-TAP,etdeleursconjuguésenvued’applicationsenbiologiemoléculaire Contributionàl’étudedelaphotophysiqueetdelaphotochimiedecomplexesderuthénium FacultédesSciencesServicedeChimieetPhysicochimieOrganiques UniversitéLibredeBruxelles

Université Libre de Bruxelles

Faculté des Sciences

Service de Chimie et Physicochimie Organiques

Contribution à l’étude de la photophysique et de la photochimie

de complexes de ruthénium

-TAP, et de leurs conjugués en vue

d’applications en biologie moléculaire

Thèse de doctorat présentée par Promotrices de thèse :

Lionel Marcélis en vue de l’obtention Pr. Cécile Moucheron

du titre de Docteur en Sciences Pr. Andrée Kirsch-De Mesmaeker

de l’Université libre de Bruxelles Comité de thèse :

Dr. Vincent Raussens

Aspirant F.R.S.-FNRS Dr. Erik Goormaghtigh (président)

Université Libre de Bruxelles

Faculté des Sciences

Service de Chimie et Physicochimie Organiques

Contribution à l’étude de la photophysique et de la photochimie

de complexes de ruthénium

-TAP, et de leurs conjugués en vue

d’applications en biologie moléculaire

Thèse de doctorat soutenue Promotrices de thèse :

les 19 et 22 novembre 2013 par Pr. Cécile Moucheron

Lionel Marcélis en vue de l’obtention Pr. Andrée Kirsch-De Mesmaeker du diplôme de Docteur en Sciences Membres du jury de thèse :

de l’Université libre de Bruxelles Pr. John M. Kelly Dr. Vincent Raussens Aspirant F.R.S.-FNRS Pr. Nathalie Vaeck

Pr. Jacques Liévin (secrétaire) Dr. Erik Goormaghtigh (président)

Remerciements

Un célèbre penseur a dit un jour que "la thèse c’est une aventure (...) faite de hauts et de bas"... Bien que, pour ma part, j’ai eu souvent davantage l’impression d’un tunnel sans fin, avec heureusement plein de gens sympathiques pour vous donner un peu de lumière, cette définition est assez correcte. C’est en tout cas une expérience inédite sur le plan personnel, parfois plus que sur le plan scientifique, et certainement plus enrichissante pour le premier que le deuxième... Car, inutile de faire durer le suspense insoutenable qui vous assaille plus longtemps, non, cette thèse ne va pas sauver le monde... Mais ce n’est pas une raison pour ne pas la lire ! Car, oui, il y a quand même de l’intérêt à la lire, et cela c’est en grande partie grâce aux personnes qui y ont été impliquées.

Cette thèse a été réalisée grâce à mes deux promotrices, les Professeurs Andrée Kirsch-De Mesmaeker et Cécile Moucheron, que je tiens à chaleureusement remercier. Si vous pouvez lire ces lignes, c’est en grande partie grâce à Fanny.1 _{Que dire... il y aurait de quoi écrire une deuxième thèse avec ces journées}

entières à discuter de modèles photophysiques pas vraiment "solubles dans l’air" jusqu’aux crises de fou-rire avec Pierre pendant nos quelques cours de Chinois. Par ton insatiable curiosité scientifique, ton sens de l’humour, ton tact très personnel et ton esprit aiguisé, j’ai appris beaucoup et cela va continuer puisque je vais partir à Taïwan, toujours grâce à tes contacts. Certes, je risque toujours par moments de "donner une dépression à tout un régiment", mais je pense que d’avoir réalisé cette thèse dans ton service m’a changé et rendu un peu meilleur... du moins je l’espère ! En tout cas, je considère comme un honneur la chance d’avoir été ton dernier doctorant. Cécile, je voudrais te remercier pour la liberté et la confiance que tu nous accordes. Je suis sûr que dans le futur tu parviendras à diriger avec brio le laboratoire maintenant que tu es full in charge, par ton dynamisme et ton moral infatigables.

Si cette thèse est finalement là, devant vous, c’est aussi en grande partie grâce aux nombreuses personnes avec qui j’ai eu la chance de pouvoir collaborer ; et elles sont nombreuses, j’espère que je n’oublierai personne...

Bien évidemment, je tiens à remercier en premier lieu le Professeur Eric Defrancq pour m’avoir accueilli à de nombreuses reprises à Grenoble. Il faut bien le reconnaître, mes séjours à Grenoble n’ont pas toujours été couronnés de succès... Preuve encore une fois de mon incommensurable talent pour la synthèse organique... Mais, au pied des Alpes, on ne développe pas que des collaborations scientifiques, et, si je n’ai pas réussi à obtenir ces fameux Ru-TAT tryptophane (désolé de casser le suspense), j’ai pu passer des moments très agréables, autour d’une bière ou d’un bon repas, qui resteront bien plus en mémoire qu’un conjugué peptidique... J’espère que dans le futur j’aurai la chance de travailler encore avec toi ; et, il faut que je l’avoue, aussi de pouvoir skier à Grenoble, car, au vu des remerciements dans les thèses de Stéphanie Deroo et Olivier Lentzen, je suis le seul à ne pas y avoir eu droit ! Également un grand merci à Rémy Lartia pour ses coups de mains en synthèse, au Professeur Didier Boturyn pour m’avoir fourni les plateformes RAFT, au Docteur Lucie Sancey et au Professeur Jean-Luc Coll pour les cultures cellulaires sur les Ru-RAFT et les autres anciens de Grenoble, Pierre, Romaric, Isabelle, Matthieu,...

