleurs confirmé la capacité de la mesure de l’activité GLU à mettre correctement en évidence des variations spatiales de la qualité microbiologiques des eaux (Figure 5 de la publication 2).
La droite de régression Log-Log entre l’activité GLU et l’abondance des E. coli présentée à la figure 2 de la publication 2 ainsi que celles publiées (George et al., 2000, 2001a, 2001b, 2004;
Farnleitner et al., 2001; Caruso et al., 2002) entre l’activité GLU et l’abondance des CF cultivables ont toutes des pentes inférieures à 1 (Tableau 1 de la publication 3). George et al.
(2000) avaient émis l’hypothèse que ceci serait du à une sous-estimation de l’abondance des CF et des E. coli par les méthodes de mise en culture dans les milieux peu contaminés en raison de la présence dans ces milieux d’un grand nombre d’E. coli actifs mais non cultivables (cad présentant une activité Glu détectable mais incapable de se multiplier dans ou sur les milieux de culture. Le dénombrement des E. coli viables par la méthode DVC-FISH a été comparé à la mesure de l’activité GLU sur des échantillons d’eau douce pour tester cette hypothèse.
Les résultats présentés dans la publication 3 montrent une corrélation significative entre le Log de l’activité GLU et celui des E. coli viables (Figure 1b de la publication 3). La pente de cette corrélation (0.99) est très proche de 1 indiquant une activité glucuronidasique des E. coli viables constante dans tous les environnements étudiés (de très peu pollués à très pollués) alors que l’activité glucuronidasique des E. coli cultivables augmente de façon importante dans les milieux peu contaminés (Figure 2 de la publication 3). Ces résultats valident l’idée que l’activité GLU est proportionnelle à l’abondance des E. coli viables et confirment l’hypothèse d’une proportion plus importante d’E. coli non cultivables dans les milieux peu contaminés. Ce travail a donc permis de valider la mesure de l’activité GLU comme méthode appropriée pour la quantification rapide des E. coli viables dans les milieux aquatiques.
IV. 6. Intérêt et limites de la méthode DVC-FISH et de la mesure de l’activité GLU.
Les résultats de nos travaux sur la méthode DVC-FISH ont montré que celle-ci pouvait être utilisée sur des eaux de rivières et des eaux usées pour énumérer les E. coli. A l’inverse des méthodes basées sur la mise en culture, elle offre l’avantage de dénombrer l’ensemble des E.
