Discussion

L'ensemble de nos résultats suggère que le processus d'internalisation de la transferrine

sérique chez un mutant sanguicole de T. brucei déficient en VSG lipase endogène est ralenti.

Une endocytose moins efficace d'un facteur de croissance comme la transferrine pourrait cons­

tituer un des éléments d'explication à l'atténuation de la croissance cellulaire du mutant,

observée in vivo chez la souris (voir la figure 15 de l'introduction).

Les études d'immunolocalisation du ligand et du récepteur, durant l'endocytose de

Mécanismes de largage et d'internalisation du TfR

transferrine, suggèrent qu'il y a plus de complexes membranaires TfR chez le mutant que chez

le contrôle, mais que néanmoins, il y a toujours une libération du récepteur dans la matrice de

la poche flagellaire. Ceci indique que, même si la GPI-PLC intervient dans le largage du

récepteur, il existe un autre mécanisme qui permet aux complexes récepteurs-ligands (comple­

xes ternaires) ou aux récepteurs libres (complexes binaires), de gagner l'espace intraluminal de

la poche flagellaire (Steverding et al. 1994). Par ailleurs, les résultats obtenus par analyse de

Scatchard révèlent que chez le mutant, il y a moins de récepteurs titrables, c'est-à-dire acces­

sibles au ligand. Pour expliquer ces observations, il est tentant de spéculer l'intervention, au

moins partielle, de la VSG lipase endogène dans le clivage du radical d'ancrage GPI du réce­

pteur de transferrine. Si c'est le cas, on devrait s'attendre à ce que l'absence de la lipase dans les

cellules du mutant diminue le pool de récepteurs libres dans la lumière de la poche flagellaire et

que, inversement, elle augmente le pool de récepteurs membranaires, avec comme conséquence

une diminution globale du nombre de récepteurs accessibles au ligand.

Cependant, il existe d'autres explications à la diminution du nombre de récepteurs

titrables chez le mutant nul:

-la fixation aspécifique du ligand par la protéine de surface majeure (le VSG) dépendan­

te de la nature du variant;

-l'altération dans le recyclage du récepteur de la transferrine chez le mutant.

Concernant la première hypothèse, étant donné qu'il y a environ 3500 fois plus de

molécules de VSG tapissant la surface du parasite (1,13 x lO^molécules/cellule) que de

molécules de récepteur hétérodimérique (~ 3 x 10^ sites/cellule contrôle), il pourrait être

tentant d'imaginer que les fluctuations observées, entre le mutant et le contrôle, dans les

estimations du nombre de récepteurs, résulteraient d'une fixation aspécifique et non identique

du ligand sur les molécules de VSG des cellules du mutant et du contrôle qui sont de types

antigéniques différents (composition en a.a. et point isoélectrique variant selon le type

antigénique).

Imaginons que les molécules de VSG fixent l'holo-transferrine avec une affinité réduite à

0,1% de l’affmité totale du contrôle (ou du mutant) qui est elle-même déjà basse (/fd de l'ordre

du iiMolaire). Il s'ensuit que, si on travaille à concentration saturante en ligand, en première

approximation, on devrait avoir environ 3500 fois plus de molécules de transferrine fixées par

les molécules de VSG que par celles du récepteur pESAG 6/7. Par conséquent, si tel était le

cas, on aurait dû détecter à la surface du parasite, en emplo\ ant des concentrations saturantes

de Tf (250 ug/ml), un marquage par la Tf couplée à l'or ou à la peroxydase de raifort. Or, cela

n'a jamais été observé, excepté pour le flagelle, où dans de très rares cas, on a pu y détecter en

surface quelques grains (Coppens et al, 1987; Salmon et al, 1994) (voir la section 3.2.3).

Cependanu certains auteurs ont détecté, en microscopie électronique, avec de la transferrine-or

ou avec des anticorps anti-Tf, un faible marquage au niveau de la surface du corps du parasite

(Webster À; Grab, 1988; Steverding et al, 1994). Etant donné que ce marquage sur coupe

Mécanismes de largage et d'internalisation du TfR

ultrafine se limite à un, voir à maximum quelques grains, dispersés sur la surface et, que les

molécules de VSG sont identiques sur toute la surface du parasite, ce marquage, même s'il est

spécifique, ne peut être attribué au VSG lui-même. Ce marquage pourrait être dû au fait que le

manteau, lors de la fixation du parasite, pourrait avoir été localement désorganisé, ce qui

permettrait à certains épitopes du récepteur d'affleurer en surface et de devenir ainsi

accessibles aux anticorps.