I thank Dr. Eduard Fron from the KULeuven for all the measurements made by Up-Conversion and SPT with my damned photoadduct ; I hope you won’t keep a too bad impression of me because of all these nights spent recording the weakest signal ever seen in your lab... I’d like to thank Pr. Michel Sliwa

from Lille for his help and acces to his laboratory ; and, of course, Dr. Mateusz Rebarz, a.k.a. the "god of lasers", formely here in Brussels and now in Lille. Mateusz, the work you do is really impressive and I wish you all the best for your future and successful career in Poland. Just one thing ; you’ll have to tell me how you get smooth laser signal, because everytime I presented results to Fanny, she said "c’était plus joli avec Mateusz...".

Je remercie également les personnes du beau pays de Liège ; le Professeur Jacques Piette, qui, bien qu’il ne me reconnaisse pas dans les ascenseurs du GIGA, m’a toujours bien accueilli à l’ULg et m’a donné la chance de travailler avec des biologistes non seulement compétents mais fort sympathiques ; Sébastien Bontems, qui a réalisé les premières expériences en FACS ; et bien évidemment, Isabelle Coupienne qui a eu la gentillesse et la patience de me former à la culture cellulaire. Et oui, maintenant je sais faire des jolies lames pour la confocale (jolies, pour un chimiste s’entend !). Merci également à Anca Reschner et aux Professeurs Philippe Delvenne et Géraldine Piel.

Je tiens à remercier le Professeur Martine Raes de l’UNamur (non, ce ne sont plus les FUNDP), ainsi que le Dr. Nancy Van Overstraeten-Schlögel et Martine Van Steenbrugge pour les travaux réalisés à Namur. J’espère que nous aurons l’occasion de publier ces résultats ! Encore merci pour les réunions Waléo lors desquelles nous avons toujours été bien reçus.

Merci également à Laurent Collard de l’UCL pour son aide et ses précieux conseils pour l’HPLC. Et bien évidemment au Professeur Benjamin Elias, le seul, l’unique, le suppôt de Satan, bref... le BOSS ! ! !

Pour conclure ces collaborations hors ULB, j’en viens bien évidemment aux personnes de l’UMons. Est-ce parce que c’est la ville du Doudou, que la vendeuse de sandwich nous accueille toujours par un jovial "salut les jeunes", que nous mangeons bercés par le doux murmure des pompes des spectros et qu’il y a toujours de la bière dans le frigo ? En tout cas, à Mons on se sent comme à la maison. En réalité, c’est grâce aux gens là-bas, qu’on ne peut pas considérer comme des collaborateurs ordinaires, mais plutôt comme des amis. Merci donc au Professeur Pascal Gerbaux pour tous ces spectres relevés de main de maître. Ta facilité à manier le Nano-ESI m’a toujours impressionné (d’ailleurs, à propos du Nano-ESI, je sais pas si Julien te l’a dit, mais il existe une petite centrifugeuse...). Je remercie également le Dr. Julien De Winter, maître du Maldi (non, je ne dirai pas ici lequel du ESI ou du Maldi est le meilleur), qui est le seul massiste capable de trier un congélateur à 70 km de distance ! ! ! Un grand merci aussi au Dr. Mathieu Surin (je te dois toujours un resto) pour les magnifiques calculs réalisés sur nos Ru-ODNs (vous verrez plus loin, si vous lisez le reste de la thèse ce qui de l’aveu même de Fanny ne risque pas trop d’arriver, les modélisations sont très jolies).

Pour les collaborations au sein de notre Alma Mater, je tiens à remercier tout particulièrement le Professeur Ivan Jabin, ainsi qu’Alice Mattiuzzi et Damien Cornut (même si apparement, c’est pas "ton" calix, pour moi le crypturée, ça restera toujours le calix de Damien !). J’ai particulièrement apprécié de pouvoir travailler dans le merveilleux monde des calixarènes (je l’ai toujours pensé, les calix sauveront le monde... une fois qu’il seront solubles dans l’eau). Merci également aux Professeurs Erik Goormaghtigh et Vincent Raussens, qui, non contents de faire partie de mon comité d’accompagnement et de mon jury de thèse, m’ont laissé libre accès à leur laboratoire. Je remercie d’ailleurs Benjamin Caroyez, a.k.a. flying

Raymond, pour son aide précieuse pour "phototuer l’utérus de cette pauvre Henrietta"... Un grand merci

au Docteur Thomas Donneux pour avoir eu la patience et l’extrême gentillesse de réaliser les mesures voltampérométriques dans le dernier sprint final ! Merci également au Professeur Michel Luhmer, ainsi qu’à Rita D’Orazio et Lidija Stefanoska pour le relevé des spectres RMN, car oui, j’ai relevé des spectres RMN, et même sur le 600 !Bon au final, c’était juste de l’eau orange, mais quand même... Merci également aux Professeurs Nathalie

Vaeck et Jacky Liévin d’avoir accepté de faire partie de mon jury de thèse.

agréable.

