La Pectine
Applications d’un polymère biodégradable dans le domaine de la santé
Mahé Joaquim 2018-2019
Thèse Pour le
Diplôme d’État de Docteur en Pharmacie
Sous la direction de Mme Pech Brigitte et co-direction de Mme Chambin Odile
Membres du jury VENIER Marie-Claire Président
PECH Brigitte Directeur CHAMBIN Odile Co-Directeur
BAGLIN Isabelle Membre
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LISTE DES ENSEIGNANTS de la Faculté de SANTÉ D’ANGERS
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et directeur du département pharmacie : Pr Frédéric Lagarce Directeur du département médecine : Pr Cédric Annweiler PROFESSEURS DES UNIVERSITÉS
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AUBE Christophe Radiologie et imagerie médicale Médecine
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BARON-HAURY Céline Médecine générale Médecine
BAUFRETON Christophe Chirurgie thoracique et cardiovasculaire Médecine
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BEYDON Laurent Anesthésiologie-réanimation Médecine
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CAROLI-BOSC François-Xavier Gastroentérologie ; hépatologie Médecine CHAPPARD Daniel Cytologie, embryologie et cytogénétique Médecine
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hospitalière Médecine
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prévention Médecine
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KEMPF Marie Bactériologie-virologie ; hygiène
hospitalière Médecine
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BRIOT Thomas Pharmacotechnie Pharmacie
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CONTRACTUEL
VIAULT Guillaume Chimie Pharmacie
RE M E RC IE M E N TS
À mon président de thèse,
Madame Marie-Claire Venier, pharmacien et professeur à l’UFR santé d’Angers. Merci de me faire l’honneur de présider ce travail de mémoire. Je vous remercie également pour les cours passionnants que vous avez pu nous apporter au cours de nos études en pharmacie. Veuillez trouver ici l’expression de mes sincères remerciements.
À mon directeur de thèse,
Madame Brigitte Pech, pharmacien et maître de conférence à la faculté́ de pharmacie d’Angers.
Vous m’avez fait le grand plaisir d’accepter la direction de cette thèse. Je tiens à vous remercier pour votre disponibilité́, vos conseils, votre aide et votre confiance. Veuillez trouver dans ce travail l’expression de mes sincères remerciements et de mon profond respect.
À mon co-directeur de thèse,
Madame Odile Chambin, pharmacien et professeur à la faculté́ de pharmacie de Dijon. Un grand merci pour votre écoute, votre gentillesse et votre accompagnement tout au long de la rédaction de ce manuscrit. C’est avec un grand plaisir que j’entame ma dernière année de thèse de science sous votre direction. Merci de me faire l’honneur et le plaisir d’être présente au sein du jury pour ce jour important.
À madame Isabelle Baglin,
Pharmacien et maître de conférence à la faculté́ de pharmacie d’Angers. Je souhaite vous exprimer ma gratitude pour avoir accepté́ de faire partie de ce jury.
À ma mère,
Qui est et sera mon idole de toujours. Tu es un exemple pour moi de courage, que ce soit dans ta vie professionnelle, personnelle ou sportive. Merci de l’éducation que tu nous as donné et de ton soutien au quotidien. Merci, de nous avoir appris dès le plus jeune âge que rien n’est acquis et que seul le travail paye. Tous les projets que j’ai pu entreprendre ont en partie pu être réalisé grâce toi.
À mon père,
L’homme du pacifique, je suis très fier de t’avoir comme père. Merci de l’amour et du soutien que tu as su me donner. Merci de m’avoir fait découvrir ta passion. Bien que nos conversations ne tournent qu’autour de la boxe, je sais que tu suis mon parcours avec attention.
À Monsieur Martial Brillant,
Merci de m’avoir donné autant de ton temps pour que je puisse réaliser mes ambitions sportives.
Je sais que nous aurions pu aller beaucoup plus haut, mais ce regret est largement compensé par ta rencontre, car tu es un homme d’exception, tout comme ta communauté.
À mes frères,
Ningel, dit l’homme à la chicha, Mendy, l’homme de la nuit, Vovo, notre petit bébé et Idriss notre petit éthiopien. Merci de l’amour et du soutien que vous me donnez. Je suis fier d’être votre grand frère et j’espère être à la hauteur.
À Leilanie,
Tu es la plus petite de la famille, mais certainement celle qui prend le plus de place. Merci, pour ta malice et ta joie de vivre.
À toute ma famille,
Merci pour les moments heureux partagés ensemble. J’espère qu’ils seront encore nombreux.
RE M E RC IE M E N TS
Aux amis,
Malcolm, mon plus vieil ami. Après toutes ces années et malgré́ l’éloignement, notre amitié́ reste la même que lorsque nous avions 12 ans. Je remercie également tes parents, Anne et Olivier, qui m’ont toujours accueilli comme un membre de votre famille.
Valentin, le beau goss thaïlandais. Merci pour ton amitié, elle compte énormément pour moi.
Promis un jour, je te règlerai toutes mes dettes.
Sébastien et Davy, grâce à vous mes années lycée ont été superbes. Je suis fier de vos parcours respectifs. J’espère qu’un jour, vous allez pouvoir jouer ensemble à la N-gage.
Sofiane, mon acolyte de la première heure. On s’est connu alors que nous n’avions pas un poil sur le menton et aujourd’hui c’est toujours le cas. J’ai également que des bons souvenirs avec toi. Je te souhaite tout le bonheur avec Cécile.
Samuel, je suis heureux d’avoir une petite crevette comme toi en ami. Bien qu’avec Sofiane nous t’ayons sauvé la vie plus d’une fois, c’est nous qui te sommes reconnaissant pour ton amitié.
Augustin, avec qui j’ai voyagé à Sunse, Chenou et Aht§$ta, les Bourget, avec qui j’ai appris à compter jusqu’à Serge en japonais, Wahiba, qui a toujours été comme une maman pour nous et Camille, qui est bien plus qu’une collègue.
