Mon expérience personnelle en microbiologie : Les impératifs de base pour l’exécution d’un test réussi.
• L’importance « d’isoler » un virus lors des tests d’identification de la bactérie ou du virus recherché.
Nous d’identifions une bactérie ou un virus pour « guider » le médecin dans son diagnostic et les traitements qui en découleront.
Pour identifier une bactérie ou un virus, il impératif d’isoler la bactérie ou le virus des autres éléments qui se trouvent dans tous spécimens biologiques. Il faut séparer le virus des autres cellules, bactéries ou champignons. « Isoler = colonie pure»
Une bactérie est considérée comme un être vivant. Un virus n’est pas considéré comme étant un être vivant. On ne peut pas TUER un virus, ce n’est pas vivant! Ils n’ont aucune fonction de la vie. Il ne se divise pas par lui-même, ne produit pas d’énergie, etc.. Un virus se multiplie à l’intérieur des cellules et est ensuite excrété à l’extérieur de la cellule.. Ils sont juste un sac de protéines avec du matériel génétique à l’intérieur. On ne peut pas le tuer.
Comment identifier une bactérie :
Mon expérience directe en microbiologie pendant 10 ans.
Je vous fais un portrait rapide de comment on identifie une bactérie, ce qui aidera ensuite à mieux comprendre avec un virus.
L'isolement est une technique qui permet de séparer les bactéries d'un échantillon. L'isolement permet d'obtenir des colonies différentes, espacées les unes des autres.
Pour aller plus loin : Voir cette vidéo de 4 minutes.
L’objectif d’isoler une bactérie est de créer des colonies PURES d’une même bactérie afin que par la suite, nous puissions exécuter plusieurs tests pour fin d’identification. Si la colonie est IMPURE, tous les tests pour fin d’identification seront faussés, souvent on n’arrive à rien, au pire on donne une mauvaise identification, et cela peut être grave pour le patient. Les traitements découlent du type de bactéries.
L’une des techniques courantes pour isoler une bactérie est l’ensemencement par épuisement L'ensemencement par épuisement a pour objectif d'isoler des bactéries et d'obtenir des colonies bactériennes distinctes. Une colonie, en principe, est un amas de bactéries visibles à l'œil nu, constitué de milliards de microorganismes tous issus d'une seule cellule bactérienne.
L'ensemencement par épuisement permet de séparer des bactéries d'une ou de plusieurs espèces. La forme, la couleur et la texture des colonies sont des caractéristiques des espèces bactériennes que nous pouvons étudier après avoir utilisé cette technique.
Comme vous le voyez sur la photo ci-haut, les bactéries croissent sur un milieu de culture. (c’est un gel avec éléments nutritifs que l’on nomme gélose : la plus utilisée est la gélose sang)
Pour identifier une bactérie : On travaille avec des colonies pures.
On identifie une bactérie par la coloration de Gram ou le test de coloration de Ziehl-Neelsen. On étudie le comportement et l'apparence des bactéries.
On interprète tous les résultats
L'identification des bactéries est une tâche complexe. L'une des raisons est que, selon des estimations, il y a entre 10 000 et un milliard d'espèces bactériennes dans le monde!
Identifier correctement les bactéries est très important, en particulier dans le domaine
médical, où le traitement adéquat d'une maladie dépend en grande partie du type de microbe qui est à l'origine du problème. Dans la plupart des cas, l'identification est faite sur la base de l'élimination. Pour identifier une bactérie, vous devez effectuer des tests de coloration, analyser son apparition et observer comment elle réagit bien à des conditions différentes.
Qu’est-ce qu’un virus?
C’est en 1953 qu’André LWOFF a énoncé les trois caractères fondamentaux faisant des virus des entités originales :
1- les virus ne contiennent qu’un seul type d’acide nucléique (ADN ou ARN) qui constitue le génome viral.
2-les virus se reproduisent à partir de leur matériel génétique et par réplication. Ils ne peuvent se reproduire qu’au sein de cellules vivantes ; ne possédant aucun système d’énergie, ils détournent la machinerie cellulaire à leur profit pour se répliquer et assurer leur pérennité. Ils constituent en quelque sorte des structures extrêmement simples dont l’ensemble des éléments protège quelques petits bouts de code génétique ayant pour objectifs de s’infiltrer dans une cellule pour la parasiter, puis la détruire.
3-les virus sont doués de parasitisme intracellulaire absolu.
Contrairement aux bactéries, les virus ont besoin des cellules vivantes pour croître. Aucun virus ne peut pousser sur une gélose.
Il est capital de se souvenir de ce fait, car c’est de là que vient toute la complexité d’isoler (séparer) un virus de sa cellule « hôte ».
Afin de mieux comprendre comment on identifie un virus, voici un minimum d’information sur la structure d’un virus.
1. Le génome : Un virus comporte toujours un génome qui est de l’ADN ou de l’ARN, de sorte que dans la classification des virus, on distingue en premier lieu virus à ADN et
virus à ARN. Le génome est formé d’une séquence de nucléopeptide.
Types d'acide nucléique
Il existe deux types d’acides nucléiques : l'acide désoxyribonucléique (ADN) et l'acide ribonucléique (ARN) :
L’ADN est le support de l’information génétique. Il contient le génome, tout ce qui est nécessaire à la formation des protéines, mais ne peut sortir du noyau.
L'ARN joue plusieurs rôles: il peut être le messager qui copie l'information génétique de l'ADN, il peut aussi jouer un rôle catalytique, ce qui est lié à sa capacité à former des structures
complexes. Il est exporté du noyau par les pores nucléaires pour fournir l'information et permettre la synthèse des protéines par les ribosomes.
2. La capside : Le génome est emballé dans une structure protéique appelée capside, d'un mot grec, capsa, signifiant boîte. La capside protège le génome. Elle a une conformation
géométrique qui, selon les virus est, soit tubulaire, soit polyédrique. On appelle nucléocapside la structure compacte formée par l'assemblage de la capside autour du génome.
3. L'enveloppe ou péplos : D'un mot grec signifiant manteau, c'est l'élément le plus externe de certains virus. La présence ou l'absence d'enveloppe règle en grande partie le mode de transmission des maladies. Ce terme évoque une structure souple et, de fait, le péplos est une membrane, dérivée des membranes cellulaires, cytoplasmique ou nucléaire, selon les virus.
Certains virus n'ont pas de péplos. Les poliovirus par exemple en sont dépourvus. Ce sont des virus "nus".
Le fait d'avoir un péplos rend le virus très fragile. Le péplos a, en effet, la fragilité des membranes cellulaires dont il dérive. C'est une membrane aussi fragile que n'importe quelle membrane biologique. Un virus, quel qu'il soit, pour être infectant doit être entier. Or, il y a deux sites où les virus à enveloppe vont dégrader rapidement leur enveloppe et du même coup perdre leur pouvoir infectieux : le milieu extérieur et le tube digestif. Dans ces mêmes endroits
les virus nus, sans péplos qui ont simplement un génome et une capside (capside icosaédrique), vont résister beaucoup plus longtemps.
Dans le milieu extérieur, les virus à péplos ne vont pas survivre longtemps car ils vont être inactivés par deux facteurs : la température, même la température ordinaire, et la dessiccation. Cela n'a rien de surprenant : les membranes cellulaires sont détruites dans le milieu extérieur et si les cellules bactériennes survivent très bien, c'est parce qu'elles protègent leur membrane cytoplasmique par une paroi. Si une cellule bactérienne se trouve sans paroi, la bactérie fragilisée meurt. Les virus à péplos sont aussi fragiles que des bactéries dont on aurait supprimé la paroi !
Qu’est-ce qu’un Exosome?
Les exosomes sont des vésicules de 30 à 90 nm, qui sont déversés par une cellule dans son environnement.
Formation
Ils peuvent être formés par tous les types cellulaires et notamment par les lymphocytes, les plaquettes, les mastocytes, les cellules dendritiques, les cellules souches, les astrocytes ou les cellules tumorales. Les exosomes contiennent différents constituants tels que des acides nucléiques et des protéines.
Rôles
Les exosomes servent de véhicule de transport et d'expulsion de composants cellulaires. Les exosomes assurent les mêmes fonctions que leur cellule parentale. En outre, ils servent à la communication cellulaire en transférant des ARN messagers et des microARN4 et peuvent par exemple jouer un rôle dans l'immunité cellulaire, comme pour le relargage de CMH II5.