Par ailleurs, dans les expériences de saturation des parasites sanguicoles avec de la

transferrine iodée que nous avons faites, la contribution due à la fixation aspécifique de Tf

(background) a été retranchée de la fixation totale du ligand par les cellules, de telle manière

qu'en fin de compte seule la fixation spécifique est mise en évidence. Cela signifie que la différ­

ence observée dans l'estimation du nombre de sites de fixation, entre le mutant et le contrôle,

est récepteur-spécifique.

Il est donc peu probable que la différence observée entre la fixation de transferrine par

les cellules mutantes et contrôles soit due à une fixation différentielle du ligand par les

antigènes de surface majeurs du trypanosome.

Un deuxième type d'hypothèse pourrait être d'imaginer que la GPI-PLC n'est pas

impliquée dans le largage du récepteur membranaire pESAG 6/7 mais dans certains aspects de

la biosynthèse des molécules GPI du trypanosome (H. Webb, 1994). Une possibilité est que

la VSG lipase pourrait être impliquée dans le catabolisme d'un excès de molécules GPI

précurseurs chez les formes sanguicoles (McConville & Ferguson, 1993). En outre, il se

pourrait que la structure de l'ancre GPI soit différente chez le mutant déficient en VSG lipase.

Ceci pourrait expliquer pourquoi la composante de 60 kDa de pESAG 6 n'a pas été

immunodétectée dans le lysat du mutant. L'altération dans la structure de l'ancre GPI de la

protéine pESAG 6 pourrait, par exemple, ralentir la vitesse de recyclage du récepteur en

surface. Actuellement, étant donné le peu d'information dont nous disposons sur le trafic

intracellulaire des molécules pESAG 6/7, nous ne pouvons exclure que dans le cas du mutant le

sort des protéines naissantes pESAG 6 soit différent de celui dans le type sauvage. Nous

reviendrons plus loin sur le problème du recyclage du récepteur de transferrine.

Une expérience récente vient conforter l'hypothèse d'implication de la GPI-PLC du

try panosome sanguicole dans le clivage des molécules ancrées à la membrane via une ancre

GPL Dans cette expérience, où l'on étudie le largage du VSG dans des conditions de pH acide,

le mutant nul et le contrôle paraissent se comporter de manières différentes lors de ce traite­

ment acide doux (Rolin et al, 1996). Si l'on incube les cellules du mutant dans un milieu acide

tpH 5.5). pendant 2 heures à 4°C, celles-ci ne libèrent dans le milieu aucune protéine de

surface détectable par du bleu de Coomassie, en gel d'électrophorèse SDS-PAGE, alors que

dans les mêmes conditions, les cellules d'un contrôle (AnTat LIA) libèrent, parmi une série de

molécules, principalement du VSG, détectable par des anticorps anti-CRD. Par ailleurs, le

Mécanismes de largage et d'internalisation di4 TfR

dosage d'une enzyme cytoplasmique du trypanosome, l'alanine aminotransférase, indique que

dans ce type d'expérience, les cellules du contrôle comme celles du mutant libèrent moins de

3% de cette enzyme dans le milieu d'incubation (D. Nolan & S. Rolin, communication

persoimelle). Ceci signifie qu'il est improbable que pendant ce traitement, il y ait eu lyse

cellulaire, comme le confirme d'ailleurs l'observation au microscope optique indiquant que les

cellules sont toujours intactes après le traitement acide.

