La spectrophotométrie uv visible
(spectroscopie d’absorption moleculaire)
lorsqu’un faisceau lumineux monochromatique (une longueur d’onde fixe) de longueur l et intensité I0 traverse une solution (exp bleu de méthylène + eau) les molécules dissoutes vont absorber une quantité de la lumière incidente
L’intensité de la lumière transmise I sera inferieur à celle de la lumière incidente I0
Définition
• La spectrophotométrie est une méthode
analytique quantitative qui consiste à mesurer l'absorbance ou la densité optique d'une
substance chimique donnée en solution,
• Plus cette substance est concentrée plus elle absorbe la lumière (relation entre la
concentration et l’absorbance).
• C’est la loi de Beer Lambert Al = el. L .C .donc on peut déterminer la concentration a partir de
l’absorbance.
• La spectrophotométrie UV visble utilise des longeures d’onde incluse dans le domaine UV et le domaine du visible.
• Les mesures sont réalisées dans:
l’UV(160nm<l<400nm)
le visible(400<l<800nm)
Les radiations détectées par l’œil humain sont appelées lumière visible
Spectre d’absorption d’une substance en solution
Obtenue en mesurant l’absorbance (DO) d’une solution de concentration fixe d’une substance X, en modifiant la longueur d’onde dans l’intervalle de L’UV-visible, on trace ensuite la courbe de
l’bsorbance (DO) en fonction de la longueur d’onde.
La valeur maximale d’absorbance corresponds a une longueur d’onde appelée l max.
Cette valeur est caractéristique de la substance X
200 280 400 600 800
Spectre d’absorption d’un substance x en solution
Absorbance
l max
La valeur maximale d’absorbance corresponds a une longueur d’onde appelée l max.
Cette valeur est caractéristique de la substance X
Longueur d’onde l(nm)
Spectre d’absorption du KMnO4 dan l’UV-visible
Loi de Beer Lambert
lorsqu’un faisceau lumineux monochromatique (une longueur
d’onde fixe) de longueur l et intensité I0 traverse une solution (exp bleu de méthylène + eau) les molécules dissoutes vont absorber
une quantité de la lumière incidente
L’intensité de la lumière transmise I sera inferieur à celle de la lumière incidente I0
Détecteur Enregistreur (Afficheur)
I
Cuve (solution a
analyser) L= 1cm
I0
Lumière
incidente Lumière transmise Source
lumineuse
(lampe) monochromateur
Si :I0= I, milieu transparent
Si :I0> I, milieu partiellement absorbant Si :I= 0, milieu opaque (absorption totale)
La transmittance (T) de la solution est le
pourcentage de lumière transmise T%=I/I0.100
• Selon la loi de Beer Lambert, L’absorbance (A) de la solution ou densité optique (DO)
représente la valeur du logarithme décimale de l’inverse de T: Al =log(1/T) =log(I0/I) = el. L .C
• Al = el. L .C
• Al= l’absorbance a une longueur l
• el= coefficient d’absorption molaire (M-1cm-1) de la substance a la longueur d’onde l définie
• L= trajet optique (cm)
• C= concentration de la solution (M)
• NB: l’absorbance n’a pas d’unité
Relation absorbance concentration
• Loi de Beer-Lambert
• Al = el. L .C = l’absorbance est en fonction de la concentration (droite linéaire)
[C]
Al
Remarque
Une substance peut avoir plusieurs pics d’absorption maximales et peut donc avoir plusieurs valeurs
e
adifférentes longueurs d’onde
Condition de validité de la loi de Beer Lambert
• Cette loi n’est pas valable que si les conditions suivantes sont remplies :
1.le monochromatisme (une seule longueur d’onde lmax )
2.Les faibles concentrations (diluées)
3.Température stable(e dépends de la Température)
4.pH stable
5.Clarté du milieu
6.Pas de réflexion ou de fluorescence.
Le spectrophotomètre
• Un spectrophotomètre UV-visible est un
appareil qui permet de mesurer l'absorbance d'une solution homogène à une longueur
d'onde donnée ou sur une région spectrale donnée.
• Le spectrophotomètre comprend :
Composants de base d’un
spectrophotometre
Une source lumineuse
ce sont des lampes utilisant un filament tungstène, elle
fournissent des radiations
lumineuses dans le domaine du visible.
Lampes à hydrogène ou deutérium , elle fournissent des radiations
lumineuses dans le domaine du UV Décharge dans les gaz
rares Solide chauffé
Le monochromateur
Il permet de sélectionner la longueur d'onde de la lumière qui traversera la solution à doser.
La cuve
• une cuve transparente dans laquelle on place la solution à étudier. Suivant la qualité et la quantité d'échantillon, il existe différentes cuves,
généralement en plastique ou en verre (spectre visible) ou en quartz (UV).