Remarquer comment un exosome ressemble à un virus : -Contient des acides nucléiques
-peut se promener libre une fois exclus de la cellule.
Certains chercheurs (44 :38m) disent même qu’ils n’y a pas de différences.
Andrew Kaufman est arrivé à des conclusions similaires sur la non-existence du supposé COVID- 19. Docteur en médecine et en doctorat, Kaufman a étudié la similitude entre ce que l'on appelle COVID-19 et les exosomes, qui sont des particules de type virus libérées par des cellules
humaines normales, peut-être plus dans des conditions de stress. Pour en savoir plus sur les travaux du Dr Kaufman, consultez : https://www.andrewkaufmanmd.com
«Quelles preuves avez-vous que les virus pourraient en fait être des exosomes? (39 :48m) Les exosomes ont été découverts il y a environ 30 ans et c’est un domaine de recherche en pleine croissance. Ils sont de minuscules petites particules qui contiennent une membrane avec des protéines et aussi du matériel génétique à l’intérieur donc exactement la même description qu’un virus. Mais les exosomes viennent clairement de nos cellules. On pense même qu’ils participent à la communication afin qu’elles puissent apporter du matériel génétique à une cellule plus éloignée du corps. Il a été aussi démontré qu’ils peuvent consommer des matières toxiques et avoir un effet protecteur sur nos cellules. »
Recherche : La majorité des microARN détectables dans le sérum et la salive sont concentrés dans les exosomes.
PROCEDURE ET TECHNIQUE D’IDENTICATION du virus.
Il est impérieux d’isoler le virus pour 3 fonctions :
1- Comme une bactérie, il est IMPÉRATIF d’isoler le virus du spécimen afin que l’on puisse faire le test Rt-PCR.
2- Pour connaitre la séquence de nucléotides du covid : un IMPÉRATIF pour créer les
« amorces » ou les antigènes covid pour l’exécution des tests.
3- pour créer un « étalon-or » (un standard); (le coronavirus connu et isolé auparavant) un IMPÉRATIF pour valider le bon fonctionnement d’un test.
De toute technique, il est impérieux de purifier les particules virales des autres particules, on devrait pouvoir extraire de l’ARN, qui devrait correspondre à l’ARN du covid pour le test. Tant qu’on ne l’a pas fait, il est possible que l’ARN provienne d’une autre source : les cellules du patient, des bactéries, des champignons, etc. Dans ce cas, ces ARN pourraient être associés avec la maladie. Alors, un résultat positif ne sera pas une preuve que l’ARN provient d’un virus. Sans isolement ni caractérisation des particules virales, on ne peut accepter qu’un test d’ARN soit une preuve de la présence du virus.
Normalement, cela se fait en 4 étapes :
1- prélèvement, 2 filtration, 3 centrifugation et 4, microscope.
DR Andrew Kaufman VIDEO (35 min)
https://www.youtube.com/watch?time_continue=8&v=APaUEgfeAYE&feature=emb_logo
Il existe différentes procédures et techniques pour identifier un virus qui sont extrêmement différentes des bactéries.
1-indirect (par la présence d’anticorps) : deux façons :
Méthode quantitative fait par des appareils sophistiqués en laboratoire.
Ou test qualitatif fait sur cassette.
Le diagnostic indirect cherche à mettre en évidence des anticorps synthétisés en réaction à une infection virale. Ces anticorps sont les marqueurs indirects de l'infection. Comme pour toute infection, on distingue :
-les IgM : marqueurs d’une infection aiguë
-les IgG : marqueurs d'une infection passée (CEUX DÉTECTÉS DANS NOS HOPITAUX) La recherche d'anticorps permet donc de différencier, comme le montre l'image ci-dessous, une infection récente si des IgM sont présents d'une immunisation vis-à-vis d'une infection si des IgG sont présents.
La détection d’anticorps dans le liquide sanguin indique seulement qu’un individu a rencontré UN coronavirus, dont on sait que la famille est nombreuse, provoque chaque année des rhumes et des syndromes grippaux dit l’infectiologue Didier Raoult. De plus, le test sérologique ne permet pas de dater la rencontre avec le système immunitaire, lequel peut continuer à réagir à l’antigène viral pendant très longtemps. Donc, pour mesurer la circulation actuelle du covid, ce n’est pas la bonne méthode.
Test SÉROLOGIQUE - L'interprétation
Il faut noter qu’un résultat négatif de présence d’anticorps SARS-CoV-2 n’exclut pas une exposition actuelle ou antérieure au virus. Des résultats négatifs peuvent survenir si les
échantillons sont prélevés trop tôt à la suite d’une infection ou chez des patients immunodéprimés.
Un résultat positif pour la présence d’anticorps SARS-CoV-2 peut indiquer une exposition antérieure ou actuelle au SARS-CoV-2, mais il NE doit PAS servir à déterminer un état d’immunité ou d’infectiosité. On ne sait pas si la présence d’anticorps indique une immunité protectrice et pour combien de temps. Il faut interpréter les résultats dans le contexte du dossier clinique et des antécédents d’exposition.
Des résultats faux positifs peuvent survenir en raison d’une réaction croisée attribuable à une infection antérieure causée par d’autres coronavirus humains ou d’autres anticorps ou autres facteurs.
Selon un expert (vidéo 4min), le test sérologique devrait être utilisé pour fin d’enquêtes pour les études épidémiologiques pour aider le ministère à prévoir pour l’avenir.
Détection des anticorps (test sérologique)
-Les tests sérologiques utilisent un échantillon de sang pour y détecter la présence d’anticorps. - -L’organisme produit des anticorps après avoir été exposé au virus.
Un résultat positif à un test de dépistage sérologique signifie que vous avez été exposé au virus à un moment de votre vie, mais ne permet pas de déterminer à quand remonte cette exposition.
-Les tests sérologiques ne sont pas utilisés pour le diagnostic de la COVID-19 au cours des premiers stades d’infection puisqu’ils ne détectent pas le virus lui-même.
Les tests sérologiques aident à :
• estimer le nombre de personnes ayant contracté la COVID-19
• mieux comprendre dans quelle mesure le virus se propage dans la collectivité
• déterminer quelles mesures de santé publique doivent être mises en place
Et pourtant, on fait croire à la population que ces tests démontrent que nous avons été exposés spécifiquement COVID-19.
David Crowe, passe en revue ces recherches récentes sur les tests d'anticorps et montre qu'ils sont autant un gâchis que les tests RT-PCR pour l'infection, peut-être plus. Les données importantes nécessaires pour valider la signification des anticorps manquent, elles sont choisies au hasard parmi les patients plutôt que de suivre une personne, ou elles contredisent directement les dogmes sur le
fonctionnement des anticorps.
Une version écrite peut être trouvée ici:
http://theinfectiousmyth.com/coronavirus/AntibodyTestingForCOVID.pdf
Publié le 22 avril 2020
C’est le constat fait par un comité d’experts des Académies des sciences, d’ingénierie et de médecine aux États-Unis(Nouvelle fenêtre) qui soulignait, le 8 avril, le manque d’informations quant à l’efficacité des anticorps et à leur persistance dans le temps.
Les études sur le SRAS-CoV et le MERS-CoV, deux virus cousins du SRAS-CoV-2, fournissent des indices : les anticorps détectés sont présents pour des durées variant de 18 mois à 3 ans.
Mais la simple présence d’anticorps n’est pas un gage d’immunité. Encore faut-il qu’ils puissent neutraliser le virus, ce qui doit être confirmé par des tests en laboratoire.
Les tests sérologiques actuellement disponibles visent tout simplement à regarder si on a des anticorps dans le but d’éliminer le virus. La présence d’anticorps veut-elle dire que l’individu est immunisé? « Pas du tout, répond Nathalie Grandvaux. C’est ça la limite des tests. » Ces tests ne mesurent pas si ces anticorps qui sont présents dans le sang de la personne sont des anticorps neutralisants, soit des anticorps qui permettent d’éliminer le virus et de donner une immunité.
Pour ça, « il va falloir avoir d’autres tests, qui sont en cours de développement ».