Ces résultats sont en faveur du rôle actif joué par la VSG lipase dans la libération du

manteau antigénique de surface et d'autres protéines ancrées à la membrane plasmique par un

lien GPl, dans des conditions de stress. Néanmoins, sachant que, in vivo, le mutant est

toujours capable de changer périodiquement son manteau de surface, il est évident que celui-ci

dispose d'un mécanisme alternatif qui lui permet de libérer ce manteau. De la même manière, il

est probable qu'un mécanisme similaire intervienne pour libérer l'hétérodimère dans la matrice

de la poche flagellaire chez le mutant. A ce propos, pour certains auteurs, il semblerait que

dans les conditions naturelles de vie du parasite, le VSG, comme le récepteur de Tf, seraient

largués dans la lumière de la poche flagellaire avec leur ancre GPl intacte (Steverding et al,

1994). En effet, il a été montré que, quand on inhibe à plus de 99% la GPl-PLC par un

inhibiteur de la Pl-PLC (PCMBS), on p>eut immunoprécipiter, à partir de la fraction soluble

d'irn lysat de trypanosome, des complexes TfBP solubles. En outre, si on traite in vitro ces

complexes par de la GPI-PLC purifiée, ils devieiment plus CRD-positifs qu'ils ne l'étaient

avant le traitement enzymatique. Ceci dànontre qu'au moins une partie du récepteur est largué

avec son ancre GPl intacte dans la lumière de la poche flagellaire. Ajoutons que le VSG a aussi

été détecté dans la lumière de la poche flagellaire où se font tous les processus d'exocytose

chez le trypanosome africain (Webster & Grab, 1988; Duszenko et ai, 1988). De manière

comparable à ce qui est observé pour les molécules GPI-liées des érythroeytes, la libération du

VSG, comme celle du récepteur de transferrine, pourrait se faire par bourgeonnement de

vésicules (Whilowcra/., 1993).

Nous pensons que ces observations, faisant intervenir deux mécanismes différents qui

conduisent à la libération du VSG, ne sont pas contradictoires mais plutôt complémentaires.

S'il est elair que le VSG est lentement largué dans le milieu, in vitro (2,2%/heure) (Seyfang et

al, 1990), probablement avec son ancre GPl intacte (= voie constitutive de largage des molé­

cules GPl de surface), on peut imaginer que, in vivo, les anticorps de l'hôte ou tout autre agent

perturbant le manteau de surface (stress! stimulent, par une voie inconnue, l'activation de la

GPl-PLC (palmindation?), laquelle une fois en surface, clive de manière aspécifique toutes les

molécules qui lui servent de substrat (= voie adaptative de largage des molécules GPl de

surface). Ceei pourrait permettre au parasite exprimant deux VSGs à la fois, pendant la

période de remplacement du manteau, d'échapper à la reconnaissance humorale et à la lyse via

le complément, en se débarrassant rapidement et sans distinction, des molécules de VSG (tout

variant confondu ». tout en continuant à s>nthétiser les nouvelles molécules du nouveau variant

Mécanismes de largage et d'internalisation du TfR

antigénique. Cela a comme conséquence que finalement, en terme de bilan, l'ancien variant est

remplacé de manière accélérée par le nouveau variant. Un argument d'ordre expérimental

pourrait appuyer cette hypothèse: les cellules de T. congolense sont capables d'échapper à la

lyse in vitro par le complément, par perte des complexes VSG-anticorps durant une

préincubation à 37°C (Frevert & Reinwald, 1990). Les auteurs postulent que la perte de VSG

se ferait par formation de filopodes, résultant de l'agrégation cellulaire, qui seraient perdus

dans le milieu extracellulaire. Néanmoins, dans le cas de trypanosomes vivants fixés sur des

lames de verre recouvertes de formvar, et en présence d'un agent qui ponte les Igs entre elles

(Clq ou ab2), les complexes immuns, après avoir formé un "cap" en surface (analogue au

"cap" des lymphocytes B), sont libérés dans le milieu. La fixation d'anticorps, spécifiques de

variant antigénique, sur le manteau de surface du parasite, induirait un mécanisme permettant

le remplacement du vieux VSG par le nouveau VSG. Ajoutons que ce phénomène a déjà été

observé chez T. brucei et dans ce cas, c'est aussi l'addition de ligands secondaires (anticorps ou

complément) qui, en pontant plusieurs complexes VSG-anticorps, permet le "capping" suivi

de la perte du VSG (Barry, 1979).

S'il semble assez plausible que la GPI-PLC, en libérant rapidement le VSG, permette au

parasite d'améliorer son système de défense face à la reconnaissance immune de l'hôte, il est

moins évident d'expliquer le(s) rôle(s) de l'activation de la GPI-PLC dans la libération du TfR.

