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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Salmon, D. (1996). Caractérisation du récepteur de la transferrine sérique chez le trypanosome africain (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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J) ÛSlSLiî

Université Libre de Bruxelles Faculté des Sciences

Laboratoire de Parasitologie Moléculaire

CARACTERISATION DU RECEPTEUR DE LA TRANSFERRINE

SERIQUE CHEZ LE TRYPANOSOME AFRICAIN

Thèse soumise à l'Université Libre de Bruxelles en vue de l'obtention du grade légal

de Docteur en Sciences Biologiques

Didier Salmon promoteur: E. Pays

Avril 1996

Université Libre de Bruxelles Faculté des Sciences

Laboratoire de Parasitologie Moléculaire

CARACTERISATION DU RECEPTEUR DE LA TRANSFERRINE

SERIQUE CHEZ LE TRYPANOSOME AFRICAIN

Thèse soumise à l'Université Libre de Bruxelles en vue de l'obtention du grade légal

de Docteur en Sciences Biologiques

Didier Salmon promoteur: E. Pays

Avril 1996

" Sous la forme du physicalisme et du matérialisme, le réductionnisme a été une très grande

réussite en biologie aussi, quoique pas complètement. Mais, même là où il n'a pas réussi, il

conduit a de nouveaux problèmes et à de nouvelles solutions. " Karl Popper (L'univers

irrésolu)

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

mrx 'J c

FACULTE DES SCIENCES.

L'épreuve publique pour l'obtention du grade légal de Docteur en Sciences de Monsieur SALMON, Didier, Licencié en sciences, pour ie groupe des sciences zoologiques, aura lieu le

LUNDI 10 JUIN 1996 A 16.30 HEURES.

dans l'Auditoire Jean Brachet, Campus de Rhode-St-Genèse, 67, rue des Chevaux à 1640 Rhode-St-Genèse.

Monsieur SALMON, Didier présentera et défendra publiquement une dissertation originale intitulée :

"Caractérisation du récepteur de la transferrine sérique chez le trypanosome africain":

et une thèse annexe intitulée :

"La manipulation de la signalisation de la GPl-PLC de T. brucei dans un système d'expression inductible devrait permettre de comprendre les processus non classiques d'export protéique".

Directeur de thèse : M. PAYS, E.

Q û

Thèse annexe:

"La manipulation de la signalisation de la GPI-PLC de T. brucei dans un système

d'expression inductible devrait permettre de comprendre les processus non classiques

d'export protéique".

ÜNlVËR^ItË' LIBRE DE

FACULTE OE59C16NÇ65.

(Oocuwnt Obstiné à la BlfcllQlhèqua).

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REMERCIEMENTS

Le travail présenté dans le cadre de cette thèse a été réalisé dans le laboratoire de Parasitologie Moléculaire dirigé par le Dr. Etienne Pays. C'est ici l'occasion d'exprimer toute ma reconnaissance à cette équipe de recherche, et tout particulièrement à Annette Pays, Suzon Van Assel, Sylvie Rolin, Patricia Tebabi, Naima Ismaïli et Magali Berberof.

Cette étude est l'aboutissement d'un travail d'équipe, sans laquelle nous n'aurions jamais pu relever ce défi de caractériser ce récepteur exotique chez le trypanosome. De manière plus prosaïque, l'aboutissement de cette étude est également le résultat d'une forte compétition entre les différentes équipes de recherche internationales qui aura fourni l'émulation nécessaire à la réalisation des papiers scientifiques (présents et futurs) découlant de ce travail.

Parmi mes fidèles collaborateurs qui se sont lancés "corps et âme" dans cette aventure passionnée, je tiens particulièrement à remercier:

Etienne Pays, pour son enthousiasme débordant mêlé à une intuition géniale, ponctuée de réalisme;

Maurice Geuskens, pour ses aides précieuses et nombreuses (merci encore pour ces photos splendides), ainsi que pour ses conseils avisés d'expert en ultrastructure et son efficacité;

Larry Ruben, pour m'avoir initié de A à Z aux techniques de biochimie des récepteurs de surface (sans Larry nous n'y serions pas arrivés...);

Jacqueline Hanocq-Quertier, pour m'avoir fait partager son énergie débordante et son bon sens pragmatique;

Françoise Paturiaux-Hanocq, pour son dévouement (je pense notamment aux milliers d'oocytes microinjectés au cours de cette étude), son amour de la recherche, son sens de la perfection (là, je pense à tous les contrôles supplémentaires qu'elle voulait inclure et que nous n'avons jamais eu le temps de réaliser...);

Derek Nolan, pour m'avoir aidé à me parfaire dans l'apprentissage des techniques biochimiques, ainsi que pour son avis éclairé d'expert dans tous les problèmes de biochimie, sans oublier les longues soirées que nous avons passées ensemble à débattre de problèmes en tous genres (des analyses de Scatchard, à la guerre en Irlande en passant par la pêche au lancé franc...);

Daniel Franckx, pour avoir toujours été sur la brèche au moment où l'on avait besoin de ses talents de photographe que l'on aura le plaisir d'apprécier au cours de la lecture de cette thèse.

Je tiens aussi tout particulièrement à remercier Sylvie Rolin, pour m'avoir communiqué

son sens de la recherche, sa loyauté, ainsi que pour ses nombreux services rendus (on se

souviendra encore longtemps des mutants PLC, de nos escapades à Tübingen...).

Je remercie aussi tout le staff BEN (Belgian EMBnet Node) et plus particulièrement Philippe Alard qui m'a initié aux techniques de bio-informatique, ainsi que pour l'intérêt qu'il a montré pour ce travail.

Je remercie l'ITMAS d'Anvers et plus particulièrement'Nestor Van Meirvenne qui, grâce au travail que nous avons fait ensemble portant sur l'améloration des tests diagnostiques de la maladie du sommeil, aura financé une grande partie de ma thèse.

Enfin, je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance à Josiane Szpirer et Oberdan Léo pour avoir accepté déjuger ce travail, et tout particulièrement Frederik Opperdoes pour m'avoir fait l'honneur, en tant qu'expert extérieur, de rapporter ce travail.

Je ne terminerai pas sans saluer la profonde confiance qu'ont toujours su garder en moi mes parents, frères et amis, même et surtout pendant les périodes difficiles.

Je terminerai, en remerciant Karine pour son amour, sa patience et sa compréhension

durant ces quatre années.