En plus des anticorps, le corps humain a des cellules du système immunitaire qui sont là pour détruire le virus, c’est ce qu’on appelle l’immunité cellulaire. La chercheuse explique que des études récemment effectuées montrent que des patients développent une immunité cellulaire, mais cette immunité cellulaire n’est pas mesurée avec les tests sérologiques actuels. Selon elle, les tests sérologiques ont pour l’instant un grand intérêt au niveau de la recherche, « mais en termes de protection de la population, ça n’aide pas beaucoup ».
En entrevue à Mario Dumont, le scientifique a déploré que malgré le fait que tout était prêt pour commencer ces analyses, rien n’a été fait encore.
«On est pris dans un carcan administratif au Québec et on est très en retard sur ce qu’on devrait faire. Les tests sont disponibles, les machines sont disponibles, les tests ont été approuvés par Santé Canada. On aurait dû commencer il y a déjà plusieurs semaines. On avait déjà même dans certains hôpitaux l’équipement pour le faire, mais on a été mis dans un carcan administratif qui nous a empêchés d’avancer rapidement», détaille-t-il.
Ces tests ne permettent pas de faire des diagnostics, mais seulement de vérifier la présence d’anticorps. Ils ne constituent pas non plus un «passeport d’immunité».
David Mendels, docteur en physique. a
testé 11 tests sur 23 et UN seul est conforme au critère de sensibilité à 95% et de spécificité à 98 %. (en France)
Une personne sur 4 est mal diagnostiquée. Scientifiquement parlant, on est sur le cul! Il y a un scandale sanitaire car les gouvernements ont attesté les 10 tests rapides qui n’ont pas franchi les contrôles, bien au-dessous du 95%. On les a testés sur nous au bureau et on a tous eu des résultats positifs quand les autres fois nous étions « négatifs ». Le processus de sélection des tests est complètement opaque et ça me cause problème comme scientifique. On est plusieurs collègues à être stupéfaits.
2-direct :
A) Les méthodes de diagnostic direct par culture : Les virus sont des parasites obligatoires des cellules : ils sont cultivés dans des cellules eucaryotes entretenues au laboratoire, sous la forme de lignées dites continues ou semi-continues
Avantages : · Bonne sensibilité + + +. La culture demeure la référence à laquelle toutes les nouvelles méthodes sont comparées.
Limites : · Délai usuel d’obtention du résultat : 48 heures à 10 jours.
· Subjectivité de la lecture : expérience de l'observateur +++.
· La culture est pratiquée dans peu de laboratoires de ville.
· Certains virus ne sont pas cultivables en dehors de laboratoires de recherche très spécialisés.
B)Le diagnostic antigénique : Protéines virales :Il existe différentes méthodes qui permettent de détecter ou de caractériser dans génomes viraux.
Et les tests antigéniques?
Les tests antigéniques ne sont apparemment pas plus fiables. Dernièrement, on a vu dans le journal The Guardian du 26 avril 2020, le virologue Christian Drosten, initiateur de la politique de tests massifs en Allemagne (qu’il estime contaminée à 8%), déplorer le fait que les tests antigéniques ne sont pas fiables : « En Europe et aux Etats-Unis, tous présentent des faux positifs. »
Selon la revue Prescrire : « La mise en évidence d’anticorps dirigés contre ce virus repose surtout sur deux types de tests, dits sérologiques : des tests de diagnostic rapide et des tests de type Elisa (de l’anglais enzyme-linked immunosorbent assay). Les anticorps de type IgM et IgG
commencent à être détectables en général 7 jours après le début de l’infection. Les IgM restent détectables pendant 7 semaines. Mi-avril 2020, on ne sait pas pendant combien de temps les IgG restent détectables au-delà de 7 semaines ». Autrement dit, on ne sait peut-être pas encore bien détecter les IgG, qui nous renseignent à la fois sur votre réponse immunitaire et sur le fait qu’il s’agit d’une affection ancienne.
Enfin, autre raison d’invalider la pertinence de ces tests est la suivante : « Aucune étude n’a prouvé que l’immunité antivirale était dépendante des anticorps », explique Emma Kahn,
virologue, dans un excellent article publié sur le site de l’association de médecins Aimsib (Vaccin anti-Covid-19 et immunité de groupe, c’est non… et encore non, le 3 mai 2020).
« On peut craindre que les antigènes sélectionnés pour de futurs tests ELISA de sérologie (pour la sensibilité et la spécificité conférés à ces tests) soient obsolètes dans quelques semaines,
explique la virologue. Il en est de même pour les amorces utilisées dans la Rt-PCR pour la détection du matériel génétique du virus »…
B) Le diagnostic direct moléculaire
Pour simplifier, trois méthodes principales dominent la routine : l’hybridation moléculaire et ses variantes (hybridation avec amplification du signal ou bDNA, hybridation à la recherche de mutations du génome viral), l’amplification génique ou PCR, et le séquençage nucléotidique.
Avantages : Sensibilité remarquable, · Automatisation possible
Limites :
· Absence de preuves du caractère infectieux du virus détecté : La mise en évidence d'un génome viral dans un échantillon ne signifie pas que les particules virales infectieuses complètes soient présentes....
.La grande sensibilité de ces techniques les rend très sensibles aux contaminations par des acides nucléiques extérieurs à l'échantillon initial,
EN RESUMÉ
La présence du virus peut être détectée par l’amplification de son matériel génétique (diagnostic moléculaire) ou par la détection de protéines virales (diagnostic antigénique).
Pour le SARS-CoV-2, le diagnostic est généralement confirmé par la détection de son ARN viral (RT-PCR) à partir de prélèvements nasopharyngés.
L’utilité des tests sérologiques. On y cherche dans ce cas les igG et les igM.
Principe de la PCR :
Comprendre la RT-PCR, Le test PCR. Le test du COVID-19 est fondé sur la PCR (en anglais Polymerase Chain Reaction ou Réaction en Chaîne de Polymérisation, NdT), un procédé qui permet de copier des milliards de fois une séquence d’ADN ou d’ARN pour la rendre
détectable (NdT). Ce procédé de fabrication d’ADN inventé par l’iconoclaste Kary Mullis, qui a reçu le prix Nobel de Chimie pour cette découverte en 1993. Décédé il y a tout juste un an, ce dernier contestait que la réaction en chaîne par polymérase puisse servir à détecter une infection virale et à en mesurer la gravité. Basée sur l’amplification de séquences génétiques, ce test peut faussement réagir à la présence d’impuretés et de débris protéiques. Quand bien même serait-elle fiable, cette technique sophistiquée ne permet nullement d’établir un lien de causalité entre une particule virale et la maladie qu’on lui impute. En d’autres mots, on ne peut affirmer que l’ARN détecté dans le test PCR COVID-19 est celui appartenant aux particules qu’on veut observer au microscope électronique, parce qu’on ne peut pas en voir le contenu – qui pourrait être des protéines, de l’ARN ou de l’ADN de bactéries, de champignons ou d’exosomes. Il n’y a donc aucune connexion entre le test et les particules. Et aucune preuve que les particules sont virales.
C’est pourquoi Kary Mullis avait adhéré au groupe scientifique des « repenseurs du sida ».
Voici deux exemples documentés avec le virus du VIH :
1-glusCHankof P et al. Cell membrane vesicles are a major contaminant of gradient- enriched human immunodeficiency virus type-1 preparations. Virology.
1997 Mar 31; 230(1): 125-133.
http://davidcrowe.ca/SciHealthEnv/papers/277-Microvesicles-Gluschankof.pdf
2- Bess JW et al. Microvesicles Are a Source of Contaminating Cellular Proteins Found in Purified HIV-1 Preparations. Virology. 1997 Mar 31; 230(1): 134-44.
http://davidcrowe.ca/SciHealthEnv/papers/278- Microvesicles-Bess.pdf
Ces tests n’ont pas été construits sur un «étalon-or» qui signifie la purification d’un virus réel. La
purification signifie que le pathogène a été séparé de tout le reste. Le co-découvreur du VIH et lauréat du prix Nobel, Luc Montagnier, a déclaré au journaliste Djamel Tahi dans une interview: « Je le répète, nous n'avons pas purifié.
Le VIH n'a jamais été «séparé de tout le reste». C'était et c'est toujours un artefact de laboratoire, un ensemble d'antigènes torturés en laboratoire autour duquel un «test» a été construit - un test qui a brisé d'innombrables millions de vies, parce que les gens regardaient la télévision et croyaient ce qu'on leur disait. Ils n'ont pas eu l'occasion d'entendre ce que Kary Mullis ou des dizaines d'autres vrais scientifiques avaient à dire sur le rétrovirus supposé mortel, le VIH.