I would like to thank Professor John M. Kelly to give me the honour to read and criticize this thesis. I am really glad that you travel from Dublin to Brussels and look forward to enjoying an enriching discussion about our results and interpretations.

J’en viens maintenant aux locataires et ex-locataires (ayant un bail plus ou moins long) du P2, chef d’œuvre d’architecture et de modernité trônant au milieu du campus. Je remercie d’abord les personnes qui font fonctionner ce vénérable édifice : Mohamed, chef d’atelier hors-pair ; Jessica, Vanessa et Mélanie, nos secrétaires efficaces et dévouées ; mais aussi Rita L., pour l’achat unique dans le monde d’une "lampe

à cathode creuse pour le fun" chez Waters ; Simon, le roi de la pipette ; une pensée émue pour Robert et

aussi finalement pour Juliana et sa toux aussi légendaire que ses mails (presque) envoyés à Mme l’Ingénieur Professeur Ordinaire K. Bartik.

La transition est donc toute trouvée pour passer aux habitants du premier étage avec qui nous par-tageons agréablement nos journées. Kristin Bartik avec sa bonne humeur, ses conseils et les petites plai-santeries partagées... À ce propos, nous devons toujours trouver ce fameux restaurant avec balcon. Merci aussi pour les cafés et les fameux drinks du 5 décembre au marmite (même si c’est dommage qu’il n’y ait pas eu de croissants...). Gilles Bruylants, le nouveau chef du labo ! Partager quelques analyses caustiques avec toi est toujours un plaisir. Flore... j’hésite à te remercier ici par quelques lignes ou t’envoyer un roman par sms à 2h du mat’... Avec ton caractère bien trempé et ton cœur d’or, je te souhaite bonne continuation avec tes micelles rebelles et tes récepteurs fluorophiles mais pas trop. Jenny, depuis ton départ les repas sont bien trop calmes ! Paolo, reparti bien trop tôt à Rome, même si, on peut bien l’avouer maintenant, c’est en grande partie à cause de toi que le P2 est devenu un repère d’alcooliques notoires. Tant que nous sommes avec les italiens, Luca, même si je n’ai pas toujours pu suivre tes raisonnements jusqu’au bout, tes explications emballées sur tes nouvelles expériences ont toujours été passionnantes. Et ce n’est pas tous les jours qu’on utilise des éléments aussi exotiques en RMN. Les ingénieurs Matthieu D. et Emilio pour les séances de mini-foot endiablées ; j’espère que l’encadrement de bioingénieurs en mémoire vous sera profitable. Et, évidemment, le seul, l’unique (aussi), l’âme du P2, rien de moins, Matthieu ! Même si la première rencontre fut, en tout cas pour moi,... marquante... je suis ravi d’avoir eu la chance de te connaître. Je ne vanterai pas tes qualités ici, tâche vaine par définition car, après tout, on est pas l’"atout de l’école polytechnique de Bruxelles" par hasard !

Dans les anciens, je voudrais remercier Luc Jacquet. Certes, nous ne nous sommes vus qu’une seule fois, mais ta thèse a réussi ce que le tas de papier que vous tenez entre les mains n’arrivera pas à faire, c’est à dire, devenir "LA bible" du labo. Mais passons aux ex-P2siens que j’ai eu la chance de côtoyer plus ou moins longtemps. Kathleen et Leslie, parce que le labo était quand même peuplé de filles quand je suis arrivé (heureusement nous renouons avec la tradition), qui apportaient joie, fou-rires et de nombreux cris d’effroi quand elles se surprenaient mutuellement au détour d’une porte. Nico C pour qui je n’ai pas eu l’occasion d’assister à la défense étant parti "skier" à Grenoble. Nico G, qui a eu le courage de se battre avec les photoadduits lui aussi. François, grâce à qui j’ai pu me mettre aux gels d’électrophorèse. Et finalement Javiera, compagne indéfectible durant le mémoire, et dont la principale qualité est, en toute modestie et de son propre aveu, "belle" ; le labo n’a plus jamais été le même pour moi sans toi. Mais, maintenant que j’en suis sorti aussi, j’espère bien qu’on ne se perdra plus ! Évidemment, je ne peux clore ce paragraphe sur les anciens sans remercier le mono-cerveau, Diane et Jonathan, qui m’ont bien vite greffé pour mon plus grand plaisir. Diane, a.k.a. Diddy McCall, source d’un nombre incalculable de bons ou "mauvais" coups, je ne peux malheureusement rien dire sans craindre le dossier bien trop compromettant que tu as sur moi... Sauf te dire que j’ai adoré ces deux années malgré les risques de coups de serpe. Et Jonathan, a.k.a. Pétunia (oui, on a pas que des surnoms cools), le mentor du mémoire, j’ai appris plein de choses grâce à toi, en photochimie mais pas seulement ! Avec vous, c’était une autre époque au P2 ; comment ne pas repenser aux bureaux piégés, aux "courses" de noël, aux fusées à l’azote liquide, au voyage à Ferrara, au déménagement des vieux labos de sonochimie, aux paris des œufs, au flipper vaincu par le "roi des boules", au "nettoyage" de la presse à sodium et à la fuite d’acide dans la réserve et les chaussures de carnaval...