Dans le cas du récepteur de la transferrine sérique, il est peu probable que le domaine de

fixation constitue une cible efficace pour les anticorps de l'hôte. D'après notre modèle d'organi­

sation du manteau de surface de la poche flagellaire (voir la section 4.2), il apparaît que le

récepteur, enfoui entre les molécules de VSG de plus grande taille, n'expose probablement

qu'un nombre limité d'épitopes invariants, constituant le domaine de fixation du ligand. Si nous

avons démontré que, in vitro, des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre la protéine de

fusion pESAG7-Pgal sont capables d'inhiber l'endocytose de Tf bovine à plus de 50% de son

internalisation optimale, il semble que cela tienne à la faible affinité du récepteur pour le ligand

bovin qui entre en compétition avec les anticorps de l'hôte pour le domaine de fixation (Bitter

et al, 1995). D'après le modèle proposé par Borst et ses collaborateurs, étant donné que le

parasite optimalise, en changeant de site d'expression, son affinité pour la transferrine sérique

de son hôte, il semble peu probable que les anticorps de l'hôte soient naturellement capables

d'affecter l'internalisation du ligand. Ainsi, avec des anticorps dirigés contre le récepteur natif,

les auteurs n'obtiennent que 10-20% d'inhibition d'internalisation de la transferrine pour im

récepteur de forte affinité et montrent que, dans ce cas, l'anticorps est sans effet sur la

croissance du parasite in vitro (Bitter et al, 1995). Par conséquent, dans les conditions

naturelles, les parasites en générant des récepteurs fixant préférentiellement la Tf de leur hôte,

diminuent le risque de lyse induite par l'anticorps via le complément.

Un des rôles possibles dans le largage du récepteur de Tf par la VSG lipase pourrait

être de dégager la membrane de la poche flagellaire, en permettant ainsi d'augmenter la vitesse

lumière de la poche flagellaire

GPl-PLC ancre

GPl

_ complexe

Tf-récepteur

I--- DAG

r-i bicouche lipidique

ôooooooooooooooo

Figure 37 Modèle schématisant le mode d'action de la GPI-PLC sur les molécules de VSG et de récepteur de Tf du manteau

de la poche flagellaire. I: inositol, P: phosphate, DAG: diacylglycérol, GPI-PLC: phopholipase C spécifique des ancres

glycosylphosphatidylinositol.

Mécanismes de largage et d'internalisation du TfR

de remplacement du manteau antigénique de surface qui se fait à partir de la membrane de la

poche flagellaire (Duszenko et ai, 1988). Cependant, il apparaît que la conséquence la plus

directe de la libération de complexes TfR. dans la poche flagellaire est finalement un

accroissement global de l'endocytose de la transferrine sérique (voir les figures 33A, B, C).

L'accumulation préférentielle des complexes TfR dans la matrice intraluminale de la poche

flagellaire, observée dans le cas du contrôle, pourrait permettre au parasite d'augmenter

l'efficacité de son système d'endocytose. Comme le suggère la figure 33C, dans le cas du

mutant, il semble que l'internalisation globale de transferrine, résulte surtout d'une endocytose

de complexes TfR via des récepteurs membranaires, plutôt que d'une endocytose "fluide".

Comme nous en discuterons dans la section suivante, la superposition d'une endocytose

"fluide" (mais toujours spécifique) à une endocytose classique via des récepteurs membra­

naires, devrait permettre au trypanosome d'accroître l'efficacité de son système d'interna­

lisation du ligand, confiné à la seule poche flagellaire.

En résumé, l'ensemble des résultats obtenus par l'analyse des phénotypes du mutant

comparés au contrôle: l'absence de libération du VSG par choc acide (Rolin et al. 1996),

l'atténuation de la croissance cellulaire (Webb, 1994), la réduction de l'internalisation de Tf

corrélée à une réduction du nombre de récepteurs accessibles et la localisation membranaire

préférentielle du ligand, nous porte à croire que la VSG lipase intervient probablement dans le

clivage de l'ancre GPI du récepteur de la transferrine, comme de celle du VSG.

