Malo Thepault P2
Brice Tirel 18/11/2020 Biophysique – F.Noury
INTRODUCTION À L’IMAGERIE (IRM) ET LA SPECTROSCOPIE (SRM) PAR
RESONNANCE MAGNETIQUE (PART 2)
Suite du cours précédent :
Sur le graphique on peut voir les différences de temps de corrélation suivant le milieu traversé.
T1 : Pour que l’échange d’énergie se fasse rapidement, il faut que la fréquence du milieu soit proche de celle de Larmor.
- Liquide : fréquence de Larmor (+ faible) assez éloignée de celle du liquide car il y a beaucoup de mouvement.
-
- Milieu riche en macromolécules (mou) la fréquence du milieu est proche de celle de Larmor donc les échanges d’énergies se font rapidement donc le temps est réduit. T1 est très court.
- Milieu solide la fréquence du milieu est très lente donc éloigné de la fréquence de Larmor donc T1 est élevé
Quand je suis dans un liquide ou un solide l’échange d’énergie va se faire plus rapidement alors que si je suis dans un tissu « mou », ex : tissu graisseux, l’échange d’énergie se fait beaucoup plus lentement.
Concernant T2 plus la mobilité est importante plus le T2 sera long plus il y aura déphasage.
- Milieu liquide : très mobile - Milieu solide : dure
3. IRM : variation des valeurs de T1 et T2
- IRM : Exemple de pondération T2
Dans un tube avec des glaçons et de l’eau liquide (l’eau des glaçons étant la même que l’eau liquide) que l’on passe à l’IRM grâce à la différence de T2 entre l’état liquide et solide on obtient une image.
Les mouvements de l’eau liquide font comme écran et du coup on a un T2 très long parce que la perte de cohérence des moments magnétiques met beaucoup de temps. Donc si le T2 est très long on va avoir du signal pendant longtemps. Alors de dans un milieu solide on perd le T2 très vite, on a donc un T2 très court , une relaxation très rapide et donc on à un signal très faible.
2 – C : Bilan du principe de la RMN
IRM est un champ constant, on n’éteint jamais le champ magnétique de l’IRM
Le champ magnétique de l’appareil appelé champ statique c’est le champ B0 de l’ordre de 100 000 fois le champ magnétique terrestre. (Très intense)
Que faut-il pour obtenir une image ou un spectre par RMN ?
- Un aimant avec un fort champ magnétique pour créer l’aimantation de l’échantillon (polarisation) - Une bobine RF pour émettre et réceptionner les ondes RF (phénomène d’excitation puis phéno-
mène de relaxation au niveau des protons)
- L’utilisation de la transformée de Fourier pour transformer ce signal en image ou spectre (pour décoder le signal)
Principe de la transformée de Fourier :
Le signal d’IRM est enregistré pendant le retour à l’équilibre du système.
Le signal d’IRM est enregistré par la bobine RF (en mode réception).
In vivo, ce signal contient des fréquences de toutes les molécules d’eau de l’échantillon du patient.
Le signal de RMN (FID) est décodé par transformation de Fourier.
En IRM ce signal contient plusieurs informations codées en fréquence : - localisation spatiale (coupes virtuelles)
- résolution de l’image - contraste de l’image
2 – D : Reconstruction du signal par transformation de Fourier
Théorème de Fourier :
« Toute onde, quel que soit sa forme, peut s’exprimer mathématiquement de façon unique comme la somme de plusieurs ondes sinusoïdales de longueur d’onde et de fréquence donnée. »
Ici, on a un signal qui est la somme de 3 ondes. On extrait le contenu fréquentiel en signal grâce à la transformée de Fourier.
- La transformation de Fourier permet d’analyser et d’extraire le contenu fréquentiel d’un signal ; trans- formation du signal du domaine temporel en domaine fréquentiel.
(Comme l’oreille absolue qui n’entend pas un mélange de plein de notes mais définit les différentes notes)
- Le signal de RMN (FID) est décodé par transformation de Fourier
-Les différentes fréquences qui composent le signal sont extraites par comparaison avec des fonctions- tests oscillantes. Pour chaque fréquence, la fonction-test et le signal sont multipliés et sommés en temps.
TF pour Transformation de Fourier sur le signal en fonction du temps.
Le résultat est l’amplitude pour chaque fréquence contenue dans le signal : c’est un spectre.
Si la fréquence testée n’est pas contenue dans le signal on trouve 0.
On teste donc toutes les fréquences et on va pouvoir savoir quelles fréquences sont contenues.