TABLE DES MATIERES

TABLE DES MATIERES...i

ABREVIATIONS... vi

RESUME... viii

INTRODUCTION... 1

1.1 LE PARASITE... 2

1.1.1 Présentation... 2

1.1.2 Particularités des trypanosomes... 2

1.1.3 Changements morphologiques et métaboliques au... cours du cycle évolutif du parasite...3

1.1.3.1 Cycle parasitaire de T. brucei... 3

1.1.3.2 Changements morphologiques et métaboliques au cours du cycle parasitaire...4

A) Chez la glossine... 4

B) Chez le mammifère... 5

1.1.4 Variation antigénique (aspects phénotypiques)...7

1.1.5 Relation hôte-parasite et compartimentation... 8

1.1.6 Ultrastructure de T. brucei et présentation de la poche flagellaire, site d'endocytose privilégié du parasite...8

1.1.6.1 Architecture externe et poche flagellaire du trypanosome africain ... 8

1.1.6.2 Ultrastructure interne...10

1.2 LA TRANSFERRINE ET LE METABOLISME DU FER... 10

1.2.1 Fer et métabolisme... 10

1.2.2 Les transferrines... 11

1.2.3 Endocytoses et récepteurs de transferrine chez les cellules de mammifères...12

1

1.2.3.1 Endocytoses chez les mammifères... 12

1.2.3.2 Récepteurs de Tf et endocytose chez les mammifères... 14

A) Les récepteurs de Tf de mammifères...14

B) Endocytose de Tf dans les cellules de mammifères... 15

1.3 ENDOCYTOSE DE LA TRANSFERRINE SERIQUE CHEZ TRYPANOSOMA BRUCEI... 16

1.3.1 L'endocytose de facteurs de croissance est modulée au cours du cycle de vie du parasite... 16

1.3.1.1 Caractéristiques générales de l'endocytose chez les formes sanguicoles...16

1.3.1.2 Caractéristiques générales de l'endocytose chez les formes procycliques... 17

1.3.2 Récepteurs et transporteurs chez T. brucei...18

1.3.3 Le récepteur de la transferrine sérique et de LDL chez T. brucei...19

1.3.3.1 Le récepteur de transferrine... 19

1.3.3.2 Le récepteur de LDL... 21

1.4 STRUCTURE DE L'ANTIGENE VARIABLE DE SURFACE (VSG)... 22

1.4.1 Introduction: structure et composants de la surface cellulaire du trypanosome... 22

1.4.2 Structure de l'ancre glycosylphosphatidylinositol (GPI)...22

1.4.3 Structure du VSG...23

1.4.4 Homologies de structure secondaire et tertiaire partagées entre différents VSGs...24

1.4.5 Dimérisation des VSGs... 25

1.4.5.1 Structure 3D du dimère... 25

1.4.5.2 Motifs additionnels de dimérisation...26

1.4.5.3 Les oligosaccharides interviennent dans la stabilisation des dimères de VSG... 26

1.4.6 Superfamille de VSGs et évolution... 27

1.4.7 Mécanismes recombinatoires assurant la variation antigénique... 28

1.4.8 Variation antigénique et sélection du répertoire fonctionnel de gènes de VSG... 30

1.4.9 Variation antigènique des récepteurs de surface...32

11

1.4.10 Dégradation et recyclage des molécules de VSGs 34 1.5 ORGANISATION ET EXPRESSION DES GENES CHEZ

T. BRUCEI...35

1.5.1 Introduction... 35

1.5.2 Expression des gènes spécifiques de stade de la forme sanguicole à partir des sites d'expression télomériques... 35

1.5.3 Régulation de l'expression de l'unité VSG... 36

1.5.4 Régulation de l'expression des ESAGs au cours du cycle parasitaire, en particulier ES AG 6 et 7... 37

1.5.5 Contrôle indépendant de l'expression des gènes ESAGs par rapport aux unités de VSG métacycliques... 38

1.6 ROLE DES ESAGS, EN PARTICULIER ESAG 6 ET 7... 39

1.7 BIOSYNTHESE DU GPI ET ROLE DE LA VSG LIPASE ENDOGENE DE T. BRUCEI (G?l-?LC)... 40

1.7.1 Structure et fonction des ancres GPI chez les trypanosomatidés... 40

1.7.2 Présentation de la GPI-PLC (VSG lipase)...43

1.7.3 Biosynthèse des molécules liées à la membrane plasmique via une ancre GPI... 44

1.7.4 La GPI-PLC est-elle impliquée dans le processus de largage des protéines GPI-liées chez Trypanosoma brucei ?... 46

1.7.5. L'expression de la VSG lipase chez un mutant promastigote de Leishmania major et la déficience en VSG lipase chez un mutant sanguicole de T. brucei sont corrélés avec un phénotype de croissance cellulaire atténuée...47

BUT... 51

MATERIEL ET METHODES... 53

2.1 Matériel... 53

2.1.1 Les trypanosomes... 53

2.1.2 Les oocytes... 53

2.2 Méthodes...54

2.2.1 Génération des anticorps anti-ESAG 7 et anti-ESAG 6...54

2.2.2 Expression d'ESAG 6/7/6s/7m dans les oocytes de

Xénopes... 55

2.2.2.1 Construction des vecteurs d'expression... 56

2.122 Préparation de TARN in vitro... 56

2.2.2.3 microinjection des oocytes... 57

2.2.3 Iodation de la transferrine bovine...57

2.2.4 Séparation de phase des protéines de membrane ancrées via un glycolipide dans une solution de Triton X-114... 57

RESULTATS...59

CARACTERISTIQUES DU RECEPTEUR DE LA TRANSFERRINE SERIQUE CHEZ T. BRUCEI... 59

3.1 Caractérisation de la protéine fixatrice de la transferrine sérique (TfBP) chez T. brucei par l'emploi d'un système d'expression dans l'oocyte de Xénope...59

3.1.1 Structure primaire des protéines pESAG 6/7...59

3.1.2 Analyse des protéines pESAG 6/7 chez le trypanosome sanguicole... 60

3.1.3 Analyse des protéines pESAG 6, 7, 6s et 7m produites par l'oocyte de Xénope...61

3.1.4 Fixation de la transferrine aux oocytes de Xénope... 63

3.1.5 Etude des caractéristiques de fixation de la TfBP par chromatographie d'exclusion moléculaire...65

3.1.6 Homo- hétérodimérisation de la TfBP...66

3.1.7 Intervention d'oligosaccharides dans la fixation de transferrine par les oocytes exprimant l'hétérodimère pESAG 6/7... 67

3.2 L'hétérodimère pESAG 6/7 constitue le récepteur de la transferrine sérique chez T. brucei...69

3.2.1 Comparaison des paramètres de fixation de transferrine, chez les trypanosomes et chez les oocytes...69

3.2.2 Immunolocalisation de l'hétérodimère pESAG 6/7 chez T. brucei...70

3.2.3 Localisation de l'hétérodimère et de la transferrine durant l'endocytose de transferrine...70

3.2.4 In vitro, des IgGs dirigées contre la protéine pESAG inhibent l'endocytose de transferrine par les trypanosomes... 71

3.3 Résumé...72

3.4 discussion...74

IV

ANALYSE THEORIQUE SUR LES ORIGINES EVOLUTIVES DU RECEPTEUR DE LA TRANSFERRINE SERIQUE CHEZ T. BRUCEI ET PREDICTION DU

SITE DE FIXATION DU LIGAND... 80

4.1 Le récepteur de transferrine est un membre appartenant à la superfamille des antigènes variables de surface...80

4.1.1 Les gènes ESAG 6 et 7 constituent une famille de gènes....80

4.1.2 La famille de gènes ESAG 6 et 7 et la famille de gènes de VSG ont des origines évolutives communes... 81

4.1.3 Motifs structuraux partagés par les protéines pESAG 6/7 et les domaines N-terminaux de VSGs de classe A... 83

4.1.4. Dimérisation du récepteur de transferiime par l'intermédiaire de motifs "coiled-coils"... 84

4.1.5 Variation antigénique des récepteurs de transferrine...86

4.1.6 Expression in vivo des gènes ESAG 6/7... 88

4.1.7 Site de fixation de la transferrine... 89

4.1.8 Stoechiométrie récepteur/ligand... 91

4.1.9 Evolution divergente des VSGs et des récepteurs de Tf...92

4.2 Modèle d'organisation du manteau de la poche flagellaire...95

ETUDE DES MECANISMES DE LARGAGE DU RECEPTEUR ET D'INTERNALISATION DE LA TRANSFERRINE SERIQUE CHEZ T. BRUCEI...97

5.1 Introduction... 97

5.2 Etude du processus de largage du récepteur de transferrine chez un mutant sanguicole de T. brucei déficient pour la GPI-PLC... 98

5.2.1 Obtention du mutant nul pour la GPI-PLC chez T. brucei 98 5.2.2 Le phénotype de croissance atténuée, observé chez le mutant nul de T. brucei, est corrélé à un ralentissement de l'endocytose de transferrine... 99

5.3 Discussion...101

5.4 Rôle de la matrice glycoprotéique et de ses composants dans la fixation du récepteur de la transferrine... 108

5.5 Mécanismes d'internalisation de la transferrine sérique chez le trypanosome africain... 110

CONCLUSION...112

REFERENCES... 116

ANNEXES... 138

V

Abréviations

ABREVIATIONS

a.a. acide aminé

ADNc ADN complémentaire

ARNm ARN messager

Asp aspartate

CRD cross-reacting déterminant

DAG 1,2-diacylglycérol

DAB 3,3'- diaminobenzidine

DMG dimyristoylglycérol

CAT chloramphénicol acétyl transférase

CHO Chinese hamster ovary

CURL compartment of uncoupling of receptor and ligand

DAF decay accelerating factor

DHAP dihydroxyacétone phosphate

ES expression site

ESAG expression site-associated gene FACS fluorescence activated cell sorter

Gai galactose

G-3-P glycérol 3-phosphate

GPI glycosylphosphatidylinositol

GIC-NH 2 glucosamine

GlcNAc N-acétylglucosamine

GRESAGs gene related to ESAGs

HRP peroxydase de raifort (horseradish peroxydase)