À Camélia,
Qui aurait dit que notre rencontre à la BU conduise à une si belle aventure. Merci, d’avoir été présente toutes ces années. Merci, pour ton soutien et ton amour. Pour ton humour, tes danses, tes chants, ta gentillesse et ta générosité au quotidien. Merci de supporter mes retards, mes oublies, mon zouk love et mon sweat à capuche. C’est en partie grâce toi que je suis devenu « un homme » … ou du moins presque. Ma plus grande fierté est certainement d’avoir une femme comme toi à mes côtés.
Sommaire
LISTE DES ABREVIATIONS INTRODUCTION
PARTIE I : LES PECTINES
1. Les pectines dans le monde végétal 1.1. Paroi cellulaire
1.1.1. Lamelle moyenne 1.1.2. Paroi primaire 1.1.3. Paroi secondaire
1.2. Rôle de la pectine dans les tissus végétaux 1.3. Synthèse des polysaccharides
1.3.1. Synthèse in situ de la cellulose
1.3.2. Synthèse golgienne des autres polysaccharides 1.3.3. Modifications enzymatiques
2. Structure et propriétés physiques 2.1. Structure de la pectine
2.1.1. Monomères d’acide galacturonique 2.1.2. Biopolymère de pectine
2.1.3. Degré d’estérification
2.2. Propriétés physiques de la pectine 2.2.1. Solubilité
2.2.2. Propriétés stabilisantes 2.2.3. Propriétés viscosifiantes 2.2.4. Propriétés gélifiantes
a) Pectine HM b) Pectine LM 3. Source et production 3.1. Extraction
3.1.1. Hydrolyse en milieu acide 3.1.2. Extraction par micro-ondes 3.1.3. Extraction enzymatique
3.1.4. Extraction par chauffage assisté par ultrasons 3.1.5. Extraction avec des agents de chélation 3.1.6. Autres méthodes d’extraction
3.2. Dé-ésterification de la pectine 3.2.1. Dé-estérification alcaline 3.2.2. Dé-estérification acide
3.2.3. Dé-estérification enzymatique
PARTIE II : MODIFICATIONS DE LA PECTINE 1. Substitution
1.1. Réactions d’alkylation
1.1.1. Alkylation des fonctions acides carboxyliques 1.1.2. Alkylation des groupements hydroxyles 1.2. Réactions d’amidation
1.3. Autres substitutions 1.3.1. Quaternisation 1.3.2. Thiolation 1.3.3. Sulfatation 1.3.4. Oxydation
2. Copolymérisation par “grafting from”
3. Réticulation 4. Dépolymérisation
4.1. Dépolymérisation chimique 4.2. Dépolymérisation physique 4.3. Dépolymérisation enzymatique 4.4. Déméthoxylation
5. Modifications enzymatiques
PARTIE III : PROPRIETES PHARMACOLOGIQUES DE LA PECTINE 1. Activités hypolipémiante et hypoglycémiante de la pectine 1.1. Activité hypolipémiante
1.2. Activité antidiabétique de la pectine
2. Traitement de la diarrhée chronique chez l’enfant par la pectine 3. Élimination de métaux toxiques par la pectine et la pectine modifiée 4. Activités anti-cancéreuses
4.1. Activités anti-cancéreuses de la pectine, par activation de la caspase-3 4.2. Activités anti-cancéreuses de la pectine modifiée, par interaction avec les galectines-3
4.3. Activités anticancéreuses de la pectine et de la pectine modifiée, par stimulation du système immunitaire.
PARTIE IV : PECTINE COMME SUPPORT DE SUBSTANCES ACTIVES 1. Pectine et les différentes voies d'administration de médicaments 1.1. Voie d’administration entérale
1.1.1. Anatomie et physiologie du système digestif 1.1.2. Intérêt de l’utilisation de la pectine par voie orale 1.2. Voie d’administration nasale
1.2.1. Anatomie et physiologie des voies nasales
1.2.2. Intérêt de l’utilisation de la pectine par voie nasale 1.3. Voie d’administration oculaire
1.3.1. Anatomie et physiologie de l’œil 1.3.2. Intérêt de la pectine par voie oculaire 1.4. Ciblage du cancer, par voie parentérale 2. Formulations à base de pectine
2.1. Comprimés
2.2. Microencapsulation 2.3. Nanoencapsulation 2.4. Polyplexes
2.5. Ingénierie tissulaire 2.6. Pansements
CONCLUSION
ANNEXES
BIBLIOGRAPHIE LISTE DES FIGURES LISTE DES TABLEAUX LISTE DES SCHEMAS
Liste des abréviations
Aa : Acide aminée PAE : Pectine acétylestérase CAP : Cellulose acétate phthalate PCM : pectine de citron modifiée Ce IV : Oxyde de chrome VI PE : Pectine-estérase
DA : Degré d’acétylation PG : Polygalacturonase DAm : Degré d’amidation PGL : Pectate lyase DISC : Complexe de signalisation de la
mort cellulaire PMG : Polyméthylgalacturonase
DM : Degré d’estérification PSA : Prostate Specific Antigen
DMSA : acide dimercaptosuccinique PSADT: Prostate Specific Antigen Doubling Time DMSO : Diméthylsulfoxyde RI : Récepteur membranaire à l’insuline
EDAC : 1-éthyl-3-(3-diméthylamino-
propyl) carbodiimide SR : Solution de réhydratation
EDTA : TAG : Triglycéride
Fe III : Oxyde de fer III TiO2 : Oxyde de titane Fe2O3 : Oxyde ferrique TLR4 : Toll-like recepteur 4 GSK3 : Glycogène synthase 3 kinase UV : Ultraviolet
HCl : Acide chlorhydrique VV : Oxyde de vanadium V HM : Hautement estérifié
HP : Haute pression
HPMCP : Hydroxypropylmethyl cellulose phthalate
HT : Haute température IL : Interleukine
LDL : Low density lipoprotein LM : Faiblement estérifié LPS : Lipopolysaccharide NHS : N-hydroxysuccinimide NF-kB : Facteur nucléaire kappa B PA : Principe actif
Introduction
Depuis toujours « l’amélioration de la qualité de vie » est au centre des préoccupations humaines. C’est dans cet environnement que la recherche tente de faciliter le quotidien de chacun en inventant continuellement de nouveaux matériaux plus performants et répondant aux exigences et contraintes de l’époque. Dans le premier quart du 20ème siècle, cette recherche a ainsi conduit à la découverte des matières plastiques (Rutot 2004). Aujourd’hui, ces matériaux ont envahi notre quotidien et il apparait comme inimaginable de vivre sans. En effet, ces matériaux sont présents dans de très nombreux domaines comme l’agroalimentaire, l’automobile, le bâtiment ou encore dans des secteurs de pointe comme l’aéronautique ou la santé.