La cellule photoélectrique
• une cellule photoélectrique, permet la
transformation de l’énergie lumineuse en énergie électrique, le courant produit est très faible et sera amplifié ultérieurement
• L’amplificateur
• un système électronique amplifie le courant fourni par la cellule photoélectrique.
L’enregistreur
• Permet de mesurer le courant fourni par
l’amplificateur , il est généralement relié a un
microordinateur qui permet d’afficher les résultats en pic (balayage de spectre) ou des valeurs fixes des absorbances.
Principes des dosages
dosage directe dosage indirecte
Utilisation d’un réactif coloré
Utilisation d’une gamme
d’étalonnage
Méthode de dosage directe
• Si la substance a doser possède un pic d’absorption caractéristique, on mesure
l’absorbance à lmax et on calcule directement la concentration par la loi de Beer Lambert(e doit être connue) ou bien on Etablis une gamme d’etalonnage
• Exp: dosage des protéine a une longueur de 280nm
Méthode de dosage indirecte
• Cette méthode est utilisée dans le cas ou la substance à doser ne possède pas un pic
d’absorbance caractéristique (lmax):
– Utilisation d’un réactif coloré
Exemple d’utilisation d’un réactif coloré
• L’utilisation d’un colorant chimique qui en réagissant avec la substance a doser développe une coloration
• Exp. L’urée sanguin ne possède pas un pic
caractéristique, elle forme un produit coloré avec le réactif diacétyl monoamine qui absorbe a 440nm.
L’urée+ diacétyl monoamine produit coloré absorbe a 440nm
Etablissement d’une gamme d’etalonnage
C1 C2 C3 C4 C5 C6
Absorbance
Concentrations connues
C1 C2 C3 C4 C5 C6
Solution a doser (concentration inconnue) Ci
Voir l’absorbance de cette solution. Exp. A=0.324
0.324
Ci
NB: Le blanc ou témoin
• La lecture au niveau du spectrophotomètre
est effectué contre une solution qu’on appelle blanc,(sur la quelle on règle le zéro) qui
contient tout les constituants du milieu sauf la substance a doser(échantillon),
• l’absorbance enregistrée sera donc celle de la substance a doser uniquement.
Applications
Permet de déterminer la concentration d’une substance en solution dans un milieu simple ou complexe.
Suivie de la cinétique d’une réaction chimique
Dosage des protéines exp hémoglobine dans le sang à 540nm.
Suivie en continue de l’élution des protéine au cours d’une chromatographie
Vérifier la pureté d’une molécule en solution
Identifier une molécule en solution
Remarque: l’opacimètrie est une méthode qui utilise le spectrophotomètre a 625 nm pour quantifier le
nombre de particules dans une suspension (exp:
suspension bactérienne ou de globules rouges ).
II) photomètrie d’émission atomique a) Photomètrie de flamme
• utilisée depuis longtemps pour l'analyse des éléments alcalins et alcalino-terreux.
Principe
• Lorsqu’une solution saline est chauffée dans
une flamme à un débit constant, l’eau s’évapore et les sels minéraux restent à l’état d’atomes.
• Les atomes sont alors portés a une haute température et captent donc une partie de l’énergie apporté par la flamme
• Ce ci les fait passer à un état éxcité
• Un atome excité revient obligatoirement à son état basale en libèrant de l’énergie sous forme d’une émission de lumière
• Chaque ion ou atome est caractérisé par une longueur d’onde spécifique . Exp:
Na : jaune
Li : violet
• L’intensité de la lumière est proportionnelle a la concentration de l’ion à doser.
• A chaque élément à analyser correspond un filtre qui sélectionnera la bande de
longueurs d'onde utile
• Il suffit alors d'établir une courbe
d'étalonnage : I=f(c). Pour déterminer la concentration d’une solution inconnue.
• Pour le dosage simultané de plusieurs
élément on doit disposé de plusieurs filtres et plusieurs détecteurs en même temps.
Photomètre de flamme (instrumentation)
• Un photomètre de flamme est composé :
• un nébuliseur qui permet de créer un « brouillard » avec la solution à analyser
• un brûleur : les gaz employés peuvent être de
l’acétylène, du butane ou du propane en fonction de la température de la flamme souhaitée
• un filtre ou monochromateur
• un détecteur : cellule photoélectrique.
Température de la flamme :
• elle dépend du melange combustible/comburant 0°C 273,15 Kelvin
Photometre de flamme
Sensibilité d’un photometre de
flamme
Préparation des échantillons
• Les échantillons doivent être sous forme d’une solution aqueuse sans débris ou particules
solides
• L’eau distillé qui est le solvant de notre
échantillon doit être d’une très bonne qualité afin d’avoir des résultats précis
• Les espèces chimiques qui peuvent causer des interférences doivent être éliminées ou bien présentes dans l’étalon et l’échantillon a une même concentration
– Exp : élimination des ions calcium par précipitation a l’acide oxalique
• Les sels peuvent être extraits des échantillons solides par de l’eau distillée ou par des réactifs
appropriés exp: CaSO4 saturé pour l’extraction du sodium du sol
• L’usage d’un broyeur ou d’un agitateur donne de meilleurs résultats
• Si l’échantillon est de nature organique, la matière organique doit etre éliminée par incinération (four a moufle).