On ne fait pas de calculs avec cette formule (pas à connaître par coeur mais comprendre le principe) Comment on applique la théorie de la RMN pour faire des études in vivo ?
À l’origine cette technique a été développée pour de la chimie pour pouvoir faire des études in vivo: voir comment on peut tester l’efficacité d’un nouveau médicament sur un modèle animal ou chez un patient.
Important pour le pharmacien pour tester l’efficacité de nouvelles molécules.
L’IRM et SRM sont adaptées aux études biomédicales in vivo :
● Techniques non invasives et atraumatiques (ne fait pas mal et n’utilise pas de rayonnement ionisant contrairement à la radiographie classique)
● Exploitation des propriétés magnétiques naturelles des noyaux : permet l’étude in vivo (chez un animal, chez un patient)
● Aucun rayonnement ionisant (X ou gamma, gros intérêt), pas de marqueur exogène radioactif
● Technique 2D, 3D, permettant une très haute résolution spatiale (IRM)
● Très bon contraste naturel sans utiliser d’agent de contraste (on a juste à changer les paramètres d’acquisition)
● Possibilité d’utiliser des agents de contraste (chélates de gadolinium), parfois c’est obligatoire
● Etudes anatomiques (IRM), fonctionnelles (IRM) et biochimiques (SRM)
Attention : médecine nucléaire (petscan) et RMN sont deux choses différentes.
SRM : modification localisée du métabolisme et de la composition biochimique
IRM : modification de la physiologie et de l’anatomie Les deux informations sont complémentaires et sont appliqués dans beaucoup de domaines biomédicaux.
Domaine à l’interface de la biologie, la pharmacologie, la chimie, la physique, l’informatique.. nécessaire pour pouvoir extraire l’information.
Mais cette technique présente quelques défauts :
● Technique très très peu sensible (ex : population de 1 millions protons → que quelques protons qui vont permettre d’avoir du signal donc très peu de signal mais on a des moyens pour com- penser ça)
● Faible disponibilité & coût important (en routine clinique, ces appareils sont chers donc le temps d’attente est long)
● Incompatibilité avec le champ magnétique intense (implants, pace maker, broche→ pas d’IRM car il peut se déplacer/dérégler à cause du champ magnétique)
Partie 2 : Spectroscopie par Résonance Magnétique (SRM)
Objectifs :
- Comprendre la formation d’un spectre RMN - Comprendre la notion de déplacement chimique
- Comprendre les spécificités de la SRM (Spectroscopie par Résonance Magnétique) in vivo - Connaître plusieurs noyaux d’intérêt en SRM in vivo
- Comprendre pq la quantification absolue n’est pas possible en SRM in vivo
I) In vivo: introduction
En routine clinique, 99,99% des examens sont faits par le signal des protons de l’eau. Mais en recherche, on peut utiliser d’autres noyaux, il n’y a pas que les protons de l’eau qui permettent de donner du signal.
SRM = spectroscopie par résonance magnétique
Même principe que l’IRM, même matériel, mais à partir du signal on reconstruit un spectre (amplitude en fonction d’une fréquence) et non une image. On a accès aux informations biochimiques d’un tissu ou d’un organe. On fait comme si c’était une biopsie virtuelle, on a une image anatomique et on définit un petit volume d’intérêt: le voxel (= volume élémentaire, pixel en 3D) et on enregistre le signal qui vient uniquement de ce petit voxel.
Chez l’homme, les dimensions du voxel sont: 2cm x 2cm x 2cm. Plus petit pour modèle animal.
On obtient un spectre (cerveau du patient). Chaque pic correspond à une molécule.
On a une analyse biochimique de ce qu’il y a dans le cube: c’est comme une biopsie mais sans prélever un morceau du cerveau (biopsie virtuelle).
La couverture spatiale est médiocre (comparé à l’IRM) et limitée au voxel d’acquisition (si on veut scan- ner tout l’organe, nous sommes obligés de répéter les acquisitions).
Par exemple, lors d’une biopsie de foie: si on prélève à côté de la tumeur, elle sera bonne, et l’échantillon sera parfaitement normal (manque de bol on a prélevé à côté de la tumeur). En effet, on ne peut pas prélever partout, sur tout le foie, sinon c’est invasif. Mais si on prélève à côté, cela perd de son intérêt.
Ici, on peut faire des spectres à l’intérieur du cerveau où on veut pour avoir une analyse biochimique:
voir comment certaines molécules sont des marqueurs biologiques d’une pathologie.