Cependant, ces matières polymères issus de l’industrie pétrochimique peuvent mettre jusqu’à 600 ans pour se décomposer dans la nature, ce qui impacte fortement notre environnement. En effet, chaque année en France environ 100 kilos de plastiques sont produits par habitant. Malgré les 3 voies de valorisation des matières plastiques usagées (recyclage, valorisation chimique et énergétique) (Rutot 2004), 50% de ces produits finiront enfuis ou dans la nature, contribuant à la formation d’un 7ème continent dans l’océan pacifique. Cette détérioration de notre environnement a un impact direct sur notre « qualité de vie ».
Pour répondre à cette problématique la recherche se tourne désormais vers l’émergence des polymères biodégradables. Ces nouveaux matériaux auront ainsi la possibilité d’être dégradés par la nature avec des durées beaucoup plus réduites. On peut différencier ces polymères biodégradables en deux grandes classes : les polymères biodégradables d’origine fossile et les biopolymères biodégradables originaires des ressources renouvelables. Avec le prix du pétrole en constante augmentation, et les réserves de cette ressource limitées dans le temps (Wei 2016), l’utilisation de ressources renouvelables apparait alors comme une alternative séduisante. Produites en très grande quantité dans la nature, ces ressources ont l’avantage que leur dégradation ne participe pas à l’augmentation de l’effet de serre. Ces biopolymères sont séparés en 3 grandes familles en fonction de leur origine : végétale, bactérienne, ou semi-synthétique (polymérisation de monomères issus des ressources végétales). Parmi ceux issus des ressources renouvelables, les polysaccharides forment la classe de biopolymères la plus répandue et utilisée, avec comme fer de lance la cellulose.
Cependant d’autres polysaccharides font également l’objet de nombreuses recherches comme l’alginate, ou encore la pectine. Ainsi on peut observer que les publications portant sur ces
Malgré cette progression, peu de documents de synthèse sont consacrés à la pectine.
Ainsi, l’objet de cette thèse est donc de proposer une vue d’ensemble sur les origines et les propriétés de la pectine, tout en passant en revue ses modifications et ses applications en particulier dans le domaine pharmaceutique.
Le premier chapitre de cette thèse présentera les origines et le rôle de la pectine à l’état naturel, ainsi que sa structure et ses propriétés physico-chimiques. Seront également présenté les différentes méthodes d’extraction.
Le deuxième chapitre proposera une vue d’ensemble des différentes modifications physiques, chimiques et enzymatiques de la pectine.
Le troisième chapitre portera sur les propriétés pharmacologiques de la pectine et de ses dérivés.
Le quatrième chapitre concernera l’intérêt de la pectine dans les diverses applications pharmaceutiques, tout en passant en revue les différentes formes galéniques à base de pectine.
Partie I : Les pectines
La pectine (Figure 1) est un polysaccharide qui a été découvert pour la première fois dans le jus de pomme par Vauquelin en 1790 (Chan 2017). Son nom est issu du mot grec ” pektikos” qui signifie se congeler ou se solidifier. Dans le monde végétal, la pectine est un biopolymère indispensable. Présente dans tous les végétaux et localisée au niveau de la paroi cellulaire, cette dernière assure la cohésion et la rigidité, en agissant comme ciment intercellulaire.
Figure 1. La pectine (Tilly 2010)
1. Les pectines dans le monde végétal
1.1. Paroi cellulaire
Les eucaryotes sont une famille d’êtres vivants regroupant des organismes uni- ou pluricellulaires. Cet ordre se distingue par la présence dans les cellules d’un noyau et généralement de mitochondries. On y distingue quatre grandes familles : les animaux, les champignons, les plantes et les protistes.
Les plantes se différencient principalement des autres, au niveau cellulaire par la présence de chlorophylle et de la paroi cellulaire. La paroi cellulaire (Schéma 1), assure une certaine rigidité indispensable au maintien de la pression osmotique intracellulaire, essentielle à la survie de la plante. Elle joue un rôle de premier ordre dans le transport, la sécrétion, l’absorption de substances et dans la défense de la plante face à des organismes pathogènes (bactéries, champignons, …). Elle est également la principale responsable de la taille et de la forme de la cellule. Sa structure (épaisseur et composition) est en relation avec la fonction de la cellule. Ainsi, elle permet souvent de distinguer les différents types cellulaires présents dans les tissus végétaux (tissu de soutien, tissu vasculaire, tissu assimilateur). La paroi cellulaire est composée de la paroi primaire, de la lamelle moyenne et de la paroi secondaire.
1.1.1. Lamelle moyenne
La lamelle moyenne est principalement composée de pectine. Elle réunit les parois primaires de deux cellules voisines. Également appelée substance intercellulaire, elle assure la cohésion entre les cellules (Raven 2008).
Schéma 1. Structure de la paroi cellulaire (Raven 2008) 1.1.2. Paroi primaire
La paroi primaire (Schéma 2) est composée de protéines, de celluloses, d’hémi- celluloses, de substances pectiques et d’eau. Présente dans toutes les cellules végétales, elle est la seule composante de la paroi cellulaire des cellules en croissance et en division et des cellules adultes participant à la respiration, la photosynthèse et à la sécrétion. L’armature de fibres cellulosiques, qui la compose, comprend des microfibrilles de cellulose de 10 à 25 nm.