• Les oxydes restants sous forme de cendre sont solubilisée ensuite par des acides forts
Applications
• Dosages d'elements alcalins ou alcalino-terreux Na, K, Ca, Li, Fe, Ba ...(qui sont en fait sous forme
ionisee Na+, K+, Ca2+, Li2+ , Fr2+ avec Ba2+...
dans la plupart des echantillons :
• • liquides biologiques comme le plasma sanguin ;
• • produits pharmaceutiques ;
• • produits alimentaires, boissons ;
• • rejets industriels, eaux usees ;
• • produits mineraux utilises en metallurgie.
II) Photomètrie d’émission atomique b) Spectrométrie par torche à plasma
Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy (ICP- AES)
• Fonctionne sur le même principe de la photométrie de flamme sauf qu’elle utilise une torche a plasma (6000- 10000 k) pour l’atomisation et l’excitation des atomes de l’échantillon.
• La méthode de ICP-AES permet la détection et le dosage de presque tout les éléments chimique (sauf les gaz et certains atomes non métalliques C, N, F, O, H)
Torche a plasma ICP
Spectrometre ICP AES
III) Spectrophotométrie d'absorption atomique
• C’est une méthode d’analyse quantitative qui permet la détermination de la concentration d’une soixantaine d’éléments en solution (Ca, Fe, Mg, Li, Cu, Zn, Na, Pb, Hg, Cd, Sn, Bi, As, Cs, Ge, P, K, Rb, Se, Te, Th…….)
• Sensible et permet la détection de traces (ppm)
• Basée sur le fait qu’un un élément a l’état d’atome est capable d’absorber la radiation (lambda défini) que lui même est capable d’emmètre.
Principe
• La solution a analyser est vaporise a un débit constant dans une flamme et les éléments se trouvent donc a l’état
d’atomes
• la température de la flamme(2000 – 3000°C) est plus faible que celle de l’émission atomique pour éviter l’excitation des atomes
• Une source lumineuse fournis une radiation lumineuse (spécifique pour l’élément à analyser) qui traverse le nuage d’atomes.
• L’atome absorbe alors une quantité de lumière incidente
• La quantité absorbée est proportionnelle au nombre d’atomes présent (concentration de l’élément)
• La concentration et determinee a l’aide d’une courbe d’etalonage prealablement etablie
• nb: la loi de Beer Lambert peu etre appliquee
principe du spectrophotomètre d'absorption atomique
sources de lumière
a) lampe à cathode creuse
constituée :
• D’une cathode : cylindre creusé à l’une de ses
extrémités et fait du métal dont on veut produire le spectre d’émission .
• d’une anode ;
• d’une enceinte scellée en verre avec une fenêtre la plus transparente possible aux longueurs
d’onde considérées (quartz, verre borosilicate) ; cette enceinte est remplie d’argon (Ar) ou de néon (Ne)
Principe d’une la lampe a cathode creuse
• Lorsqu’une tension électrique est appliquée entre l’anode et la cathode (300 à 400 V), quelques atomes du gaz
neutre de remplissage sont ionisés et accélérés vers la cathode.
• Ils arrachent ainsi des atomes métalliques de cette dernière
• Les chocs avec les ions Ar+ ou Ne+ vont ensuite porter les atomes métalliques à un état excité
• (phase d’excitation) dont le retour à l’état fondamental est accompagné de l’émission d’une
• lumière caractéristique (phase d’émission)
sources de lumière
• b) Lampe à décharge EDL (electrodeless discharge lamps).
• La lampe est constituée d’une ampoule scellée en quartz dans laquelle se trouve une petite quantité d’élément sous forme de métal ou de sel.
• Cette ampoule est placée à l’intérieur d’une bobine radiofréquence.
• Lorsqu’on applique un courant à la bobine, un champ radiofréquence est créé.
• Celui-ci vaporise les atomes à l’intérieur de l’ampoule et les porte à un état excité.
• L’émission des raies caractéristiques accompagne le retour à l’état fondamental.
• Remarque
• Un four graphite peut remplacer le bruleur pour l’atomisation
Applications de la photométrie d’absorption/émission atomique
• Dosages des sels st des métaux dans les liquides biologiques (sang, plasma, urine, homogénat de tissus…..)
• Qualité de l’eau; analyse du contenu en sels est métaux
• Toxicologie dosage des métaux lourd dans les aliment, l’eau et même dans les tissus
• Archéologie; le dosage du Ca, Sr, Zn dans les os
• Géologie l’analyse des éléments pour identification des pierres
