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CHAPITRE 5
ADN
L'ADN est la molécule vectrice de l'hérédité. L'Homme a essayé de comprendre pourquoi les individus d'une même famille se ressemblaient. On ne connaissait pas cette molécule. Les caractères se transmettent de génération en génération. Sur la base de cette molécule, il y a tout le plan de construction d'un individu unique. Il y a plus de 50 ans, nous avons découvert que l'ADN soit le livre de la vie. A chaque étape de cette découverte, il y a eu résistance de la part du monde scientifique. Nous allons étudier toutes ces étapes.
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La Biologie de l'ADN
Félix HOPPE-SEYLER:
Il est un pionnier de la biologie moléculaire: il a découvert que dans les noyaux de spermatozoïdes une abondance d'une molécule unique qu' 'était acide et dont la composition est du C, H, N, O et P.
Par sa composition que ce n'est ni des carbohydrates, ni des lipides, ni des protéines. On ne
trouvera jamais du P dans les protéines mais qui peuvent être phosphorylé mais qui est relativement rare et qui est une modification post-traductionnelle (MPT). Il a donc appelée cette molécule l'Acide Nucléique (AN).
Grégory MENDEL:
Par ses expériences de croisements, il a conclu à l'existence d'unité fonctionnelle responsable de la transmission des caractères appelés allèles alors qu'il ignorait complètement la nature et la
composition. L'ADN était essentiellement concentré dans la vésicule nucléaire dans les cellules eucaryotes. Cette vésicule un peu spéciale qui est protégé.
Alexander FLEMMING:
Il est un histologiste qui a fait des dessins des cellules eucaryotes. Il a montré à l'aide d'un microscope photonique que lors du cycle cellulaire apparait des structures filamenteuses d'un nombre constant qui se répartissent de façon égale lors de la division cellulaire. Ces filaments sont particulièrement riches en AN.
A un moment donné, cette fonction d'assurer la perpétuation des caractères des organismes vivants doivent être complexes. Ils doivent donc être des protéines car ils se composent à partir de 20 AA différents avec des structures très variables alors que les AN sont beaucoup plus simples.
Frederik GRIFFITH:
Il est l'un des premiers qui a suggéré que l'ADN était la molécule vectrice de l'hérédité. Il est le premier à avoir exécuté les premières transformations de bactéries c-à-d du changement du phénotype des bactéries par incubation de souches bactériennes. Il a utilisée des techniques élémentaires.
Il a montré que certaines bactéries comme le pneumocoque pouvait soit tuer la souris qui le recevait soit ne pas la tuer. Il existe donc des souches pathogènes et des souches bénignes. Une des caractéristiques phénotypiques qui permet de distinguer les méchantes des gentilles est l'aspect des colonies. Les méchantes vont donner des colonies lisses et les gentilles des rugueuses.
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Il s'est rendu compte que l'aspect est lié par la présence d'une capsule qui permet à la bactérie de se coller à la paroi. Griffith a injecté les bactéries S à une souris qui est morte peu de temps après.
Lorsqu'il injecte des bactéries R, la souris survivait. Ensuite il a pris des bactéries R qu'il a fait bouillir et qu'il a injectée dans une souris qui a survécu: il ne savait pas que les bactéries meurt par hautes températures.
Il a alors injectée des bactéries S mortes avec des bactéries R à une souris qui est morte peu après.
Les bactéries récupérées dans ses poumons ont acquiert une capsule: elles se sont transformées.
Manifestement, quelque chose était présent dans la soupe de bactéries S qui a été captée par les R vivantes.
Oswald AVERY:
Il a remarqué que on pouvait extraire l'ADN d'une bactérie et le transmettre à une autre bactérie. Il a donc su que les bactéries peuvent utiliser le matériel génétique de leur milieu pour se transformer. On a compris que les bactéries S étaient capable de faire une capsule car elles avaient un plasmide (morceau d'ADN extra-chromosomique) qui codaient pour la glycoprotéine qui forme la capsule.
Avery a pris des bactéries S et en a extrait les molécules (ADN, ARN, lipides, carbohydrates et protéines) par chimie et les a testées sur des bactéries R. Quelle est la molécule capable de transformer la bactérie?