Ces fibres sont rattachées à des molécules d’hémicelluloses, de pectines et de glycoprotéines structurales. Les fibres de cellulose s’organisent sans orientation en s’entremêlant, formant une structure dispersée. En association avec le calcium, les molécules de pectine ont pour rôle de retenir l’eau, donnant un aspect de gel hydraté. Cette paroi riche en eau conserve sa plasticité, tout en étant rigide. Ainsi, lorsque la paroi cellulaire est composée uniquement de la paroi primaire, les cellules ont le possibilité de se diviser et de perdre leurs fonctionnalités pour de nouveau se différencier (Raven 2008).
1.1.3. Paroi secondaire
La paroi secondaire est principalement formée d’un réseau fibrillaire de cellulose, d’hémicellulose et de lignine (pour le bois). Elle se forme lorsque la cellule a cessé de croître.
De structure rigide, elle joue un rôle important pour les cellules impliquées dans la conduction de l’eau et la consolidation des tissus. La paroi secondaire est composée de 3 régions, distinctes, caractérisées par des orientations fibrillaires différentes (Raven 2008).
Schéma 2. Structure de la paroi primaire (Chan 2017) 1.2. Rôle de la pectine dans les tissus végétaux
La pectine joue un rôle important dans la rigidité et la structure du tissu végétal. Elle est retrouvée dans la paroi primaire et la lamelle moyenne impliquée dans l’adhésion cellulaire.
Dans ces zones, ce biopolymère forme un réseau plus ou moins lâche, dépendant du type cellulaire, stabilisé par des liaisons cationiques et hydrogène décrites dans la partie “Propriétés physiques” (cf. page 11). La pectine joue également un rôle dans la défense de la plante.
Lorsqu’un agent pathogène digère la paroi cellulaire par l’intermédiaire d’enzyme, la pectine est le premier substrat. Les enzymes sécrétées par ces agents dégradent la pectine et libèrent des oligogalacturonides. Ces molécules agissent ensuite comme des molécules de signal initiant la réponse immunitaire de la plante, stimulant ainsi la production de molécules oxygénées (H2O2 et O2), d’inhibiteurs de protéase et d’antimicrobien comme la phytoalexine (Chan 2017). La pectine influence aussi diverses propriétés des parois cellulaires telles que la porosité, la charge de surface, le pH et l'équilibre ionique en formant des réseaux et en piégeant des molécules de soluté qui permettent le transport ionique (Chan 2017).
1.3. Synthèse des polysaccharides
Tous les polysaccharides de la paroi cellulaire sont synthétisés à partir de la molécule d’UDP-glucose (Figure 2). L’Uridine diphosphate glucose (UDP-glucose) est un produit de dégradation du saccharose et/ou de l’amidon(Meyer 2008).
Figure 2. Représentation de la molécule d’UDP-glucose 1.3.1. Synthèse in situ de la cellulose
Un important complexe enzymatique, comprenant la cellulose synthétase, est associé à la membrane cellulaire. La cellulose synthétase polymérise l’UDP-glucose en chaîne de cellulose vers le compartiment extracellulaire. Les molécules de glucose sont reliées par des liaisons b 1-4 (Meyer 2008) (Schéma 3).
Schéma 3. Synthèse de la cellulose par la cellulose synthase (Raven 2008) 1.3.2. Synthèse golgienne des autres polysaccharides
La synthèse des pectines et des hémicelluloses est réalisée dans l’appareil de Golgi par l’intermédiaire d’enzymes. Les polysaccharides sont ensuite exportés vers la membrane plasmatique, via des vésicules golgiennes. Ensuite, les polysaccharides sont transportés vers la paroi cellulaire par exocytose (Meyer 2008) (Schéma 4).
1.3.3. Modifications enzymatiques
En fonction du rôle de la pectine dans le tissu cellulaire, celle-ci va subir différentes modifications pour adapter sa structure à son usage. Au niveau cellulaire, ce sont des enzymes qui vont intervenir et assurer ces modifications. Une des principales enzymes intervenant sur la pectine est la pectine methylestérase. Présente dans la plupart des cellules végétales, cette enzyme agit sur la déméthoxylation de la pectine.
Schéma 4. Synthèse golgienne des autres polysaccharides (Pratt)
2. Structure et propriétés physiques
2.1. Structure de la pectine
Bien que découverte il y a plus de 200 ans, la structure de la pectine fait encore l’objet de nombreuses études. L’importante hétérogénéité de cette famille de polymère et les limites technologiques rendent la caractérisation de sa structure difficile.
2.1.1. Monomères d’acide galacturonique
La pectine est majoritairement formée de monomères d’acide galacturonique (Figure 3A). Ce monomère est un acide uronique, obtenu par oxydation du carbone 6 du
une forme de pyranose galacturonique (Figure 3C). Cet hétérocycle est composé de 6 atomes : 5 de carbone et 1 d’oxygène. Les atomes de carbone qui composent le cycle, présentent une fonction hydroxyle en position C1, C2, C3 et C4 et une fonction carboxylique en C5. Dans les polymères de pectine, on retrouve principalement la forme D de l’acide galacturonique. En effet, la présence de carbones asymétriques dans cette molécule entraine une chiralité. La forme D indique un type particulier de stéréoisomère, où l’hydroxyle porté en C1 se positionne à droite (Walter 1991).
Figure 3. Représentation de la molécule de D-acide galacturonique (A), D-galactose (B) et du cycle pyranose (C).
