Article pp.175-184 du Vol.25 n°3 (2005)

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L’ALIMENTATION ET LA VIE

Revivification de spores

de Clostridium perfringens stressées par un traitement thermique sublétal,

dans une matrice alimentaire, avant analyse microbiologique

A. Boubetra, F. Billaux

*Institut Scientifique d’Hygiène Alimentaire – 25, avenue de la République – 91300 Massy – France.

SUMMARY

Resuscitation of heat-injured Clostridium perfringens spores in model media Peptone water and minced meat are used as food matrix to heat-shock spores of C. perfringens at 85°C during 15 minutes. Three strains are used for this study. For the recovery of damaged spores, three types of experimental design are defined.

Many factors are studied; diluents, lysozyme, sodium hydroxide treatment, phosphates in diluents and time incubation of the primary-suspension.

These experiments showed that the presence of lysozyme at 10 µg/ml in selective and non-selective medium increases the recovery of stressed C. perfringens spores.

Before numeration, spores are sensitized by sodium hydroxide and incubated in the primary-suspension during 30 minutes at 37°C.

Type of diluent, presence or absence of phosphates in diluents and time incubation of primary-suspension have not a significant effect on the recovery of spores. This study showed that the recovery of heat-injured spores of C. perfringens depends on the strain and the matrix food.

Keywords

C. perfringens, spore, stress, resuscitation.

Dans chaque numéro, cette rubrique met en avant un article traitant d’un des aspects de la nutrition, du rôle des technologies agroalimentaires sur la qualité des aliments jusqu’à la

« cuisine », en passant par les problèmes nutritionnels, la toxicologie alimentaire, et plus générale- ment les conséquences sur la santé des pratiques alimentaires. Les articles retenus sont soit des travaux de synthèse de haut niveau faisant le point sur une question, soit des publications origina- les rendant compte de travaux de recherche appliquée récents apportant un regard nouveau.

La Société scientifique d’hygiène alimentaire (SSHA), société savante créée en 1904 pour contri- buer à la diffusion des connaissances en nutrition et sécurité sanitaire, est aujourd’hui formée de deux départements : l’Institut supérieur de l’alimentation (ISA) développe des actions de formation, d’information et de conseil ; l’Institut supérieur d’hygiène alimentaire (ISHA) propose un catalogue complet d’analyses (composants nutritionnels, contaminants, analyse sensorielle, microbiologie…).

Les propositions d’articles, remarques et suggestions peuvent être envoyées à : Claude Bourgeois

SSHA

Rue du Chemin Blanc, BP 138, Champlan F-91163 Longjumeau cedex Tél. : + 33 (0)1 69 79 31 50

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RÉSUMÉ

Deux matrices modèles, l’eau peptonée sans phosphates et la viande hachée, sont utilisées pour appliquer un stress thermique de 15 minutes à 85 °C à des spores de trois souches de Clostridium perfringens. La mise en place et la réalisation de 3 plans d’expériences, dans le cadre de la revivification des spores ainsi stressées, ont mon- tré que la présence de lysozyme à la concentration de 10 µg/ml dans le milieu de dénombrement, donne les meilleurs taux de recouvrement. Ces résultats sont obtenus après sensibilisation des spores à la soude et une incubation de la suspension- mère à 37 °C pendant 30 minutes et varient d’une souche à l’autre.

Le diluant utilisé pour réaliser la suspension-mère, la présence ou l’absence de phosphates dans ce diluant et le temps d’incubation de cette suspension n’ont aucun effet significatif sur la revivification des spores.

Mots clés

C. perfringens, spore, stress, revivification.

1 – INTRODUCTION

Des traitements physiques ou chimiques sont souvent utilisés en industrie agro-alimentaire pour rendre un produit microbiologiquement « sain » sans modifier ses qualités organoleptiques. De ce fait, les microorganismes présents dans l’aliment peuvent être soit détruits soit stressés. Dans un laboratoire d’analyse microbiologique, les lésions (létales ou sublétales) causées par ces traitements ont un effet direct sur le résultat de l’analyse. Une sous-estimation du nombre réel de microorganismes présents dans l’aliment est alors observée. Les bactéries stressées sont viables mais incapables de croître sur un milieu sélectif. Pourtant, après une lente récupération au sein de l’aliment, ces bactéries pourront se développer et être à l’origine de toxi-infections alimentaires. Le recouvrement des microorganismes stressés constitue un enjeu important. Cet enjeu est d’autant plus important que les microorganismes gardent leur pouvoir pathogène intact, ce qui constitue un réel problème de santé publique (SPECK et RAY, 1977 ; MOSSEL et CORRY, 1977 ; BRAUX et al. 1997).

