I. Le contrôle épigénétique de la transcription

I. Le contrôle épigénétique

de la transcription

I.1. Généralités

I.1.1. La chromatine

Dans le noyau d’une cellule eucaryote, l’ADN n’est jamais nu mais toujours associé à des protéines, l’ensemble constituant ce qu’on appelle la chromatine. L’unité de base de la chromatine est le nucléosome (Figure 1). Il est composé d’une séquence d’ADN d’environ 150pb entourant un octamère de petites protéines basiques, le tout organisé en une structure en collier de perles. Les composants protéiques du nucléosome sont appelés histones. La double hélice d’ADN s’enroule 1,6 fois autour de cet octamère protéique composé de 2 copies de chacune des histones H2A, H2B, H3 et H4 [1]. Un empaquetage de l’ADN de 6 fois est ainsi obtenu. C’est avec le concours, entre autres, d’une autre protéine histone, l’histone H1, que des états chromatiniens encore plus condensés peuvent se former. Les nucléosomes s’agrègent ensuite en une fibre de 30nm pour atteindre un empaquetage de 40 fois (Figure 2). Cette fibre chromatinienne est ensuite condensée encore une fois afin de former :

soit l’euchromatine qui présente un ratio de compaction de 1.000. C’est au sein de l’euchromatine que se situent essentiellement les gènes activement transcrits.

soit l’hétérochromatine plus dense que l’euchromatine et ayant un facteur de compaction de 10.000. L’hétérochromatine est composée de l’hétérochromatine constitutive et de l’hétérochromatine facultative. L’hétérochromatine constitutive renferme des séquences d’ADN non-codantes incluant les séquences satellites, répétées et parasites qui sont souvent localisées au niveau des centromères et qui restent invariablement silencieuses. En revanche, l’hétérochromatine facultative est constituée de régions d’euchromatine qui ont été converties en hétérochromatine. L’exemple par excellence de l’hétérochromatine facultative est le chromosome X inactif chez les mammifères femelles et sur lequel nous allons revenir ultérieurement dans le point I.4.3.c de ce chapitre.

Dans les cellules eucaryotes, la chromatine présente une organisation compacte dans laquelle la plupart des séquences d’ADN sont inaccessibles de part leur structure et fonctionnellement inactives. Cette organisation de l’ADN en chromatine joue un rôle déterminant dans toutes les fonctions du génome comme la transcription, la réplication de l’ADN et la réparation de l’ADN. L’état chromatinien détermine et contrôle l’accessibilité de l’ADN à divers facteurs nucléaires comme les facteurs de transcription [2].

I.1.2. L’épigénétique

L’épigénétique réfère à « un changement héritable mais réversible de l’activité du génome qui est dû à un mécanisme autre que l’altération dans la séquence primaire de l’ADN » [3]. Les mécanismes épigénétiques entraînent des modifications réversibles de la structure propre de l’ADN ainsi que des protéines entourant l’ADN. Différents états de la chromatine sont ainsi obtenus correspondant soit à une chromatine dans un état décondensé et transcriptionnellement actif soit à une chromatine dans un état condensé et transcriptionnellement inactif. Le contrôle épigénétique permet en effet de moduler l’accessibilité de l’ADN aux divers processus biologiques nucléaires, comme la transcription de gènes spécifiques et de maintenir cet état d’activité (soit actif soit silencieux) d’une génération cellulaire à l’autre. Ce contrôle est réversible et est modulé au cours du développement (empreinte génétique, inactivation du chromosome X chez les mammifères femelles), de la différenciation cellulaire, du temps (vieillissement) et en réponse à des stimuli extérieurs [3]. Le contrôle épigénétique permet également de maintenir le patrimoine génétique, par exemple en le protégeant d’attaques virales suite à l’inactivation des gènes viraux intégrés dans le génome.

Le contrôle de la structure de la chromatine peut se faire à plusieurs niveaux [1, 4, 5]:

l’ajout ou l’enlèvement de modifications covalentes des histones, l’ajout de groupements méthyls sur l’ADN lui-même et le remodelage de la chromatine par des complexes ATP-

dépendants (Figure 3). Une dérégulation de ces modifications épigénétiques peut entraîner des maladies telles que le cancer [6].

Dans les paragraphes suivants, nous allons d’abord revenir brièvement sur le remodelage de la chromatine par des complexes ATP-dépendants (I.2.) et sur les modifications post-traductionnelles des histones (I.3.) pour ensuite décrire plus en détail la méthylation de l’ADN (1.4.), mécanisme auquel nous nous sommes intéressés plus particulièrement au cours de la thèse. Ensuite, nous allons évoquer les liens, souvent complexes, entre les différents mécanismes épigénétiques dans le point I.4.8. et ce, à l’aide de plusieurs exemples.

I.2. Le remodelage de la chromatine par des complexes ATP-dépendants

I.2.1. Les familles des complexes de remodelage

Les complexes de remodelage de la chromatine, découverts il y a dix ans, remodèlent de façon dynamique et non-covalente la structure de la chromatine en catalysant l’ATP. Ces complexes de remodelage de la chromatine sont caractérisés par la présence d’une protéine ayant un domaine ATPase très conservé. On peut les subdiviser en trois familles, illustrées dans la partie supérieure de la Figure 3, selon la présence d’autres domaines caractéristiques [4].

- La famille fondatrice SWI/SNF2 est caractérisée par la présence d’un bromodomaine qui

est un domaine essentiellement lié à des histones acétylées et à un état actif de la transcription (voir aussi I.3.2.a.).

- La famille ISWI contient un domaine SANT ou SLIDE qui lui confère une activité hélicase capable de changer la conformation des contacts entre l’ADN et les histones (voir aussi I.3.3.b.).

- La famille Mi-2 contient un chromodomaine et une structure de doigts PHD (Plant

Homeodomain). Le chromodomaine est le plus souvent lié à un marquage de l’hétérochromatine tandis que le domaine PHD présente une interface pour l’interaction avec d’autres protéines (voir aussi I.3.3.b.et I.4.5.).

La plupart du temps ces ATPases font parties de complexes multi-protéiques dont les plus connus sont représentés sur la Figure 3.

I.2.2. Le rôle et les fonctions des complexes de remodelage de la chromatine

Ces complexes sont très bien conservés au cours de l’évolution et on les retrouve aussi bien chez la levure, la mouche que chez les mammifères supérieurs. Ils jouent un rôle important au cours de la réplication, dans la réparation de l’ADN suite à des agressions aux UV et dans le contrôle de l’accessibilité au génome de facteurs de transcription [4, 7].

Les complexes de remodelage de la chromatine sont capables de repositionner les nucléosomes par un effet de glissement ou par une altération du nucléosome ou encore par un détachement du nucléosome. On retrouve dans la plupart des complexes ATP- dépendants également des hélicases qui modifient le degré de torsion de l’ADN et qui conduisent directement à un changement dans les contacts entre les histones et l’ADN. Les mécanismes de repositionnement des nucléosomes permettent aux facteurs de transcription d’accéder pendant une fraction de temps à des régions condensées de la chromatine et de les transcrire ou à l’opposé, rendent une région de la chromatine complètement inaccessible.