Rien n'a été prouvé avant d'être affirmé. Cela est devenu la norme, ouvrant la voie à la situation dans laquelle nous nous trouvons actuellement. Communisme viral mondial. Nous redoutions tous que cela se produise, mais nous n'avons jamais rêvé qu'ils choisiraient un virus du rhume. Un virus Corona. La PCR est une aiguille dans une technologie de botte de foin qui peut être extrêmement trompeuse dans «le diagnostic des maladies infectieuses». Le premier conflit entre cette technologie révolutionnaire et la vie humaine s'est produit sur le champ de bataille du SIDA, et Mullis lui-même est venu en première ligne en argumentant contre la PCR comme outil de diagnostic.
Comme la PCR est une méthode très sensible car de très petits volumes sont nécessaires pour des réactions uniques, il faut impérativement
s’assurer qu’elle est spécifique au COVID, d’où l’importance CAPITALE que la culture obtenue soit PURE.
1-Extraire l’ARN du virus : À partir d’un prélèvement, l’ADN ou l’ARN sont extraits, selon différentes méthodes.
C’est un ÉTAPE CAPITALE, on doit s’assurer que l’on extrait QUE l’ARN du virus spécifique.
L'évaluation de l'intégrité de l'ARN est une première étape essentielle pour obtenir des données d'expression génique significatives. Travailler avec de l'ARN de mauvaise qualité peut
fortement compromettre les résultats expérimentaux des applications en aval qui sont souvent laborieuses, chronophages et très coûteuses. L'utilisation d'ARN intact est un élément clé pour l'application réussie des méthodes de biologie moléculaire modernes, comme la qRT-PCR ou l'analyse par micro-array. Souvent, en routine, l’extraction est obtenue par adsorption des acides nucléiques (chargés négativement) sur des
particules de silices chargées positivement, puis élution.
Il existe différents protocoles expérimentaux pour extraire les acides nucléiques, qui suivent approximativement le même schéma de principe :
- Lyse des cellules
- Élimination des protéines et des lipides - Élimination d’un acide nucléique donné : en effet, un « extrait acides nucléiques » brut contient en mélange ARN, ADN génomique et ADN plasmidique pour les bactéries. Il existe aujourd'hui des kits commerciaux permettant de réaliser rapidement l’extraction et la purification à l'aide de réactifs prêts à l'emploi.
L'échantillon… peut contenir, de par sa nature ou éventuellement suite à une contamination, une (ou plusieurs) cellule(s) (identiques ou différentes). Par « cellule », on entend, dans le cadre de la présente invention, aussi bien une cellule de type procaryote que de type eucaryote. Parmi les cellules eucaryotes, la cellule peut être une levure telle qu'une levure du genre Saccharomyces ou Candida, une cellule végétale ou une cellule animale telle qu'une cellule de mammifères ou d'insectes. Les cellules de type procaryote sont des bactéries qui peuvent être de type gram positif ou des Gram -. Parmi ces bactéries, on peut citer, à titre d'exemples et de façon non-exhaustive, les bactéries appartenant aux embranchements des spirochètes et des chlamydiae, les bactéries appartenant aux familles des entérobactéries (telles que Escherichia coli), des streptococcacées (telles que Streptococcus et, en particulier, Streptococcus pneumoniae), des microccacées (telles que Staphylococcus), des légionelles, des mycobactéries, des bacillacées et autres.
Coronavirus: à Madagascar, l'institut Pasteur admet des dysfonctionnements dans les tests :Le gouvernement malgache avait donc demandé de refaire les tests sur de nouveaux prélèvements. Sur les 55 échantillons qui sont parvenus à l’Institut Pasteur, seuls 5 cas positifs ont été détectés par l’IPM et par le CCIN (Centre d’infectiologie Charles Mérieux). De 67 cas positifs à 5, la différence est de taille.Un échantillon d’une charge virale exceptionnelle a pu contaminer une série entière, précise André Spiegel, directeur de l’institut Pasteur. Une contamination involontaire aurait pu impacter toute la chaîne, depuis le prélèvement des échantillons à l’hôpital jusqu’à leur arrivée à l’institut. Ce qui a abouti à des faux positifs, selon le directeur qui évoque cette hypothèse.
Dans le fichier «CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel» du 30 mars 2020, par exemple, il est dit:
La détection de l'ARN viral peut ne pas indiquer la présence d'un virus infectieux ou que le 2019-nCoV est l'agent causal des symptômes cliniques » Ce test ne peut pas exclure des maladies causées par d’autres pathogènes bactériens ou viraux. »
Et la FDA admet que : des résultats positifs […] n'excluent pas une infection bactérienne ou une co- infection avec d'autres virus. L'agent détecté peut ne pas être la cause définitive de la maladie. »
FDA : La Food and Drug Administration est l'administration américaine des denrées alimentaires et des médicaments. Cet organisme a, entre autres, le mandat d'autoriser la commercialisation des médicaments sur le territoire des États-Unis.
Gouvernement du Canada : Instruments médicaux autorisés pour les utilisations liées à la COVID-19 : Liste d’instruments de dépistage autorisés : tous des Technologie des acides nucléiques ou sériques. *Il a été noté que des titres élevés de Candida albicans peuvent interférer avec le contrôle interne de l'acide ribonucléique (ARN) de la levure.
2- Une étape préliminaire de transcription inverse en ADN est indispensable avant la PCR.
Tous les réactifs cités ci-dessus sont commercialisés.
RT-PCR. L'ARN est transcrit inverse en ADN complémentaire (ADNc), en utilisant la transcriptase inverse. La qualité et la pureté du génome du SARS-COV2 obtenu dans l’étape de l’extraction sont essentielles pour le succès de la RT-PCR. Cela formera l’ADN MATRICE. La première étape de la RT-PCR est la synthèse d'un hybride ADN / ARN. La
transcriptase inverse a également une fonction RNase H, qui dégrade la partie ARN de l'hybride. La molécule d'ADN simple brin est ensuite complétée par l'activité ADN polymérase dépendante de l'ADN de la transcriptase inverse en ADNc. L'efficacité de la réaction du premier brin peut affecter le processus d'amplification. À partir de là, la procédure standard de PCR est utilisée pour amplifier l'ADNc. (En d’autres mots : on fabrique un brin d’ADN car le test de PCR est conçu seulement pour l’ADN)
3- PCR (polymerase chain reaction) ou L’amplification génique, ou permet le recopiage d’une portion limitée du génome viral, grâce à des amorces (préalablement fourni et d’origine d’un étalon pure) et à l’action d’une ADN polymérase.
Les amorces sont conçues de telle sorte qu’elles s’hybrident au génome viral du patient, l’une sur le brin sens, l’autre sur le brin anti-sens. On ne peut donc choisir des amorces que pour un virus dont on connaît la séquence nucléotidique ; de plus, les amorces doivent être spécifiques du virus, et ne s’hybrider à aucun autre génome que celui qui est recherché.
Définition du mot « hybrider : Pratiquer le croisement de deux variétés ou de deux espèces différentes.
L’ADN polymérase « s’accroche » aux deux amorces et synthétise de l’ADN complémentaire du génome viral qui lui sert de modèle ; la synthèse est possible grâce à l’apport dans le milieu réactionnel de dATP, dCTP, dGTP, dTTP.
Chaque cycle de PCR comporte une étape de dénaturation de l’ADN, une étape d’hybridation des amorces, puis une étape de synthèse de l’ADN, étapes réalisées dans un thermocycleur par
trois changements successifs de température (ex : 94°C, 60°C, 72°C).
