APPORT DE LA BIOLOGIE MOLÉCULAIRE DANS LA SURVEILLANCE DU RISQUE DE LEGIONELLOSE DANS LES HÔTELS ET INDUSTRIE À ABIDJAN.
COULIBALY-KALPY JULIEN1*; MONEMO PACÔME2; KOFFI KOUADIO STÉPHANE1; SYLLA ABOUBACAR3, EHUIÉ PIERRE1, KISSIÉDOU EUGÈNE1, KACOU-N’GAZOA SOLANGE3; KOFFI-
AKOUA CHANTAL2; DOSSO MIREILLE1,3 RÉSUMÉ
1- Unité de Chimie et Microbiologie Environnementale / Institut Pasteur de Côte d’Ivoire, 01 BP 490 Abidjan 01 2- Université Alassane Ouattara / Centre Hospitalo-Universitaire de Bouaké, BP V 18 01, Côte d’Ivoire, Bouaké 3- Plateforme de Biologie Moléculaire / Institut Pasteur de Côte d’Ivoire, 01 BP 490 Abidjan 01
En Afrique, 33,52% des pneumopathies commu- nautaires restent sans diagnostic étiologique et la Légionellose y est peu connue. Cette pathologie causée par les Légionnelles est pourtant responsable de 15%
des hospitalisations dues aux pneumopathies com- munautaires en occident avec un taux de létalité de l’ordre de 25 à 40%. Ce travail a été conduit dans le but de d’étudier la contamination des systèmes d’eaux chaudes et froide de certaines hôtels et industries d’Abidjan par Legionella en vue de mettre en évidence un risque éventuel pour les populations.
Des échantillons d’eau ont été prélevés dans 4 hôtels et une centrale électrique de la ville d’Abidjan, et la présence de Legionella sp. a été recherchée par méthode moléculaire. La température de l’eau a aussi été relevée.
La présence de Legionella sp. a été mise en évidence dans 18% des échantillons. Les tours aérorefrigérantes et les eaux de refroidissement étaient contaminées de manière significative par la bactérie. Il n’a pas été noté de différence entre la présence de la bactérie dans les eaux dites froides ou chaudes et la température, pre- mière arme de lutte contre ce microorganisme n’était pas respecté. 40,5% des eaux dites froides avaient une température permettant la prolifération des Legionella et certaines piscines étaient contaminées.
A Abidjan, le risque de Légionellose existe donc de par la présence de la bactérie dans les établissements recevant du public comme les hôtels et industries. Il est impérieux de mettre à jour les niveaux de températures requis pour essayer de le prévenir.
Mots clefs : LegioneLLa, TempéraTure, risque, pneu-
mopaThie, CôTed’ivoire
INTRODUCTION La légionellose est une pneumopathie
bactérienne peu connu dans les pays en développement. Elle est provoquée par les bactéries du genre Legionella. Cette maladie a un taux de létalité de 25 à 40% et est res- ponsable de 15% des hospitalisations dues aux pneumopathies communautaires en occident [6].
Legionella est une bactérie Gram-négative ubiquitaire que l’on trouve dans les eaux douces et dans l’environnement. [10 ; 11]. Leur capacité à coloniser et à prospérer dans les systèmes d’eau artificiels, tels que les unités de conditionnement d’air, tours aéroréfri- gerantes, bains à remous, et des systèmes d’eau potable crée un danger potentiel pour la santé humaine. [6].
Il existe à ce jour environ 50 espèces dans le genre Legionella dont 18 impliqués en pa- thologie humaine. Le diagnostic étiologique de cette affection est basé sur la culture dont la durée (10 à 15 jours en moyenne) est un facteur limitant. En effet, seule Legionella Pneumophila serogroupe 1 dispose d’un test rapide et la rapidité de traitement condi- tionne le pronostic. La transmission de la bactérie se fait par inhalation d’aérosols contaminés provenant tours aéroréfrigé- rantes ou de systèmes de climatisation des hôtels et des industries [16 ;21]. La Legionellose est souvent associée aux séjours dans des hôtels [24] et la surveillance des eaux poten- tiellement contaminées par Legionella est essentielle pour prévenir la maladie [8].