Les traitements thermiques altèrent le système de lyse enzymatique du cortex des spores de C. perfringens. Ces dernières ont besoin de ce système composé de plusieurs enzymes pour leur germination (CHEN et al. 1997 ; URAKAMI et al. 1999 ; SHIMAMOTO et al. 2001).

Cette altération induit alors un besoin en lysozyme de la spore pour initier sa germination (CASSIER et SEBALD, 1969). Seules 1 à 2 % des spores de C. perfringens sont naturellement sensibles au lysozyme (BARACH et al. 1974, 1975). Pour augmenter cette sensibilité, des traitements sont effectués, avant l’ajout du lysozyme. La soude (ADAMS, 1973a) ou l’EDTA (éthylène diamine tetra acétate) (ADAMS, 1973b) ont été utilisés. Ces traitements augmen- tent considérablement le taux de germination des spores stressées thermiquement.

Le but principal de cette étude est la mise au point d’une méthode pratique de revivification des spores stressées par un traitement sublétal (traitement thermique) dans une matrice alimentaire. Deux matrices sont utilisées : la viande hachée et l’eau peptonée sans phosphates, ces derniers possédant une action négative sur la récupération des spores soumises à des températures supérieures à 80 °C [travaux non publiés]. Les facteurs étudiés sont le lysozyme ajouté dans le diluant et dans le milieu de dénombrement, le diluant (eau peptonée ou tryptone sel), la présence de phosphates dans le diluant et le temps d’incubation de la suspension-mère.

L’évaluation de la réparation de ces spores est réalisée au moyen de dénombrements en milieu sélectif et en milieu non sélectif.

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2 – MATÉRIELS ET MÉTHODES

2.1 Espèces bactériennes

Trois souches de C. perfringens obtenues sous forme de spores sont utilisées : R49, souche B1 (Professeur BEERENS, UER de pharmacie de Lille) ; R50, souche IPL 128 (Pro- fesseur CATTEAU, SERHMA-Institut Pasteur-Lille) ; R51, souche CIP 417/86.

2.2 Milieux de dénombrement

Milieu non sélectif : TSC base (Tryptone Sulfite Cycloserine sans antibiotique : Oxoid).

Milieu sélectif : TSN (Tryptone Sulfite Neomycine : Merck).

2.3 Diluants

Eau peptonée, composition pour 1 litre d’eau distillée : extrait de viande (Merck) 1 g, protéose peptone n° 3 (Difco) 10 g, NaCl (Merck) 5 g.

Tryptone sel, composition pour 1 litre d’eau distillée : tryptone (Oxoid) 1 g, NaCl (Merck) 8,5 g.

Ces 2 diluants sont utilisés avec ou sans addition de phosphates [Na 2HPO

4, 12 H₂O (Merck) 9 g, KH

2PO

4 (Merck) 1,5 g].

2.4 Matrices

Viande hachée de bœuf répartie, à raison de 20 g, en sachets (Grace-Cryovac NOP 101), congelée à – 24 °C et ionisée par électrons accélérés sous 5 kGy.

Eau peptonée sans phosphates.

2.5 Lysozyme

Solutions à 0,2 % et 0,1 % (M/V) en eau distillée, stérilisées par filtration (SIGMA).

2.6 Essais de revivification

2.6.1 Application du stress

Chaque suspension de spores diluée au 1/10^e en matrice, constitue l’échantillon.

Les échantillons sont répartis, à raison de 3 ml ou 3 g, en tubes stériles à vis en Pyrex. Les tubes sont complètement immergés pendant 15 minutes dans un bain d’eau réglé à 85 °C. Aussitôt après la fin du traitement, ils sont plongés dans l’eau froide.