2.1.2. Biopolymère de pectine
Ce biopolymère est principalement composé de monomères d’acide galacturonique, qui se polymérisent par des liaisons glycosidiques de type a 1-4 pour former des chaînes de pectine, dites région homogalacturonique à chaîne droite (Schéma 5). La liaison glycosidique ou osidique, met en jeux les fonctions hydroxyles du monomère en position C1 et C4. Cette liaison résulte de la condensation de 2 fonctions hydroxyles de 2 monomères différents avec l’élimination d’une molécule d’eau. Cette liaison de type covalente bloque la conformation des carbones asymétriques impliqués. La conformation a de ce biopolymère indique que les enzymes de l’homme, comme l’a-amylase, sont capables de la dégrader, a contrario de la conformation b présente dans la cellulose.
A B C D
Figure 4. Représentation de la molécule de rhamnose (A), arabinose (B), galactose (C) et xylose (D).
Plus de 17 autres monosaccharides peuvent entrer dans la composition de la pectine dans différentes proportions en fonction de l’origine de celle-ci. Ces monomères sont principalement : le rhamnose, l’arabinose, le galactose et le xylose (Figure 4) (Novosel’skaya 2000). En fonction de la répartition de ces sucres, deux autres types de régions sont identifiés sur la pectine (Schéma 5) (Annexe 1). La première, appelée rhamnogalacturonique I, correspond à une succession de 100, ou plus, unités de disaccharide de a-1,2-L-rhamnose-a- 1,4-D-acide galacturonique. La liaison osidique de ce dimère intervient sur les fonctions hydroxyles en position C1 et C2 du rhamnose et C1 et C4 de l’acide galacturonique. Dans la plupart des cas, l’hydroxyle en C4 du rhamnose sert de point d’ancrage des chaînes latérales.
Ces chaînes latérales sont principalement constituées de sucres neutres comme le galactose, xylose, mannose, …. La taille de ces chaînes varie d’un à 50 monomères de sucre et est dépendante de l’origine de la pectine (Chan 2017). Cette zone spécifique de chaînes latérales est encore nommée « régions ramifiées ». La dernière zone est appelée région rhamnogalacturonique II. Elle se différencie de la précédente par son squelette formé de monomères d’acide galacturonique. Cette zone fait également partie des régions ramifiées. En effet, des chaînes latérales sont greffées sur le squelette. Cette fixation est permise par la formation de liaison entre les hydroxyles en position C2 et C3 du monomère d’acide galacturonique et des sucres neutres par un réaction d’estérification (Novosel’skaya 2000).
D’autre part, les monomères d’acide galacturonique sont présents sous différentes formes dans le squelette pectinique. Leurs fonctions hydroxyles peuvent subir une réaction d’acétylation par l’acide acétique. Et leurs fonctions acides peuvent être amidées par une amine, formant la pectine amidée, neutralisées par des cations ou encore estérifiées (Figure 5). Ces modifications dépendantes de l’origine de la pectine auront un impact sur les
différentes propriétés de celle-ci. Ainsi, en fonction de ces modifications, la pectine est caractérisée par son degré d’acétylation (DA), d’amidation (Dam) et d’estérification (DE).
Schéma 5. Structure du biopolymère de pectine (Chan 2017)
Figure 5. Représentation des substitutions de l’acide galacturonique (Tilly 2010) 2.1.3. Degré d’estérification
Sur les chaînes linéaires, les fonctions acides carboxyliques des monomères galacturoniques peuvent subir une méthoxylation. Ainsi, il sera défini le degré de méthoxylation (DM) correspondant à la proportion des fonctions acides méthylées. Deux types de pectines sont alors identifiées les « pectines hautement méthylées » (HM), correspondant à plus 50% de méthylation des fonctions acides, et les « pectines faiblement méthylées » (LM), correspondant à moins de 50% de méthylation des fonctions acides (Novosel’skaya 2000) (Figure 6). Le DM de la pectine dépend de son origine végétale, du type de tissu et de la maturité de celui-ci. A l’état naturel, on retrouve essentiellement de la pectine HM avec un DM qui varie entre 60 et 90% (Walter 1991). Celui-ci a un rôle important dans la structure de la plante et dans les propriétés physiques de la pectine.
Figure 6. Représentation de la structure de la pectine (Tilly 2010) 2.2. Propriétés physiques de la pectine
La pectine est principalement utilisée dans l’industrie agroalimentaire et pharmaceutique pour ses propriétés physiques. Ces propriétés sont, comme dit précédemment, généralement dépendantes de sa structure.
2.2.1. Solubilité
La structure de la pectine la rend insoluble dans les solvants organiques et soluble dans l’eau. La solubilité dans l’eau est généralement dépendante de la distribution des groupements méthoxylés et de la masse molaire. La solubilité de la pectine augmente avec la diminution du DM (Chen 2015) et pour les petites masses molaires de pectine (Thakur 1997). De plus, la présence de groupements chargés sur le polymère entraine des répulsions électrostatiques entre ces groupements chargés, ce qui diminue la formation d’agrégats et facilite sa solubilité.
L’ionisation de ces groupements se réalise lorsque la pectine est dans une solution au pH supérieur au pKa des fonctions carboxyliques de la pectine (pKa ≈ 3,5) (BeMiller 1986). Ainsi, un pH supérieur à 5,5 favorise la solubilisation de la pectine (Simpson 1984). La pectine se solubilise grâce à 3 étapes successives : hydratation, gonflement et dissolution (Chen 2015).
2.2.2. Propriétés stabilisantes
Les stabilisants sont des additifs qui permettent de maintenir l’état physico-chimique du produit. Ils stabilisent les phases non miscibles entre elles et évitent la séparation des constituants du produit. Trois stratégies sont envisageables pour obtenir cette propriété. La première consiste à augmenter la viscosité de la solution. La deuxième crée un réseau assurant le maintien en suspension des particules. La troisième masque les éléments qui peuvent interagir entre eux (Tilly 2010). Cette dernière est utilisée dans le cas des boissons laitières acides contenant des protéines, comme la caséine. En effet, ces protéines ont tendance à
chargent de façon dipolaire entrainant une attraction entre elles. Or, en présence de pectine, ces chaînes interagissent avec les charges positives des particules les empêchant de s’agglomérer (Schéma 6) (SKW Biosystems 2001).