Ig immunoglobuline

Ino inositol

IP 3 D-my-o-inositol 1.4,5-triphosphate ISG invariant surface glycoprotein

kb kilobase

LDL low density lipoprotein

LGP lysosomal membrane glycoprotein

LPG lipophosphoglycane

VI

Man mannose

MBS-H modified Barth solution-Hepes NacGal N-acétylgalactosamine

NADfH) nicotinamide adénine dinucléotide

neo néomycine

PAGE polyacrylamide gel electrophoresis PARP procyclic acidic répétitive protein

PBS phosphate buffered saline

pESAG protéine codée par ESAG

pb paire de bases

PGK phosphoglycerate kinase

PCMPS p-chloromercuriphenyl-sulfonate PCMBS p-chloromercuribenzène-sulfonate

PI phosphatidylinositol

PLAP placental alkaline phophatase

PLC phospholipase C

pro procycline

PSG phosphate saline glucose

RE réticulum endoplasmique

RIME ribosomal mobile élément

RME receptor-mediated endocytosis

TfBP transferrin binding protein

Tf transferrine

TfR transferrin receptor

TNF-a tumor necrosis factor-a

SDS sodium dodecylsulphate

UTR untranslated région

VSG %ariant surface gheoprotein

mA'SG membrane form VSG

sVSG water soluble VSG

Résumé

RESUME

La forme sanguicole du trypanosome africain, Trypanosoma brucei, protozoaire unicellulaire, se multiplie activement dans le sang de l'hôte tout en échappant à la réponse immunitaire de l'hôte par changement périodique de son manteau antigénique de surface (VSG). Ce parasite est capable d'internaliser de façon rapide et efficace les macromolécules qu'il est incapable de synthétiser et qu'il puise dans le sang de son hôte mammifère. Parmi ces molécules, la transferrine sérique constitue par son pouvoir chélateur de fer, un facteur de croissance indispensable au parasite.

Nous avons caractérisé le récepteur de la transferrine sérique chez la forme sanguicole de Trypanosoma brucei. Ce récepteur ne possède aucune homologie de séquence avec les récepteurs d'eucaryotes supérieurs et est tout a fait atypique. 11 s'agit d'un hétérodimère codé par deux gènes homologues ESAG 7 et ESAG 6 qui sont les premiers gènes de l'unité de transcription du gène de la glycoprotéine variable de surface, le VSG. L'extrémité C-terminale de la protéine ESAG 6 possède un radical glycosylphosphatidylinositol (GPI) qui permet l'ancrage du récepteur dans la membrane plasmique. Cependant, on observe que la majeure partie du complexe récepteur-ligand n'est pas associée à la membrane de la poche flagellaire, une invagination de la membrane plasmique à la base du flagelle, mais se retrouve essentielle­

ment dans la lumière de celle-ci. C'est à cet endroit, site privilégié d'endocytose du parasite, que l'internalisation des complexes récepteur-transferrine se fait via des puits et des vésicules

"recouverts".

Par l'émde d'un mutant sanguicole déficient en GPI-PLC (GPl-specific phospholipase C), enzyme qui utilise comme substrat les molécules ancrées par un radical GPl, nous montrons que le phénotype de croissance cellulaire atténuée du mutant est corrélé à une réduction de l'endocytose du ligand due à une diminution du nombre de récepteurs de transferrine présents dans la lumière de la poche flagellaire. Ceci signifie que la lipase endogène du trypanosome (GPI-PLC). utilisant l'ancre GPI du récepteur comme substrat naturel, est probablement impliquée dans le processus d'internalisation du ligand. Néanmoins, chez le mutant, un largage des complexes récepteur-transferrine se poursuit, mais de manière ralentie.

Cela suggère que le largage du récepteur dans la lumière de la poche flagellaire fait partie du processus d'internalisation du ligand, sans pour aunnt être une étape obligée.

Sur le plan évolutif, il semble que les gènes de VSG et du récepteur dérivent d'un ancêtre commun. Nous montrons que, en plus des homologies de séquence primaire, les protéines pES.AG 6 et 7 panagent plus de 80 '’

des motifs structuraux que l'on retrouve

\iii

Résumé

conservés dans le domaine N-terminal des VSGs de classe A. Ceci suggère que le récepteur se comporte comme un mini-VSG, ce qui lui permet de s'intégrer entre les molécules de VSG de la membrane plasmique, tout en gardant masqués une grande partie de ses épitopes conservés.

Par ailleurs, nous montrons que les différences de séquence entre les protéines pESAG 6 et 7 (représentant environ 11% des différences totales d'acides aminés), qui sont regroupées en quatre blocs d'hétérogénéité dans le domaine C-terminal du récepteur, interviennent dans la fixation du ligand. Par analogie structurale avec le VSG, nous prédisons que le domaine de fixation du ligand pourrait correspondre à quatre boucles peptidiques exposées en surface.

L'ensemble de ces observations indique que le trypanosome utilise un mode original de fixation et d'internalisation de la transferrine sérique qui lui permet de résoudre un défi de taille: l'endocytose d'un facteur de croissance via un récepteur spécifique, tout en échappant à la réponse immune de l'hôte.

K

Introduction

INTRODUCTION

L'élucidation de la structure et de la fonction des récepteurs impliqués dans la reconnaissance cellulaire, la transmission de signaux transmembranaires et le transport de macromolécules est un des domaines des plus actifs dans le champ d'investigation de la biologie moléculaire actuelle.

Dans le cas des parasites, les récepteurs jouent un rôle prépondérant dans la reconnaissance cellulaire suivie de l'invasion des cellules hôtes, ainsi que dans l'internalisation de facteurs de croissance qui sont fournis par l'hôte. Pour ceux d'entre eux qui doivent, au cours de leur cycle de vie complexe, passer par plusieurs hôtes successifs, il est capital de pouvoir exploiter au mieux les différents environnements auxquels ils devront faire face.

Cette situation est représentative de ce qui se passe chez les trypanosomes, organismes unicellulaires flagellés appartenant à l'embranchement des Kinétoplastides {Kinetoplasta) (Vickerman, 1989), un groupe de protozoaires qui a divergé très tôt du lignage eucaryotique (Sogin et al, 1986). Au cours de leur cycle parasitaire, le passage de l'hôte vertébré (mammifère) à l'hôte invertébré (insecte) et vice versa, déclenchera une cascade d'événements morphologiques et biochimiques aboutissant finalement à une expression ou à une répression de la synthèse adaptative de récepteurs spécifiques.

Néanmoins, si les trypanosomes constituent un matériel de choix dans l'étude des interactions cellulaires, ils ont été très peu caractérisés au ni\ eau de leurs récepteurs compa­

rativement aux \ irus, aux bactéries et aux eucaryotes supérieurs. L'analyse des récepteurs de

surface a été particulièrement difficile car les trypanosomes ont développé des surfaces

cellulaires hautement spécialisées en réponse aux environnements hostiles qu'ils doivent

traverser. Cependant, étant donné l'importance économique ei médicale de ces parasites dans

le Tiers monde, la caractérisation de ses récepteurs de surface permettrait de définir de

nouvelles cibles qui pourraient être pri\'ilégiées dans une lutte thérapeutique et vaccinale.

Introduction

1.1 LE PARASITE

1.1.1 Présentation

Les protozoaires flagellés Kinetoplastides possèdent de 1 à 4 flagelles et la plupart sont des espèces parasites. La famille des trypanosomatidae contient quatre genres:

Leptomonas, Crithidia, Trypanosoma et Leishmanie. Les deux premiers sont des parasites d'invertébré à 1 hôte (monoxènes) alors que les deux derniers évoluent chez deux hôtes (hétéroxènes). Les représentants de la famille des trypanosomatidae sont des organismes très mobiles, de forme allongée, avec un noyau central, un kinétoplaste contenant l'ADN mito­

chondrial, une membrane ondulante et un flagelle partiellement libre.