2.6.2 Revivification

Les suspensions-mères sont préparées à partir des échantillons stressés en utilisant les diluants avec ou sans phosphates. Elles peuvent subir, ou non, un traitement à 45 °C pendant 15 minutes, en présence de NaOH (1 ml de NaOH 1M dans 10 ml de suspension- mère), suivi d’une neutralisation avec HCl (1 ml de HCl 1M dans les 11 ml précédents).

Le lysozyme est ajouté, ou non, à une concentration de 10 µg/ml, dans la suspension- mère (facteur lysozyme – diluant : 0,1 ml de la solution à 0,1 % dans 10 ml de suspension- mère), avant incubation à 37 °C pendant 30 ou 180 minutes (facteur suspension-mère).

Un ensemencement dans la masse est effectué en TSC base (variable) et en TSN (variable), avec ou sans lysozyme à une concentration de 10 µg/ml (facteur lysozyme –

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2.7 Plan d’expériences

Dans un premier temps, des plans factoriels fractionnaires ont été utilisés. Dans une seconde étape, des plans complets sont réalisés avec les facteurs principaux qui ressor- taient après analyse de la première étape.

Trois plans d’expériences sont utilisés pour cette étude.

2.7.1 Plan d’expériences n° 1

C’est un plan factoriel fractionnaire de résolution VI à 6 facteurs de 2 niveaux et 32 essais (fraction 1/2). Deux plans de ce type sont réalisés (2 souches, R49 et R51). L’eau peptonée sans phosphates est utilisée comme matrice pour ce plan d’expériences (modalités des facteurs : cf. tableau 1).

Tableau 1

Modalités des facteurs (plan d’expériences n° 1)

Table 1

Modality of factors (experimental design n° 1)

C’est un plan complet à 4 facteurs de 2 niveaux chacun. Il est réalisé pour confirmer les résultats du premier plan d’expériences. Deux matrices sont utilisées séparément (eau peptonée sans phosphates et viande hachée) avec trois souches (R49, R50 et R51).

Le traitement à la soude est systématiquement réalisé quand il y a présence de lysozyme. Le diluant utilisé pour la suspension-mère est l’eau peptonée avec phosphates (modalités des facteurs : cf. tableau 2).

Tableau 2

Table 2

Facteur Modalité

1 - Diluant 1 : eau peptonée 0 : tryptone sel

2 - Phosphates 1 : présence 0 : absence

3 - NaOH-HCl 1 : oui 0 : non

4 - Lysozyme-diluant (d) 1 : présence 0 : absence

5 - Suspension-mère 1 : 30 min-37 °C 0 : 180 min-37 °C 6 - Lysozyme-milieu (m) 1 : présence 0 : absence

1 - Phosphates 1 : présence 0 : absence

2 - Lysozyme-diluant (d) 1 : présence 0 : absence 3 - Lysosyme-milieu (m) 1 : présence 0 : absence

4 - Suspension-mère 1 : 180 min-37 °C 0 : 30 min-37 °C

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C’est un plan complet à 3 facteurs de 2 niveaux chacun. La matrice utilisée est la viande hachée et le traitement thermique est porté à 85 °C pendant 30 minutes pour augmenter l’intensité du stress. L’eau peptonée avec phosphates est utilisée comme diluant de la suspension-mère, comme précédemment, et les 3 souches sont utilisées (modalités des facteurs : cf. tableau 3).

Tableau 3

Table 3

3 – MÉTHODES STATISTIQUES

Toutes les valeurs numériques obtenues à partir des dénombrements sont transfor- mées en logarithmes décimaux [log de UFC (unité formant colonie)/g ou log de UFC/ml]

avant la réalisation des analyses statistiques. Les variables analysées sont le milieu TSC base et le milieu TSN.

Les effets des différents facteurs sont déterminés par analyse de variance avec un seuil de signification de 5 %. Les moyennes sont comparées par le test de Tukey, au risque 5 %, et classées en groupes homogènes.

Les analyses de variance et les comparaisons de moyennes sont réalisées avec le logiciel Minitab.

4 – RÉSULTATS ET DISCUSSION

Trois plans d’expériences sont utilisés pour cette étude. L’analyse de variance est réalisée indépendamment sur les résultats obtenus en milieu sélectif et en milieu non sélectif (2 variables : TSC base et TSN).