"Modification de la présentation des résultats pour les résultats de la PCR du SRAS-CoV2
(Il y a 3 séquences de gènes qui peuvent être détectés : ORF1, E et N)
Jusqu'à présent, vous avez reçu deux résultats en fonction du test utilisé. Si l'échantillon a été analysé en utilisant la méthode Roche, nous avons donné les résultats de mesure pour les deux séquences cibles de la PCR (gènes ORF1 et E) séparément. Le gène ORF1 est spécifique du SARS-CoV-2, tandis que le gène E se trouve également dans d'autres virus corona. Nous avons déjà évalué les cas dans lesquels seul le gène ORF a été amplifié comme positif. Peu de cas avec un gène E positif isolé ont été classés comme douteux et ont donc conduit à plusieurs reprises à des questions et à des problèmes concernant la poursuite de la prise en charge des patients affectés. Compte tenu de la situation
épidémiologique et de l'augmentation globale du taux positif, nous suivons désormais la recommandation de
l'OMS et donnerons déjà un résultat comme "positif" si seul le gène E était amplifié. Afin de simplifier la constatation, seul un résultat global (positif ou négatif) apparaîtra à l'avenir. Un résultat est positif si au moins une des deux séquences cibles du SARS-CoV-2 a été détectée dans le frottis. , nous nous limitons au test de dépistage précédent qui cible le gène E. (le lien a été retiré !!!????) La traduction automatique est très mauvaise…
qPCR et RT-qPCR
En qPCR, le marquage fluorescent permet la collecte de données à mesure que la PCR progresse. Cette technique présente de nombreux avantages en raison d'une gamme de méthodes et de chimies disponibles. Le qPCR à base de colorant (généralement vert), le marquage fluorescent permet la quantification des molécules d'ADN amplifiées en utilisant l'utilisation d'un colorant de liaison d'ADNdb. Au cours de chaque cycle, la fluorescence est mesurée. Le signal de fluorescence augmente proportionnellement à la quantité d'ADN répliqué et donc l'ADN est quantifié en «temps réel». Les inconvénients de la qPCR à base de colorant sont qu'une seule cible peut être examinée à la fois et que le colorant se liera à tout ADN-DS présent dans l'échantillon.La qPCR à base de colorant, c'est souvent la technologie utilisée dans les tests de diagnostic de qPCR.
***si vous procédez avec la PCR traditionnelle, vous lirez vos résultats comme "présence ou absence" du produit génique amplifié en utilisant l'électrophorèse sur gel d'agarose (pas de quantification). Alors que la qPCR (PCR quantitative) ou parfois appelée PCR numérique, vous avez une machine qPCR et un colorant fluorescent dans votre réaction de PCR (Sybr green ou Taqman Probe) qui se lient à votre produit génique amplifié et vous donnent une valeur Ct, qui vous donnera plus tard une idée de la quantité de votre ARN ou ADN dans votre réaction en fonction d'un standard utilisé, dans ce cas vous n'avez pas besoin de faire une électrophorèse sur gel pour voir votre produit PCR amplifié. RT-PCR est utilisé pour amplifier la transcription inversée du code ADN lorsque le QPCR mesure l'amplification. QPCR est de nature
quantitative alors que la RT-PCR n'est pas
ÉTUDE PUBMED : Quantification absolue de l'ARNm à l'aide de tests de réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse en temps réel.SA Bustin 1
La réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse (RT-PCR) est la méthode la plus sensible pour la détection de l'ARNm de faible abondance, souvent obtenu à partir
d'échantillons de tissus limités. Cependant, il s'agit d'une technique complexe, il existe des problèmes substantiels liés à sa véritable sensibilité, reproductibilité et spécificité et, en tant que méthode quantitative, elle souffre des problèmes inhérents à la PCR.
Étude PUBMED : Quantification de l'ARNm par PCR en temps réel par transcription inverse (RT- PCR): tendances et problèmes, SA Bustin 1
Abstrait
La PCR (RT-PCR) de transcription inverse en temps réel basée sur la fluorescence est largement utilisée pour la quantification des niveaux d'ARNm à l'état d'équilibre et est un outil essentiel pour la recherche fondamentale, la médecine moléculaire et la biotechnologie. Les analyses sont faciles à réaliser, capables d'un débit élevé et peuvent combiner une sensibilité élevée avec une spécificité fiable.
Note : S’il n’y a pas de nucléopeptides spécifiques du covid dans le spécimen, l’amorce spécifique au covid ne trouvera pas « preneur » ce qui donnera un résultat négatif. On aura beau amplifier, s’il n’y a pas de chaine, à la fin du processus, le résultat sera négatif.Cette revue examine les aspects techniques impliqués, contraste les méthodes de RT-PCR conventionnelles et cinétiques pour quantifier l'expression génique et compare les différents systèmes de RT-PCR cinétiques.
Comment fonctionnent les tests de dépistage du Covid19 ? https://www.youtube.com/watch?v=hNVDHCf8bGA
*** Comme toute technique, afin de s’assurer que tout le processus ait été bien exécuté, que tous les réactifs ne soient pas passés date et que les appareils soient en bonne ordre ( ce qui mènerait à de faux résultats) il faut IMPÉRATIVEMENT un ÉTALON, un contrôle. Dans ce cas, il nous faut un spécimen pur de l’ARN du covid comme étalon et on le traite en même temps que le patient ou souvent pas « bath » de réactif. Si le résultat du contrôle est négatif, cela nous indique qu’il y a échec de la technique. Il faut trouver la source du problème. Il arrive que c’est le contrôle lui-même le problème ou encore au niveau de l’étape PREANALYTIQUE.
(ex : le prélèvement)
*** Dans toutes techniques il y a des faux négatifs et des faux positifs.
FAUX POSITIFS ET DES FAUX NÉGATIFS avec le RT-PCR
Voici une description des problèmes qui peuvent survenir tout au long du processus (publiée sur le site de l’INSSS )
Outre l’altération thermique ou chimique de l’échantillon et les charges virales insuffisantes, il existe de multiples éléments pré-analytiques susceptibles de nuire à l’obtention de résultats fiables. Selon une revue de la littérature proposée, on dénote les problèmes généraux tels que des erreurs d'identification des échantillons, des procédures inadéquates de collecte, de manipulation, de transport et d’entreposage des échantillons, ainsi que la collecte de matériel inapproprié. La présence de substances interférentes ainsi que la contamination des
échantillons peuvent également nuire à la fiabilité du résultat. Certains problèmes analytiques peuvent également contribuer à compromettre la précision du diagnostic, comme l'utilisation de tests insuffisamment validés, le dysfonctionnement de l'instrument, ainsi que d'autres problèmes techniques spécifiques.
Problème avec l’étalon-or : isoler, purifier
L’étalon
Si nous avions un nouveau test pour détecter le staphylocoque doré [de la bactérie] dans le sang, nous avons déjà des hémocultures, c'est notre étalon-or que nous utilisons depuis des décennies, et nous pourrions comparer ce nouveau test à cela.
Mais pour COVID-19, nous n'avons pas de test de référence. » Quelle est la précision des résultats des tests?
Aucun test ne donne un résultat précis à 100%; les tests doivent être évalués pour déterminer leur sensibilité et leur spécificité, idéalement par comparaison avec un «standard de
référence». L'absence d'une telle «norme d'or» claire pour les tests covid-19 rend l'évaluation de la précision des tests difficile.
Et comme les tests PCR sont calibrés pour les séquences de gènes (dans ce cas, les séquences d'ARN car on pense que le SARS-CoV-2 est un virus à ARN), nous devons savoir que ces fragments de gènes font partie du virus recherché. Et pour savoir cela, un isolement et une purification corrects du virus présumé doivent être exécutés.
25 janvier 2020, corrigé le 30 juillet 2020 : L'épidémie en cours du nouveau coronavirus (2019- nCoV) récemment apparu constitue un défi pour les laboratoires de santé publique, car les isolats de virus ne sont pas disponibles alors qu'il existe des preuves de plus en plus nombreuses que l'épidémie est plus répandue qu'on ne le pensait initialement et que la propagation…
PROBLEME LIÉ A LA TECHNIQUE Rt-PCR
1-L’EXTRACTION : Purification du spécimen, isoler le virus
Il existe de nombreux inhibiteurs qui peuvent être co-purifiés pendant la préparation des échantillons et il existe une variété de facteurs physiques et chimiques qui dégradent les acides nucléiques pendant le processus de préparation ou le stockage ultérieur. Par conséquent, il est important de veiller à déterminer s'il existe un problème de pureté et d'intégrité et, pour les applications quantitatives, cela devrait être mesurable et quantifiable.