La limite de détection des métabolites est de quelques milli molaires (mM) en dessous de cette molé- cules on détecte très difficilement les molécules endogènes. (certains biomarqueurs ne peuvent pas être analysés car leur concentration endogène est trop faible)
Aujourd’hui il y a environ une trentaine de métabolites cérébraux potentiellement détectable in vivo par SRM.
En RMN l’axe des abscisses toujours gradué à l’inverse.
A partir d’un échantillon, réception d’un signal contenant plusieurs fré- quences → chaque raie = une fréquence de résonance différente. Le noyau d’intérêt n’a pas la même fréquence de résonance selon la molé- cule étudiée et le milieu environnant (champs locaux), cela va entraîner la dispersion fréquentielle de la résonance, c’est à dire que tout le monde n’est pas à la fréquence de Larmor.
Le résultat est représenté sous forme d’un spectre et l’origine du spectre:
le déplacement chimique (et le couplage scalaire).
A) Informations générales sur le spectre
On a une amplitude (ordonnée) en fonction de la fréquence (abscisse).
La fréquence va être représentative de différentes choses selon la technique d’acquisition du spectre. On aura à chaque fois un déplacement chimique.
A partir d’un échantillon, on a réception d’un signal contenant plusieurs fréquences (une raie correspond à une fréquence de résonance). En théorie, si on a fait le spectre avec du proton (= noyau d’H): tous les protons résonnent à la fréquence de Larmor. Donc, on devrait avoir un seul pic.
Pourquoi tous les noyaux H+ ne résonnent-ils pas tous exactement à la fréquence, c-à-d à la fréquence de Larmor V0?
Fréquence de Larmor : (à comprendre et à connaître)
Car l’environnement électronique de l’atome va modifier le champ magnétique local vu par chaque noyau hydrogène de chaque groupement chimique
et par conséquent, en modifier la fréquence de résonance correspondante :
Fréquence effective :
Constante d’écran est liée au nuage électro- nique qui « masque » en partie le champ Bo de l’appareil au noyau atomique
gamma = rapport gyromagnétique
Exemple : pour l’éthanol : CH3-CH2-OH
● le nuage électronique est différent pour les groupements CH3 et CH2, donc :
Le nuage électronique est différent pour les deux groupements chimiques. Donc la constante d’écran n’est pas la même, donc le champ effectif n’est pas le même, donc la fréquence de résonance n’est pas la même. On a donc une fréquence de résonance qui correspond au proton du premier plan chimique et une autre qui correspond au second plan chimique.
(→ 2 raies différentes).
B) Notion de déplacement chimique
Le déplacement chimique (noté delta) c’est le décalage en fréquence pour le noyau d’intérêt en fonction du groupement chimique. Ce déplacement chimique s’exprime par rapport à une fréquence de référence Vref et une fréquence de travail (= fréquence de Larmor) :
On multiplie par 1 million (10 puissance 6) donc c’est en ppm (partie par million).
Ce n’est pas la fréquence du groupement CH3, c’est le décalage en fréquence du groupement CH3 par rap- port à une référence.
Bien de connaître la formule L'intérêt d’utiliser le déplacement chimique en ppm:
Si deux personnes travaillent avec des machines à différentes fréquences, on ne peut pas superposer les spectres obtenus car la fréquence dépend du champ de l’appareil. Donc si on travaille avec le déplace- ment chimique (en ppm) qui est indépendant du champ magnétique. On peut superposer des spectres obtenues à des champs magnétiques différents.
Donc lors d’analyse spectrale, en fonction des fréquences de résonances, on arrive à retrouver quelle est la molécule. Pour cela, on a des tables de correspondance.
Le résultat est représenté sous forme d’un spectre.
L’environnement électronique de l’atome (cad les groupements chimiques ou molécule autour) va mo- difier le champ magnétique local vu par les noyaux de chaque groupement chimique et par conséquent en modifier la fréquence de résonance correspondante (déplacement chimique).
La SRM utilise le déplacement chimique entre les différents groupements chimiques (ou molécules) dans lesquels se trouve le noyau d’intérêt : 1H ou autre noyau (13C, 19F…)
La fréquence est changée par le champ magnétique ou le rapport gyromagnétique.
Pour un noyau donné, le rapport gyromagnétique ne change pas donc c’est le champ qui est en cause (pas le même environnement électronique).
On travaille généralement au protons, mais on peut travailler également avec d’autres noyaux.
Les déplacements chimiques sont très faibles (qques Hz) par rapport à la fréquence de travail (10^2 MHz) et sont exprimés en ppm = partie par million (et non en
fréquences !!!) pour que les valeurs soient indépendantes du champ statique B0 :
● 200 MHz (4,7 T) : 1 ppm <-> 200MHz
● 400 MHz (9,4 T) : 1 ppm <-> 400 MHz
● NAA pic : 2 ppm
● Choline pic : 3 ppm
La référence souvent choisie est le tétraméthylsilane (TMS) = Si(CH3)4 à 0 ppm (très loin des déplace- ments chimiques que l’on veut étudier).