Cette analyse devait être réalisée sur la différence du nombre de colonies entre les 2 milieux mais dans ce cas aucun facteur ne ressort significatif : il existe toujours une dif- férence entre les 2 milieux, même après revivification. Cette différence est due essentiel- lement à l’effet lysozyme qui augmente le taux de récupération des spores présentes, en milieu sélectif (TSN) comme en milieu non sélectif (TSC base).

4.1 Plan d’expériences n° 1

L’analyse de variance sur l’ensemble des résultats pour les 2 variables ne montre pas d’effet significatif pour les phosphates, la suspension-mère et le diluant au risque

1 - Lysozyme diluant (d) 1 : présence 0 : absence 2 - Lysozyme milieu (m) 1 : présence 0 : absence

3 - Suspension-mère 1 : 180 min-37 °C 0 : 30 min-37 °C

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4.1.1 Effet du lysozyme

L’utilisation du lysozyme est, jusqu’à présent, le seul moyen indiqué dans la littérature pour améliorer la récupération des spores stressées thermiquement.

Plusieurs auteurs ont opté pour l’utilisation du lysozyme dans le milieu de dénombre- ment (ADAMS, 1973 ; ANDO et TSUZUKI, 1986 ; BARACH et al., 1975 ; GOULD, 1984). Son utilisation dans le bouillon de réparation, a également été décrite (FLOWERS et ADAMS, 1976).

L’analyse de variance des résultats montre un effet significatif de ce facteur. Cet effet est significatif seulement lorsque le lysozyme est introduit dans le milieu de dénombre- ment, avec P < 0,05 quels que soient le milieu et la souche utilisés. La présence du lysozyme induit une augmentation du taux de récupération comprise entre 0,65 et 1,32 (en log).

Le lysozyme dans le diluant ne présente aucun effet significatif.

L’interaction double [lysozyme milieu - lysozyme diluant] est également significative, avec P < 0,05, pour les 2 milieux (ou variables).

La comparaison des moyennes de cette interaction double confirme que le lysozyme dans le milieu de dénombrement donne significativement les meilleurs résultats (tableau 4). La présence simultanée du lysozyme dans le diluant et dans le milieu diminue l’efficacité de la récupération des spores et cette diminution est significative en TSN.

Tableau 4

Effet de l’interaction lysozyme milieu et lysozyme diluant en matrice eau peptonée (plan d’expériences n° 1)

Table 4

Effect of lysozyme medium and lysozyme diluent interaction in peptone water (experimental design n° 1)

4.1.2 Effet du traitement NaOH-HCl

La sensibilisation des spores au lysozyme par différents traitements a fait l’objet de plusieurs publications. Le traitement à la soude, à différents temps et températures, est le plus souvent décrit (ADAMS, 1973 ; ANDO et TSUZUKI, 1983 ; BARACH et al., 1975 ; IONESCO, 1978).

L’analyse de variance montre un effet significatif de ce facteur en milieu TSC base (P = 0,004) pour la souche R51. L’utilisation de ce traitement, en l’absence de lysozyme, empêche la formation de colonies et la moyenne des résultats obtenue en présence de ce traitement est inférieure à celle obtenue sans ce traitement.

Souche Variable Lym+

Lyd+

Lym+

Lyd –

Lym – Lyd+

Lym – Lyd –

R49 TSC base

TSN 2,56ab*

1,31b

2,84b 1,78c

2,24ab 1,08b

1,18a 0,25a

R51 TSC base

TSN 2,07ab

1,23b

2,87b 2,35c

2,24b 1,52b

0,87a 0,00a a, b, c, ab représentent les groupes homogènes du test de Tukey pour chaque souche et pour chaque milieu de dénombre-

ment.

Lym : lysozyme milieu, Lyd : lysozyme diluant, (+) : présence, (–) : absence.

* : log (UFC/ml).

a, b, c, and ab present the homogenous groups of Tukey’s test for each strain and each medium.

Lym : lysozyme medium, Lyd : lysozyme diluent, (+) : presence and (–) : absence.

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Cependant, bien que l’interaction [lysozyme milieu - traitement NaOH-HCI] soit non significative, l’analyse des moyennes montre que la meilleure récupération des spores est obtenue avec le lysozyme dans le milieu de dénombrement, après un traitement à la soude : 2,18 (en log) au lieu de 1,69 sans ce traitement, pour la souche R49 en TSN par exemple (résultats non présentés).