En Côte d’Ivoire, les Pneumopathies communautaires constituent la deuxième cause d’hospitalisation. De façon générale, les germes responsables sont très variés avec une prédominance du Pneumocoque
[18]. Cependant, selon Zé et al, [32], 33,52%
des pneumopathies communautaires restent sans diagnostic étiologique en Afrique prin- cipalement pour des limites techniques [18]. Elles sont en augmentation régulière depuis l’avènement de l’infection par le VIH et en pratique courante, la difficulté majeure pour le clinicien réside dans le choix d’une attitude thérapeutique cohérente en l’absence de toute orientation bactériologique, d’où les antibio- thérapies probabilistes [18]. Avec une incidence de 33% et un taux de létalité de 27%, elles demeurent graves et meurtrières [1].
La mise en évidence de Legionella sp. dans les eaux hospitalières Abidjan [17] et l’échec des traitements à base de bêta-lactamine dans 50% des cas [18] ravive les inquiétudes face à une possible circulation des bactéries du genre Legionella dans les Pneumopathies bactériennes communautaires. Legionella sp. est en effet naturellement résistant aux bêta-lactamines qui sont majoritairement prescrits en première intention devant une Pneumopathie communautaire supposée bactérienne [18].
Le but de cette étude était d’étudier la contamination des systèmes d’eaux chaudes et froides de certains hôtels et industries d’Abidjan en vue de mettre en évidence un risque éventuel pour les populations.
MATÉRIELS ET MÉTHODES 1- CADRE ET TYPE D’ÉTUDE
Il s’agit d’une étude transversale et des- criptive qui s’est déroulée d’aout 2015 à octobre 2015 à l’Institut Pasteur de Cote d’Ivoire (IPCI). Les échantillons ont été pré- levés dans 4 hôtels d’Abidjan et une centrale électrique.
2- MATÉRIEL BIOLOGIQUE
Il s’agissait d’échantillons d’eau prove- nant de circuits d’eau chaude et froide, des
tours aéro-réfrigérantes et des systèmes de climatisations.
3- MATÉRIELS ET SITES DE PRÉLÈVEMENT
Les prélèvements ont été effectués au niveau des points d’usage, à partir du pre- mier jet d’eau du réseau de distribution des hôtels d’Abidjan, des robinets de purge des ballons d’eaux chaudes, des réservoirs d’eau, de tours aéro-réfrigérantes, eau chaude de
robinet de cuisine, eau de réserve en surface, eau de piscine, eau de baignoire, eau de refroidissement, eau du ventilo-convecteur.
Au niveau de la centrale électrique, les eaux des circuits de refroidissement des turbines ont été aussi collectées au niveau de leur dispositif de purge.
4-MATÉRIELS D’ÉTUDE MOLÉCULAIRE Les amorces dans le tableau 1 et contrôle positif ont été utilisées pour l’amplification d’un fragment du gène codant pour l’ARNr 16S de Legionella sp. Le contrôle positif est constitué de l’ADN de Legionella Pneumophila fourni par le Centre National de Référence de Legionella de Lyon en France.
Tableau 1 : Amorces utilisées pour la détection de Legionella spp dans les extraits d’ADN provenant des échantillons d’eaux .
Gène Séquences
Taille produit
PCR
Références
Legio-F 5’AAGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’ 386pb Kacou et al, 2012 Leg-R 5’CCAACAGCTAGTTGACATCCG-3’ 386pb [17]
4-MÉTHODES
4.1-Echantillonage
♦ Les sites de prélèvements
Les sites ont été fixés selon les critères de stagnation des eaux dans le circuit des hôtels, d’usage et de production éventuelle d’aérosols et de vapeurs. Il en était de même pour les chambres les plus éloignées des sites de production d’eau chaude. Ainsi les sites fixes susceptibles d’être à risque ont été identifiés : il s’agissait d’eau chaude sanitaire (ECS) et froide des pommes douche, chauffe- eau, eau chaude de robinet de cuisine, eau de réserve en surface, eau de piscine, eau de baignoire, eau de refroidissement, eau du ventilo-convecteur, eau de bâche.