Pour un pH< 4,6 les molécules de caséine vont se charger en partie positivement (pKi
caséine = 4,6) et former des particules dipolaires. Ces particules vont interagir entre elles en absence de pectine, puis précipiter.
Schéma 6. Stabilisation de boissons laitières acides par la pectine (Tilly 2010) 2.2.3. Propriétés viscosifiantes
La viscosité est la grandeur qui relie le taux de cisaillement à la contrainte. Les agents dits viscosifiants ont la propriété de modifier le comportement de la phase continue, sans former des zones de jonction contrairement aux gélifiants et certains stabilisants. La pectine HM possède cette caractéristique due à son haut poids moléculaire. Ainsi, on retrouve son utilisation dans les boissons fruitées (Tilly 2010).
2.2.4. Propriétés gélifiantes
La gélification est un procédé qui consiste à former un gel. On peut définir un gel comme
”un système colloïdal : les molécules gélifiantes sont des macromolécules qui forment un réseau en se solvatant. Ce réseau tridimensionnel solide contient entre ses mailles une phase liquide” (Wehrlé 2012).
a) Pectine HM
La gélification des pectines HM est permise par un ensemble de liaisons hydrogènes et d’interactions hydrophobes formant un réseau tridimensionnel, comprenant un solvant (Schéma 7).
Schéma 7. Zone de jonction des pectines HM lors de la gélification (Tilly 2010) Liaisons hydrogènes
Pour les chaînes de pectine HM, les liaisons hydrogènes interviennent entre les groupes méthoxyles, carboxyles et hydroxyles. Ces forces intra- et intermoléculaires, considérées d’intensité faible, représentent 70% de la force du gel (Tilly 2010). Cependant, l’énergie dégagée par ce type de liaisons n’est pas suffisante, les interactions hydrophobes sont donc indispensables à la formation du gel.
Intéractions hydrophobes
Les interactions hydrophobes sont essentielles à la formation d’un gel pour les pectines HM. Celles-ci impliquent les fonctions méthoxylées des monomères d’acides galacturoniques (Figure 6). Ainsi, le degré de méthoxylation de la pectine aura un impact sur le réseau formé.
Se situant au niveau des chaînes linéaires de la pectine, la longueur des zones de jonction tend à stabiliser le système colloïdal. A noter que les régions ramifiées, comprenant les autres sucres, limitent les zones de jonctions empêchant ainsi la précipitation des chaînes (Tilly 2010).
Facteurs affectant la gélification de la pectine HM
Le pH est un facteur affectant la gélification de la pectine. Lorsqu’il est inférieur au pKa des fonctions carboxyliques des acides galacturoniques (pKa ≈ 3,5), ces fonctions se retrouvent sous la forme non-ionisée, favorisant la formation de liaisons hydrogènes (Tilly 2010). La concentration en polyols (sucres) dans la chaîne de pectine joue également un rôle
dans les liaisons hydrogènes. Les sucres agissent comme un déshydratant facilitant le rapprochement des chaînes et donc la formation de liaisons hydrogènes. De plus, les interactions hydrophobes se retrouvent renforcées et stabilisées par la présence des sucres (El-Nawawil 1997).
b) Pectine LM
La pectine LM possède moins de 50% de fonctions carboxyliques qui sont estérifiées.
Celle-ci possède des interactions similaires à la pectine HM (liaisons hydrogènes et liaison hydrophobes). Cependant, la pectine LM est capable de former des liaisons de coordination en présence de cations donnant naissance à un réseau.
La présence de cations avec la pectine entraine la formation d’interactions entre les chaînes, formant des ponts cationiques. Ces associations sont responsables de la formation d’un gel (Ravanat 1980) (Schéma 8). La force de ces interactions est influencée par des facteurs intrinsèques (masse molaire, régions ramifiées, distribution des groupements méthoxylés, DM) et extrinsèques (pH, température et concentration en cation, nature du cation) (Capel 2005). L’influence du pH est importante lors de la formation de ce type de gel.
Pour un pH supérieur à 4,5, la pectine est chargée négativement par ses groupements carboxyles, ce qui assure une attraction électrostatique et la formation d’un gel en présence de cations (Capel 2006). Dans la littérature, plusieurs modèles se sont suivis pour décrire ces interactions. A noter que dans ces modèles, les régions ramifiées et les fonctions d’acides estérifiées sont des facteurs limitant des zones de jonctions. Ainsi, ce type de liaison est considéré comme stable lorsqu’au moins sept motifs de répétitions d’acide galacturonique se suivent et participent aux liaisons de coordination (Powell 1982).
Schéma 8. Mécanisme de gélification de la pectine LM (Tilly 2010)
Modèle « egg-box »
Ces interactions ont tout d’abord été décrites en 1973 par Grant dans le modèle « egg box » impliquant le cation calcium (Grant 1973) (Schéma 9). Dans ce modèle inspiré de l’alginate, des paires de chaînes hélicoïdales de pectine s’entremêlent autour des Ca2+ et sont maintenues par des liaisons de coordination. Ici, chaque cation forme 10 liaisons de coordination avec les oxygènes de deux chaînes : 8 oxygènes des fonctions hydroxyles et 2 oxygènes des fonctions carboxyliques (Grant 1973).
Schéma 9. Représentation du modèle « egg box » (Grant 1973) Modèle « shifted egg-box »
En 2001, Braccini et Perez ont remis en question le modèle « egg-box » pour établir le modèle « shifted egg-box » (Braccini 2001). En effet, il était très peu probable au vu de la littérature sur les complexes calcium-carbohydrate que le calcium forme autant de liaisons de coordination. Étant donné la complexité pour étudier la conformation d’un gel de polysaccharides, cette théorie a été envisagée par modélisation moléculaire. Ici, le calcium forme entre 7 et 9 (principalement 8) liaisons de coordination avec les oxygènes de deux chaînes de pectines. En 2011, Plazinski confirme ce modèle par simulation dynamique moléculaire sur un modèle calcium-oligoglucuronate (Schéma 10) (Plazinski 2011).