4.2 Plan d’expériences n˚ 2

Les analyses de variance sur l’ensemble des données en matrice eau peptonée sans phosphates confirment les résultats du plan d’expériences n° 1.

L’interaction double [lysozyme milieu - lysozyme diluant] a un effet significatif (P < 0,05) pour les trois souches. En présence du lysozyme dans le milieu de dénombrement uniquement, le recouvrement des spores est maximal, de 1,31 à 2,21 en log et en moyenne pour le TSC base et de 2,31 à 2,41 en log et en moyenne pour le TSN (tableau 5).

On notera aussi un effet significatif des phosphates pour la seule souche R50 (P = 0,028) : leur présence augmente, en moyenne, le taux de spores d’environ 0,70 (en log).

Tableau 5

Effet de l’interaction lysozyme milieu et lysozyme diluant en matrice eau peptonée (plan d’expériences n° 2)

Table 5

Effect of lysozyme medium and lysozyme diluent interaction in peptone water (experimental design n° 2)

Pour la matrice viande hachée, comme pour la matrice eau peptonée sans phosphates, l’analyse de variance montre un effet significatif du lysozyme dans le milieu pour la variable TSC base (P < 0,05 pour les trois souches). En présence de lysozyme, le taux de récupération des spores augmente, en moyenne, de 0,12 à 0,26 (en log) alors que ce facteur n’est pas significatif pour la variable TSN.

Pour cette matrice, l’effet du facteur suspension-mère est significatif pour 2 souches sur 3 en TSC base et en TSN. Une incubation de 180 minutes de la suspension-mère augmente la récupération des spores de 0,27 et 0,40 (en log), pour le TSC base, et de 0,27 et 0,38 (en log), pour le TSN, respectivement pour les souches R49 et R51. Il y aurait une réparation en dehors de l’action du lysozyme pour ces 2 souches, mais les temps de

Souche Variable Lym +

Lyd +

Lym + Lyd –

Lym – Lyd +

Lym – Lyd –

R49 TSC baseb

TSNb

2,79b*

1,83b

3,32b 2,31b

2,84b 1,77b

1,39a 0,00a

R50 TSC baseb

TSNb

2,87ab 2,11ab

3,45b 2,61b

2,49ab 1,69ab

1,24a 0,25a

R51 TSC baseb

TSNb

2,80ab 1,97ab

3,55b 2,98b

3,20ab 2,56ab

2,24a 0,57a a, b, ab représentent les groupes homogènes du test de Tukey pour chaque souche et pour chaque milieu de dénombrement.

* : log (CFU/ml).

a, b, and ab present the homogenous groups of Tukey’s test for each strain and each medium.

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Pour les deux matrices utilisées, l’effet du facteur lysozyme diluant est significatif pour une souche sur trois pour la variable TSN, alors que l’effet du lysozyme dans le milieu (pour la même variable) n’est pas significatif. L’apparition de cet effet peut s’expli- quer par une inhibition partielle de l’action du lysozyme, par la néomycine présente dans le TSN. La présence du lysozyme dans le diluant augmente le taux de spores de 0,65 (en log). Ces résultats confirment les travaux de (BARACH et al. 1974).

Pour confirmer les résultats obtenus en matrice viande hachée, un troisième plan d’expériences est réalisé.

4.3 Plan d’expériences n° 3

L’intensité du stress ne permet pas d’interpréter les résultats obtenus avec la souche R50, ainsi que les résultats obtenus pour les 2 autres souches (variable TSN).

Pour ces 2 souches, la comparaison des moyennes de l’interaction [lysozyme milieu - lysozyme diluant] montre que la présence du lysozyme donne significativement de meilleurs résultats qu’en absence du lysozyme. La présence du lysozyme, uniquement dans le milieu de dénombrement, permet d’obtenir le meilleur taux de recouvrement de spores avec une augmentation de 0,79 et de 0,64 (en log) pour les souches R49 et R51 (tableau 6).