Par exemple le complexe SWI/SNF qui joue surtout un rôle dans l’activation des gènes, conduit à une exposition de l’ADN à la surface du nucléosome permettant ainsi l’accès aux facteurs de transcription [8]. La spécificité des enzymes catalysant l’ATP semble varier selon le substrat. Ainsi par exemple, l’ATPase SWI/SNF ne semble pas faire la différence entre l’ADN nu et les nucléosomes tandis que les ATPases ISWI et Mi-2 montrent une spécificité accrue pour l’ADN enroulé autour des nucléosomes [9]. Les enzymes ATPases peuvent

également remodeler la chromatine de différentes manières et leur spécificité dépend de la composition du complexe dans lequel elles se trouvent. En effet, au sein des complexes de remodelage, les autres partenaires protéiques contribuent également à la spécificité du complexe et ils peuvent intervenir dans le ciblage des complexes sur certains promoteurs spécifiques de façon directe ou en interagissant avec des facteurs de transcription. Par exemple, ISWI déplace un octamère d’histones plutôt aux extrémités d’un fragment d’ADN de 248pb [10] tandis que ISWI le repositionne préférentiellement en position centrale lorsqu’il se trouve au sein des complexes CHRAC ou ACF, contenant tous les deux la sous-unité Acf- 1; illustrant le rôle de cette sous-unité dans le remodelage de la chromatine par ISWI [11].

I.3. Les modifications post-traductionnelles des histones

I.3.1. Le rôle des histones

Les histones forment le corps du nucléosome (Figure 1) et donc de la chromatine, comme déjà illustré précédemment dans le point I.1.1. Les changements dans la structure ou dans la composition du corps du nucléosome se traduisent par un changement de la conformation de la chromatine.

Les modifications post-traductionnelles des histones touchent majoritairement les queues N-terminales protubérantes des histones et jouent sur la structure des histones et donc des nucléosomes et par conséquent sur l’accessibilité de l’ADN au sein de la chromatine [12]. Les principales modifications post-traductionnelles connues des histones sont : l’acétylation, la méthylation, la phosphorylation et l’ubiquitinylation (Figure 4). Les modifications post-traductionnelles des histones sont illustrées dans les paragraphes suivants et composent ensemble le code des histones sur lequel nous allons revenir dans le dernier point I.3.5. [13].

Un autre volet dans la régulation des histones est leur substitution par des histones atypiques. Par exemple CENP-A, protéine centromérique A, est une variante de l’histone H3 et participe à l’assemblage centromérique des nucléosomes avec les autres histones H4, H2B et H2A. [14]. Un autre exemple est le remplacement de l’histone H3 par le variant H3.3, qui permet l’activation immédiate de l’expression des gènes qui ont été préalablement réprimés par une modification post-traductionnelle de l’histone H3 [15].

I.3.2. L’acétylation et la désacétylation d’histones

L’hyperacétylation de résidus lysines aux extrémités amino-terminales des histones a été proposée, il y a presque quarante ans, comme étant impliquée dans l’activation transcriptionnelle [16]. Des découvertes plus récentes et la caractérisation de complexes qui peuvent ajouter ou retirer des groupements acétyls, ont permis une meilleure compréhension de cette modification covalente qui touche essentiellement les résidus lysines des extrémités amino-terminales des histones (Figure 4).

Des études sur le taux global d’acétylation ont montré que pour un gène activement transcrit, sur les 30 résidus lysines présents dans un octamère d’histones, il peut y avoir jusqu’à 13 lysines acétylées [17]. L’ajout d’un groupement acétyl neutralise la charge positive de l’extrémité des histones permettant de relâcher l’interaction ADN-histones et l’interaction entre les nucléosomes et conduisant ainsi à une chromatine plus flexible où l’ADN est plus accessible aux facteurs de transcription. A l’échelle cellulaire, le niveau d’acétylation délimite topographiquement l’euchromatine et l’hétérochromatine au moyen d’un gradient d’acétylation/désacétylation. Cette modification post-traductionnelle des histones joue aussi un rôle dans la progression cellulaire, la recombinaison et la réparation de l’ADN, ainsi que dans l’apoptose [18].

Le niveau global d’acétylation d’histones est maintenu par les actions antagonistes des acétyltransférases d’histones, les HAT, et des désacétylases d’histones, les HDAC (Figure 5). Ces enzymes régulent l’ajout et l’enlèvement d’un groupement acétyl sur les

résidus lysines des histones et/ou d’autres protéines non-histones. Ces enzymes sont ciblées sur des promoteurs spécifiques, ce qui leur permet de réguler localement la structure d’histones et donc la transcription. Le ciblage peut se faire soit par l’interaction directe d’une HAT ou HDAC avec un facteur de transcription séquence-spécifique soit par l’interaction avec un complexe multi-protéique. En effet, des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) utilisant des anticorps spécifiques contre les histones acétylées ont permis de vérifier que l’augmentation du taux d’acétylation d’un promoteur proximal d’un gène est bien corrélée à un recrutement d’une HAT au niveau du promoteur et à une augmentation de l’expression du gène étudié [19]. A l’inverse, l’hypoacétylation de certains promoteurs est liée à un recrutement des enzymes HDAC ainsi qu’à une répression des gènes [20].

a. Les acétyltransférases d’histones, HAT

Les HAT sont les enzymes responsables du rajout d’un groupement acétyl sur les résidus lysines d’histones. Elles sont classées en six familles qui sont illustrées sur la Figure 6.

Brièvement, les GNAT, dont les membres principaux sont Gcn5 et PCAF, sont caractérisées par un domaine catalytique HAT et un bromodomaine qui permet un ciblage sur les histones acétylées et qui est associé à un état actif de la transcription [21]. Les membres de ce groupe sont des co-activateurs de la transcription et ils sont le plus souvent présents au sein de complexes multi-protéiques, les complexes Gcn5/PCAF. Ces complexes comportent une combinaison spécifique d’autres protéines comme des protéines TAF_II (TATA-binding protein–associated factor) et des protéines ADA (adaptor protein) dont certaines sont spécifiques d’un complexe tandis que d’autres peuvent être présentes dans plusieurs complexes différents. PCAF peut également acétyler d’autres protéines que des histones et ainsi il est également considéré comme une FATpour Factor Acetyltranferase.

Les membres de la famille MYST sont caractérisés par un domaine catalytique HAT qui contient également un domaine riche en cystéines liant le zinc et par un chromodomaine situé en position N-terminale. Le chromodomaine permet aux HAT de la famille MYST d’être ciblées de façon spécifique dans le génome et d’interagir, entre autres, avec des facteurs intervenant dans le remodelage de la chromatine [22]. Ainsi par exemple Tip60, d’abord identifié comme une protéine interagissant avec la protéine Tat de HIV, peut se retrouver au sein d’un complexe Tip60 qui contient également la protéine TRAPP, l’hélicase p400 (SNF2- like) et les ATPases Tip48 et Tip49 [23]. Certains membres du groupe MYST, comme par exemple MOZ, sont impliqués avec une autre HAT (comme par exemple CBP, p300 et TIF2), dans des translocations chromosomiques, décrites dans certaines leucémies aigues, et engendrant un ciblage inadéquat de l’activité HAT dans le génome [24].