Chez les Kinétoplastides, la plupart des recherches se sont concentrées sur les espèces d'importance économique et médicale. C'est le cas des différentes espèces tropicales et subtropicales de Leishmanie (kala-azar et autres leishmanioses cutanées et viscérales), de Trypanosoma cruzi, trypanosome sud-américain responsable de la maladie de Chagas et des trypanosomes africains salivaires (maladie du Sommeil chez l'homme, Nagana du bétail).

1.1.2 Particularités des trypanosomes

Les trypanosomes appartiennent aux Protistes, groupe constitué d'un assemblage de lignages eucaryotiques dont la diversité évolutive dépasse celle des Plantae, Fungi et Animalia réunis (Sogin et al, 1986). Etant donné qu'ils se sont diversifiés très tôt à l'échelle évolutive, bien avant la radiation des Métazoaires, il y a environ 1 milliard d'armées, ils ont acquis de nombreuses propriétés biochimiques et génétiques qu'ils sont les seuls à posséder (Sogin et al, 1986; Michels & Opperdoes, 1991). Parmi ces particularités, la plus étrange est sûrement le

"RNA editing": mécanisme de correction post-transcriptionnel générant l'addition ou la soustraction de résidus U pour donner naissance à des ARN messagers mitochondriaux fonctionnels (revue récente: Benne, 1994). Par ailleurs, certaines de ces particularités sont clairement liées à leur mode de vie parasitaire extrêmement spécialisé. Parmi ces particularités structurelles et métaboliques que l'on retrouve chez tous les membres de l'embranchement des Kinétoplastides, citons:

-le kinétoplaste: organite contenant l'ADN de la mitochondrie unique qui consiste en un énorme réseau de milliers de molécules d'ADN circulaires concaténées et constituées d'environ 10000 minicercles hétérogènes et d'une centaine de maxicercles identiques d'environ 1 kb (Stuan. 1983: Simpson, 1986). Les maxicercles codent pour une partie des protéines mito­

chondriales, alors que les minicercles contiennent les informations nécessaires à la maturation des précurseurs d'ARNm mitochondriaux (editing).

2

Introduction

-les glycosomes (microbodies): organites limités par une membrane unitaire, contenant notamment les sept premières enzymes de la glycolyse, plus deux enzymes associées au métabolisme du glycérol (Opperdoes & Borst, 1977).

- la variation antigénique: c'est-à-dire la capacité qu'a la forme sanguicole du trypanosome africain d'échapper à la réponse immunitaire de l'hôte par modification de la spécificité antigénique de son manteau de surface. Ce phénomène est propre aux trypanosomes africains (Cross, 1975; revues récentes: Pays & Steinert, 1988; Borst, 1995).

Une autre caractéristique partagée par les Kinétoplastides est la maturation des transcrits primaires par un mécanisme de //'cr/i^-épissage. Chez T. brucei, tous les transcrits primaires sont maturés par addition à leur extrémité 5' d'une séquence de 39 nucléotides qui n'est pas retrouvée dans les gènes nucléaires correspondants (revues: Borst, 1986; Laird, 1989). Cette séquence de 39 nucléotides, appelée "mini-exon", porte une coiffe en 5' (cap) et est codée par environ 200 copies de gènes nucléaires qui sont exprimées sous forme d'ARNs de 141 nucléotides, appelées "med-RNA" pour "mini-exon-derived-RNA".

1.1.3 Changements morphologiques et métaboliques au cours du cycle évolutif du parasite

1.1.3.1 Cycle parasitaire de T. brucei

Parmi les trypanosomes africains, Trypanosoma brucei, agent responsable de la maladie du Sommeil chez l'homme et de la Nagana du bétail sévissant en Afrique constitue, par son mode de vie extracellulaire, une cible de choix dans l'étude des interactions hôte-parasite.

Comme tous les trypanosomes africains, T. brucei se multiplie activement dans le sang et les tissus de l'hôte qu'il infecte.

Quand une mouche tsé-tsé (du genre Glossind) pique un hôte infecté, lors de son repas sanguin, les formes sanguicoles vont migrer dans l'intestin moyen de l'insecte où elles se différencient en formes procycliques. Après plusieurs étapes de différenciation, des formes métacycliques sont formées dans les glandes salivaires de la mouche qui seront susceptibles d'être injectées dans un mammifère, lors d'un prochain repas sanguin, bouclant ainsi le cycle parasitaire (Vickerman, 1985).

3

IN TSETSE SALIVARY GLANDS Premetacyclic

attached ro host microvilli

Nascent Metacyclic

Epimastigote'

IN TSETSE MIDGUT

Figure 1 Cycle de développement de T. brucei montrant les différents changements morphologiques et ultrastructuraux que le trypanosome subit (d'après Vickerman ,

1985). L'astérisque représente les étapes durant lesquelles le trypanosome se divise.

Introduction

1.1.3.2 Changements morphologiques et métaboliques au cours du cycle parasitaire (Vickerman, 1985; Opperdoes, 1987) (voir la figure 1)

Les trypanosomes sont fusiformes et possèdent une dimension moyenne de 4 p.m sur 15 |im; ils présentent un cycle de développement complexe au cours duquel le parasite subit d'importante modifications morphologiques (altérations de la forme, de la position du kinéto- plaste par rapport au noyau, du manteau de surface) et métaboliques (activation ou répression des gènes contrôlant l'activité de la mitochondrie et des glycosomes).

A) Chez la glossine

Les trypanosomes sanguicoles ingérés par la mouche à l'occasion d'un repas sanguin sur un mammifère infecté gagnent la partie postérieure de l'intestin moyen et migrent dans l'espace endopéritrophique (espace séparant par une membrane chitineuse l'épithélium intestinal de la lumière de l'intestin où transite le bol alimentaire). C'est là que les trypanosomes sanguicoles se différencient en forme procycliques. Ces formes procycliques se divisant activement sont caractérisées par un accroissement de la taille, une activité endocytotique réduite et une perte du manteau de surface qui caractérise les formes sanguicoles et qui, au microscope électro­

nique, constitue un manteau opaque aux électrons d'environ 15 nm d'épaisseur couvrant la totalité de la surface du parasite (Vickerman, 1969). En outre, alors que la mitochondrie se développe en un réseau branché, les glycosomes de formes sphériques prennent l'aspect de structures bacilliformes. Ces transformations morphologiques traduisent un changement de substrat énergétique. En effet, alors que la forme sanguicole utilise le glucose comme source de carbone et d'énergie pour la glycolyse (glycosomes), la forme procyclique respire principa­

lement la proline (mitochondrie) que la glossine utilise comme source d'énergie pour le vol.

Ajoutons que si la proline est préférentiellement oxydée in vivo, c'est probablement parce qu'elle se trouve présente en grande quantité dans l'hémolymphe de l'insecte (150 mM), alors que le glucose ne se trouve qu'à l'état de trace (Bursell, 1981). L'expansion de la mitochondrie chez les formes procycliques est corrélée avec une reprise de l'activité du cycle de Krebs et de la chaîne respiratoire mitochondriale (apparition des crêtes mitochondriales). Des modifica­

tions morphologiques, comparables à celles qui ont lieu dans l'intestin moyen de la mouche peuvent être obtenues en incubant des formes sanguicoles à 27°C dans un milieu de culture contenant du cw-aconitate et du citrate de sodium (Overath et al, 1986). Après leur différen­

ciation, les formes procycliques quittent l'espace péritrophique, gagnent le proventricule où elles cessent de se diviser (mésocycliques proventriculaires) et remontent l'oesophage, les pièces buccales et les conduits salivaires pour arriver finalement aux glandes salivaires de l'insecte. Une fois dans les glandes salivaires, les formes mésocycliques se différencient en épimastigotes (kinétoplaste prénucléaire), formes prolifératives sans manteau attachées par

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A B

Figure 2 Fluctuation de la parasitémie chez des souris de laboratoire infectées

avec un variant pléomorphe (A) ou monomorphe (B).