♦ Conditionnement des prélève- ments
Les prélèvements étaient effectués d’un site à l’autre. La température a été mesurée in situ au lieu du prélèvement. Les échantil- lons ont été conservés entre 6° et 8°C puis acheminés au laboratoire de microbiologie de l’environnement de l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire (IPCI) pour l’analyse.
Condition de prélèvement.
Une quantité d’un (01) litre d’eau était prélevé dans des bouteilles en verre de même capacité contenant du Thiosulfate de Sodium
pour atteindre une concentration de 5%
♦ Filtration et concentration des échantillons d’eaux
Les échantillons sont filtrés sur des membranes en polycarbonates de 47 millimètres de diamètres et 0,45 µm de porosités(Sartorius AG-37075 Goettingen, Germany). Les filtres sont mis en suspension dans des flacons en verre de 10 ml stériles contenant 5ml d’échantillon initial d’eau.
Les flacons sont passés ensuite au sonica- teur (bain à ultrasons) pendant 5 minutes à 50 kHz afin de décrocher les bactéries de la membrane.
4.2-Etude moléculaire
♦ Extraction génomique de l’ADN bactérien
Elle a été réalisée à l’aide du Kit d’extrac- tion Nuclisens (Biomerieux, Boxtel, NL) selon les instructions du fabricant. Brièvement 500 µl du filtrat de l’échantillon prélèvéont été préparés et ajouté à 1 ml de tampon de lyse puis incubés 10 minutes à Température ambiante. Ensuite 40 µl de solution de silice ont été rajouté au mélange précédemment cité et incubés à température ambiante durant 10 minutes. La solution a été alors centrifugée pendant 30 secondes à 13000 tours/minute à T° ambiante. Le culot a été
recueilli, lavé et séché. Enfin une élution de l’ADN a été obtenu par l’ajout de 60 µl de tam- pon d’élution suivie d’une incubation (bain- marie Bioblock scientific) à 56° C pendant 10 minutes et une centrifugation (Centrifugeuse ALC 4237R) d’une minute à 13000 tours/
minutes a permis de récupérer le surnageant contenant l’ADN total et conservé à -20°C.
♦ Détection moléculaire par amplifi- cation génique
La détection de Legionella spp. dans les extraits d’ADN provenant des échantillons d’eaux a été faite selon le protocole de Joly et al. [15]. Elle est Basée sur la séquence de l’ARNr 16s spécifique du genre Legionella. La réaction a été faite dans un volume de 50 µl contenant : 1,5 µl de chacune des amorces spécifiques, 2 µl de dNTPs à 10 millimolaire (mM) , 2,5 µl de MgCl2 à 25 mM, 10 µl de tampon 10X, 0,4 µl de Taq Polymérase 5U/ul (Promega, Allemagne) et 5 µl d’ADN. L’ampli- fication a été faite dans un thermocycler de type Perkin Elmer 9700 (Appied Biosystems, USA). Les conditions d’amplification sont
programmées dans le thermocycleur et se déroulent comme suit ont été les suivantes:
d’abord une dénaturation initiale de 5 mn à 94°C suivit d’une phase cyclique répétée 30 fois comprenant une étape de dénaturation 30 secondes à 94°C, une étape d’hybridation (fixation des amorces) de 45 secondes à 60°C et une étape d’élongation de 1 minute à 72°C.
La réaction d’amplification est terminée par une phase d’élongation finale de 10 minutes à 72 °C.
L’électrophorèse des fragments d’ADN a été réalisée sur gel d’Agarose à 1,5% conte- nant 0,5µg/mL de bromure d’Ethidium. La migration a été faite à 135V pendant 30 minutes.
Les fragments d’ADN ont été observés sous un transilluminateur UV (Biorad).