CBP/p300 est une très grande protéine d’environ 300kDa qui a une activité HAT et FAT et qui est généralement considérée comme un co-activateur global de la transcription [25]. CBP/p300 est connu pour interagir avec de nombreuses protéines comme des facteurs de transcription spécifiques, des facteurs de la machinerie basale de transcription et des récepteurs nucléaires. CBP/p300 est composée d’un large domaine HAT, d’un bromodomaine (comme les autres HAT de la famille GNAT et TAFII250) et de trois petits domaines riches en résidus cystéines et histidines qui sont impliqués dans des interactions protéine-protéine .

Certains co-activateurs des récepteurs nucléaires ont une activité HAT et sont regroupés dans la famille SRC. Ils interagissent avec d’autres HAT comme PCAF et CBP/p300 et sont acétylés eux-mêmes par CBP/p300. Il est intéressant de remarquer que Tip60, CBP/p300 et PCAF peuvent également fonctionner comme des co-activateurs des récepteurs nucléaires et ainsi répondre à un signal extérieur. ATF-2, membre de la famille SRC, est le premier co-activateur transcriptionnel séquence-spécifique décrit comme ciblant spécifiquement son activité HAT dans le génome grâce à son domaine de liaison à l’ADN [26].

TAFII250 et TFIIIC sont des HAT qui font partie de la machinerie basale de transcription [27-29]. TAFII250 fait partie de la sous unité TFIID qui est nécessaire à l’assemblage de l’ARN polymérase II dans le complexe de préinitiation de la transcription tandis que TF_IIIC appartient à l’ARN polymérase III qui est impliquée dans la synthèse de l’ARN de transfert, ARNt.

b. Les désacétylases d’histones, HDAC

Les désacétylases d’histones, illustrées dans la Figure 7, interviennent dans la répression transcriptionnelle et elles sont partagées en deux grandes familles, les HDAC dites classiques et les HDAC NAD⁺-dépendantes [20]. Les HDAC fonctionnent rarement toutes seules mais font souvent partie de complexes multi-protéiques contenant d’autres protéines qui ont des fonctions dans le recrutement du complexe, dans le remodelage de la chromatine et/ou dans la co-répression.

La grande famille des HDAC dite classique est subdivisée en deux classes. La classe I, la mieux caractérisée, est composée des protéines HDAC1, 2, 3 et 8 qui sont essentiellement localisées dans le noyau des cellules. HDAC1 et HDAC2 appartiennent à plusieurs complexes répresseurs : NuRD (nucleosome remodelling and deacteylation), SIN3 (complexe appelé d’après son membre caractéristique, mSin3a qui est un corépresseur) et Co-Rest [30]. Les deux complexes NuRD et Sin3 possèdent un noyau protéique commun composé des protéines HDAC1, HDAC2, RbAp46 et RbAp48. Ce noyau protéique ne possède pas une activité HDAC maximale et d’autres partenaires protéiques sont requis [31, 32]. Ainsi, le complexe NuRD contient également Mi2, une enzyme du remodelage ATP- dépendant de la chromatine, et des protéines MBD liant l’ADN méthylé, sur lesquelles nous allons revenir ultérieurement dans le point I.4.6 de l’introduction [33]. HDAC1 et HDAC2 peuvent également interagir directement avec des facteurs de transcription séquence- spécifique comme YY1 (Yin and Yang 1, une protéine régulatrice de la matrice nucléaire) [34], Sp1 [35] et Rb (Retinoblastoma protein) [36]. HDAC1 et HDAC2 sont également

recrutées par les enzymes méthylant l’ADN [37, 38], associant ainsi deux événements épigénétiques de répression transcriptionnelle et nous allons y revenir plus tard dans les points I.4.5 et I.4.8. de l’introduction. HDAC3, un autre membre de la classe I, est décrit comme interagissant avec les co-répresseurs NCoR (nuclear receptor co-repressor) et SMRT (silencing mediator for retinoic acid and thyroid hormone receptors) qui, à leur tour, peuvent interagir avec le co-répresseur mSin3a dans le complexe SIN3 [39]. HDAC3 est également capable de contacter les HDAC4, 5 et 7 via les complexes formés avec SMRT et NCoR [40].

Les HDAC de la classe II sont des enzymes de plus grande taille qui peuvent transiter entre le noyau et le cytoplasme. L’expression de cette classe est plus restreinte que celle de la classe I, ce qui laisse suggérer que ces enzymes sont impliquées dans la différenciation cellulaire et dans le développement [30]. Cette classe d’HDAC est bien moins bien décrite et jusqu’à maintenant aucun complexe contenant une activité HDAC de classe II n’a pu être identifié. HDAC4, HDAC5 et HDAC7 sont capables d’interagir avec les répresseurs SMRT/NCoR, BCoR (Bcl-6 interacting co-repressor) et le facteur de transcription myogénique MEF2 qui joue un rôle important dans la différenciation musculaire. HDAC9 semble également avoir une fonction pendant la différenciation musculaire tandis qu’HDAC10 semble être impliqué dans la régulation du cycle cellulaire. HDAC6, elle, est une désacétylase de la tubuline et joue dans la régulation de la motilité cellulaire [41].

La deuxième famille de HDAC, appelée SIR2 d’après son membre fondateur Sir2 chez la levure (Silent information regulator), a été découverte beaucoup plus récemment et elle est composée d’un autre type d’HDAC à savoir des HDAC NAD⁺-dépendants qui désacétylent une lysine pour chaque clivage d’une molécule NAD+. Chez l’Homme sept protéines Sir2, nommées SIRT1 à SIRT7, sont connues mais le rôle biologique de la plupart de ces protéines reste encore inconnu [42]. SIRT1 est essentiellement localisé dans le noyau des cellules et intervient dans le développement embryonnaire et la différenciation musculaire [43, 44]. Par exemple, SIRT1 désacétyle les facteurs p53 et PML (promyelocytic leukemia protein) et les régule négativement, favorisant ainsi la croissance cellulaire [45].

Des autres membres de la famille Sir2, seuls SIRT2, SIRT3 et SIRT5 ont une activité HDAC mais peu de données sont disponibles sur la fonction et la régulation des ces enzymes.

SIRT2 est plutôt localisé dans le cytoplasme et intervient avec HDAC6 dans la désacétylation de la tubuline et donc dans la motilité cellulaire tandis que SIRT3 est localisé dans la matrice mitochondriale et devient enzymatiquement actif seulement après le clivage d’un peptide signal [46, 47].

I.3.3. La méthylation d’histones

Il y a deux types de méthylation d’histones, ciblant le groupement méthyl soit sur des résidus arginines (Arg, R) soit sur des résidus lysines (Lys, K). Chaque type de méthylation est effectué par des enzymes méthyltransférases d’histones spécifiques.

a. La méthylation sur des résidus Arginine

La méthylation spécifique de certains résidus d’arginine dans les histones H3 et H4 est corrélée avec à un état de transcription actif (Figure 4). Les PRMT (protéine R méthyltransférases) catalysent le transfert du groupement méthyl sur ces résidus arginines qui peuvent être mono ou di-méthylés (diméthylation symétrique ou asymétrique) [48]. Chez les mammifères, cinq PRMT ont été décrits ; ceux-ci sont schématisés dans la Figure 8.