En pratique, cependant, la plupart des publications ne mentionnent même pas la pureté des échantillons mesurée par l'absence d'inhibition. Les chercheurs détectent un nouvel ARN chez de multiples patients atteints de la grippe ou de pathologies du type pneumonie, et ils
considèrent que la détection de l’ARN (emballé dans des protéines pour former l’ARN d’un virus, comme on le suppose chez les coronavirus) équivaut à isoler le virus. Non, cela n’est pas isoler le virus car il n’y a rien qui dit qu’il n’y a pas d’ARN qui provienne de cellules, de bactéries, etc.
En principe, une quantification fiable de l'ARN nécessite un ARN raisonnablement
intact ; la question est de savoir ce qui constitue «raisonnablement» intact et comment le mesurer au mieux.
Maintenant, la question est: qu'est-ce qui est requis en premier pour l'isolement / la preuve du virus? Nous devons savoir d'où provient l'ARN pour lequel les tests PCR sont calibrés.
En tant que manuels (par exemple, White / Fenner. Medical Virology, 1986, p. 9) ainsi que les principaux chercheurs en virus tels que Luc Montagnier ou Dominic Dwyer , la purification des particules - c'est-à-dire la séparation d'un objet de tout ce qui n'est pas cet objet , comme par exemple la lauréate du prix Nobel Marie Curie a purifié 100 mg de chlorure de radium en 1898 en l'extrayant de tonnes de pechblende - est un préalable indispensable pour prouver
l'existence d'un virus, et ainsi prouver que l'ARN de la particule en question provient d'un nouveau virus.
La raison en est que la PCR est extrêmement sensible, ce qui signifie qu'elle peut détecter même les plus petits morceaux d'ADN ou d'ARN - mais elle ne peut pas déterminer d'où proviennent ces particules. Cela doit être déterminé à l'avance.
Et comme les tests PCR sont calibrés pour les séquences de gènes (dans ce cas, les séquences d'ARN car on pense que le SARS-CoV-2 est un virus à ARN), nous devons savoir que ces fragments de gènes font partie du virus recherché. Et pour savoir cela, un isolement et une purification corrects du virus présumé doivent être exécutés.
Par conséquent, nous avons demandé aux équipes scientifiques des articles pertinents auxquels il est fait référence dans le contexte du SARS-CoV-2 de prouver si les plans de microscopie électronique représentés dans leurs expériences in vitro montrent des virus purifiés.
Mais pas une seule équipe n'a pu répondre à cette question par «oui» - et NB., Personne n'a dit que la purification n'était pas une étape nécessaire. Nous n'avons obtenu que des réponses telles que «Non, nous n'avons pas obtenu de micrographie électronique montrant le degré de purification».
(Dans ce contexte, il faut remarquer que certains chercheurs utilisent le terme «isolement»
dans leurs articles, mais les procédures qui y sont décrites ne représentent pas un processus d'isolement (purification) approprié. Par conséquent, dans ce contexte, le terme «isolement»
est mal utilisé).
Ainsi, les auteurs de quatre des principaux articles du début de 2020 affirmant la découverte d'un nouveau coronavirus admettent qu'ils n'avaient aucune preuve que l'origine du génome du virus était des particules de type viral ou des débris cellulaires, purs ou impurs, ou des particules de toute nature. En d'autres termes, l'existence de l'ARN du SRAS-CoV-2 est basée sur la foi et non sur les faits.
Un internaute a fait la demande suivante : ils étaient plutôt ouverts à tous les enregistrements décrivant l'isolement du «virus COVID-19» effectué par n'importe qui, jamais, n'importe où sur la planète. Les réponses sont revenues il y a quelques semaines (mi-juillet, après deux mois).
Tous les établissements ont indiqué la même chose: ils ont recherché et n'ont pu trouver aucun enregistrement décrivant l'isolement d'un «virus COVID-19».
Toronto Sunnybrook
« L'Université de Toronto et le Sunnybrook HSC n'ont aucune trace d'isolement du «virus COVID- 19» POURTANT Des chercheurs de l'Université de Toronto ont affirmé il y a des mois avoir
«isolé le SRAS-COV-2» (le prétendu «virus COVID-19») dans le cadre d'un effort d'équipe avec des chercheurs du Sunnybrook Research Institute (qui fait partie du Sunnybrook Health Sciences Centre ), L'Université McMaster et l'hôpital Mount Sinai de Toronto. »
Santé Canada
https://www.fluoridefreepeel.ca/health-canada-has-no-record-of-covid-19-virus-isolation/
Dr Charles Calisher, virologue chevronné. En 2001, Science a publié un «plaidoyer passionné…
à la jeune génération» de plusieurs virologues chevronnés, dont Calisher, disant que:
[les méthodes modernes de détection de virus comme] la réaction en chaîne par polymérase […]
ne disent pas grand-chose ou rien sur la façon dont un virus se multiplie, quels animaux le transportent, [ou] comment il rend les gens malades. [C'est] comme essayer de dire si quelqu'un a mauvaise haleine en regardant son empreinte digitale. »
Et c'est pourquoi nous avons demandé au Dr Calisher s'il connaissait un seul article dans lequel le SRAS-CoV-2 a été isolé et finalement vraiment purifié. Sa réponse:
Je ne connais pas une telle publication. J'en ai gardé un œil. ».
Cependant, avec l'utilisation croissante de la PCR pour détecter les génomes de virus, le virus lui- même peut ne pas être isolé et, par conséquent, les tests de neutralisation ne peuvent pas être effectués. Il faut garder à l'esprit qu'un génome n'est qu'une partie d'un virus, d'un moustique ou d'un humain; ce n'est pas le virus, le moustique ou l'humain dont il est issu, bien que ce soit la partie critique.
DR Andrew Kaufman: “Tous ce qui est fait dans tous les articles sur le coronavirus, ils disent l’avoir isolé, alors qu’ils prennent (photo 41;16) le même échantillon de liquide pulmonaire et la première chose qu’ils font c’est d’extraire le matériel génétique sans passer par l’étape de la purification, alors ils prennent TOUT le fluide et ensuite ils donnent des enzymes qui brisent toutes les
membranes afin que chaque type de cellules qui s’y trouve fuit son contenu dans le fluide puis ensuite, ils recherchent du matériel génétique spécifique et l’amplifier.
Donc, ils pourraient séquencer le matériel génétique mais le problème est qu’il existe de
nombreuses sources de matériel génétique dans un liquide pulmonaire. Il a donc été découvert dans des études de recherches qu’il y a du matériel génétique ne faisant pas partie d’une cellule qui se trouve dans le liquide pulmonaire et les exosomes sont présents dans tous les types de cellules et surtout présents dans les maladies, ce sont donc des exosomes qui ont du matériel génétique, il y a aussi des bactéries, des champignons et aussi les cellules pulmonaires qui contiennent du matériel génétique. Donc, il y a toutes ces différentes sources, et si vous ne purifiez pas ces particules que vous dites être « notre » virus, vous ne savez pas vraiment quelle est la source réelle de ce matériel génétique. C’est une procédure TRES BACLÉE. Et ensuite ce qu’ils font pour soi-disant isoler les particules virales, ils sont mélangés généralement très couramment avec des cellules de la culture cellulaire rénales de singe appelés « verocells » car ils se développent facilement en laboratoire, puis ils ajoutent des antibiotiques à cela. Parfois, ils utilisent des cellules cancéreuses. Mais dans chaque méthode que j’ai vue, ils mélangent essentiellement avec des cellules qui fabriquent des exosomes, donc, lorsque vous associez des « verocells » et des antibiotiques, ils vous induisent des exosomes. Les antibiotiques sont toxiques pour la cellule, c’est pourquoi elle produit des
exosomes essentiellement et que vous mélangez ensuite au fluide pulmonaire. Vous prenez ce mélange et en regardant cela au microscope, mais comment savoir si les particules que vous regardez sont des exosomes de cellules ou d’un virus? » (FAUX POSITIF)
Les médecins n’apprennent pas cela pendant leurs études de médecine. On apprend l’existence des exosomes en recherche, en biologie moléculaire.
Le test tr-PCR ne mesure pas ni les exosomes ni les virus, il mesure une séquence d’ARN.
Les scientifiques qui sont favorables au paradigme de la maladie du virus doivent retrouver
beaucoup de virus présents pour provoquer la maladie, s’il y en a que quelques-uns, ça ne fera rien.