disparaissent les week-ends sur le campus, c’est pour te faire une table basse. Gaetan, j’espère que tu trouveras ton ligand de la mort qui tue plus vite que le remboursement par l’ULB des abonnements STIB. Karim "mon" deuxième mémorant ; Cédric, "mon" troisième mémorant, bien que j’en doute par moments, car je suis pratiquement sûr que ce n’est pas moi qui t’ai refilé ni ce goût pour la synthèse organique, ni celui pour la sobriété à l’atelier ; enfin, quand tu sortiras tes nouvelles recettes de cuisine, n’oublie pas de citer qui tu sais ! Sofia, tu ne m’en voudras pas de ne pas utiliser 3 hectolitres d’encre pour te remercier... Après tout, le seul fait d’être dans mes remerciements te permet de tweeter sur Foursquare que tu y es présente avec Marc Inquer et Marc Christ, le frère de Bruno et le deuxième neveu caché de Jésus. Que demander de plus ? ? Et puis les petits nouveaux, Kwatar ou Quatar, c’est quand même compliqué à prononcer, Guillaume, qui persiste à vouloir qu’on l’appelle Jérôme (j’ai toujours dit que tu étais le meilleur des mémorants) et Dounia ou Wendy (là j’ai toujours pas compris le lien), j’espère que tu profiteras bien de cette année à Grenoble (et tu me diras si on skie vraiment là-bas).

Si ces quelques années ont été spéciales au P2, c’est aussi grâce à toi, Laureline. Tu es une fille géniale et j’ai été très heureux de te connaître vraiment ; car ta timidité cache une gentillesse, un cœur énorme et une grandeur d’âme insoupçonnable et rare. J’espère de tout cœur que tu seras heureuse, et pas seulement avec J & B. Ne sombre pas dans l’alcoolisme ambiant au P2 (même si avec une seule Kasteel Red par sortie, ça ne reviendra pas trop cher !). Et, maintenant en toute déontologie, je te souhaite sincèrement tout le meilleur pour l’avenir ! (avec de belles nanoparticules, ce serait encore mieux !)

Pour clore ces remerciements intra-P2, j’en viens bien évidemment à Ludo ; Dieu vivant de la synthèse organique (il faudra quand même que tu m’expliques le coup du micro-onde... avoue, il est truqué !), roi des BBQ, tornade blanche du labo, coupeur de sodium hors-pair, ma thèse n’aurait pas été la même sans toi. Et le labo te doit beaucoup. Et comme, à mon sens, tu n’en es pas remercié assez, je le fais ici ! J’espère que tu recevras le soutien que tu mérites pour la rédaction et que cela te permette de t’envoler vers un post-doc qui, j’en suis sûr, sera épanouissant ! So, keep going and we’ll see us soon in the US, buddy !

Le P2, c’est bien, mais pour tenir le choc de la thèse, heureusement qu’il y a des gens en dehors ! Je profite donc de cette thèse (heureusement, on en écrit qu’une) pour les remercier aussi. Merci aux anciens chimistes de la promo, et en particulier à Éléonore (courage, la fin approche !), Yannick (ne "termine" quand même pas trop d’étudiants avant la fin de ta thèse) et Stéphane (bientôt la fin des caribous ! ! !), ainsi que Steven et Maxence. Je tiens également à remercier deux personnes importantes dans mon parcours scolaire et personnel. Myriam Vogel, dont l’éloge en tant que meilleur professeur de chimie n’est plus à faire, comme notre Recteur s’en est déjà chargé ; j’ajouterai néanmoins qu’être prof n’est pas tout, et qu’avoir une personne humaine en face de nous pour nous donner cours te singularisait encore davantage à l’athénée. Évidemment, merci à Frédéric Noël ; si on m’avait dit que j’allais remercier un prof de néerlandais dans une thèse en chimie quand j’assistais à mes cours en 3ème _{secondaire je ne}

l’aurais pas cru... C’était avant de te rencontrer et d’apprendre à aimer (si si) la langue de Vondel lors de nos cours particuliers, mais tu me permettras j’en suis sûr de te remercier ici non pas en tant que prof, mais plutôt en tant que grand frère.

Je remercie la famille qui m’a entouré toutes ces années. Merci à toi, Odile, pour m’avoir accueilli lors de ma première année à l’unif, c’était vraiment chouette de passer du temps à l’appart après les cours. Merci à Arlette et Roberto, Daniel et Renée, Christine et Michel, Pierrot et Claude, Josiane, Marie-Paule et Louis, pour leur soutien inconditionnel et leur affection. Je n’en ferai pas des tonnes, parce qu’il faut bien voir la vérité en face, je n’ai pas la même passion pour les envolées à la guimauve... mais ça ne m’empêche pas de t’écrire ici que, oui tu es un père formidable, Pa ; mais n’en profite pas après pour le crier sur tous les toits ! Enfin, je remercie mon petit frère, Arnaud. Si nous avons eu quelques différends quand nous étions plus jeunes (mais en même temps, tu étais insupportable), je suis heureux que nous soyons de vrais frères désormais. À la vie à la mort comme on dit, et n’oublie pas que, quoi qu’il arrive, pour moi tu es le meilleur, et surtout que je serai toujours là pour toi !