Seules les bactéries qui avaient le plasmide ont changé leur phénotype. Il a découvert que l'ADN était la molécule de l'information mais il n'a convaincu personne.
Martha CHASE et Alfred HERSHEY:
Ce couple de biologiste a réalisé l'expérience la plus convaincante. Ils ont travaillé sur les
bactériophages qui ont un tropisme pour les bactéries. Ces virus injectent leur matériel génétique dans la bactérie pour la transformer en usine. Ils se sont dits que si les protéines sont responsables de la transformation, ce sont elles qui doivent être injectées. Pour pouvoir le prouver, ils ont utilisé des isotopes radioactifs.
Ils ont utilisé du Phosphore 32 placé dans le sérum des bactéries infectées. Les virus allaient nécessairement avoir toutes les molécules qui contiennent le P32 qui est abondant dans les AN. Après un cycle, ils ont pris les bactériophages radioactifs qui ont leur molécule radioactives. Il a pris ces virus qui ont infecté des bactéries froides. Il a attendu puis enlevé les virus et a récolté les bactéries.
Il voit que dans ces dernières on a énormément de radioactivité. Donc la molécule de la vie a du P32 et que c'est l'AN.
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Ils ont alors fait la même expérience avec du Souffre 35 qui composent seules deux AA qui sont la méthionine et la cystéine. Les molécules sont doivent être seules des carbohydrates. Il ont infecté les bactéries vierges et ont remarqué qu'après rinçage des virus l'essentiel de la radioactivité était au niveau des bactériophages. L'ADN est donc le vecteur de l'hérédité.
Des expériences ont été fait qui montrent qu'avant la division mitotique, la quantité d'AN du noyau est doublée. Ce paquets se divise en deux quantité égales chez les cellules filles. Les chromosomes qui sont la forme la plus condensée de l'ADN pouvaient être simple brin ou double brin.
Erwin CHARGAFF:
Il a abouti sur une conclusion sur la composition biochimique de l'ADN. Il a montré qu'il y avait la même proportion de phosphates, de sucres et de bases. C'était toujours équimolaire. Chaque nucléotide a une base, un phosphate et un sucre. Chaque proportion de base étaient semblables pour une même espèce mais différents pour une autre espèce. Il a montré aussi qu'il y a toujours la même proportion de A et T ET C et G. Cette molécule acide (due au groupement phosphate) est responsable de l'information génétique.
Rosalyn FRANKLIN:
Elle est spécialisée dans la cristallographie. Elle a étudié les propriétés physico-chimiques des molécules dont l'ADN. Par diffraction, on peut prévoir la structure spatiale de la molécule. Franklin a déterminé que l'ADN est une structure hélicoïdale de diamètre constant de 2 nm.
WATSON & CRICK:
A partir des données de Franklin, ils ont affirmé que les purines sont plus larges que les pyrimidines et ont su que chaque purine est liée à une pyrimidine vu le diamètre stable. Ils ont très facilement montré que l'ADN est constitué en double hélice associée par des liaisons H. Les bases se lient donc par complémentarité. On peut donc construire le brin complémentaire facilement.
Les C et G sont liés par trois pont H alors que les A et T n'en ont que deux ce qui implique d'une molécule d'ADN riche en C-G sont plus difficiles à séparer que lorsqu'il y a des A-T. Les extrémités 5' et 3' sont données par le désoxyribose.
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Structure et Régulation de la Chromatine chez les Eucaryotes
Le vieillissement est du aux modifications de l'ADN par oxydation notamment des bases. L'altération progressive peut altérer la structure des protéines et donc la fonction. L'ADN est la molécule vectrice de l'hérédité. Le génome est l'ensemble de l'information génétique contenue dans une cellule somatique. L'ADN est un polymère de nucléotides. Le gène est l'unité fonctionnelle du génome qui code pour une molécule d'ARNm codant pour une protéine. L'ADN des cellules eucaryotes n'est pas non plus exclusivement contenu dans le noyau mais peut être dans des plastes ou des mitochondries.
Lors de la mitose, l'ADN se condense pour atteindre des tailles visibles en µscopie photonique (1-2 µm). Elle apparait sous forme de structure qu'on appelle chromosome double avant la mitose et simple après la mitose.