Introduction

leur flagelle aux microvillosités des cellules épithéliales par des complexes de jonction. Après deux étapes de différenciation, ces formes donnent naissance aux formes métacycliques matures, libres dans la lumière de la glande. Ces formes infectieuses ne se divisent pas, sont caractérisées par la réacquisition d'un manteau de surface et possèdent des mitochondries non branchées et des glycosomes sphériques actifs.

B) Chez le mammifère

Lors d'une piqûre de glossine dans le derme d'un mammifère, après formation d'une réaction inflammatoire locale, les trypanosomes métacycliques gagnent la circulation sanguine, via les vaisseaux lymphatiques. Une fois dans le sang, ils se différencient en "slenders", formes allongées qui se multiplient activement par mitoses successives. Ces formes "slenders" se différencient en formes "intermédiaires" puis "stumpies", formes trapues et ne se divisant plus. La transformation de "slender" en "stumpy" est marquée par un gonflement du canal mitochondrial avec un développement des crêtes tubulaires.

Au cours de l'infection de l'hôte mammifère, le nombre de parasites dans le sang fluctue, formant ainsi une succession de vagues de parasitémie (pléomorphisme) (voir la figure 2A). Alors qu'en début de phase ascendante de parasitémie, on trouve des formes "slenders"

allongées de ~ 20 microns se divisant activement, au sommet et dans les phases de rechute de parasitémie, on trouve des formes trapues ne se divisant plus (formes "intermédiaires" et

"stumpies"). Ainsi, les pics de parasitémie en dents de scie correspondent à une alternance

"slenders" (phase ascendante)/"stumpies" (sommet et phase descendante) et représentent une adaptation remarquable du parasite à son hôte, où le parasite surv it à la réponse immunitaire de l'hôte par changement de la spécificité antigénique de son manteau de surface (voir la section suivante). Pour certains auteurs, ce changement dans la composition de la population au sein de chaque pic serait plus la conséquence d'une réduction du nombre de "slenders", éliminés dans leur grosse majorité par la réponse immunitaire de l'hôte à travers la lyse par le complément, que d'un signal de différenciation spécifique (McLintock et al, 1993).

Cependant, des travaux récents suggèrent que la différenciation est contrôlée par le parasite lui-même, via un facteur sécrété dans le milieu, de manière analogue au système cytokine des mammifères (Hesse et al, 1995). Un facteur de différenciation serait accumulé dans le milieu de culture et la concentration de ce facteur, atteignant un certain seuil, induirait la différencia­

tion slender => stumpy via une cascade d'événements complexes qui n'ont pas encore été identifiés, mais aboutissant finalement à l'activation d'une adénylate cyclase du parasite (Rolin et al, 1993). In vitro, en culture axénique, on a pu reproduire la différenciation des formes

"slenders" en formes "stumpies" de manière cyclique et pendant une longue période de temps (Hamm et al, 1990; Hesse et al, 1995). Celle-ci semble indépendante de la présence de facteurs provenant de l'hôte ou de la déplétion en nutriments spécifiques et se fait donc en

5

Glycosome Cytosol Mitochondrie Glucose

Figure 3 Rôle physiologique du système a-glycérol-phosphate oxydase (GPO) dans la balance NADH/NAD"^ chez le trypanosome africain (adapté d'après Clarkson et al, 1989). Le système GPO est composé principalement d'une glycérol- 3 phosphate déshydrogénase (DH) glycosomale et d'une oxydase qui sont liés entre eux par un C 0 Q 9 (Q). DH: glycérol 3-phosphate déshydrogénase; DHAP:

dihydroxyacétone phosphate; G-3-P: glycérol 3-phosphate;

3-PGA: 3-phosphoglycérate.

Introduction

absence de sélection immune. Après de multiples passages successifs dans des souris ou des rats de laboratoire, les trypanosomes perdent leur propriété à se différencier in vivo, chez la souris et, constituent des populations monomorphes de "slenders" se divisant activement (voir la figure 2B). Cependant, comme les cellules monomorphes sont encore capables, en culture, de se différencier en formes "stumpies", on a émis l'hypothèse que les formes monomorphes seraient en réalité des formes pléomorphes ayant une réponse réduite au facteur de différenciation accumulé dans le sérum (Hesse et al, 1995). En outre, il semble que le processus de différenciation des formes sanguicoles en formes procycliques peut se faire de manière synchrone, seulement s'il est initié à partir des cellules "stumpies" qui correspondent à des cellules ne se divisant plus et arrêtées en phase G

.

Très récemment, il a été démontré que le TNF-a (tumor necrosis factor-a) joue un rôle fondamental dans le contrôle de la croissance cellulaire in vivo (Magez et al, 1996). Cette cytokine, surtout produite par les macrophages activés de l'hôte, peut être induite par le parasite lui-même et, exercer un effet lytique in vitro, par perte de l'osmorégulation, seulement sur des populations de parasites isolées à partir du sommet des pics de parasitémie. Ainsi, le TNF-a semble contribuer à limiter le nombre de parasites circulant dans le sang, la cavité péritonéale et les organes lymphoïdes. Un tel système de régulation équilibrée de la croissance permet au parasite de vivre suffisamment longtemps sans pour autant tuer son hôte, ce qui assure l'efficacité de la transmission de l'espèce.

Sur le plan métabolique, les formes sanguicoles ne possèdent pas un cycle de Krebs fonctionnel et les cytochromes sont absents de la mitochondrie. Leur métabolisme se limite donc à la glycolyse. Le glucose est la source d'énergie préférée mais le fhictose, le glycérol et le mannose peuvent aussi assurer la mobilité et la respiration du trypanosome sanguicole. Le pyruvate représente plus de 98% des produits sécrétés par le parasite in vivo (en aérobiose).

Comme le glycosome contient les sept premiers enzymes de la glycolyse, en terme de bilan énergétique par molécule de glucose consommée, il y a production de 2 molécules de 3- phosphoglycérate, 2 molécules de nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) sans production nette d'ATP. La réoxydation des molécules de NADH ne se fait pas comme chez les autres eucaryotes via une lactate déshydrogénase mais s'effectue grâce à un système navette assuré par le glycérol 3-phosphate (G-3-P) et le dihydroxyacétone phosphate (DHAP) (voir la figure 3). En effet, la glycérol-3-phosphate déshydrogénase glycosomale réduit le DHAP en G-3-P tout en régéné-rant le NAD"*". Le G-3-P quitte la matrice glycosomale et dans le cytoplasme est oxydé par une glycérol-3-phosphate déshydrogénase mitochondriale en DHAP, puis ce dernier regagne le glycosome pour de nouveau régénérer une molécule de NAD'*' en étant transformé en G-3-P (Grant & Sargent, 1960; Clarkson et al, 1989). Dans ce système navette, la déshydrogénase mitochondriale est couplée à une oxydase alternative similaire à celle trouvée chez les plantes qui nécessite l'oxygène moléculaire comme accepteur final d'électron.

Il s'agit donc d'une respiration mais sans couplage à une phosphorylation oxydative.

6

Introduction

Le 3-phosphoglycérate quitte le glycosome pour être métabolisé en pyruvate, avec synthèse d'une molécule d'ATP. Par conséquent, c'est dans le cytosol que les formes sanguicoles produisent l'ATP.

1.1.4 Variation antigénique (aspects phénotypiques)

La surface cellulaire des trypanosomes sanguicoles est protégée par ime couche épaisse de glycoprotéines variables de surface (VSG) (Cross, 1975) qui sont changées à intervalles fréquents: ce remplacement d'antigènes de surface immunologiquement distincts (variation antigénique) permet au parasite de survivre indéfiniment face à la réponse immune récurrente de l'hôte (revues récentes: Pays & Steinert, 1988; Borst, 1995). Ce processus de variation antigénique se produit spontanément à un taux allant jusqu'à 10‘2 /cellule/génération (Turner &

Barry, 1989) et est le fruit de l'expression d'un seul gène de VSG sur les ~1000 que compte le génome du parasite (Van der Ploeg et al, 1982). Ainsi, même au cours d'une infection clonale, la population de trypanosomes sanguicoles présente dans chaque pic est hétérogène et est constituée d'un type antigénique majeur, l'homotype et de types antigéniques mineurs, les hétérotypes. Durant la phase ascendante de parasitémie, la majorité des parasites "slenders" se divisant constituent l'homotype, ensuite quand la parasitémie entre dans sa phase descen­

dante, les parasites portant l'homotype sont éliminés alors que des hétérotypes continuent de se multiplier. Un de ces variants va prendre le dessus sur les autres et constituera le prochain homotype. Ainsi, pendant la variation antigénique, chaque population de trypanosomes exprimant majoritairement un VSG sera éliminée par le système immunitaire de l'hôte et sera remplacée par une autre antigéniquement distincte qui, après expansion clonale, sera à son tour neutralisée, et ainsi de suite, ce qui donnera naissance au développement d'une infection chronique.