PRMT4/CARM1 peut également méthyler des facteurs non-histone comme par exemple CBP/p300 [49]. La méthylation sur des résidus arginine influence également l’acétylation d’histones, ainsi par exemple, la méthylation de l’arginine 3 de l’histone H4 par PRMT1 facilite l‘acétylation de l’histone H4 et augmente l’activation de la transcription induite par les récepteurs hormonaux nucléaires [50].

Jusqu’à peu, la déméthylation active était encore très hypothétique. Très récemment, par contre, deux équipes ont décrit simultanément une déméthylation par déimination des résidus arginines des histones par l’enzyme PAD4 (peptidylarginine deiminase) [51, 52]. En effet, PAD4 est capable de déiminer les résidus arginine méthylés par CARM1 et PRMT1.

PAD4 semble jouer un rôle dans la régulation transcriptionnelle et plus précisément dans la répression génique induite après une stimulation hormonale.

b. La méthylation sur des résidus Lysines

La méthylation de résidus lysines est connue pour toucher les lysines 4, 9 et 27 de l’histone H3 ainsi que la lysine 20 de l’histone H4 (Figure 4). Dans la suite de l’exposé et afin de faciliter la nomenclature des différents sites des acides aminés au sein des histones touchées par une modification post-traductionnelle, nous allons utiliser, par exemple, l’abréviation H3-K9 pour se référer à la lysine 9 de l’histone H3.

La méthylation des lysines peut avoir un rôle activateur ou répresseur de la transcription selon les lysines modifiées. Ainsi la méthylation en H3-K4 est liée à un état activé tandis que la méthylation en H3-K9 et H3-K27 est liée à un état réprimé de la transcription [48]. La méthylation en lysines est une modification beaucoup moins dynamique que la phosphorylation ou l’acétylation d’histones. En effet elle est beaucoup plus stable au cours du temps et elle marque aussi bien des gènes spécifiques (niveau génique) que des larges régions particulières de la chromatine (niveau chromosomique) [12]. La méthylation de résidus lysines des histones H3 et H4 est directement impliquée dans l’hérédité épigénétique (empreinte génétique, inactivation du chromosome X chez les mammifères femelles) ainsi que dans l’établissement et la maintenance de profils transcriptionnels pendant la mitose et la méiose. Néanmoins, il paraît de plus en plus clair qu’il existe un moyen actif de déméthyler les résidus lysines des histones soit par réelle déméthylation soit par remplacement des histones méthylées [53].

La méthylation des lysines est catalysée par les HKMT, les méthyltransférases de lysines des histones. Les HKMT peuvent rajouter jusqu’à trois groupements méthyl sur un résidu lysine et le niveau de méthylation est lié à des états chromatiniens différents. Une conversion progressive vers un état de tri-méthylation pourrait contribuer à une stabilité accrue de la méthylation de la lysine et engendrer une empreinte génétique à long terme,

par exemple l’inactivation du chromosome X chez les mammifères femelles (I.4.3.c) [54].

Plusieurs classes de HKMT ont été caractérisées chez la levure, chez la drosophile et chez les mammifères; elles possèdent toutes un domaine catalytique SET. Ce domaine doit son nom au trois premiers membres décrits chez la drosophile Su(var)3-9, Enhancer of Zeste et Thritorax qui étaient connus depuis longtemps comme des modificateurs de PEV (position effect variegation : des gènes transcrits activement sont rendus silencieux par leur proximité à de l’hétérochromatine). Les familles de HKMT de mammifères sont représentées dans la Figure 8. Les différents HKMT ont une spécificité bien déterminée et ils catalysent l’ajout d’un ou de plusieurs groupements méthyl sur des lysines bien précises.

La méthylation des lysines favorise la liaison de protéines à chromodomaine avec les nucléosomes. Ainsi l’H3-K9 méthylée est reconnue par les protéines de la famille HP1 (heterochromatin protein 1, protéines structurales de l’hétérochromatine). HP1 est une protéine à chromodomaine qui est surtout connue pour être présente au niveau de l’hétérochromatine mais dont le rôle dans la répression d’un gène spécifique n’est pas encore très clair [55]. L’H3-K27 méthylée, par contre, est reconnue par la protéine PC (Polycomb, protéine à chromodomaine) qui est connue pour intervenir dans la répression de gènes durant le processus du développement [56]. Le chromodomaine est retrouvé non seulement dans les HKMT Suv39H1 et Suv39H2 ainsi que dans les protéines HP1 et PC mais également dans d’autres protéines comme la HAT CBP/p300 et certaines ATPases ; ce qui laisse à nouveau suggérer que la méthylation d’un résidu lysine induit le recrutement d’autres complexes intervenant dans le remodelage de la chromatine.

Comme déjà mentionné précédemment, la méthylation d’histones par le biais des HKMT est impliquée dans la répression transcriptionnelle aussi bien au niveau chromosomique qu’au niveau d’un gène spécifique [54]. Ainsi par exemple, Suv39H conduit préférentiellement à la triméthylation de H3-K9 dans les régions péricentromériques de l’hétérochromatine [57, 58]. En revanche, Suv39H peut également intervenir dans la répression transcriptionnelle d’un gène spécifique tel que la cycline E suite à son association avec l’oncoprotéine Rb [59].

I.3.4. Les autres modifications

La phosphorylation de la sérine 10 de l’histone H3, H3-S10, la mieux étudiée des sérines phosphorylées des histones, est corrélée à la mitose et à la condensation des chromosomes ; tout comme la sérine 28 de l’histone H3, H3-S28 [60]. D’autres sites de phosphorylation sur des résidus sérines ont été identifiés dans les histones H4, H2A et H2B (Figure 4). La phosphorylation en H3-S10 est également liée à une activation transcriptionnelle. Quand des cellules de mammifères sont exposées à des mitogènes ou au stress, la cinétique de cette phosphorylation correspond à l’expression transitoire des gènes précoces (immediate-early). Ainsi une même phosphorylation peut conduire à des réponses nucléaires très différentes. Les kinases qui peuvent phosphoryler l’histone H3 sont Aurora- B/Ipl1, PKA, Rsk-2 tandis que la famille des protéines phosphatases PP1 peuvent abolir cette phosphorylation. Jusqu’à maintenant on n’a pas encore identifié des facteurs qui pourraient être recrutés sur les résidus phosphorylés des histones. En revanche, il a été montré que la HAT Gcn5 est capable d’accroître sa capacité d’acétyler les lysines de l’histone H3 quand il y a une phosphosérine adjacente [61]. Ainsi la phosphorylation joue, peut-être, un rôle unique dans la régulation d’autres modifications qui lui sont adjacentes. Il a été proposé que la phosphorylation pourrait neutraliser l’effet de la méthylation des lysines et que les phosphosérines présentent une sorte d’interrupteur binaire [62].

L’ubiquitinylation d’histones est particulière car elle ne met en jeu qu’une simple

mono-ubiquitinylation non-dégradative d’une lysine dans le domaine carboxy-terminal des histones H2A ou H2B. L’ubiquitinylation est attribuée à un contrôle positive de la transcription [63]. L’ubiquitinylation de H2B est importante pour la méthylation des lysines 4 et 79 de H3.