Les photos des gels ont été réalisées avec un appareil photo (Nikon 9100).
4.3- Analyse statistique
Le test statistique Exact de Fischer a per- mis de calculé une p-value (p) avec un seuil de significavité fixée 5% (α = 0,05).
RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 1- RÉSULTATS
Un total de 51 échantillons d’eau ont été prélevés dans quatre hôtels et une centrale électrique. Il a été prélevé 11 échantillons soit 22% dans la centrale électrique contre
40 (78%) dans les hôtels. Les échantillons ont varié de 9 à 11 échantillons suivant les hôtels. La prévalence des échantillons contaminés par Legionella sp était de 18%
(Figure 1 et 2)
Figure 1: Proportion des échantillons contaminés par Legionella sp.
Figure 2 : Détection de Legionella sp dans les échantillons d’eaux par amplification génique (M : marqueur de masse moleculaire ; CP : Contrôle positif ; 60 : Code échantillon ; 60-1 : Dilution au 10ème de l’échantillon 60 ; CN : Contrôle Négatif)
Contaminations suivant l’origine de l’échantillon.
Les échantillons ont été en majorité récoltés dans les Hôtels. La prévalence de la contamination par Legionella y était plus éle- vée également (Tableau 2) mais la différence n’était pas significative. (p=0,28).
Tableau 2 : Distribution des Echantillons contami- nés entre les Hôtels et les centrales Electriques
Nombre d’échantillons
Echantillons Positifs
n % n %
Centrale
électrique 11 22 3 33
Hôtels 40 78 6 67
Total 51 100 9 100
Les échantillons analysés étaient domi- nés par les prélèvements provenant des chambres d’Hôtels avec 33% suivi par les ballons d’eau chaude, les réservoirs et les tours aéroréfrigerantes avec respectivement 16%, 14 et 14 %. Plus de la moitié des échan- tillons contaminés (56%) par Legionella était issue de tour aérorefrigerantes. Après les tours aéro-réfrigerantes, les eaux de Piscines étaient les plus contaminées avec 22% puis les eaux des réservoirs et des chambres d’Hôtels avec 11% chacun. La contamination
des tours aéroréfrigerantes par Legionella était statistiquement significatifs (p=0,0287) (Figure 3).
Figure 3: Proportions des Echantillons contami- nés par Legionella sp suivant l’origine
Contamination selon le type d’eau (Température)
La contamination des eaux de refroidis- sement était statistiquement significative (p=0,01) contrairement à celle des eaux dites froides et chaudes. (p=1). (Tableau 3)
Tableau 3 : Répartition des échantillons conta- minés par Legionella sp selon le type
Type eau
Echantillons Positifs N (%)
Nombre d’échantillons P
Eau chaude 3 (11) 28 p=1
Eau de
refroidissement 3 (100) 3 p=0,01
Eau froide 3 (15) 20 p=1
TOTAL 9 (18) 51
Suivant la température, tous les échan- tillons analysés avaient une température inférieure à 60°C (Tableau 4). Dans le réseau d’eau chaude, 21% des échantillons avaient des températures inférieures à 20°C et 85%
des échantillons du réseau d’eau froide avaient des températures supérieures à 20°C dont 10%
au-dessus des 40°C. Il n’y a pas été observé de différences statistiques entre les classes de température et la contamination (p=1). Environ 90% des échantillons contaminés par Legio- nella ont des températures comprises entre 20 et 60°C. Le circuit d’eau froide a produit 40,5%
de l’ensemble des échantillons concerné par cette plage de température
Tableau 4 : Distribution des échantillons positifs par classe de températures Température Eau chaude Eau de refroidissement Eau froide TOTAL
N EP N EP N EP N EP
T°C<20 6 1 0 0 3 0 9 1
20<T°C<40 6 0 3 3 15 2 24 5
40<T°C<60 16 2 0 0 2 1 18 3
T°C>60 0 0 0 0 0 0 0 0
28 3 3 3 20 3 51 9
N= Nombre d’échantillon ; EP= Echantillon positif
Figure 4 : Proportion des échantillons contaminés suivant la plage de température.