En dehors de la mitose, l'autre partie de la vie cellulaire s'appelle l'interphase. L'ADN n'est plus ultra condensé et parait désorganisé. Pourtant l'ADN est toujours associé à des protéines histoniques et non-histoniques et est extrêmement organisée vu son importance vitale.
La chromatine est une structure dynamique résultant de l'association de l'ADN nucléaire et de protéines histoniques et non histoniques et dont l'aspect varie en fonction de l'activité de la cellule et des phases du cycle cellulaire.
En interphase, il existe deux aspects grossiers de la chromatine:
Les cellules où l'essentiel de la chromatine est compacté et forme des mottes denses. L'ADN est suffisamment dense mais pas assez pour former des chromosomes.
On parle d'hétérochromatine. Elle est abondante dans les cellules quiescentes.
L'aspect plus lâche est appelé l'euchromatine. L'ADN est moins dense, comme
"ouvert". Les cellules sont en train de lire l'ADN et de synthétiser abondamment des protéines.
On a séquencé nos 46 chromosomes qui correspondent à 3,2 Milliards de paires de bases mais seules 5 à 10% codent pour des ARNm qui codent pour des protéines. Au cours de l'évolution, le nombre de paires a augmenté mais le contenant nucléaire n'a pas grandi. Il faut faire entrer 2m de molécule d'ADN dans une vésicule de 2 µm. Ce compactage possède un avantage d'être protégé contre les agressions.
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Il y a plusieurs membres dans la famille des histones. Cette famille de protéine intervient dans l'organisation et la compaction de l'information génétique. Ces histones appartiennent a des catégories: H1, H2A, H2B, H3 et H4. L'histone H1 est utilisée pour la compaction de la fibre de chrimatine.Ils interviennent dans le premier niveau de compactage de l'ADN. Elles sont hautement conservées au cours de l'évolution c- à-d que la structure primaire n'a pas été changée. Les histones ont comme caractéristique leur basicité. Elles sont chargées positivement et se lient grâce aux forces électriques aux acides
nucléiques chargées négativement en solution aqueuse. Les histones sont riches en groupement amine surtout dans ses queues amino-terminales (lysine).
Le compactage de l'ADN va se faire selon plusieurs niveaux hiérarchiques. L'ADN nu a diamètre de 2 nm.
Le premier niveau est appelé collier de perle ou nucléosome.
Ce collier va s'enrouler sur lui-même pour former une fibre de chromatine qui s'enroule sur elle- même: c'est le niveau deux.
146 nucléotides s'enroulent autour de l'histone octamère pour former le nucléosome (deux tours).
Celui-ci est donc fait de protéines et d'ADN. On passe de 2 m à 28 cm. à 4 cm et pour finir à 2µm.
Le problème est qu'une fois l'information fermée, il n'est plus possible de la lire.
Pourtant, à tout moment, on doit y avoir accès!
Il y a trois activités fondamentales qui sont liées à l'utilisation de l'ADN:
1. La transcription des gènes. C'est la photocopie de l'ADN en ARN.
2. La réplication de l'ADN. Il faut répliquer l'information pour la mitose.
3. La réparation de l'ADN. Pour éviter les maladies et dégénérescences, il faut réparer l'ADN. Il y a des enzymes qui détectent les bases défectueuses oxydées.
Ces trois activités nécessitent que l'ADN soit ouvert.
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La Régulation Épigénétique
On pensait pendant longtemps que la cellule ne pouvait pas fonctionner normalement si l'ADN est endommagé. Le cancer ne survenait que s'il y avait mutation. Si on a pas accès à une protéine par exemple qui stoppe la division cellulaire (P16), il peut y avoir apparition de tumeur au sein d'un organisme pluricellulaire.
L'ARNm est un intermédiaire entre le gène et la protéine alors que les autres ARN sont des acteurs de cette production protéique. Lorsqu'au premier niveau de compactage nucléosomal, on ne sait pas lire. Il faut le dérouler. Il est important de décompacter l'ADN.
L'ensemble des mécanismes moléculaires subtiles qui permettent de contrôler et de réguler l'accès de l'information par la machinerie transcriptionnelle et traductionnelles de réparation s'appelle la régulation épigénétique autour du génome. Cette régulation est héritable sans qu'il y ait
modification du gène.