Schéma 10. Structure moyenne sur un modèle calcium-oligoglucuronate déterminée par simulation moléculaire dynamique (Plazinski 2011)
Approfondissement du modèle « shifted egg-box »
Une fois le modèle « shifted egg-box » admis, des études ont été réalisées pour définir le mécanisme d’association des chaînes de pectine en présence de cations divalents. Fang et al. ont tout d’abord étudié le mécanisme d’association des chaînes en présence d’une concentration croissante de calcium. Ainsi, ils ont démontré que la liaison de la pectine LM avec le Ca2+ est un processus en deux étapes. L'étape I correspond à la formation de monocomplexes entre les Ca2+ et les unités d'acide galacturonique. L'étape II représente la formation de dimères de « shifted egg-box » par appariement des monocomplexes (Fang 2008).Par la suite, Huynh et al. ont tenté d’approfondir le modèle en tenant compte des caractéristiques intrinsèques des cations divalents (M2+) induisant la gélification (le rayon ionique, la densité de charge, l’énergie d'interaction entre les molécules M2+ et les molécules d'eau, le nombre de coordination, etc.). Ainsi, il a été étudié différents types de M2+ (Ba2+, Ca2+, Mg2+ et Zn2+) pour établir le mécanisme d’interaction et la structure finale du réseau formé. L’étude par simulation dynamique moléculaire a montré que le cation divalent Zn2+ se fixe à un seul oxygène du groupement carboxylate et le Ca2+ et Ba2+ à deux oxygènes. A noter qu’aucun gel n’a été obtenu avec le Mg2+. Le mécanisme d’association proposé par cette étude est composé de 2 étapes : la formation de monocomplexes et de réticulations ponctuelles, puis la formation de dimères (Huynh 2016) (schéma 11), ceci en fonction du temps et/ou des concentration en pectine et en cations.
Schéma 11. Mécanisme d’association du polygalacturonate en présence de cations divalents (Huynh 2016)
3. Source et production
Les pectines sont une bio-ressource très disponible dans le monde végétal, comme vu précédemment. Cependant, les sources naturelles pour un usage industriel restent limitées.
En effet, les caractéristiques structurales, propres à chaque végétal, ne leur confèrent pas les mêmes propriétés pour des applications industrielles. Ainsi, en fonction des besoins industriels, la source ne sera pas la même. Le choix de la source se fait indépendamment de la quantité de pectine présente dans le végétal (Brudieux 2007) (Annexe 2). Les pectines sélectionnées ont une forte teneur en acide carboxylique. Les exigences dans l’industrie alimentaire et pharmaceutique sont au minimum de 65% d’acides galacturoniques (May 1990).
Actuellement, le marc de pomme et le zeste d’agrumes sont les principales sources commercialement acceptables (Thakur 1997).
La pectine a d’abord été utilisée pour ses propriétés gélifiantes. On la retrouve dans les confitures pour compléter celle issue du fruit. A l’origine, la production de pectine remonte au développement des manufactures de conserve. Les déchets produits comme les peaux et les noyaux ont été utilisés pour extraire la pectine. Ainsi, le développement du marché de la pectine a été étroitement lié à l’industrie de la conserve. Au vu de la quantité de résidus de fruits produits par l’industrie du jus et du cidre dans les années 1920 et 1930, de nombreuses entreprises ont été créées pour extraire la pectine de ces déchets. Les résidus de pomme se sont alors révélés très appropriés pour l’extraction (May 1990).
3.1. Extraction
La pectine fut isolée pour la première fois par J. Braconnot en 1825, mais ce n’est qu’au début du 20e siècle qu’elle est extraite de façon industrielle. D’abord pour compenser la faible teneur en pectine de certains fruits, aujourd’hui son usage s’est étendu dans le domaine pharmaceutique et agroalimentaire, notamment pour ses propriétés viscosifiantes, stabilisantes et gélifiantes (Tilly 2010). L’industrie utilise principalement des sources riches en pectine comme le marc de pomme (reste des pommes broyées et pressées) ou les écorces d’agrumes qui sont riches en propectine (précurseur de la pectine liée aux autres composants de la paroi primaire) et en acide pectinique. D’autres sources moins utilisées existent comme la betterave à sucre, la mangue et le fruit de la passion. Différentes techniques d’extraction ont été décrite en cherchant à optimiser les conditions opératoires en fonction de la source de la pectine (Annexe 3).
3.1.1. Hydrolyse en milieu acide
Le procédé d’extraction en milieu acide de la pectine consiste à hydrolyser le polymère, par cuisson en milieu acide des sous-produits issus de l’industrie du jus de fruits (Annexe 4).
Dans une première étape, l’hydrolyse acide dans une solution chaude va transformer la propectine en acide pectinique. Cette réaction chimique intervient au niveau des liaisons entre la propectine et les autres constituants de la paroi cellulaire. Il en résulte une fraction insoluble, comprenant l’acide pectinique, et une fraction soluble. La fraction insoluble est séparée, puis concentrée. Elle est ensuite mélangée avec de l’alcool (isopropanol) pour faire précipiter la pectine et former un coagulum. Celui-ci est lavé, séché et broyé pour obtenir une poudre. La pectine obtenue est généralement HM, elle devra subir une seconde étape de désestérification chimique pour devenir LM (Tilly 2010).
3.1.2. Extraction par micro-ondes
L’extraction par micro-ondes est une méthode qui réduit considérablement le temps et les coûts d’extraction par rapport à l’hydrolyse en milieu acide. En effet, 15 min de chauffage par micro-ondes est équivalent, en quantité de pectine extraite, à une extraction de 3h en milieu acide. De plus, l’extraction par micro-ondes limiterait les phénomènes de dépolymérisation de la pectine qui peuvent être observés lors de l’extraction acide (Fishman 1999).