Quand le test sort « positif » tout ce que cela dit c’est qu’il y a une sorte de séquence d’ARN dans leur corps. J’ai vu une étude ou le taux de faux positif est de 80% concernait 3 personnes sur 4, asymptomatiques donc étiquetés. Même le CDC affirme qu’un test positif ne prouve pas que vous ayez la maladie. Nous avons tous des dizaines de coronavirus au moins présents dans notre corps à un moment donné qui ne causent pas de maladie. Je crois qu’ils font partie de notre corps, que ce sont des exosomes.
Les mensonges dans les études : voici un exemple (1h06 et plus)
2-
L'étape RT
Un examen minutieux de l'histoire de la RT-PCR révèle la triste vérité selon laquelle les
problèmes fondamentaux qui gênent la fiabilité des expériences d'aujourd'hui ont été identifiés à un stade précoce, ont été constamment exposés et portés à l'attention de la communauté de recherche, mais continuent d'être ignorés par la plupart. Le potentiel de combiner les étapes RT et PCR pour détecter des cibles ARN a été réalisé peu de temps après le rapport de la
première expérience PCR, avec son utilisation comme un essai quantitatif suggéré peu de temps après. Cependant, il est très vite devenu clair que la quantification de l'ARN n'était pas aussi simple que l'application des mêmes procédures utilisées pour la quantification de l'ADN, c-à-d que, par exemple, une transcription inverse fiable de l'ARN pour l'amplification par PCR dépend de la concentration d'ARN et des méthodes d'amorçage.
De plus, parmi d'autres facteurs pouvant altérer le résultat, avant de commencer la PCR proprement dit, dans le cas où vous recherchez des virus à ARN présumés tels que SARS-CoV-2, l'ARN doit être converti en ADN complémentaire (ADNc) avec l'enzyme Reverse Transcriptase - d'où le «RT» au début de «PCR» ou «qPCR».
Mais ce processus de transformation est «largement reconnu comme inefficace et variable», comme l'ont souligné Jessica Schwaber du Centre for Commercialization of Regenerative Medicine de Toronto et deux collègues chercheurs dans un article de 2019 .
David Crowe :
3-L’étape des cycles :
Faut savoir que cette technique ne produit pas de résultats positifs ni négatifs, mais
simplement le nombre de cycles nécessaire pour détecter suffisamment de matériel génétique afin de dépasser le seuil arbitraire entre un résultat positif et un résultat négatif.
Si « positif » signifie « infecté » et « négatif » correspond à « non infecté », il existe des cas où les gens passent d’infectés à non infectés puis de nouveau à infectés en l’espace de quelques jours.
À partir d’un double brin d’ADN qu’on clive (on l’ouvre en deux), des brins complémentaires peuvent alors se synthétiser, à l’instar de ce qui se passe dans une cellule lors de la mitose (division cellulaire). Jusqu’ici rien d’extraordinaire, mais grâce à la magie de la réplication, si ce processus est répété dix fois, vous obtenez environ 1.000 doubles brins d’ADN identiques.
Vingt fois, un million (220). Trente fois, un milliard (230). Quarante fois, mille milliards (240).
Chaque doublement est appelé un cycle. Pour user (ou abuser) de la PCR comme test de dépistage, on assume qu’on part d’un nombre inconnu de brins et qu’on arrive à un multiple exponentiel après « n » cycles. On peut estimer la quantité de départ grâce à la quantité à l’arrivée. Le gros problème, c’est que, comme la PCR est un processus de réplication exponentiel, les erreurs augmentent également de manière exponentielle. En réalité, la quantité de départ n’est souvent pas estimée, mais on détermine l’absorbance (ou densité optique, c'est-à-dire le taux d’absorption de longueurs d’onde données, NdT) ou une autre caractéristique du tas d’ADN en train de grossir. Un autre problème avec de nombreux virus,
comme les coronavirus, est qu’on pense qu’ils sont composés d’ARN. On peut le résoudre en convertissant tout l’ARN en ADN avec l’enzyme transcriptase inverse dès le début du processus.
La technologie, après ces deux adaptations, est connue sous le nom de RT-PCR (réaction de polymérisation en chaîne par transcription inverse). Ce sont les nombres de cycles. Cela laisse entendre qu’il a toujours fallu au moins 20 cycles de PCR avant de pouvoir détecter de l’ARN, et qu’on a arrêté le processus après un maximum de 37 cycles. La ligne bleue signale le 38e cycle et les points noirs ne signifient pas que de l’ARN a été détecté après 38 cycles (comme cela est expliqué dans l’article) mais qu’il n’était pas détecté après 37 cycles, et que le processus a donc été stoppé. Ce «seuil de séries de cycles » (en anglais Ct pour cycle threshold, NdT) était la définition arbitraire d’un résultat négatif par les auteurs de l’étude de Singapour.
SELON LE NOMBRE DE CYCLES CHOISIS ARBITRAIREMENT PAR LES FABRICANTS,
LES TESTS SONT NÉGATIFS OU POSITIFS
Nous pouvons voir que c’était arbitraire, car dans un autre article, les auteurs avaient deux seuils : 37 et 40.
« Une valeur de seuil de cycle (valeur Ct) inférieure à 37 a été définie comme un test positif, et une valeur Ct de 40 ou plus a été définie comme un test négatif. Une charge moyenne, définie comme une valeur Ct de 37 à moins de 40, nécessitait une confirmation par un nouveau test. Si la valeur Ct répétée était inférieure à 40 et un pic évident a été observé, ou si la valeur Ct répétée était inférieure à 37, le restes a été jugé positif. »
On remarque ici que cet article considère un résultat à 37 comme indéterminé alors que l’étude de Singapour le considère positif.
Dans une étude de 33 tests approuvée par la FDA (pour Food and Drug Administration, l’Agence américaine des produits alimentaires et médicamenteux, NdT) dans l’urgence, où un nombre de cycles de PCR était recommandé, celui-ci variait considérablement. Des fabricants
recommandaient chacun qu’un test soit déclaré positif à moins de, respectivement, 30, 31, 35, 36, 37, 38 ou 39 cycles. 40 cycles était le plus populaire pour 12 fabricants, deux autres
recommandaient 43 et deux autres 45.
https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use- authorizations-medical-devices/vitro-diagnostics-euas
Dans de nombreux cas, de multiples tests sont exigés, et il est courant de conclure que quelqu’un est infecté
même
avec quelques tests négatifs et que quelqu’un est non infecté, même avec quelques tests positifs. Dans le premier cas, cela peut se traduire en isolement, en médications spécifiques, en précautions exceptionnelles pour le personnel de santé etc.Mais en réalité, même les tests individuels ne sont pas binaires – ni positifs ni négatifs – mais donnent une série de chiffres qui sont arbitrairement divisés entre positifs d’un côté et négatifs de l’autre. Il se peut qu’il y ait une zone grise qui ouvre la porte à d’autres facteurs, y compris la subjectivité du médecin ou du laboratoire, pour l’interprétation des résultats ou qui rendront nécessaire de procéder à d’autres tests.
Dans la vidéo du 18 aout 2020 DIDIER RAOULT a démontré qu’il y a 21% de FAUX POSITIFS en détestant des cas. Il confirme que tous les cas POSITFS avec un seuil plus que 35, sont de faux positifs.
« 838 personnes depuis le 1 juillet 2020 qui sont arrivés avec des tests positifs à l’extérieur, on a trouvé que 21% d’entre eux étaient en fait NÉGATIFS. Ça veut dire que simplement il faut faire attention. On a mesuré la « significacité » de la PCR en la comparant à la culture et au-delà d’une certaine courbe, qui pour nous sont à 35, il ne faut pas interpréter cela comme des résultats positifs, parce que ça n’en ait pas. Parce que ça représente moins d’une molécule par test et cela n’est plus significatif…plus que ça, c’est n’importe quoi, ce n’est pas un virus »
L'inventeur lui-même du PCR, Kary Mullis, a accepté, lorsqu'il a déclaré :
Si vous devez effectuer plus de 40 cycles pour amplifier un gène à copie unique, il y a quelque chose qui ne va pas avec votre PCR. »
Les lignes directrices MIQE (pour Minimum Information for Publication of Quantitative Real- Time PCR Experiments ou informations minimales pour la publication d'expériences
quantitatives de PCR en temps réel, NdT) recommandent d’écarter les données avec 40 cycles ou plus. Certains pensent que 35 est un meilleur seuil.