Il y a deux grandes catégories de réactions biochimiques qui interviennent:
Il y a d'abord une modification directe de l'ADN
Une modification des queues amino-terminales des histones par des MPTs
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On sait que la méthylation (groupement méthyle -CH³) est une modification des molécules organiques dont les protéines mais également l'ADN. Parmi les bases
nucléotidiques, la Cytosine peut être
méthylée par SAM (S-Adénosine-Méthionine).
SAM va être le réactif des ADNméthylase.
Lorsque SAM donne son groupe méthyle, il se transforme en S-Adenosyl-Homocysteine qui se transforme directement en Homocysteine.
Ce dernier doit être re-méthylé en Méthionine ( AA essentielle ) qui en présence d'ATP va reformer SAM par la Met-synthéase qui a besoin de Vitamine B12. Et on a la méthylation qui se fait grâce au 5-Méthylène-Tetrahydrofolate-Réductase (5-MTHF) qui est produit à partir de MTHF. L'enzyme est la 5-MTHFRéductase.
L'Homocysteine est un métabolite intermédiaire "clé" de plusieurs voies métaboliques comme la méthylation. La Béta-CS qui a besoin de Vitamine B6 va donner la cystéine qui est nécessaire pour la production de glutathion réduit.
Notre alimentation intervient dans la régulation de l'information génétique.
Toutes les méthylations du métabolisme sont orchestrées par SAM. Une fois qu'il est utilisé a donné sont groupe méthyle, il se transforme en Homocysteine. Ce dernier peut s'accumuler s'il n'y a pas suffisamment de possibilité de re méthylation en Méthionine. La cause première du déficit est la carence en Vitamine B9. Lorsqu'on a observé que cette carence est due à l'ultra raffinage des céréales. L'Homocysteine est toxique pour les vaisseaux et les neurones.
eCette enzyme 5-10-MTHFR est l'objet d'un polymorphisme génétique c-à-d que 40% de la population a cette enzyme qui fonctionne mal. Il faut donc plus de Vitamine B9.
Généralement, il ne faut pas doser la vitamine B9 mais bien l'Homocystéine. On peut y avoir une quantité normale en Vitamine B9 mais une Hyper-Homocystéinémie due à un besoin plus conséquent en la Vitamine chez un individu
La Méthylation est intimement liée à l'alimentation et son défaut va entraîner un risque accru de cancer. Lorsque les gènes ont en amont dans leur domaine 5' une zone qu'on appelle promotrice qui joue le rôle d'interrupteur de la transcription. Il faut que cette zone promotrice y est. Si le
promoteur qui a beaucoup de cytosine voit la cytosine méthylée, l'interrupteur est bloquée: inhibition de la transcription.
La méthylation de la zone régulatrice promotrice d'un gène inhibe la possibilité d'utiliser ce gène. Par exemple, si c'est un gène qui code pour un ARNm qui code pour une protéine qui joue le rôle de stop lors de la mitose, il va y avoir tumeur.
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Cette méthylation est un phénomène qui permetd'effectuer l'inactivation d'un chromosome X.
Les femmes ont deux chromosomes et doivent en inhiber un. Il est vital qu'un des chromosomes se condense le maximum possible et il se fait pas la méthylation. Il se forme un amas qui s'appelle le corpuscule de Barr qui se colle à la lamine et qui permet de pouvoir identifier le sexe.
Des troubles de la méthylation se reflète par une hypercystéinémie entre autre qui sont associer aux cancers comme le pancréas.
Les promoteurs pour pouvoir être relié à une
régulation par méthylation doivent avoir un nombre important de cytosine dans leur séquence génétique. On peut le connaître par séquençage.
Les cellules cancéreuses essaient d'activer des gènes qui pourraient leur être utile pour leur mission de prolifération incontrôlée. Pour se faire, elles vont dé méthyler.
Une autre régulation plus subtile et complexe qui a monté le niveau de la complexité à un stade insoupçonné: les modifications des queues amino-terminales des histones.
La première modification est l'acétylation par un groupe acétate; vient ensuite la méthylation, la phosphorylation et l'ubiquitination.
La stabilité dépend d'interactions spécifiques entre les charges positives des histones et les charges négative de l'ADN. Les conditions sont normales lorsqu'il n'y a pas de MPT. Pour déclipser, on doit supprimer les charges positives: on met de l'acétate amenée par un groupe Histone-Acétique- Transférase en présence de Coenzyme A (dépendance de Vit B5) sur les lysines.