Dans cette méthode, lors du chauffage par micro-ondes, la pression s’accumule dans le matériau à extraire. Cette pression modifie la structure cellulaire du résidu et permet une
meilleure pénétration des solvants d’extraction (acide citrique, acide chlorhydrique, acide nitrique) (Srivastava 2011; Dranca 2018).
3.1.3. Extraction enzymatique
L’extraction enzymatique de la pectine est effectuée par la pectinase. La pectinase est une enzyme extraite de micro-organismes et de champignons. Le traitement enzymatique intervient sur les liaisons osidiques de la pectine et assure leurs coupures. Cette action diminue la viscosité de la solution, facilitant la filtration et la centrifugation. Cette méthode d’extraction a l’avantage d’être moins polluante que les précédentes. De plus, les pectinases ont une réactivité spécifique à la pectine. Cependant, la production enzymatique reste coûteuse et la réaction est difficile à contrôler. Enfin, cette méthode peut entrainer une dégradation de la pectine et une perte de ses propriétés (Munarin 2012).
3.1.4. Extraction par chauffage assisté par ultrasons
L’extraction à chaud assisté par ultrasons est une méthode étudiée pour diminuer le temps d’extraction et augmenter le rendement par rapport aux méthodes classiques (hydrolyse en milieu acide). Cependant, les recherches portant sur ce type d’extraction restent limitées. En effet, il a été constaté que les ultrasons ont tendance à dégrader les polymères comme la pectine (Wang 2015).
En milieu liquide, le traitement par ultrasons conduit à un phénomène de cavitation.
Cela entraine la formation de bulles microscopiques instables qui vont imploser. Ce phénomène fait varier la température et la pression à proximité des bulles. Ces conditions modifient la structure du résidu mis en solution, ce qui permet une meilleure pénétration des solvants d’extraction.
3.1.5. Extraction avec des agents de chélation
La pectine est très répandue dans la lamelle moyenne. Dans cette zone, elle forme des liaisons avec des ions calcium, formant des pectates de calcium. Ainsi, cette caractéristique est utilisée pour l’extraction par les agents chélateurs.
Les chélateurs, comme l’éthylène diamine tétraacétate (EDTA), le cyclohexanediamine tétraacétate (CDTA) ou encore les tampons imidazole, vont capter le cation Ca2+ pour former un complexe. Cette capture entraine une désorganisation de la structure formée avec le cation et permet l’extraction de la pectine désolidarisée de la matrice. Cette extraction a l’avantage de ne pas endommager les chaînes de pectine. Cependant, la purification des chélateurs est
difficile. Et leur présence dans le produit final affectent les propriétés de gélification de la pectine (Munarin 2012).
3.1.6. Autres méthodes d’extraction
Il existe d’autres options pour l’extraction de la pectine comme l’extraction par l’autoclave, ou encore les procédés physiques comme le prétraitement par cuisson-extrusion.
3.2. Dé-ésterification de la pectine
Les pectines obtenues par extraction industrielle sont principalement sous la forme HM.
Les pectines LM existent à l’état naturel mais sont généralement obtenues par dé-estérification de la forme HM. Plusieurs méthodes existent pour obtenir cette modification : la dé- estérification acide, alcaline et ou enzymatique.
3.2.1. Dé-estérification alcaline
L'une des méthodes industrielles les plus couramment utilisées est la dé-estérification alcaline par l'ammoniac dans l'alcool. Cette méthode a pour résultat la formation d’une pectine LM et amidée (ALMP). Pour réaliser cette modification, d’autres dérivés de l’ammoniac peuvent également être utilisés comme l’hydroxylamine. Dans cette réaction, les monomères d’acide galacturonique estérifiés subissent une aminolyse entrainant la diminution progressive du DM, et l’augmentation du DAm (Figure 7). Deux avantages ont été identifiés avec cette méthode : le poids moléculaire de la molécule et les chaînes latérales comportant les sucres neutres restent inchangés après la modification. Ainsi, il a été suggéré que cette modification n’entrainait pas la dépolymérisation de la molécule de pectine (Chan 2017). La dé-estérification alcaline peut également être effectuée en utilisant de l’hydroxyde de sodium. La réaction de saponification est alors responsable de la dé-estérification. Cette voie est plus rapide et n’entraine pas la formation d’amide. Cependant, elle peut dégrader la molécule.
Figure 7. Mécanisme réactionnel de la dé-estérification alcaline (Chan 2017)
3.2.2. Dé-estérification acide
La dé-estérification acide est réalisée par des acides inorganiques forts comme l’acide chlorhydrique. La réaction d’hydroxylation intervient au niveau des fonctions esters de la molécule. Cette méthode a l’inconvénient d’intervenir aussi sur les liaisons glycosidiques de la pectine par hydrolyse ou ß-élimination, entrainant la dégradation du squelette. Concernant ces deux types de réaction de dégradation, il a été démontré que l’hydrolyse est pH dépendant (Krall 1998) et que la ß-élimination est température dépendante (BeMiller 1986). Ainsi, en contrôlant ces paramètres, la maitrise de la dépolymérisation est envisageable.
3.2.3. Dé-estérification enzymatique
La déestérification enzymatique est une voie de plus en plus populaire pour obtenir la pectine LM. En effet, elle apparait comme la stratégie la plus efficace et la plus écologique.
Plus important encore, cette stratégie est capable de produire une distribution aléatoire ou en bloc de monomères d’acide galacturonique non estérifié. La pectine méthyl-estérase est l’enzyme la plus utilisée par cette voie.
Deux mécanismes sont proposés pour la dé-estérification enzymatique de la pectine : - La réaction à chaîne unique, une seule enzyme se déplace de façon linéaire sur le squelette de pectine, de façon à produire des séquences de monomères dé-estérifiés.
- Le mécanisme à attaque multiple impliquant plusieurs enzymes sur la pectine, produisant des blocs plus courts de pectine dé-estérifiée (Chan 2017).