Le manteau de VSG ne recouvre pas seulement le corps cellulaire du parasite mais tapisse aussi la totalité de la poche flagellaire, une invagination de la membrane plasmique à la naissance du flagelle. En effet, ce manteau continu agit comme une véritable barrière au système immunitaire et protège le parasite de la voie alternative d'activation du complément (Ferrante & Allison, 1983; revue: Balber, 1990).

Lorsque les trypanosomes sanguicoles se différencient en formes procycliques dans l'intestin moyen de la mouche, le VSG est rapidement perdu et remplacé par une autre pro­

téine de surface prédominante: la procycline ou PARP (Procyclic Acidic Répétitive Protein) (Roditi et al, 1989). Ce n'est que lorsque ces formes procycliques migreront dans les glandes salivaires et se différencieront en formes métacycliques, que le manteau de VSG viendra remplacer celui de procycline.

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Introduction

1.1.5 Relation hôte-parasite et compartimentation

La surface des trypanosomes africains forme une interface hôte-parasite qui a évolué pour permettre au parasite d'échapper aux défenses immunitaires de l'hôte.

Les protistes exhibent un degré élevé de compartimentation intracellulaire qui est plus sophistiqué et plus apparent que dans une cellule de mammifère individuelle. Cette tendance à la spécialisation permet au protiste d'assurer diverses fonctions de manière très efficace, de la même manière que le font les organes des organismes multicellulaires. Chez le trypanosome, la nécessité de compartimenter est encore plus importante en raison des contraintes dictées par le cycle évolutif du parasite. C'est notamment le cas des glycosomes qui en compartimentant le "pathway" glycolytique permet au parasite d'assurer la glycolyse de manière beaucoup plus efficace que n'importe quelle autre cellule eucaryote connue jusqu'à maintenant (Opperdoes &

Michels, 1993). L'efficacité du système serait contrôlée par la perméabilité sélective de la membrane glycosomale unitaire qui permettrait une concentration intracellulaire des intermé­

diaires glycolytiques tout en empêchant leur dilution dans le cytosol (Opperdoes, 1987).

Plusieurs transporteurs permettant l'internalisation de sucres (D-glucose chez T. brucei;

Bringaud & Baltz, 1993), d'acides aminés (Hansen, 1977) et l'export d'ions (H'*'-ATPase de Leishmania; Zilberstein & Dwyer, 1988) ont été caractérisés chez les trypanosomatidés (revue récente; Zilberstein, 1993). Comment le parasite arrive-t-il a internaliser ces macro­

molécules sans exposer les éléments invariants de ces transporteurs (appartenant par exemple, au site de fixation) au système d'immunité cellulaire et humorale de l'hôte? Comme nous allons le voir, une partie de la réponse tient en la compartimentation des transporteurs /récepteurs dans un "organe" spécialisé dans l'endocytose des nutriments, la poche flagellaire. Chez la plupart des trypanosomatidés, la poche flagellaire est composée par l'association d'un cytostome (ou cytopharynx) ("bouche" des bodonidae, Kinétoplastide "primitif, libre préda­

teur de bactéries) et d'une poche flagellaire stricto senso, site d'émergenee du flagelle hors du corps cellulaire (Webster & Russell, 1993). Cette association cytostome/poche flagellaire semble faciliter l'accès des nutriments, tout en protégeant en partie les récepteurs /transporteurs requis pour l'endocytose de ces macromolécules.

1.1.6 Ultrastructure de T. brucei et présentation de la poche flagellaire, site d'endocytose privilégié du parasite

1.1.6.1 Architecture externe et poche flagellaire du trypanosome africain (revue; Balber, 1990)

Comme nous l'avons décrit précédemment, au cours de la variation antigénique, où l'on

observe une fluctuation de la parasitémie au cours du temps, la morphologie du trypanosome

est très variable selon que l'on se trouve dans la phase ascendante (formes "slenders") ou

o.5um

Figure 4 Ultrastructure de la forme sanguicole de T. brucei.

pf: poche flagellaire; f: flagelle; N: noyau; k: kinétoplaste; m: mitochondrie; GL: glycosome;

mi; microtubules; flèche: zone d'adhésion flagellaire; e: réticulum endoplasmique; v: vésicules Les pointes de flèche indiquent le complexe de jonction hemidesmosomal à l'entrée de la poche flagellaire, à l'endroit où le flagelle émerge du corps cellulaire (photos M.Geuskens).

Les parasites sont lavés 2 fois dans du PBS à 4°C, puis fixés à la glutaraldéhyde 1,6% et postfixés au tétroxyde

d'osmium 1%. Après déshydratation à l'éthanol, le culot de cellules est inclus dans une résine (Epon). Les

coupes sont colorées d'abord avec de l'acétate d'uranyle, puis avec du citrate de plomb.

Introduction

descendante du pic de parasitémie (formes "stumpies"). Ce changement de forme est sans doute à mettre en relation avec des processus de polymérisation/dépolymérisation du réseau de microtubules sous-tendant la membrane plasmique. En fait, la forme du parasite est maintenue par un corset de rangées serrées de microtubules (hétéropolymères de tubuline oc/P) se trouvant juste en dessous de la membrane plasmique (Woods et al, 1989) (voir la figure 4).

L'interaction des microtubules sous-pelliculaires avec la membrane se fait par l'intermédiaire d'une série de protéines associées aux microtubules (MAPs) (Seebeck et al, 1988). Ce cortex de microtubules représente un barrière efficace contre le transport vésiculaire (Vickerman &

Preston, 1976). Le flagelle naissant postérieurement (sens antéro-postérieur défini relative­

ment à la direction natatoire) à partir d'une invagination spécialisée de la membrane plasmique appelée poche flagellaire est relié au kinétoplaste (ADN mitochondrial) par son corps basal.

La poche flagellaire constitue une région hautement différenciée de la surface des trypanosomes qui est fortement conservée à travers tous les membres de la famille des trypanosomatidés (Webster & Russell, 1993). Le flagelle sortant de la poche est refoulé antérieurement contre le corps cellulaire du parasite. A ce niveau, les membranes du flagelle et de la poche flagellaire se touchent et sont reliées par des complexes jonctiormels de type

"macula adherens" environ tout les 100 nm jusqu'à l'extrémité antérieure du parasite, où le flagelle devient libre. Cette région, appelée zone d'adhésion flagellaire (voir la figure 4), correspond à la membrane ondulante visible au microscope optique, partie refoulée de la membrane plasmique. Cette zone d'adhésion cellulaire est caractérisée par des interactions complexes entre différents éléments du cytosquelette et les membranes flagellaires et cellulaires. Cette région opaque aux électrons (voir la figure 4) est dépourvue de microtubules corticaux, lesquels sont remplacés par un groupe de 4 microtubules spécialisés (relique des microtubules du cytopharynx des Kinétoplastides primitifs) (Vickerman, 1969; Vickerman &

Preston, 1976).

Près de l'entrée de la poche flagellaire, le cortex microtubulaire s'infléchit tout en s'amincissant graduellement jusqu'à disparaître entièrement, là où la membrane plasmique vient en contact avec le flagelle (Vickerman & Preston, 1976). L'absence de microtubules au niveau de la partie antérieure de la poche, libère celle-ci de toute contrainte mécanique et, lui permet de jouer un rôle actif dans les processus d'endocytose réalisés par l'intermédiaire de récepteurs spécifiques ("RME" ou receptor-mediated endocytosis) et de pinocytose (voir la section 2.3).