En revanche, Ubq8, une protéine contenue dans le complexe SAGA, est capable d’enlever l’ubiquitine de la lysine de H2B [64, 65]. Ainsi l’ubiquitinylation et la déubiquitinylation peuvent interagir avec la méthylation sur des résidus lysines et ainsi contrôler la régulation transcriptionnelle.

I.3.5. Le code des histones

Comme illustré dans les points précédents, les histones peuvent subir de nombreuses modifications. En outre, il apparaît que ces modifications sont interconnectées, non seulement lorsqu’elles sont présentes sur une même queue d’histone mais également en trans. Il a été proposé que les différentes modifications post-traductionnelles des histones constituent un code, le code des histones [13, 66]. Selon l’hypothèse du code des histones, chaque combinaison de modifications conduirait à une réponse biologique spécifique, en créant par exemple un site de liaison pour une autre protéine, et serait traduit en un état chromatinien particulier : actif, permissif, restrictif ou inactif. Etant donné la grande diversité des modifications possibles (Tableau 1), le nombre de combinaisons potentielles sur un nucléosome composé d’un octamère d’histones est extrêmement élevé [54]. Une fois établi, ce code marquerait de façon épigénétique un locus ou une grande région de la chromatine soit d’une manière transitoire ponctuelle, soit de façon stable. A titre d’exemple, la Figure 9 illustre des interrelations régulatrices entre les différentes modifications des histones H3 et H2B [13]. Comme déjà cité précédemment, la phosphorylation de H3-S10 entraîne une acétylation plus importante de H3-K14 par Gcn5 [67]. Ces deux modifications répriment alors la méthylation de H3-K9, ce qui permet un état actif de transcription. En revanche, la méthylation de H3-K9 inhibe la phosphorylation de H3-S10 et donc provoque une répression de la transcription. D’autre part, chez la levure, la mono-ubiquitinylation de H2B-K123 est nécessaire pour qu’il y ait méthylation de H3-K4 et H3-K79 entraînant une activation génique [68].

I.4. La méthylation de l’ADN

I.4.1. Historique

Il y a plus d’un demi-siècle que Rollin Hotchkiss a découvert la 5-méthylcytosine dans l’ADN d’un thymus de veau en utilisant la chromatographie sur papier [69], à une époque où la structure et la fonction de l’ADN comme matériel héréditaire n’avaient pas encore été découvertes. Le déchiffrage du code génétique par Nirenberg et Matthaei a constitué le début de la biologie moléculaire moderne et le commencement de la recherche sur la méthylation de l’ADN [70].

Les études sur l’infection par des bactériophages ont conduit à la compréhension et à la découverte chez les bactéries des enzymes de restriction et de la méthylation séquence- spécifique de l’ADN. Les bactéries tirent profit de la méthylation de leur ADN pour se protéger de l’intégration de l’ADN de bactériophages dans leur génome. Les endonucléases distinguent ainsi l’ADN étranger et le dégradent rapidement [71]. Accessoirement, la méthylation de l’ADN permet aux bactéries de contrôler la fidélité de la réplication de leur ADN.

Vers 1975, pour la première fois, Roy et Weissbach purifient et caractérisent une méthylase de l’ADN à partir de noyaux cellulaires de HeLa [72]. Au début des années 80, l’observation que le gène de hamster aprt (adénine phosphoribosyltransférase) méthylé in vitro et transfecté dans des cellules de souris, resta transcriptionnellement inactif dans les cellules, suggère pour la première fois un rôle de la méthylation de l’ADN dans la répression génique [73].

La première méthyltransférase murine de l’ADN fut clonée par le laboratoire de Bestor en 1988 [74]. La méthylation de l’ADN fut longtemps considérée comme un épiphénomène biologique mais depuis la caractérisation des enzymes responsables de la méthylation de l’ADN, des énormes progrès ont été réalisés et ont permis de démontrer, au cours des dernières années, le rôle essentiel joué par la méthylation de l’ADN dans divers

processus biologiques. Ces processus seront décrits plus avant dans le point I.4.3. D’autre part, il semble de plus en clair qu’une méthylation aberrante tient un rôle primordial dans la cancérogenèse (I.4.7.c.) [75].

I.4.2. Généralités

La méthylation de l’ADN est une modification épigénétique réversible de l’ADN. Elle est retrouvée des plantes aux mammifères supérieurs en passant par la drosophile. En revanche, elle est absente du nématode C.elegans et de la levure Saccharomyces cerevisiae [76].

Chez les humains et les autres mammifères supérieurs, la méthylation est essentiellement imposée sur des résidus cytosines qui précèdent une guanosine dans la séquence de l’ADN, appelés encore les dinucléotides CpG. Dans une cellule somatique humaine, 70 à 80% des dinucléotides CpG du génome sont estimés méthylés [77]. Ces sites méthylables suivent une distribution non uniforme : il existe des domaines, appelés îlots CpG, où ce dinucléotide est plus fortement représenté. Les îlots CpG sont fréquemment retrouvés dans le promoteur et le premier exon de gènes et ils ne sont eux en général pas méthylés dans les cellules [78]. La fréquence générale des dinucléotides CpG dans le génome est considérablement inférieure à la fréquence théorique. La méthylation de l’ADN a probablement conduit au cours de l’évolution à l’extinction de beaucoup des dinucléotides CpG du génome. Cette élimination est reliée à la tendance des cytosines méthylées à perdre spontanément un groupement amine et ainsi à se transformer en thymidine. Si cette mutation n’est pas réparée, le changement cytosine-thymidine persiste. En effet, dans le génome, cette transition nucléotidique est retrouvée aux sites de déplétion de dinucléotides CpG. Ce changement de base constitue également le plus commun des polymorphismes génétiques dans la population humaine [79].

Certes la méthylation de l’ADN est réversible mais peu est connu à l’heure actuelle sur la déméthylation de l’ADN, qui conduit probablement à un état déréprimé et activable de

l’ADN. Les mécanismes par lesquels la déméthylation a lieu, ne sont pas encore compris et aucune protéine impliquée dans un tel processus n’a pu être mise en évidence. Reste donc ouverte la question de savoir si la déméthylation de l’ADN résulte d’une perte de la méthylation au cours des réplications cellulaires ou d’une substitution de la base méthylée ou, le plus probablement, d’une déméthylation active par une (des) enzymes encore non identifiée(s) [76].