Pour terminer, après avoir remercié tous ceux qui comptent et que je n’ai pas eu l’occasion de citer, je dédie ces quatre années de travail, avec toutes leurs joies et leurs peines, à ceux qui m’ont tant manqué pour les partager.

Avant-propos

Le présent travail tend à rapporter au mieux les expériences réalisées au cours des quatre années de mandat d’aspirant F.R.S.-FNRS. Les recherches menées se situent dans le cadre global de l’étude de complexes de ruthénium photoréactifs. Au vu de la variété des études menées, nous nous proposons de scinder ce travail en plusieurs chapitres, comprenant à chaque fois une introduction dédiée spécifique. Ces chapitres, repris dans la deuxième partie, porteront respectivement sur : (i) l’étude fondamentale des complexes de ruthéniumII _{comprenant le ligand tétraazaphénanthrène (TAP), en particulier une étude en}

présence d’un dérivé calixarènique et une étude en spectroscopie femtoseconde (Chapitre 1) ; (ii) l’étude fondamentale du photoadduit entre complexe de ruthénium et la GMP (Chapitre 2) ; (iii) l’étude de conjugués Ru-OAS (ancrage de complexes sur oligonucléotides anti-sens), ainsi que l’étude et l’application du processus "Seppuku" (Chapitre 3) ; (iv) et finalement, l’étude de conjugués Ru-peptide en vue de l’étude la vectorisation cellulaire des complexes de ruthénium, ainsi que les études des complexes photoréactifs ancrés sur calixarènes (Chapitre 4).

Finalement, une conclusion générale ainsi que les perspectives pour de futures recherches seront expo-sées. Suivront ensuite la partie expérimentale, ainsi que la bibliographie générale du travail. Notons qu’une partie de la section expérimentale sera présentée en anglais.

Une introduction générale ouvrira le début de la thèse et constituera une mise en contexte plus théorique des travaux. Loin d’être exhaustive dans la présentation des concepts qu’elle introduit, cette introduction générale ne sert que d’entrée en matière et sa construction relève d’un choix personnel. Celle-ci est principalement basées sur des ouvrages de référence reconnus en photophysique, photochimie et photobiologie.[1–4] _{Néanmoins, au vu de la structure de cette thèse, cette introduction générale n’est}

pas essentielle à la compréhension du travail effectué. Aussi, l’introduction strictement nécessaire à la compréhension des travaux réalisés dans chaque chapitre est reprise de manière spécifique en début de ceux-ci et comprend les références bibliographiques adaptées.

Table des matières

Remerciements i

Avant-propos vi

Table des matières x

Abréviations et structures des principaux ligands cités xiv

Liste des publications xvi

Résumé xvii

I

Introduction Générale

1

1 Introduction à la Photophysique et à la Photochimie 2

1.1 Lumière et matière - Un peu d’histoire . . . 2

1.1.1 Théorie classique de l’optique . . . 2

1.1.2 Mécanique quantique et photons . . . 3

1.2 Photoluminescence : fluorescence et phosphorescence . . . 5

1.2.1 Historique . . . 5

1.2.2 Absorption photonique . . . 6

1.2.3 Diagramme de Perrin-Jablonski . . . 8

1.2.4 Temps de vie et Rendements Quantiques . . . 10

1.3 Techniques expérimentales usuelles en photophysique et photochimie . . . 10

1.3.1 Spectroscopies d’émission et d’excitation stationnaires . . . 11

1.3.2 Techniques expérimentales de spectroscopie résolue dans le temps . . . 11

1.4 Quenching de luminescence . . . 15

1.4.1 Quenching dynamique . . . 16

1.4.2 Quenching statique . . . 19

1.4.3 Quenchings dynamique et statique simultanés . . . 21

1.5 Processus photo-induits . . . 21

1.5.1 Transfert d’électron . . . 21

1.5.2 Transfert de proton photo-induit et formation de ponts hydrogènes . . . 23

1.5.3 Autres mécanismes de quenching . . . 25

2 Vers la photobiologie... Complexes de Ruthénium, lumière et ADN 27 2.1 Introduction à la photobiologie . . . 27

2.1.1 Lumière et ADN . . . 27

2.1.2 Photothérapie . . . 28

2.2 Complexes de Ruthénium, lumière et ADN . . . 28

2.3 [Ru(bpy)3]2+: le modèle . . . 29

2.4 [Ru(bpy)2(dppz)]2+: l’effet light-switch et l’ADN . . . . 30

II

But du travail

33

III

Résultats et Discussions

36

1 Études photophysiques et photochimiques de complexes de RuII ₃₇

État de l’art 37

1.1 Photophysique des complexes polyazaaromatiques de RuII-TAP . . . 37

1.1.1 Formation de l’état3_{MLCT : études des processus ultra-rapides . . . . 37}

1.1.2 Photodégradation et photoréactivité par substitution de ligand : l’état 3_{MC . . . . 38}

1.2 Calixarènes : inclusion et reconnaissance . . . 40

Résultats et discussion 41 1.3 Photophysique et photochimie du [Ru(TAP)2(phen)]2+en présence de calix[6]arènecrypturée 41 1.3.1 Transfert de proton photo-induit avec le calix protoné . . . 41