L'ouverture de la poche flagellaire est gardée par des complexes jonctionnels de type desmosome (desmosome-like tight junctions) qui se trouvent localisés entre les membranes de la cellule et du flagelle (voir la figure 4) (Brooker, 1970). Néanmoins, ces desmosomes dont le rôle est inconnu ne forment pas une barrière continue car, de grosses molécules comme la ferritine et les anticorps peuvent entrer et sortir.

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Introduction

1.1.6.2 Ultrastructure interne

Comme tous les eucaryotes, les trypanosomes possèdent un noyau, un réticulum endoplasmique (RE) lisse et granuleux et un appareil de Golgi qui est situé entre le noyau et la poche flagellaire. Dans le cytosol, outre les glycosomes de 0,2 à 0,3 |im de diamètre (Opperdoes & Borst, 1977) et la mitochondrie unique, simple ou branchée, on trouve différentes structures endocytotiques et exocytotiques (Langreth & Balber, 1975). Parmi ces structures, on distingue des structures tubulo-vésiculaires analogues aux endosomes de mammifères (voir la section 2.3) (200 nm de diamètre), de petites vésicules et citernes (20-25 nm de diamètre), et de larges structures lysosomales (200-300 nm de diamètre) analogues aux lysosomes de mammifères. Des vésicules pinocytotiques peuvent être vues à tous les stades développementaux du parasite. Par ailleurs, des vésicules à morphologie "recouverte" (coated vesicles) sont principalement vues au voisinage des poches sanguicoles et leur présence dans les formes de l'insecte reste controversée (Langreth & Balber, 1975, Magez et al, 1996).

1.2 LA TRANSFERRINE ET LE METABOLISME DU FER

1.2.1 Fer et métabolisme

L'évolution des organismes montre une longue dépendance du fer, surtout après que le fer disponible a diminué suite à la présence d'oxygène atmosphérique. Le fer possède deux états d'oxydation stables en solution aqueuse, le fer ferreux, Fe(II), et le fer ferrique, Fe(III).

Cette propriété lui permet de jouer un rôle crucial dans les réactions biologiques (par exemple, le transfert d'oxygène (hémoglobine, myoglobine), le transfert d'électrons (cytochromes), la fixation de l'azote (nitrogénase), et la synthèse d'ADN (ribonucléotide réductase)). La solu­

bilité du fer est devenue un véritable problème il y a 2,5 milliards d'armées quand l'eau a commencé à être utilisée comme source d'hydrogène pour la photosynthèse. L '02 produit par la photosynthèse, véritable polluant pour les organismes dépendants du fer, a crée un dilemme pour ces organismes. Ceux-ci ont dû soit migrer vers des envirotmements moins hostiles dépourvus d' 02 , soit s'accommoder de la basse solubilité du fer ferrique produit par l '02 à partir du fer ferreux (Fe(III) est lO'^ moins soluble que Fe(Il)). C'est pourquoi, on trouve dans la plupart des organismes procaryotes et eucaryotes, une large protéine cytoplasmique, la ferritine, qui stocke le fer dans les cellules et le maintient dans une forme soluble (Fe(IIl)O.OH) utilisable pour les réactions biochimiques requérant du fer (revue: Theil, 1987).

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Introduction

1.2.2 Les transferrines

Comme dans le sérum des vertébrés le fer ferrique disponible est présent en faible concentration, les organismes ont évolué en synthétisant des molécules chélatrices de fer permettant la capture, la séquestration et la solubilisation du fer (sidérophores des procaryo- tes, transferrines des mammifères) (Aisen & Litowsky, 1980). Notons que les transferrines sont de petites molécules qui fixent jusqu'à deux atomes de fer (~ 80 kDa) par rapport aux ferritines sphériques (~ 450 kDa) qui constituent de véritables réservoirs pouvant contenir jusqu'à 4500 atomes de fer/molécule. Ces propriétés font que les transferrines interviennent principalement dans la mobilisation du fer à l'intérieur de la cellule et entre cellules. Le recyclage par les macrophages du fer à partir des érythrocytes vieillis illustre l'importance considérable de la transferrine et de la ferritine chez l'homme. Chaque jour, chez un homme, plus de 10^^ érythrocytes vieillis se font phagocyter par les macrophages. Sur les 0,54 mmoles de fer que contiennent les érythrocytes, 90% sont convertis par les macrophages en ferritine, qui largue lentement le fer à l'apo-transferrine. Ensuite, l'holo-transferrine délivre le fer aux érythrocytes immatures, bouclant ainsi le cycle (Theil, 1987).

Plusieurs transferrines ont été identifiées à ce jour. Cela inclut la transferrine sérique, la lactoferrine trouvée dans le lait, les leucocytes et d'autres sécrétions, l'ovotransferrine trouvée dans le blanc d'oeuf, et finalement la melanotransferrine, véritable récepteur de fer lié à la membrane plasmique des cellules de mélanome humain, par un radical glycosylphosphatidyl- inositol (GPI) (revues: Huebers & Finch, 1987; Rose, et al, 1986; Kennard, et al, 1995).

Toutes les transferrines, en particulier la lactoferrine et l'ovotransferrine, peuvent jouer un rôle bactériostatique lors d'infection bactérienne en contrôlant les niveaux de fer utilisable par les cellules. En outre, la transferrine sérique est la principale protéine transporteuse de fer chez les vertébrés. Outre sa fonction de transport, la transferrine sérique jouerait un rôle secondaire indépendant dans la stimulation de la prolifération cellulaire. Ce rôle serait joué par l'exon 2 de la transferrine sérique qui possède des homologies de structure avec des protéines transform­

antes de lymphocytes B de poulet et humaines (ChBlym-I et HuBlym-I), dont la seconde est associée au lymphome de Burkitt (Bailey et al, 1988). Ainsi chez les vertébrés, la transferrine sérique représente la principale voie d'acheminement du fer ferrique depuis les sites d'absorp­

tion et de dégradation de l'hème (épithélium intestinal), jusqu'aux sites de stockage et d'utilisa­

tion (système hématopoïétique) (revue: Thorstensen & Romslo, 1990).

Les transferrines sériques sont des glycoprotéines composées d'une seule chaîne poly­

peptidique de ~ 80 kDa. Elles possèdent deux lobes similaires partageant ~ 40% d'identité de séquence. Ces deux lobes sont reliés par une courte chaîne qui peut être protéolysée pour produire deux demi-molécules N et C-terminales. Chaque lobe est capable de fixer par liaison de coordination une molécule de fer ferrique (Bailey et al, 1988). Les transferrines sériques

11

Introduction

fixent le fer ferrique avec une très haute affinité au dessus de pH 6 (ATa de 10^2 à pH 7,4;

Aisen & Litowsky, 1980), mais en dessous de cette valeur le larguent très rapidement.

1.2.3 Endocytoses et récepteurs de transferrine chez les cellules de mammifères

1.2.3.1 Endocytoses chez les mammifères (revues: Dautry-Varsat & Lodish, 1984;

Smythe & Warren, 1991; Robinson, 1994)

Les cellules d'un organisme multicellulaire baignent dans un milieu aqueux, dérivé du sang, très riche en molécules diverses. Beaucoup de ces ingrédients se trouvent en concen­

trations très basses. Certains d'entre eux sont nécessaires aux cellules pour les biosynthèses (a.a. et vitamines...), d'autres délivrent des signaux intercellulaires spécifiques (hormones), d'autres enfin sont des produits sans intérêt pour la cellule voire même des substances toxiques. Dans ce contexte, chaque cellule doit extraire du milieu extracellulaire les substances dont elle a besoin et rejeter le reste.