Le largage des protéines de surface ancrées via un radical GPI n'est pas sans précédent

chez les protozoaires. En effet, des évidences claires démontrent qu'une PI-PLC endogène,

régulée au cours du cycle cellulaire de T. cruzi, intervient dans la libération de l'antigène Ssp-4,

durant la différenciation des formes amastigotes en formes épimastigotes (Andrews et ai,

1988). Par ailleurs, dans le mécanisme d'invasion des érythrocytes par les formes mérozoïtes

de Plasmodium falcipanim et P. chabaudi, une sérine protéase de 68 kDa est activée, suite au

clivage par une GPI-PLC endogène du mérozoïte (Braun-Breton et ai, 1992).

Notons que dans ces expériences, un contrôle additionnel indispensable devrait

consister en l'emploi d'un mutant révertant dans lequel on a rétabli l'expression du gène de la

VSG lipase. En outre, si nous avions disposé d'anticorps capables d'immunoprécipiter le

récepteur de Tf, nous aurions pu sélectivement comparer la nature de l'ancrage de la fraction

soluble du récepteur chez les cellules du mutant avec celle des cellules contrôles.

La figure 37 représente un modèle schématisant le mode d'action de la GPI-PLC sur les

molécules de VSG et de TfR. Comme nous l'avons déjà mentionné auparavant, un problème

subsiste: comment la VSG lipase, qui serait associée à la face externe de vésicules intracyto­

plasmique (Bülow et ai. 1989a), peut-elle passer à travers la bicouche lipidique pour assurer

le clivage enzymatique de l'ancre GPI? Cette problématique n'est pas sans précédent chez le

Mécanismes de largage et d'internalisation du TfR

trypanosome: les protéines du glycosome (analogue sur le plan évolutif au peroxysome et au

glyoxysome des organismes supérieurs; Michels & Opperdoes, 1991) synthétisées par les

polyribosomes cytoplasmiques doivent être importées post-traductionellement, sans

modification, dans le glycosome, quelques minutes après leur synthèse (revues récentes:

Opperdoes & Michels, 1993; Clayton et al, 1995). Le ciblage de la plupart des enzymes

glycolytiques au glycosome requiert une séquence signal C-terminale homologue à la séquence

de type PTS-1, impliquée dans le ciblage des protéines aux peroxysomes des cellules de

mammifères. Le fait que ces protéines possèdent un signal consensus d'adressage C-terminal

exclut que celles-ci soient importées co-traductionnellement. Dès lors, cela implique qu'elles

sont délivrées à la machinerie d'import, soit dans un état de reploiement, soit dans un état

déroulé maintenu par des chaperonines cytoplasmiques. Des chaperonines ont été identifiées

chez T. brucei et pourraient jouer un rôle dans le reploiement correct des protéines solubles

ainsi que dans le maintien des protéines destinées à être transportées à travers des membranes,

dans une conformation apte au transport (Glass et al., 1986).

La séparation topographique de la GPI-PLC et de ses substrats potentiels (mfVSG,

TfR), pourrait jouer un rôle fondamental dans le contrôle de l'activité de la lipase. Dans des

conditions de stress acide, l'étape fondamentale nécessaire au largage du manteau de surface

devrait être le contrôle de la translocation de la GPI-PLC à travers la membrane plasmique.

Ainsi, l'élucidation des mécanismes d'activation (par démodification?) et de ciblage de la GPI-

PLC, devrait contribuer fortement à améliorer nos connaissances sur le mode d'action de cette

enzyme impliquée dans le clivage de protéines GPI de surface.

Remarquons que la GPI-PLC génère par son action enzymatique de l'IP3 et du DAG

qui sont connus comme étant d'importants messagers secondaires chez les eucaryotes

supérieurs, produits via des récepteurs de surface en réponse à des hormones, cytokines et

autres facteurs de croissance (Majerus, 1992). Néanmoins, il est peu probable que la VSG

lipase soit impliquée dans la génération de messagers secondaires (IP3, DAG) comparable à ce

qu'on observe dans le cas de la stimulation du récepteur de l'insuline. En effet, contrairement à

ce qu'on observe dans la transduction de signaux par les PLC de type I (a, (3, y, ô) (calcium

dépendantes) (Majerus, 1992), les produits résultant du clivage des molécules GPI de surface,

par la GPI-PLC, sont générés à l'extérieur de la cellule et non à l'intérieur de celle-ci. Par

ailleurs, le fait que chez le mutant, un traitement acide doux ne libère pas le manteau de surface

mais, active l'adénylate cyclase, indique que ces deux phénomènes ne sont pas couplés, comme

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