1.3.2 Etude de la photochimie du [Ru(TAP)2(phen)]2+avec les chlorures . . . 42

1.3.3 Proposition de modèle photophysique pour le [Ru(TAP)2(phen)]2+dans l’acétoni-trile et le butyronil’acétoni-trile et modélisations des temps de vie de luminescence . . . 47

1.4 Études sub-nanoseconde de la dynamique du [Ru(TAP)3]2+excité . . . 51

Conclusions et perspectives 53 2 Études photophysiques et photochimiques de photoadduits RuII-GMP 55 État de l’art 55 2.1 Formation d’adduits entre complexes de métaux de transition et cibles biologiques . . . . 55

2.1.1 Le cisplatine et ses dérivés . . . . 55

2.1.2 Les complexes de RuthéniumII _{. . . . 57}

Résultats et discussion 58 2.2 Isolement et purification des photoadduits de complexes de RuII _{avec la GMP . . . . 58}

2.2.1 Photoproduction d’adduit RuII_{-GMP . . . . 58}

2.2.2 Caractérisation par spectrométrie de masse haute résolution des photoadduits isolés 59 2.3 Étude photophysique du photoadduit majoritaire (fractiona) isolé et purifié . . . 63

2.3.1 Absorption et effet de pH . . . 63

2.3.2 Émission stationnaire du photoadduit . . . 64

2.3.3 Voltampérométrie cyclique . . . 64

2.3.4 Mesures spectroscopiques ultra-rapides en absorption transitoire et en émission . . 65

2.3.5 Mesures spectroscopiques résolues dans le temps à l’échelle des nanosecondes . . . 71

Conclusions et perspectives 73 3 Photoréactivité de conjugués RuII_{-ODN et "Gene silencing" 74} État de l’art 74 3.1 La "Thérapie Génique" . . . 74

3.1.1 Gene silencing par thérapie génique anti-gène et anti-sens . . . 74

3.1.2 Gene silencing et si -RNA . . . . 75

3.2 Développement des conjugués RuII_{-OAS et processus "Seppuku" . . . . 75}

Résultats et discussion 77 3.3 Étude de la sélectivité entre photoréactions inter- vs intra-brins . . . . 77

3.3.1 Influence de la position de la base Guanine sonde . . . 77

3.3.2 Modélisation moléculaire . . . 79

3.3.3 Étude de la photoréaction intra-brin en conformation double hélice . . . 81

3.4 Validation de la stratégie anti-sens Ru-OAS in vivo . . . . 83

3.4.1 Silencing de la GFP . . . 83 3.4.2 Restauration de l’apoptose dans les cellules infectées par le Papillomavirus Humain 87

4 Complexes de RuII _{ancrés sur oligopeptides et internalisation cellulaire 91}

État de l’art 91

4.1 Vectorisation cellulaire d’OAS et d’ADN en thérapie génique . . . 91

4.1.1 Vecteurs viraux . . . 91

4.1.2 Transporteurs non-viraux . . . 92

4.1.3 Internalisation cellulaire photoinduite . . . 92

4.2 Vectorisation cellulaire des complexes de RuII _{. . . . 93}

4.2.1 Pénétration cellulaire de complexes de RuII_{. . . . 93}

4.2.2 Les cell penetrating peptides et le peptide TAT . . . . 93

4.2.3 La plateforme RAFT-(RGD)4 . . . 94

Résultats et discussion 95 4.3 Études des conjugués Ru-TAT . . . 95

4.3.1 Synthèse et ancrage de complexes de RuII _{sur le peptide TAT . . . . 95}

4.3.2 Photoréactivité des conjugués Ru-TAT . . . 96

4.3.3 Vectorisation cellulaire des conjugués Ru-TAT . . . 96

4.3.4 Cytotoxicité et photo-cytotoxicité des conjugués Ru-TAT . . . 100

4.4 Conjugués Ru-RAFT(RGD)4 . . . 103

4.4.1 Synthèse et caractérisation des Ru-RAFT(RGD)4 . . . 103

4.4.2 Vectorisation cellulaire des Ru-RAFT(RGD)4. . . 105

4.5 Conjugués Ru-Calix . . . 108

4.5.1 Synthèse et électrochimie des conjugués Ru-Calix . . . 108

4.5.2 Photophysique des conjugués Ru-Calix . . . 108

4.5.3 Étude du processus de quenching . . . 110

4.5.4 Deuxième génération de Ru-Calix . . . 113

Conclusions et perspectives 114

IV

Conclusions générales et perspectives

115

V

Partie expérimentale

118

A.1.1 Mesures photophysiques stationnaires . . . 119

A.1.2 Mesures photophysiques résolues dans le temps . . . 121

A.2 Expériences in-vitro . . . 122

A.3 Autres équipements et techniques . . . 123

B Syntheses and protocols 126 B.1 Syntheses of ligands . . . 126

B.1.1 Synthesis of 1,4,5,8-tetraazaphenanthrene . . . 126

B.1.2 Synthesis of 1,4,5,8,9,12-hexazatriphenylene . . . 127

B.1.3 Synthesis of 2,2’-bipyrazine . . . 128

B.1.4 Synthesis of phen”-Boc . . . 129

B.2 Syntheses of ruthenium complexes . . . 131

B.2.1 Synthesis of the Wilkinson’s complex . . . 131

B.2.2 Synthesis of [Ru(TAP)3]2+ . . . 132

B.2.3 Syntheses of [Ru(L)2(L’)]2+complexes . . . 132

B.2.4 Synthesis of [Ru(TAP)(bpz)(HAT)]2+ _{. . . 132}

B.3 Photosyntheses of RuII _{adducts with biomolecules . . . 134}

B.3.1 Photosyntheses of [Ru(TAP)2(TAP-GMP)] and [Ru(TAP)(phen)(TAP-GMP)] ad-ducts . . . 134