1.4.3. Les rôles biologiques de la méthylation de l’ADN

Comme déjà mentionné précédemment dans le point I.4.1., le rôle biologique de la méthylation de l’ADN chez les bactéries est de défendre leur patrimoine génétique face à l’introduction d’un ADN étranger. En revanche chez les mammifères, la méthylation de l’ADN est impliquée dans beaucoup plus de fonctions biologiques, liées notamment au développement, comme l’inactivation du chromosome X chez les mammifères femelles, l’empreinte génétique ou l’expression de gènes tissus-spécifiques ou encore l’inhibition de l’expression de séquences parasites [5]. En effet, la méthylation de l’ADN intervient dans la répression de la transcription touchant soit un gène spécifique soit une région précise du génome. Lorsqu’on se réfère à l’établissement d’un profil de méthylation dans le génome, on parle d’une méthylation de novo de l’ADN (Figure 10). Ensuite ces profils de méthylation sont conservés tout au long des cycles cellulaires et le plus souvent tout au long de la vie de l’organisme par une méthylation de maintien de l’ADN, sauf si des facteurs extérieurs et/ou génétiques perturbent les profils de méthylation, tel que par exemple pendant la cancérogenèse de la cellule [76].

a. Le développement

Au cours du développement précoce, des changements du profil de méthylation s’opèrent de façon orchestrée et précise [5]. Immédiatement après la fécondation, les chromosomes maternels et paternels du zygote subissent une vague de déméthylation

globale qui efface en partie les profils de méthylation parentale mais qui préserve les gènes d’empreinte [5]. Entre l’implantation de l’embryon et la gastrulation, le blastocyste traverse des étapes de méthylation de novo de son ADN [80]. La fonction biologique exacte de cette reprogammation dynamique de l’ADN est certes essentielle au développement harmonieux mais elle reste encore inconnue jusqu’à maintenant [81, 82]. Par ailleurs, pendant la différenciation cellulaire, quelques gènes dans certains tissus subissent une déméthylation permettant à la cellule d’exprimer ces gènes et d’acquérir ainsi des fonctions spécialisées qui deviennent ensuite transmissibles aux cellules filles [83].

b. L’empreinte génétique (parentale)

L’empreinte génétique est un processus par lequel l’expression de certains gènes est restreinte à un allèle, paternel ou maternel. L’allèle non exprimé est rendu et maintenu silencieux par la méthylation de sa séquence [84].

c. L’inactivation du chromosome X

L’inactivation du chromosome X chez les mammifères femelles est établie pendant l’embryogenèse précoce et permet de rendre transcriptionnellement silencieux de façon permanente un des deux chromosomes X. L’euchromatine est transformée en hétérochromatine sous l’influence d’un ARN nucléaire non-codant Xist, de la désacétylation et la méthylation d’histones ainsi que de la méthylation de l’ADN. La méthylation de l’ADN semble surtout jouer un rôle dans la maintenance et l’irréversibilité de l’inactivation du chromosome X [85].

d. L’inactivation de séquence parasites

Les rétrovirus endogènes et rétrotransposons sont des éléments parasites qui sont rendus silencieux lorsqu’ils sont intégrés dans le génome de la cellule. Il s’agit probablement d’un moyen de défense pour préserver le bon fonctionnement de la cellule. Lorsqu’un

transgène actif est intégré dans le génome d’une cellule, son expression s’éteint très rapidement (après 11 jours). L’étude des différentes modifications épigénétiques a permis de comprendre que la répression du transgène est effective quand il y a eu une désacétylation d’histones H3 et H4 et une perte de la méthylation en H3-K4. Ensuite, probablement pour verrouiller définitivement le transgène, il y a méthylation de l’histone H3 en K9 et méthylation de la région promotrice du transgène [86].

1.4.4. Les deux caractéristiques clefs de la méthylation de l’ADN

a. La méthylation verrouille l’expression génique

L’importance de la méthylation de l’ADN dans de nombreux processus biologiques est probablement à rapprocher de son rôle important dans la répression et le verrouillage de la transcription de certaines régions spécifiques du génome (Figure 11) [87]. En revanche, les mécanismes par lesquels la méthylation de l’ADN peut inhiber l’expression génique sont peu compris.

Il a été proposé que le rajout d’un groupement méthyl sur l’ADN puisse engendrer un encombrement stérique, ne permettant plus la fixation sur l’ADN de protéines essentielles à la transcription génique, comme les facteurs de transcription. Ce mécanisme indirect est toutefois jugé peu fréquent in vivo [5, 76, 88].

Un autre mécanisme, beaucoup plus général que le premier, se base sur les protéines directement impliquées dans la méthylation de l’ADN, à savoir les méthyltransférases de l’ADN, Dnmt (DNA methyltransferase), et les protéines liant les dinucléotides CpG méthylés, MBD (Methyl Binding Protein). Nous allons revenir en détails sur les Dnmt dans le point I.4.5 et sur les MBD dans le point 1.4.6. [3]. Ces protéines influencent directement la structure de la chromatine, notamment en contactant d’autres protéines intervenant dans le remodelage dynamique de la chromatine, comme par exemple

des HDAC et certaines ATPases [89, 90]. Ainsi, la méthylation de l’ADN coopère avec les autres modifications épigénétiques pour atteindre un état chromatinien plus compact et inaccessible aux facteurs de transcription [1]. Nous allons revenir sur les mécanismes de verrouillage et sur l’interconnectivité des facteurs impliqués dans le contrôle épigénétique de la transcription dans le point I.4.8..

b. La méthylation est ciblée en des régions précises du génome

Les sites méthylés de l’ADN marquent de façon non-aléatoire des vastes régions chromosomiques, comme le chromosome X inactif chez les mammifères femelles, et des séquences très petites, notamment les îlots CpG situés dans la région promotrice d’un gène spécifique (Figure 11) [89]. Comment précisément la méthylation de l’ADN est ciblée en ces différents sites reste encore peu clair. La caractérisation des Dnmt et l’identification de leurs partenaires protéiques ont permis d’ouvrir la voie vers une meilleure compréhension du ciblage de la méthylation de l’ADN dans le génome. Nous allons y revenir plus en détail dans le point I.4.8..

I.4.5. Les méthyltransférases de l’ADN (Dnmt)

a. Caractéristiques

Le clonage et la caractérisation des enzymes responsables de la méthylation de l’ADN ont permis de commencer à comprendre comment la méthylation de l’ADN fonctionne.

Les méthyltransférases de l’ADN, Dnmt, utilisent le S-adénosyl-méthionine comme substrat pour catalyser le transfert d’un groupement méthyl sur l’anneau de la cytosine avec formation de la cinquième base, la 5-méthylcytosine (Figure 12) [91].

b. La famille des Dnmts

La famille des Dnmts chez les mammifères est divisée en trois classes: Dnmt1, Dnmt2 et Dnmt3 (Figure 13).

c. Dnmt1

Dnmt1, la première Dnmt caractérisée, est celle qui est la plus abondante dans la cellule [74, 92]. Dnmt1 méthyle préférentiellement l’ADN hémi-méthylé (par rapport à l’ADN non-méthylé) in vitro et ainsi on considère souvent Dnmt1 comme la méthyltransférase de maintien qui permet de garder le même profil de méthylation au fil des divisions cellulaires (Figure 10) [93]. Effectivement, lors de la réplication cellulaire, Dnmt1, qui est généralement répartie de façon diffuse dans le noyau, se lie à PCNA (proliferation cellular nuclear factor) et se concentre dans les foci de réplication dès le début de la phase S [94]. Comme la présence de Dnmt1 n’est pas restreinte aux cellules en prolifération mais qu’elle est également localisée dans des tissus ayant un faible taux de prolifération (comme le cœur et le cerveau), il est fort probable que Dnmt1 puisse également intervenir dans la méthylation de novo et dans d’autres mécanismes biologiques [95].