2- DISCUSSION
Au niveau de la surveillance micro- biologique
Les légionelles colonisent de façon ubi- quitaire de très nombreux milieux naturels aquatiques et vont progresser vers des sites hydriques artificiels comportant des installa- tions qui favorisent la multiplication et leurs dispersions sous formes d’aérosols [13]. Dans notre série de 51 échantillons prélevés, 22%
provenaient de centrale électrique et 78%
des hôtels.
Les prélèvements provenaient des chambres d’Hôtels avec 33% suivi par les ballons d’eau chaude, les réservoirs et les tours aéroréfrigerantes avec respectivement 16%, 14 et 14 %. Les eaux de piscine repré- sentaient 10%. Les points d’échantillonnage étaient similaires de ceux des travaux de Jalila et al. , qui a mené une investiga- tion environnementale sur un effectif de 40 échantillons d’eaux chaudes sanitaires au Maroc [14]. De l’enquête épidémiologique conduite par Jalila et al. il est ressortit la présence de deux cas cliniques confirmés de légionellose incitant les autorités sur l’impé- rieuse nécessité de la surveillance pour la prévention de la légionellose.
L’étude moléculaire des circuits d’eau chaude et froide d’Abidjan a permis la détection d’une éventuelle niche écologique de légionelles qui pourrait être à l’origine de cas sporadique de légionellose comme décrite dans la plupart des investigations environnementales de cas de légionelloses
[12 ;27]. Cette étude se présente comme une
approche qualitative pour identifier une contamination environnementale et mettre en lumière des risques éventuels de conta- mination humaine.
Au plan épidémiologique
En zone tropicale d’importantes données font mention de l’existence de Legionella spp et d’une augmentation du taux de préva- lence des pneumopathies chez les malades hospitalisés [5 ;23]. La prévalence des pneu- mopathies est certainement sous-estimée.
En effet Monzer et al au Liban a rapporté 1,4%, Von Baum et al. en Allemagne (3,7%)
[23 ;28 ;30] contre 84 à 90% des cas déclarés en
France [3]. Des enquêtes épidémiologiques revendiquent la place prépondérante de l’environnement hydrique dans les pays où sont survenus des épidémies de légionellose
[4 ;9]. Le Taux de légionelles dans un réseau
d’eau chaude sert d’indicateur de qualité de l’eau [26]. Cette étude a mis en évidence une fréquence de détection moléculaire de Legio- nella spp de l’ordre de 18% dans les eaux analysées à Abidjan. Ces résultats étaient inférieurs à ceux d’Ialta et al., qui a obtenu une fréquence de 36,4%. Cette différence pourrait s’expliquer par le nombre d’échan- tillon analysé car cet auteur a travaillé sur plus de 1000 échantillons. Cette différence est toutefois à relativiser car selon l’auteur les taux de positivité variaient durant les 4 années de surveillance du réseau de distri- bution d’eau dans un hôpital de 1400 lits situé au sud de l’Italie (27,8% en 2008, 14,1%
en 2009, 16,4% en 2010 et 41,7% en 2011.
Toutefois, le nombre d’échantillons positifs de notre étude est en progression par rapport à une étude antérieure dans les hôpitaux d’Abidjan. [17]. Il y avait été obtenu 1,3% de taux de positivité corroborant l’observation de Ialta et al sur la variation de la détection de légionnelle dans l’environnement suivant le temps et l’espace.
Cependant, au niveau régional et dans les hôtels, notre résultat est proche de ceux du Cameroun (26,2%) et du Sénégal (14,5%) comme décrit par Wouafo et al en 2011 [29].
Parmi les échantillons contaminés 33%
provenaient de la centrale électrique et 67%
des hôtels. La contamination des industries est proche des 35% observé par Li et al. en Chine[21].
Au niveau du risque de propaga- tion des légionelles
Parmi les échantillons d’eaux contaminés, 56% étaient des eaux des tours aéroréfrige- rantes (TAR), 22% des eaux de piscine et 11%
pour les réservoirs d’eau et les chambres.