Ici, on s’affranchit de la variation à cause du champ magnétique.
La surface sous une raie de résonance est proportionnelle à la quantité de noyaux, donc à la concentration relative de la molé- cule correspondante (SRM in vivo, SRM clinique) ou à la proportion du groupement chimique correspondant (RMN in vitro, chimie).
Il faut réussir à retrouver une information quantitative, ou semi quantitative: on intègre la surface sous la raie qui est proportionnelle à la quantité de noyau et donc on peut la rap- procher de la concentration de la molécule.
Si bcp de NAA : amplitude +++
Les déplacements chimiques sont exprimés en ppm (partie par million) et non en fré- quences: l’échelle est indépendante du champ statique.
à 7 T: 1 ppm = 300 Hz à 9.4 T: 1 ppm = 400 Hz
Dans un tube (in vitro): accès à une concentration absolue en ajoutant un produit de référence (concentration très précise, pour recalculer la surface sous la raie) dans l’échantillon en concentration connue (calcul de concentration absolue → quantification absolue).
Mais in vivo :Accès à une concentration relative puisqu’il n’est pas possible d’utiliser de produit de référence, car ce sont généralement des produits toxiques (il faut que la raie de résonance du produit soit très loin du detectable in vivo = toxique).
Mais aussi d’autres problèmes : comment il est métabolisé ? avec quelle cinétique ? → on a aucune référence interne. Donc in vivo (dans un patient) et in vitro, on n’est pas à la même échelle. On ne peut pas mettre de concentration interne ⇒ juste concentration relative (limite).
On peut utiliser un métabolite dont la concentration est supposée stable comme référence interne, on utilise aussi la concentration en eau (55.5 mol/kg) supposée constante dans les tissus comme référence interne.
La SRM in vivo permet l’identification des différentes molécules contenues dans un tissu biologique, ainsi que leur concentration relative : information à la fois quantitative et qualitative puisque l’on détecte les molécules.
La SRM in vivo permet :
- de comparer les métabolites contenus dans une zone lésée par rapport à une zone saine —>
recherche de biomarqueurs
- D’évaluer les différences en concentrations des métabolites d’une même zone pathologique (bio- marqueurs)
- De suivre la quantité des métabolites d’intérêt contenus dans une zone lésée pendant l’évolution de la pathologie —> efficacité d’un traitement
Pour certaines pathologies, les anomalies détectées en SRM (biochimie) sont plus précoces que les mo- difications visibles en IRM (anatomie) = modifications biologiques avant l'apparition des signes anato- miques.
Par exemple : on prend un cerveau avec une zone qui nous intéresse. On compare les concentrations des molécules dans les deux parties du cerveau : zone pathologique et zone non pathologique. Si on a une molécule dont la concentration varie au cours du temps on peut dire que c'est un marqueur de la pathologie.
IRM ET SRM SONT COMPLÉMENTAIRES DANS L’ÉTUDE ET LE DIAGNOSTIC DE NOMBREUSES PATHOLOGIES.
SRM est peu utilisée en routine clinique. SRM in vivo demande beaucoup plus de temps et on obtient des raies larges. Par contre est utilisée en pré-clinique.
II) Acquisition localisée d’un spectre
On fait une acquisition localisée du spectre c’est à dire qu’on prend un petit volume qu’on va récupérer entièrement.
In vivo : un patient à une tumeur, et on cherche à avoir le spectre de toute la tumeur, donc on localise uniquement au-niveau de la tumeur sans exciter les autres protons.
On ne veut pas mélanger le signal de la tête avec celui des pieds!! Cela se fait par des gradients de champ électromagnétique. Les chimistes eux n’en n’ont pas besoin d’où une différence concernant les appareils entre chimistes et physiciens.
Chez une souris, on prend plutôt de petits voxels car sinon on englobe une trop grosse partie de la souris : 3mm de côté, et encore c’est trop grand (prend la moitié du cerveau de la souris).
Acquisition en routine clinique (chez le patient): Voxel = 2 cm x2cmx2xm : Limite de sensibilité en SRM in vitro: quelques milli molaires, en dessous on pourra rien détecté.
Acquisition en études préclinique (souris/rat): voxel = 3mmx3xmmx3mm
Mais pourquoi on ne prend pas un voxel plus petit (0,5 mm de côté)? Problème: on dépasse la limite de sensibilité.