L’expression de Dnmt1 se fait à partir de plusieurs promoteurs dont des promoteurs sexe-spécifiques et donne naissance à trois isoformes : Dnmt1, Dnmt1o et Dnmt1p. Dnmt1 est la forme somatique qui est la plus répandue et qui se retrouve dans toutes les cellules en division. L’expression de Dnmt1o commence à partir du promoteur et exon 1o et donne lieu à une protéine Dnmt1 dépourvue des 118 premiers acides aminés mais totalement fonctionnelle au point de vue activité méthyltransférase de l’ADN. L’expression de Dnmt1o est restreinte à l’oocyte jusqu’à l’embryon pré-implantatoire [96]. Pendant cette période, Dnmt1o effectue plusieurs aller-retour entre le noyau et le cytoplasme mais son rôle précis dans ce stade précoce du développement n’est pas encore tout à fait compris [97]. Il est intéressant de remarquer qu’au stade pachytène de la spermatogenèse, l’expression de Dnmt1 se fait à partir du promoteur et exon 1p mais elle ne donne pas lieu à la synthèse d’une protéine [97].

L’invalidation du gène Dnmt1 chez la souris entraîne une létalité embryonnaire précoce associée à une hypométhylation génomique sévère avec une dérégulation des gènes d’empreinte et une activation ectopique du chromosome X, soulignant son importance pendant le développement embryonnaire précoce [81, 98].

Dnmt1 interagit avec bon nombre d’autres protéines (Figure 13) et ce nombre continue à augmenter avec la compréhension des rôles de Dnmt1 dans la cellule. Dans ce paragraphe, nous n’allons que brièvement évoquer les différents partenaires protéiques de Dnmt1 mais nous allons revenir sur certains d’entre eux quand nous allons parler des mécanismes induits par les Dnmt dans le point I.4.8. Dnmt1 interagit avec d’autres protéines intervenant dans le remodelage de la chromatine comme les HDAC, la protéine HP1β et la HKMT Suv39H1 [37, 99, 100]. Dnmt1 interagit également avec les MBD, les autres protéines de la méthylation de l’ADN, ainsi qu’avec d’autres Dnmt, à savoir Dnmt3a et Dnmt3b [101, 102]. Dnmt1 contacte aussi des facteurs de transcription séquence-spécifique comme le suppresseur de tumeur Rb et l’oncoprotéine PML-RAR [103, 104]. D’autres partenaires identifiés de Dnmt1 sont une polymérase de l’ARN, RNApolII, et, comme déjà mentionné, la protéine PCNA qui se trouve au niveau des foci de réplication de l’ADN [94, 105].

d. Dnmt2

La protéine Dnmt2 constitue la classe la moins bien connue des Dnmt. Lorsque Dnmt2 est invalidée chez la souris, les profils de méthylation de l’ADN ne semblent pas être modifiés et la cellule est toujours capable de méthyler une séquence rétrovirale qui s’est intégrée dans le génome [106]. Néanmoins, deux études très récentes ont pu mettre en évidence que Dnmt2 a effectivement une activité de méthyltransférase de l’ADN qui semble être reliée à une certaine spécificité de séquence [107, 108]. Jusqu’à présent aucun rôle biologique n’a pu être attribué à Dnmt2 mais il semble que cette protéine ait une fonction plus spécifique que les autres Dnmt. T.Bestor spécule que Dnmt2 a un rôle dans la fonction

des centromères car des homologues de Dnmt2 sont retrouvés uniquement chez les espèces possédant une fonction et une structure des centromères semblables [98].

e. Le groupe Dnmt3

Au cours de notre thèse, nous nous sommes surtout focalisés sur la classe Dnmt3 qui est composée de trois membres Dnmt3a, Dnmt3b et Dnmt3L (Figure 13).

- Les membres de cette classe

Seuls Dnmt3a et Dnmt3b sont enzymatiquement actifs et ils sont classiquement appelés les méthyltransférases de novo car ils méthylent in vitro aussi bien l’ADN nu que l’ADN hémi-méthylé [82]. Dnmt3a et Dnmt3b sont fortement exprimés dans les cellules ES, les embryons précoces et les cellules germinales en développement ; par contre, leur expression est quasi absente dans les cellules somatiques différenciées [109]. Deux isoformes de Dnmt3a et six isoformes de Dnmt3b ont été identifiées. Les propriétés biochimiques et les fonctions biologiques des différentes isoformes sont peu connues [110].

Pour Dnmt3a par exemple, les deux isoformes se font à partir de promoteurs différents et elles se distinguent par une distribution subnucléaire différente, Dnmt3a1 est localisée au niveau de l’hétérochromatine tandis que Dnmt3a2 a une localisation nucléaire plus diffuse [110].

Une invalidation des gènes Dnmt3a ou Dnmt3b dans des cellules ES n’engendre pas de phénotype spécifique. En revanche, quand les deux Dnmt sont inactivés simultanément, il y a absence d’une méthylation de novo des séquences rétrovirales intégrées au génome et une perte progressive de la méthylation globale de l’ADN, ce qui permet de suggérer que Dnmt3a et Dnmt3b ont non seulement un rôle dans la méthylation de novo mais également dans le maintien des profils de méthylation du génome [82, 111].

Lorsque Dnmt3a ou Dnmt3b sont invalidés chez la souris, celles-ci ne sont pas viables ; les souris Dnmt3a-/- meurent 4 semaines après la naissance tandis que les souris

Dnmt3b-/- meurent in utero au jour embryonnaire 9,5 au moment où la gastrulation se met en place [82]. L’utilisation de souris ayant une invalidation conditionnelle dans les cellules germinales de Dnmt3a a permis de montrer que Dnmt3a joue un rôle essentiel dans l’établissement de l’empreinte génétique aussi bien maternelle que paternelle [112]. En effet, le phénotype obtenu par cette invalidation conditionnelle est similaire à celui obtenu par une invalidation constitutive du gène Dnmt3L qui conduit à une absence d’empreinte maternelle [113].

Dnmt3b semble être responsable, au moins en partie, de la méthylation des régions péricentromériques satellites mineures [114]. Des mutations dans le gène Dnmt3b sont les caractéristiques génétiques des patients atteints du syndrome ICF, dont nous allons reparler dans le point I.4.7.b.

Dnmt3L est dépourvue d’une grande partie de son domaine catalytique et n’est ainsi plus capable de méthyler l’ADN [115]. Dnmt3L, par contre, semble influencer de façon indirecte la méthylation de l’ADN. En effet, comme déjà évoqué précédemment, l’invalidation du gène Dnmt3L chez la souris conduit à une absence de l’empreinte maternelle chez les femelles homozygotes portant des embryons hétérozygotes et se traduit chez les mâles par une stérilité et une absence de progéniture [116]. Récemment, il a été montré que Dnmt3L joue également un rôle dans l’empreinte paternelle et plus précisément au moment de la naissance des souriceaux mâles quand il y a méthylation de novo des séquences répétées isolées dans les cellules germinales mâles [117]. Dnmt3L influence la méthylation de l’ADN dans le cadre de l’établissement de l’empreinte génétique, notamment en augmentant l’activité méthyltransférase de Dnmt3a et Dnmt3b avec lesquels il interagit directement [118].

- La structure de la classe Dnmt3

Les protéines Dnmt3a et Dnmt3b possèdent dans leur partie amino-terminale une région régulatrice composée de deux domaines hautement conservés : le domaine PwwP et le domaine PHD, tandis que Dnmt3L possède uniquement le domaine PHD (Figure 13).