Dans notre étude, la contamination des tours aéro-réfrigérantes par Legionella était statistiquement significatifs (p=0,0287).
Ceci conforte les travaux de Delmas qui ont démontrés que les TAR (Tours aéroréfrige-
rantes), de par leur mode de fonctionnement et leurs caractéristiques physicochimiques sont générateurs de pollution par L. pneu- mophila [7]. De plus dans cette étude, les eaux de refroidissement étaient statistique- ment plus contaminées que les autres eaux.
(p=0,01). Bien que non significative, le niveau de contamination des eaux des chambres et piscines des hôtels est assez important.
Aussi, existe-il un risque évident pour les personnels et la clientèle de ces établisse- ments. En effet, la première épidémie (1976) ayant entrainé le décès de 34 participants de l’American Légion réunis à Philadelphie a permis d’identifier le système de climatisa- tion comme étant une source de contamina- tion indéniable à Legionella après un séjour hôtelier. Depuis cette date, les résultats de nombreuses études ont Corroborés avec ceux de notre étude [2 ;19 ;24 ;26].
Cette étude a montré une variation des températures dans les limites de développe- ment de Legionella. En effet, la température moyenne de cette étude était de 33,2±12,3°C avec un minimum à 11,8°C et un maximum à 56,6°C. Selon Yee [31], Legionella était capable de persister à des températures allant de de 4 à 60°C avec un optimum de développement à 37°C [17] quand 47% des échantillons analysés avaient une tempéra- ture comprise entre 20 et 40°C. Il est donc à constater que toutes les températures obser- vées étaient insuffisantes à la destruction de Legionella. Ces températures pourraient être idéales pour la multiplication des bac- téries dans plus de moitié des cas [29]. Et à défaut de les détruire, pouvaient les main- tenir dans le circuit de distribution et de ce
fait constituer un risque pour la population.
Cette observation est confortée par celle de Wouafo et al. [29], qui faisait état de ce que le système de distribution d’eaux des éta- blissements publics constitue une source potentielle de contamination [19]. Aussi semble exister la menace dans les systèmes de distribution d’eaux à Abidjan comme l’atteste ces résultats car les températures, premiers moyens de lutte contre légionnelle ne sont pas maitrisés et donc inefficace.
En outre, les eaux supposées froides de même que les piscines étaient pour la plupart des eaux chaudes avec des températures au-dessus des 25°C suivant la directive européenne sur la qualité des eaux. Il n’y avait pas de différence statistique entre la contamination de ces différents types d’eau par Legionella (p=1). La présence de Legio- nella dans ces eaux était constatée dans 2 échantillons d’eaux de piscine soit un taux de positivité de 22%. Malgré la désinfection de l’eau par du chlore, la détection de Legionella a été possible dans les piscines des hôtels. En 2001, Leoni et al confirme le risque encouru lorsque ces piscines sont mals entretenues avec de faible concentration de chlore favo- risant ainsi dans ces piscines à ciel ouvert constamment réchauffées par le soleil, le développement des légionelles [20].
Ce travail renfermait une limite certaine.
La PCR conventionnelle ne fait pas la diffé- rence entre les Legionella viables et les non viables, mais la combinaison entre la surveil- lance moléculaire et la culture pourrait être un protocole de surveillance efficace et pra- tique. Cela permettrait en effet selon Miyamoto et al., de prévenir les risques d’infections et de dissémination précocement [22].
CONCLUSION A Abidjan, le risque de contracter une
Legionellose existe de par la présence de la bactérie dans les établissements recevant du public comme les Hôtels et les industries. Il
est impérieux de mettre à niveau les niveaux de températures requis pour essayer de le prévenir.
REMERCIEMENTS Les auteurs voudraient remercier la Direc-
tion de l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire, les responsables des hôtels et centrale électrique
ainsi que toutes les personnes qui ont permis la réalisation de ce travail.
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