Son caractère arbitraire n’est pas le seul problème de l’utilisation du nombre de cycles. Les valeurs ne sont pas comparables entre les laboratoires et varient au sein d’un même laboratoire, surtout si on procède à des changements mineurs au processus (comme l’utilisation de tubes en plastique transparent au lieu de plastique blanc). Dans une interview à la radio, le Professeur Stephen Bustin, expert en RT- PCR, a déclaré que les cycles devraient probablement être limités à 35. Les lignes directrices MIQE, qui encadrent l’utilisation et la publication de résultats de RT-PCR et dont le Pr Bustin est co-rédacteur,
mettent en garde sur le fait que « les valeurs de Ct supérieures ou égales à 40 sont douteuses à cause de la faible efficacité implicite et elles devraient être en général signalées », alertant expressément sur le risque de faux positifs. Les exemples cités ont utilisé 37 et 40 comme seuil maximal et une analyse publiée par l’Hôpital allemand Charité à Berlin, a stipulé 45 cycles. Les tests d’Altona Diagnostics et de Vitassay recommandent également 45 cycles. « Thermal cycling was performed at 55°C for 10 min for reverse transcription, followed by 95°C for 3 min and then 45 cycles of 95°C for 15 s, 58°C for 30 s.”
Est-ce que Rt-qPCR (q=quantitative) mesure vraiment la «charge virale» d’un patient?
La charge virale étant la quantité de virus dans le spécimen du patient. On nous dit que plus la charge virale est haute plus le patient est « malade ».
En théorie, le nombre de cycles de PCR auquel l’ADN est détectable nous indique la quantité relative d’ARN. Quelle que soit la quantité nécessaire pour être détectable au 20e cycle, 21 cycles seront deux fois plus sensibles et pourraient en détecter la moitié et 30 cycles un millième de fois moins que 21. On peut donc s’attendre à ce que des personnes plus malades hébergent plus de virus et donc qu’elles présentent un nombre moins élevé de cycles lors du dépistage.
Dans une enquête sur les personnes positives à l’ARN à Guangdong en Chine, les chercheurs ont examiné la « charge virale » (quantité d’ARN) et concluent que « la charge virale qui était détectée sur les patients asymptomatiques était la même que celle des patients qui présentaient des symptômes ».
Une étude conclut : Un problème important avec le test RT-PCR en temps réel est le risque d'obtenir des résultats faux négatifs et faux positifs. Il est rapporté que de nombreux cas
«suspects» présentant des caractéristiques cliniques typiques de COVID-19 et des images de tomodensitométrie (TDM) spécifiques identiques n'ont pas été diagnostiqués. Ainsi, un résultat négatif n'exclut pas la possibilité d'une infection au COVID-19 et ne doit pas être utilisé comme seul critère pour les décisions de traitement ou de prise en charge des patients. Il semble que la combinaison de la RT-PCR en temps réel et des caractéristiques cliniques facilite la gestion de l'épidémie de SRAS-CoV-2. Plusieurs facteurs ont été proposés pour être associés à l'incohérence de la RT-PCR en temps réel. Dans ce qui suit, nous tentons de discuter de divers
défis concernant la détection du SRAS-CoV-2 par RT-PCR en temps réel. On s'attend à ce que cela puisse fournir des informations utiles pour la compréhension des limites des résultats obtenus et pour améliorer les approches de diagnostic et le contrôle de la maladie.
Conformément, l'échantillon de contrôle de modèle négatif (NTC) doit être négatif, ne montrant aucune courbe de croissance de fluorescence qui traverse la ligne de seuil. L'apparition de faux positifs avec une ou plusieurs des réactions d'amorce et de sonde NTC indiquent une
contamination de l'échantillon. Il est important de noter que le contrôle interne doit être inclus pour aider à identifier les échantillons contenant des substances susceptibles d'interférer avec l'extraction de l'acide nucléique et l'amplification par PCR. En raison des nombreux risques encourus par les patients en cas de résultat faussement positif, tous les laboratoires cliniques utilisant ce test doivent suivre les lignes directrices standard en matière de tests de confirmation et de déclaration en fonction de leurs autorités de santé publique compétentes.
Parmi d’autres problèmes, la fluorescence de fond augmente et peut produire un faux positif avec suffisamment de cycles.
OPTI SARS-CoV-2 RT-PCR Test ( page 9 du pdf)
David Crowe - chercheur canadien, diplômé en biologie et en mathématiques, animateur du balado The Infectious Myth et président du groupe de réflexion Rethinking AIDS. Il a décomposé les problèmes du test Corona basé sur la PCR avec beaucoup de détails, révélant un monde d'une complexité inimaginable, ainsi que de la supercherie. David, à sa manière canadienne discrète, a lancé une bombe dans sa prochaine déclaration:
«Je pense que si un pays disait:« Vous savez, nous devons mettre fin à cette épidémie », ils pourraient tranquillement envoyer un mémo disant:« Nous ne devrions pas avoir le seuil à 37. Si nous le mettons à 32, le nombre des tests positifs diminue considérablement. Si ce n'est toujours pas
suffisant, eh bien, vous savez, 30 ou 28 ou quelque chose comme ça. Ainsi, vous pouvez contrôler la sensibilité. »
Oui, tu l'as bien lu. Les laboratoires peuvent manipuler le nombre de «cas» de Covid-19 dans leur pays. Donc, nous revenons au fait que le virus n'est pas en cours de purification. Si vous pouviez purifier le virus, alors vous pourriez prendre une centaine de personnes qui ont été testées positives et vous pourriez rechercher le virus en elles. Et si vous avez trouvé le virus dans 50 sur cent et pas dans les 50 autres, vous pourriez dire que le test n'est précis que 50% du temps. Mais nous n'avons aucun moyen de le faire car nous n'avons pas encore purifié le virus. Et je ne pense pas que nous le ferons jamais.
Dave Rasnick a eu des échanges avec David Crowe à ce sujet et il est d'accord: «À ma connaissance, ils n'ont pas encore purifié ce virus.»
«C'est comme des empreintes digitales. Avec la PCR, vous ne regardez qu'un petit nombre de nucléotides. Vous regardez un petit segment de gènes, comme une empreinte digitale. Lorsque vous avez des empreintes digitales humaines régulières, elles doivent avoir des points de confirmation. Il y a des parties communes à presque toutes les empreintes digitales, et ce sont ces parties
génériques d'un virus Corona que le test PCR détecte. Ils peuvent avoir des boucles partielles, mais si vous ne prenez que quelques petits échantillons d'empreintes digitales, vous allez trouver beaucoup de segments d'ARN dont nous ne sommes pas sûrs d'avoir quoi que ce soit à voir avec le virus corona. Ils apparaîtront toujours dans PCR. Vous pouvez descendre à des niveaux où il n’est pas pertinent du point de vue biologique, puis l’amplifier d’un billion de fois. »
«Je suis triste qu'il ne soit pas là pour défendre sa technique de fabrication», a-t-il déclaré. «Kary n'a pas inventé de test. Il a inventé une technique de fabrication très puissante dont on abuse.
Quelles sont les meilleures applications de la PCR? Pas de diagnostic médical. Il le savait et il l'a toujours dit.
RÉSULTAT
CHan J f-W et al. A familial cluster of pneumonia associated with the 2019 novel coronavirus indicating person-to-person transmission: a study of a family cluster. Lancet. 2020 Jan 24.
Tous les échantillons respiratoires étaient négatifs sur deux systèmes de PCR multiplex au point de service pour 18 cibles virales respiratoires et quatre cibles bactériennes. Les deux échantillons fécaux des patients 3 et 4 qui avaient déjà eu une diarrhée étaient négatifs lors d'un test PCR multiplex pour les virus, bactéries et parasites diarrhéiques courants ( tableau 2 ). Les
échantillons respiratoires des patients 1, 2, 4, 5 et 7 étaient positifs pour les gènes RdRp et S par RT-PCR conventionnelle, et pour le gène S par RT-PCR en temps réel, qui ont été confirmés par séquençage Sanger de tous amplicons ( annexe pp 3–5 ). Bien que les échantillons respiratoires du patient 3 aient été négatifs pour les deux RdRpet le gène S (recueilli 9 jours après
l'apparition des symptômes), il était toujours considéré comme un cas infecté car il était fortement lié épidémiologiquement à l'exposition à l'hôpital de Wuhan et montrant radiologiquement des opacités pulmonaires multifocales en verre dépoli.