La limite est autour de 1 ou 2mm de côté. En des- sous, on n’aura pas assez de signal. Cependant, on arrive, malgré ces dimensions à faire des choses sympas.
→ L'échelle n’est pas la même selon si animal (très compliqué, mais c’est ce qui se fait en recherche) ou humain.
Plus volume d’acquisition est petit moins j’ai de noyaux d’hydrogène donc moins j’ai de signal.
La limite de sensibilité est toujours de l’ordre du millimolaire, en dessous on ne pourra rien détecter.
On compense en augmentant le champ magné- tique.
Spectre obtenue : signaux des noyaux des molé- cules chimiques présente dans le voxel
→ Le spectre obtenu est différent en fonction du noyau d'intérêt
On étudie les molécules qui sont dans le volume.
En fonction du noyau, on obtient un spectre. Si on utilise le phosphore 31, on aura un spectre diffé-
rent de celui du proton. Le Phosphore 31 est un noyau intéressant in vivo (détaillé dans la suite du cours).
On est obligé de localiser spatialement le signal.
A) SRM in vivo en 1H
1) suppression/saturation du signal de l’eau Il est nécessaire de réduire le signal de l’eau qui gêne la détec- tion des protons des autres molécules moins concentrées. On ne veut pas le pic de l’eau, on veut voir les autres molécules (avec une fréquence de résonance différente de celle de l’eau). On ne les voit pas car leur concentration est très faible par rapport à la concentration de l’eau.
Pour pouvoir les identifier, on tape sur le signal de l’eau pour le supprimer, puis on arrive à détecter les autres produits con- tenus dans le patient. Ici, on est sur une étape intermédiaire, il faudra encore “taper”. Attention, sur le schéma, les échelles ont changées.
En chimie, on peut ou pas supprimer le signal de l’eau selon ce qu’on fait. Souvent, on utilise des solvants ne contenant pas de protons et du coup on a pas besoin de le supprimer. In vivo, on a pas le choix: on doit supprimer ce signal.
On sature le signal des protons qui sont sur les molécules d’eau car ce n’est pas celui là qui nous intéresse. On “tape”’(on envoie des impulsions radiofréquences spécifiques sur cette fré-
quence) sur le signal de l’eau, une fois que son amplitude sera arrivée à l’amplitude de l’autre on pourra faire son acquisition.
Ex :
2) Détection des fréquences de résonances du noyaux d'intérêt pour une mo- lécule donnée
On met une molécule dans le tube en plus du solvant (ex: eau) → molécules en solution.
Une bobine radiofréquence excite la molécule. Chaque proton n’est pas au même endroit dans la molé- cule, donc il ne subira pas les mêmes champ locaux, ce qui fait que chaque proton donne une raie décalée (= déplacement chimique).
On peut ainsi détecter cela : ici pic de l’eau (le solvant). Dans un tube, c’est facile. On peut détecter pleins de choses sur un spectre: comment on identifie les groupements chimique, on peut cibler une interaction ligand protéine, on peut faire de la mesure de pH, on peut aller cibler des couplages … (vu avec les chimistes). In vivo, on ne pourra pas voir tout ca, car nous sommes pas assez sensible (on pourra juste détecter une molécule).
3) Échelle de temps des observable en RMM
Dans un tube, c’est facile. On peut détecter pleins de choses sur un spectre : comment on identifie les groupements chimique, on peut cibler une interaction ligand protéine, on peut faire de la mesure de pH, on peut aller cibler des couplages … (vu avec les chimistes).
In vivo, on ne pourra pas voir tout ca, car nous sommes pas assez sensible (on pourra juste détecter une molécule). Il faut savoir que l’on peut détecter les mouvements de vibrations des molécules (avec les chimistes).
4) Détection des fréquences de résonances du noyau d'intérêt pour diffé- rentes molécules
Chaque métabolite contient plusieurs protons qui ont une fréquence de résonance différente. Le problème est que toutes les molécules sont mélangées. On se retrouve avec un spectre avec toutes les raies superposées. C’est le bordel, mais il faut réussir à retrouver.
Prenons l’exemple de notre molécule de NAA : on cherche à détecter celle qui résonne le plus fort. On ne peut pas identifier tous les métabolites du cerveau car certains pics sont cachés (dessous les autres pics).
C’est pour ca que l’on ne peut pas voir tous les métabolites du cerveau. Ce n’est pas pareil que les chi- mistes qui peuvent voir certains mouvements moléculaires: nous ne sommes pas à la même échelle que les chimistes.