En régulant le degré d'acétylation, on peut contrôler l'ouverture ou la fermeture de l'ADN.
Les queues amino-terminales peuvent subir plusieurs MPT et la même AA peut être acétylée, méthylée, ubiquitinée ou phosphorylée! On peut créer un code Histone.
Toutes ces MPT peuvent donner un message, un ordre particulier: le code Histone. C'est un code qui permet d'ouvrir et de fermer l'ADN. On peut avoir des activations et des inhibitions des histones. Pour un nucléosome, on peut avoir plus de 4000
combinaisons possibles. Il existe des protéines lectrices du code histone qui reconnaissent les histones.
La première lésion épigénétique est
l'hyperméthylation de la Glutathion-Réductase qui réduit la Glutathion oxydée en Glutathion réduit.
L'H²O² se transforme en H²O par le couplage de GSH en présence de Sélénium pour donner de la GS. La méthylation du GPR augmente relativement.
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La réplication de l'ADN
Il existe plusieurs modèles pour essayer d'expliquer la réplication de l'ADN:
1. Le modèle semi-conservateur: chaque brin de la molécule ancienne sert de support pour pouvoir reconstruire un nouveau brin sur les deux molécules d'ADN produites.
2. Le modèle conservateur: la molécule ancienne sert de modèle où les deux nouveaux brins forment une nouvelle molécule.
3. Le modèle dispersif: les morceaux sont recopiés et recollés entre nouveau et ancien ADN.
Pour le prouver, on a produit des molécules d'ADN plus lourdes en utilisant l'isotope 15 de l'Azote. Au départ, on a cultivé pendant longtemps des bactéries dans de l'azote lourd: toutes les
molécules contenant de l'azote ont été synthétisées à partir de l'isotope dont l'ADN (les bases). Dans ces conditions, si on supprime le milieu avec de l'azote lourd, les molécules d'ADN vont être utilisées pour répliquer dans le cas de la division cellulaire et vont utiliser de l'azote normal. Il suffit de comparer l'évolution de la densité de l'ADN pour savoir quel modèle est prédominant à l'aide d'une centrifugeuse qui caractérisent les molécules par leur densité.
L'ADN va stagner dans la solution de Chlorure de Césium là où se situe le gradient à la densité de la molécule. Si on prend de l'ADN lourd, l'ADN sera au fond alors que le léger sera vers la surface.
Après avoir changé le milieu, on a une bande intermédiaire! On peut donc éliminer le modèle conservatif mais il pourrait être dispersif.
Au fur et à mesure que les bactéries sont cultivées dans la solution normales, on voit réapparaitre des bandes légères ce qui implique le modèle semi-conservatif. Chaque fois, dès la première réplication, les deux brin lourds se séparent et forment deux nouvelles molécules et ainsi de suite jusqu'à ce qu'il reste une portion réduite d'ADN lourd par rapport à l'ADN léger.
KORNBERG a conclu qu'il fallait pour répliquer l'ADN des nucléosides triphosphates, un support d'ADN, une ADN Polymérase et le Magnésium (cofacteur des enzymes ATPases comme l'ADN Polymérase).
La polymérase va hydrolyser deux fois les nucléosides pour former les nucléotides (catalyse enzymatique endergonique) ce qui consomme beaucoup d'énergie. Il y a formation de liaisons phosphodiesters entre l'hydroxyle 3' et le Phosphate en 5'.
Le problème est que les deux brins de l'ADN sont antiparallèles. On va voir que l'ADN polymérase lit 3' - 5' et synthétise 5' - 3' par complémentarité. Il y a donc deux enzymes qui lisent dans les deux sens: l'ADN Polymérase 1 et 2.
L'ADN Polymérase va trouver par hasard le nucléotide qui correspond à l'origine de la réplication.
Elle est très rapide (800 Nuc/s) et fait très peu d'erreurs. La mission de recopier de l'ADN est indispensable pour la survie de la cellule: toute erreur peut avoir des conséquences sur la structure primaire de la protéine!