Le domaine PwwP, comme son nom l’indique, est caractérisé par la séquence Pro- Trp-Trp-Pro. Il est constitué de 161 acides aminés et forme une structure de 5 feuillets β anti- parallèle suivis d’une hélice α [119]. Ce domaine est retrouvé dans une soixantaine d’autres protéines, toutes impliquées dans l’assemblage de la chromatine. Le rôle fonctionnel de ce domaine est encore peu connu. Le domaine PwwP seul lie l’ADN in vitro et permet à Dnmt3a et Dnmt3b d’être ciblés au niveau de la chromatine in vivo [120]. Même si le domaine PwwP ne présente pas de préférence pour une séquence spécifique de l’ADN, il contribue probablement à ce que les Dnmt aient accès à l’hétérochromatine.

Le domaine PHD pour Plant Homeodomain (homéodomaine), est également un motif retrouvé dans de nombreuses protéines nucléaires impliquées dans la régulation transcriptionnelle et le remodelage de la chromatine. Ce domaine est composé de 58 acides aminés riches en résidus cystéines et histidines. Ce domaine est surtout impliqué dans les interactions protéine-protéine. Ainsi, notre laboratoire a montré que des membres de la classe Dnmt3 interagissent via ce domaine avec des partenaires protéiques comme les HDAC et RP58 [38].

Dans la partie carboxy-terminale des protéines Dnmt3a, Dnmt3b et Dnmt1, est localisé le domaine catalytique qui fixe le substrat, catalyse et transfère un groupement méthyl sur certains résidus cystéines de l’ADN (I.4.5.a.).

- Les partenaires protéiques de la classe Dnmt3

Dnmt3a a certains partenaires protéiques en commun avec Dnmt1, comme par exemple HDAC1,2, Suv39H1, HP1 ainsi que le facteur de transcription PML-RAR [38, 99, 104]. D’autre part, Dnmt3a peut également interagir avec le répresseur transcriptionnel séquence-spécifique RP58, qui est lié à l’hétérochromatine [38]. Dnmt3b est décrit pour interagir avec HDAC1, le co-répresseur Sin3a, l’enzyme de remodelage de la chromatine hSNF2H, une ligase SUMO ainsi que plusieurs protéines contenues dans des complexes de condensation de la chromatine [121, 122]. Dnmt3a et Dnmt3b, d’autre part, interagissent avec les autres méthyltransférases Dnmt1 et Dnmt3L [118, 123].

Les rôles des différents partenaires protéiques dans les mécanismes de méthylation de l’ADN sont illustrés dans le point I.4.8.

1.4.3. Les protéines liant les cytosines méthylés (MBD)

La méthylation de l’ADN implique non seulement les enzymes qui catalysent l’ajout du groupement méthyl à l’ADN, les Dnmt, mais aussi les protéines qui lient spécifiquement les dinucléotides CpG méthylés, les MBD (Methyl-Binding-Domain Proteins). Les MBD sont des répresseurs transcriptionnels qui recrutent d’autres facteurs et complexes répresseurs au niveau des sites CpG symétriquement méthylés et participent ainsi à l’inhibition de la transcription induite par la méthylation de l’ADN [124, 125]. La famille MBD comprend cinq membres : MeCP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4 (Figure 14). Tous les membres de la famille MBD, via leur domaine conservé MBD, peuvent fixer les dinucléotides CpG méthylés à l’exception de MBD3 [124].

Kaiso n’est pas un membre de la famille MBD mais il lie les sites CpG méthylés via un domaine en doigt de zinc. Kaiso a été identifié comme partenaire de la caténine p120 qui intervient dans les jonctions cellulaires et qui est fréquemment altéré dans les cancers [126].

Kaiso est également retrouvé dans le complexe de désacétylases d’histones NCoR [127].

MeCP2, MBD1, MBD2 et MBD3 sont des répresseurs transcriptionnels dépendants des sites CpG méthylés. En revanche, MBD4 est une glycosylase de thymidine qui intervient dans la réparation des échanges spontanés de CpG méthylés en TpG et permet ainsi de maintenir les motifs CpG dans le génome [128]. MBD2 et MBD3 font partie intégrale du complexe de remodelage de la chromatine Mi2/NuRD (Figure 4) [129, 130]. MBD2/MBD3 ainsi que MeCP2 sont également décrits comme interagissant avec Dnmt1, probablement dans le cadre de la méthylation de maintien, au cours de la réplication à partir de brins d’ADN hémi-méthylés [101, 131].

MeCP2 est le membre fondateur de la famille MBD, décrit il y a plus d’une dizaine d’année par l’équipe de A. Bird [132]. Le gène MeCP2 est muté dans 80% des patients

atteints du syndrome de Rett (1.4.7.a.). MeCP2, comme d’ailleurs tous les MBD à l’exception de MBD4, réprime la transcription en recrutant un complexe contenant des HDAC [133]. Le fait que des inhibiteurs des HDAC ne permettent pas de lever entièrement la répression transcriptionnelle induite par MeCP2 indique qu’il y a d’autres mécanismes de répression par lesquels MeCP2 réprime la transcription. Récemment, il a été décrit que MeCP2 recrute au niveau du gène cible H19 (un gène d’empreinte) une activité HKMT en H3-K9 et que cette méthylation en H3-K9 contribue à la répression génique induite par MeCP2 [134]. Le lien entre MeCP2 et la méthylation d’histones est également souligné par l’étude d’un autre gène cible de MeCP2, bdnf (brain derived neurotrophic factor). Lorsque MeCP2 est phosphorylé ou muté et qu’il ne peut plus se fixer sur le gène bdnf, il y a une déméthylation locale des histones et une légère augmentation du taux d’expression du gène bdnf [135, 136]. Une situation similaire est observée chez Xenopus laevis où la transcription du gène xHairy2a est anormalement accrue en absence de MeCP2 [137]. Xhairy2a est, comme bdnf, un gène exprimé dans le cerveau et sa suppression conduit à des défauts neuronaux sévères (I.4.7.a.). MeCP2 est aussi décrit comme interagissant avec d’autres co-répresseurs comme Co-REST et c-SKI mais il n’est pas clair comment ces partenaires participent à la répression transcriptionnelle induite par MeCP2 [138, 139]. Co-REST semble servir de plateforme pour recruter au niveau de gènes cibles REST/NRSE d’autres protéines, comme Suv39H1 et HP1, qui permettent de maintenir et de propager l’état silencieux de la chromatine [138].

MeCP2 peut également réprimer la transcription dans un contexte indépendant de son domaine MBD et des sites CpG méthylés. En effet, in vitro MeCP2 est capable d’assembler la chromatine dans de nouvelles structures secondaires conduisant ainsi à une compaction de la chromatine et donc aussi à une inaccessibilité de l’ADN [140].

MBD1, un autre membre de la famille, peut lui aussi réprimer la transcription via des mécanismes dépendants et indépendants des HDAC [141]. Ainsi il a été décrit comme interagissant directement non seulement avec des HDAC mais également avec la HKMT Suv39H1 et la protéine de l’hétérochromatine, HP1α. Dans le cadre de cette interaction Suv39H1 augmente la capacité de répression de MBD1 [142].