B.4 Conjugation of biomolecules to RuII _{complexes . . . 134}

B.4.1 Syntheses of Ru-ODN conjugates . . . 134

B.4.2 Syntheses of Ru-TAT conjugates . . . 134

B.5 Cells cultures protocols . . . 135

B.5.1 Cells cultures . . . 135

B.5.2 Determination of cytotoxicity (MTT) . . . 136

B.5.3 Preparation for confocal microscopy experiments . . . 136

VI

Bibliographie

137

Abréviations et structures des principaux ligands cités

bpy

bpz

phen

TAP

pytz

phen’’-Boc

HAT

dppz

PHEHAT

ADN Acide Désoxyribonucléique

Ala ou A Alanine

Arg ou R Arginine

ARN Acide Ribonucléique

BET Back Electron Transfer - Transfert d’électron en retour Boc tert-Butoxycarbonyl

bpy 2,2’-bipyridine

bpz 2,2’-bipyrazine

C Cytosine

CEPT Concerted Electron-Proton Transfer - Transferts d’électron et de proton concertés CPP Cell Penetrating Peptide

DMF N,N-diméthylformamide

DMSO Diméthylsulfoxyde

dppz dipyrido[3,2-a ;2’,3’-c]phenazine

ECS Electrode au calomel saturé

ESI Electrospray ionization ET Transfert d’électron

G Guanine

GFP Green Fluorescent Protein Gln ou Q Glutamine

Glu ou E Acide Glutamique

Gly ou G Glycine

GMP Guanosine 5’-monophosphate

HAT 1,4,5,8,9,12-hexaazatriphénylène

HPLC High Performance Liquid Chromatography - Chromatographie liquide haute performance HPV Papillomavirus Humain

Lys ou K Lysine

MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionization

MC Metal Centred

MS Mass Spectrometry - Spectrométrie de masse ODN Oligodésoxyribonucléotide

PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis

PCET Proton-coupled Electron Transfer - Transfert d’électron couplé à un transfert de proton PET Photo-induced Electron Transfer - Transfert d’électron photoinduit

PHEHAT 1,10-phénanthrolino[5,6-b]1,4,5,8,9,12-hexaazatriphénylène

phen 1,10-phénanthroline

Pro ou P Proline

PT Transfert de proton

pytz 2-(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)pyridine

RMN Résonance magnétique nucléaire

TAP 1,4,5,8-tétraazaphénanthrène

TFA Acide Trifluoroacétique

Trp ou W Tryptophane

Tyr ou Y Tyrosine

UA Unité arbitraire

Liste des publications avec comité de lecture

Articles

A. Reschner, S. Bontems, S. Le Gac, J. Lambermont, L. Marcélis, E. Defrancq, P. Hubert, C. Moucheron, A. Kirsch-De Mesmaeker, M. Raes, J. Piette, P. Delvenne, « Ru-thenium oligonucleotides, targeting HPV16 E6 oncogene, inhibit the growth of cervical cancer cells under illumination by a mechanism involving p53 », Gene Ther. avr. 2013, 20, 435–443.

A. Reschner, Y. H. Shim, P. Dubois, P. Delvenne, B. Evrard, L. Marcélis, C. Moucheron, A. Kirsch-De Mesmaeker, E. Defrancq, M. Raes, J. Piette, L. Collard, G. Piel, « Evaluation of a New Biocompatible Poly(N-(Morpholino Ethyl Methacrylate)-Based Copolymer for the Delivery of Ruthenium Oligonucleotides, Targeting HPV16 E6 Oncogene », J. Biomed. Nanotechnol. 2013, 9, 1432– 1440.

A. Mattiuzzi, L. Marcélis, I. Jabin, C. Moucheron, A Kirsch-De Mesmaeker, « Synthe-sis and Electrochemical and Photophysical Properties of Calixarene-Based Ruthenium(II) Complexes as Potential Multivalent Photoreagents », Inorg. Chem. 2013, 52, 11228–11236.

L. Marcélis, C. Moucheron, A. Kirsch-De Mesmaeker, « Ru–TAP complexes and DNA : from photo-induced electron transfer to gene photo-silencing in living cells », Phil. Trans. R. Soc. A 2013,

371, DOI10.1098/rsta.2012.0131.

Revues

L. Marcélis, J. Ghesquière, K. Garnir, A. Kirsch-De Mesmaeker, C. Moucheron, « Photo-oxidizing RuII complexes and light : Targeting biomolecules via photoadditions », Coord. Chem. Rev. 2012,

256, 1569–1582.