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1. Il faut séparer les deux brins qui se fait par un complexeenzymatique appelé la Hélicase. Cette séparation fait
apparaitre un espace appelé l'œil de réplication . Pour l'ADN des procaryotes, il n'y a qu'un œil par molécule d'ADN et pour les Eucaryotes des centaines ou des milliers. Chaque angle (là où va commencer la réplication) se nomme la fourchette de réplication. La synthèse va commencer par une amorce d'ARN dans le sens 3' - 5' et se fait de façon continu.
2. Le brin tardif (dans le mauvais sens) va être synthétisé par petit morceau grâce au dépôt séquentiel de petits fragments d'ARN qui servent à rattacher les différentes parties de l'ADN répliqué. La synthèse du brin tardif se fait par petit fragments de même taille appelés fragments d'Okazaki qui vont être réduit par l'ADN Ligase par après. Chaque morceau va être lié à l'autre. Les fragments sont synthétisés à partir d'amorce d'ARN (primase). On a plus de chance de faire des erreurs avec les fragments d'Okazaki qu'avec le brin continu.
3. L'ADN Polymérase qui lit le brin 3' - 5' est continu et ne voit sa réplication interrompue qu'à son terme: on l'appelle tout simplement le brin continu.
L'ADN polymérase se relit et est capable de voir ses erreurs: c'est un système d'autocorrection lors de la synthèse. Il existe aussi des enzymes qui réparent. S'il n'y a pas de réparation, l'erreur est définitive et est stabilisée; on ne peux plus ou peu réparer l'ADN.
Chez les procaryotes, la synthèse est continue tant que la bactérie à tout ce qu'il faut pour sa survie.
La phase S est hautement régulée.
En µscopie électronique, on peut voir les yeux et la réplication de l'ADN. Il y a entre 3 000 et 300 000 nucléotides qui séparent deux yeux de réplication. Les yeux vont se rencontrer les molécules d'ADN vont pouvoir se séparer les unes des autres. http://www.youtube.com/watch?v=OjPcT1uUZiE
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Les yeux de réplications ont conservé quasi la même quantité d'ADN mais il y a une partie de la molécule qui ne va pas être synthétisé: ce sont les télomères. Ce sont les queues terminales des chromosomes qui sont représentées par des répétitions de séquences identiques. Le nombre de télomères estproportionnel à la longévité de l'espèce!! Ils déterminent le potentiel réductif. L'ADN polymérase va se placer sur le télomère pour commencer la réplication ne sait pas recopier une partie.
La seule manière de maintenir le potentiel réductif d'une cellule est de re synthétiser les unités télomériques. La télomérase est
capable de faire la télomérisation et ne se fait pas par l'ADN polymérase. On peut rallonger cette queue pour donner une certaine immortalité. Malheureusement, les cellules cancéreuses vont activer cette télomérase et augmenter leur longévité à défaut de tuer l'organisme.
C'est grâce à ces origines de réplication que l'on peut faire la réplication aussi rapide alors que ca devrait prendre 800h. En fonction de l'environnement, l'ADN peut être attaqué. Pour survivre, la cellule a du développer des structures de réparation. Moins on agresse l'ADN, plus on répare les erreurs, plus on reste jeune. Le mieux est de ne pas devoir réparer.
Il y a deux stratégies qui se complètent: réduire les agressions et augmenter les réparations.
Les mutations apparaissent quand un gène est
endommagé ou changé par n'importe quel moyen lorsqu'il altère le message génétique porté par le gène.
Le mutagène est un agent qui peut apporter une altération permanente dans la composition physique du gène ce qui change le message codé.
Il y a toute une série de mutagènes. Les UV vont faire des cross-linking en abimant les bases en les reliant entre elles. ces lésions font perdre de l'information. L'ADN polymérase doit alors deviner quels sont les nucléotides manquants; elle a donc 3/4 de rater son coup pour chaque nucléotide.
Ces mutations peuvent avoir soit un effet direct sur la protéine soit aucun effet:
1. Mutations silencieuses lorsque le codon changé est un synonyme de l'AA.
2. Mutations aucun sens lorsque l'AA est changée.
3. Mutation non-sens où le codon code pour l'AA stop!
4. Insertion d'une lettre. On change presque toutes les AA du reste de la chaîne ce qui a comme conséquence un changement radical de la protéine!