La membrane plasmique de la cellule joue le rôle de tamis moléculaire en contrôlant les trafics avec le milieu et avec les autres cellules. Comme toutes les membranes biologiques, la membrane plasmique est principalement constituée par une bicouche de molécules phospho­

lipidiques entre lesquelles se trouvent réparties toute une variété de protéines. Une des fonctions majeures de cette membrane est de faciliter l'entrée sélective de molécules solubles à travers la bicouche lipidique imperméable. Les ions, les petites molécules solubles comme les acides aminés et les sucres diffusent simplement à travers la membrane ou sont pompés à travers des canaux spécialisés de la membrane (perméases). En ce qui concerne les larges molécules, celles-ci sont transportées à l'intérieur de la cellule par l'intermédiaire d'un méca­

nisme différent appelé endocytose par lequel les macromolécules sont entourées par la membrane plasmique avant d'être progressivement internalisées par l'intermédiaire de vésicules formées par cette membrane. Classiquement, on distingue trois types différents d'endocytose.

Dans la phagocytose, la liaison d'une très large molécule ou d'un complexe moléculaire à la surface de la cellule déclenche une expansion de la membrane autour de l'objet (pseudo­

podes) qui est progressivement incorporé dans une vésicule naissant d'une invagination de la membrane appelé le phagosome, généralement d'une taille supérieure à 250 nm mais pouvant aller jusqu'à plusieurs | 0 .ms de diamètre. Ce système d'endocytose est largement répandu chez les protistes (ingestion de bactéries) et chez toutes les cellules devant ingérer des nutriments de très grande taille (macrophages,...).

La pinocytose est un processus différent qui résulte d'une internalisation non spécifi­

que de fluide extracellulaire. Dans ce processus, une mini-gouttelette de liquide est entourée par une in\’agination de la membrane plasmique et est internalisée dans une vésicule d'une taille qui est généralement <150 nm de diamètre. Contrairement à la phagocytose qui requiert des

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récepteurs spécifiques dont l'activation déclenche la formation de pseudopodes, la pinocytose est un processus constitutif qui se produit de manière continue. Le taux d'internalisation de membrane plasmique réalisée par l'intermédiaire de ce processus varie considérablement d'une cellule à l'autre (par exemple, le macrophage peut ingérer 100 % de sa membrane plasmique en l'espace de deux heures).

En contraste avec les deux processus d'endocytose que nous venons de décrire, l'endo­

cytose réalisée par l'intermédiaire d'un récepteur (RME, receptor-mediated endocytosis) est extrêmement spécifique. Les récepteurs sont des protéines de membrane et chacune d'entre elles possède au moins un domaine de fixation pour un ligand particulier: une protéine ou une petite particule. Alors que le ligand se trouve en faible concentration parmi toutes une série d'autres molécules composant le milieu extracellulaire, le récepteur fixe spécifiquement et rapidement son ligand. Après la fixation en surface des ligands sur les récepteurs transmembra­

naires, les complexes récepteur-ligand sont regroupés dans des puits "mantelés" qui sont des invaginations de la membrane plasmique épaissies du côté cytoplasmique (coated pits). Parmi les molécules internalisées par l'intermédiaire de récepteurs spécifiques sont inclus des nutriments (LDL (low density lipoprotein) et Tf), des facteurs de croissance (EGF), des hormones (insuline), certains virus et d'autres antigènes étrangers. Le composant majeur du manteau est une protéine complexe, appelée clathrine, qui interagit avec la queue cytopla­

smique du récepteur via des complexes protéiques appelés "adaptors" (a-adaptine, P-adapti- ne, AP50 et AP 17) autres constituants protéiques du manteau impliqués dans la liaison du manteau de clathrine à la membrane plasmique et dans la capture spécifique des récepteurs à l'intérieur des vésicules (Pearse, 1988; Trowbridge, 1991). La clathrine est composée de 6 chaînes polypeptidiques (3 chaînes légères de 30-40 kDa et trois chaînes lourdes de 180 kDa) qui, ensemble, forment une structure "à trois bras" appelée triskelion (Brodsky, 1988). Les triskelions de clathrine s'assemblent en une corbeille convexe formée de pentagones et d'hexagones. La croissance et le réarrangement de ce treillis de clathrine cause une invagination du puits. L'invagination, suivie de la fermeture du puits, processus dans lequel est impliqué une protéine GTPase (dynamine), conduit au largage intracytoplasmique d'une vésicule "man- telée" (coated vesicle) qui transporte le ligand dans le cellule. La vésicule "mantelée" perd rapidement son manteau et la vésicule d'endocytose résultante délivre son contenu aux endosomes précoces. Là, les récepteurs et les ligands peuvent avoir différentes destinations.

Ils peuvent être déli\Tés à des lysosomes, dans lesquels ils seront dégradés. Alternativement, ils peuvent être transportés dans des granules de stockage (par exemple, la vitellogénine est transportée et cristallisée dans des granules formant les plaquettes vitellines de l'oocyte de Xénope; Busson et al. 1989). Quant aux récepteurs, ils peuvent être soit dégradés, soit recyclés en surface pour subir d'autres cycles d'endocytose.

En réalité, la dichotomie entre pinocytose et endocytose réalisée par l'intermédiaire de récepteurs n'est pas aussi nette qu'il y paraît et est sujette à controverse (Watts & Marsh,

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1992). En effet, lors de l'invagination des puits "mantelés", une partie du fluide extracellulaire est emprisonnée et par conséquent, des substances dissoutes du fluide extracellulaire sont internalisées via les vésicules à clathrine. Ce processus contribue à l'endocytose "phase-fluide"

de la cellule. Ainsi, la formation de vésicules "mantelées" peut être responsable, à la fois, de l'endocytose spécifique (RME) et de la pinocytose. C'est pourquoi, certains auteurs considè­

rent qu'il y a seulement deux types d'endocytose: la pinocytose se faisant de manière consti­

tutive (pinocytose "phase-fluide" continue couplée à la pinocytose adsorptive ou RME) et la phagocytose induite par des ligands. Cependant, il apparaît de plus en plus clairement que des mécanismes pinocytotiques clathrine-indépendants {via des vésicules lisses) interviennent dans l'endocytose "phase-fluide" (Watts & Marsh, 1992). Par ailleurs, on peut induire par des esters de phorbol ou des facteurs de croissance l'endocytose "phase-fluide" (Swanson et al, 1985). Dans ce cas, on parlera plutôt de macropinocytose car les vésicules peuvent avoir une taille de plusieurs pm de diamètre.

En outre, contrairement aux processus d'endocytose faisant intervenir des vésicules "à man­

teau", les macropinocytoses et pinocytoses clathrine-indépendantes semblent faire intervenir un mécanisme de type actine-tubuline, comme le montre la sensibilité de ces endocytoses à la cytochalasine D et à la colchicine.

Pour terminer, notons qu'il existe un autre type d'endocytose (potocytose) réalisé par l'intermédiaire de récepteurs ancrés à la membrane par un radical GPI (récepteur de l'acide 5- méthyltétrahydrofolique) au niveau de microinvaginations de la membrane (caveolae) (Roth- berg, 1990; 1992). Cependant, dans ce cas les microinvaginations ne quittent pas la surface cellulaire pour rejoindre les endosomes précoces. Par conséquent, le rôle des "caveoli" reste très limité dans les processus d'endocytose et est considéré distinct des chemins d'endocytose dépendant ou indépendant de la clathrine.

1.2.3.2 Récepteurs de Tf et endocytose chez les mammifères

A) Les récepteurs de Tf de mammifères

Les récepteurs de Tf (TfR) de mammifère sont des homodimères transmembranaires de

~ 180 kDa composés de deux sous-unités de ~ 760 a.a. attachées entre elles via deux ponts disulfures (Trowbridge & Omaiy, 1981; Schneider et al. 1982; revues: May & Cuatrecasas, 1985; Thorstensen & Romslo. 1990). Chaque sous-unité porte en plus de 3 hydrates de carbone, un acide palmitique qui renforce l'ancrage du récepteur à la membrane plasmique.

Typiquement- un polypeptide est organisé en trois domaines; une queue cytoplasmique N- terminale de 62 a.a., un segment transmembranaire de 26 a.a. et une région extracellulaire C- terminale glycosylée constituant le reste du polypeptide. Le segment transmembranaire contient trois résidus cystéine impliqués dans la fixation d'une chaîne d'acide palmitique et

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