J. Ghesquière, S. Le Gac, L. Marcélis, C. Moucheron, A. Kirsch-De Mesmaeker, « What Does the Future Hold for Photo-Oxidizing RuII Complexes with Polyazaaromatic Ligands in Medicinal Chemistry ? », Curr. Top. Med. Chem. 2012, 12, 185–196.

Chapitre de livre

L Marcélis, W. Vanderlinden, A. Kirsch-De Mesmaeker in Inorganic Chemical Biology :

Résumé

Les complexes polyazaaromatiques de ruthéniumII, et en particulier le [Ru(bpy)3]2+, ont fait l’objet de

nombreuses études fondamentales en photochimie et photophysique. Du fait de ses propriétés photophy-siques, et entre autres grâce à son temps de vie de luminescence relativement long, le [Ru(bpy)3]2+ est

devenu un composé modèle en photophysique. Dès les années 1970, et principalement grâce aux travaux de T.J. Meyer, la photophysique du [Ru(bpy)3]2+ a été étudiée en détail afin de permettre l’élaboration

d’un modèle photophysique qui peut être valablement étendu aux autres complexes polyazaaromatiques de RuII_{. La caractérisation du complexe [Ru(bpy)}

2(dppz)]2+et de ses interactions avec l’ADN a, elle, promu

l’étude des complexes de RuII _{en présence de biomolécules et a encouragé la recherche pour l’utilisation}

de complexes de ruthénium comme photosondes en biochimie.

Dans ce cadre, le laboratoire de Chimie Organique et Photochimie de l’ULB s’est attaché au développe-ment de complexes polyazaaromatiques de ruthéniumII_{se caractérisant par leur capacité à photoréagir avec}

certaines biomolécules. Ces complexes se caractérisent par l’utilisation de ligands fortementπ-déficients, comme le 1,2,4,5,8-tétraazaphénanthrène (TAP). Nettement plus photooxydant que les complexes ana-logues au [Ru(bpy)3]2+, ces complexes photooxydants sont capables, sous irradiation, de donner lieu à un

transfert d’électron depuis la base guanine de l’ADN vers le complexe excité. Les deux entités radicalaires ainsi formées peuvent ensuite réagir entre elles pour former un photoadduit au sein duquel un lien covalent lie irréversiblement un ligand TAP du complexe à la guanine.

Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse de doctorat s’inscrivent dans la poursuite de la recherche effectuée au sein du laboratoire autour de cette photoréaction. Deux axes majeurs ont été développés. Un premier axe de recherche a été dédié à l’étude fondamentale des propriétés photophysiques et photochimiques du photoadduit obtenu suite à la photoréaction du [Ru(TAP)3]2+avec une base guanine.

Cette étude photophysique fondamentale de l’adduit [Ru(TAP)2(TAP-GMP)] (présentée dans le deuxième

chapitre) vise à caractériser sa photophysique afin de comprendre comment, sous irradiation, des biadduits entre un complexe de ruthénium et deux guanines sont observés, alors que les premières études réalisées sur les photoadduits indiquent que ceux-ci ne sont pas luminescents. Le second axe de recherche consiste en la mise au point de systèmes élaborés à base des complexes de ruthénium visant à contrôler leur photoréactivité dans un milieu biologique. Pour ce faire, les complexes de ruthénium photoréactifs ont été ancrés sur des molécules biologiques. D’une part, les complexes ont été conjugués sur des OAS, oligonucléotides anti-sens, afin de conférer aux conjugués résultants la possibilité de cibler une partie précise de l’ADN ou d’ARN, et mener, in fine, au blocage de l’expression d’un gène particulier. Ces conjugués ont déjà été étudiés par le passé dans notre laboratoire. Les résultats présentés ici (chapitre 3) permettent à la fois de mieux comprendre la photochimie des Ru-OAS en présence de leur cible spécifique, ainsi que de démontrer in vivo la validité de la stratégie de gene silencing envisagée depuis quelques années. D’autre part, des complexes de ruthénium ont été conjugués à des peptides ou plateformes en vue de leur permettre de pénétrer à l’intérieur des cellules (chapitre 4). Les complexes ne pouvant normalement pas traverser les membranes cytoplasmiques, nous avons démontré que l’ancrage de ceux-ci au peptide transvecteur TAT permet de les vectoriser dans le cytoplasme. Cette incorporation se fait vraisemblablement par endocytose. Lors de ces études, l’importance de la localisation finale du complexe au sein de la cellule a été mise en évidence. Afin de conférer une sélectivité de vectorisation dans des cellules données (pénétration active et selon la présence de récepteurs spécifiques à la surface membranaire), les complexes ont été ancrés sur une plateforme RAFT(RGD)4. Dans ce cas, nous avons démontré qu’une internalisation spécifique dans

des cellules sur-exprimant l’intégrineα_vβ₃est possible pour les conjugués Ru-RAFT(RGD)4. Finalement,

En sus de ces deux axes de recherche principaux, le premier chapitre de résultats et discussions porte quant à lui sur l’étude fondamentale des complexes [Ru(TAP)3]2+ et [Ru(TAP)2(phen)]2+; plus

préci-sément, une étude complète du complexe [Ru(TAP)2(phen)]2+ dans l’acétonitrile et le butyronitrile en