Tableau 6

Effet de l’interaction lysozyme milieu et lysozyme diluant en matrice viande hachée (variable : TSC base) (plan d’expériences n° 3)

Table 6

Effect of lysozyme medium and lysozyme diluent interaction in minced meat (variable: TSC base) (experimental design n° 3)

L’effet du facteur suspension-mère est significatif pour la souche R51 uniquement en TSC base, avec une augmentation de 0,23 (en log) lorsque la durée d’incubation passe de 30 à 180 minutes.

5 – CONCLUSION

Cette étude a principalement permis de mettre en évidence l’action du lysozyme, pré- sent dans le milieu de dénombrement, sur les spores de C. perfringens stressées thermiquement. Cette action nécessite un traitement préalable de la suspension-mère à la soude. Ce travail montre également que le diluant, le temps d’incubation et la présence de phosphates, à l’exception d’une souche en matrice eau peptonée sans phosphates pour ce dernier facteur, n’ont aucun effet significatif sur la revivification des spores.

Souche Lym +

Lyd +

Lym + Lyd –

Lym – Lyd +

Lym – Lyd –

R49 1,64ab* 2,09b 1,34a 1,30a

R51 2,73b 3,00b 2,78b 2,36a

a, b, et ab représentent les groupes homogènes du test de Tukey pour chaque souche.

* : log (CFU/g).

a, b, and ab present the homogenous groups of Tukey’s test for each strain and each medium.

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Ces résultats permettent de préconiser la méthode de revivification suivante : – un traitement au NaOH pour sensibiliser une majorité de spores au lysozyme ; – une incubation dans l’eau peptonée tamponnée pendant (30 ± 5) minutes à (37 ± 1) °C ; – un ensemencement en milieu de dénombrement additionné de lysozyme (10 µg/ml).

En matrice eau peptonée sans phosphates, la présence du lysozyme augmente, en moyenne, le taux de spores de 1,81 (en log) pour le TSC base et de 2,36 (en log) pour le TSN. Pour la matrice viande hachée, cette augmentation est de 0,38 (en log) pour le TSC base, et nulle pour le TSN. On notera, pour cette matrice, qu’une incubation de 3 heures de la suspension-mère peut améliorer la récupération des spores. L’augmentation du nombre de colonies en milieu TSC base après ces 3 heures d’incubation n’est pas due à une croissance cellulaire mais à une réparation.

Un problème important, soulevé au cours de cette étude, est la différence entre le nombre de colonies sur TSC base (milieu non sélectif) et sur le TSN (milieu sélectif), après la revivification. Pour le TSC base, le taux atteint, par les 3 souches, varie de 2,23 à 3,12 (en log) en matrice eau peptonée et de 2,70 à 2,90 (en log) en matrice viande hachée.

Dans le cas du TSN, ce taux varie de 1,13 à 2,30 (en log) et de 2,38 à 2,42 (en log) respectivement pour l’eau peptonée et la viande hachée. Cette différence est sans doute due à l’action inhibitrice de la néomycine présente dans le milieu TSN sur le lysozyme. Au contraire, l’ajout de la cyclosérine dans le milieu TSC base n’a aucune influence sur l’action de cet enzyme, comme l’ont démontré (BARACH et al. 1974) et comme le confirme les résultats du tableau 7.

Ce travail a porté sur 3 souches de C. perfringens. Chacune de ces souches a donné des résultats différents : la R51 donne, après revivification, une augmentation de la récu- pération proche de 2 (en log), alors que cette augmentation est de 1 pour la souche R49, en eau peptonée sans phosphates. En matrice viande hachée cette augmentation est, par exemple, de 0,80 et de 0,60 (en log) respectivement pour les souches R49 et R51.

Tableau 7

Dénombrement des spores de C. perfringens stressées à 85 °C-15 min en eau peptonée tamponnée sans phosphates, en TSC base, TSC base + lysozyme (*) et TSC base + cyclosérine + lysozyme (*).

Table 7

Count of spores of C. perfringens injured at 85°C during 15 minutes in peptone water without phosphates, in TSC base, TSC base + lysozyme (*)

and TSC base + cycloserine + lysozyme (*)

Souches TSC base TSC base * TSC *

Souche R49 < 1^a 2,07 2,15

Souche R50 1 2,07 1,87

Souche R51 2,20 3,33 3,26

a : log (CFU/ml).

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RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

ADAMS D., (1973a). Sensitizations by ethyle- nediaminetetraacetate of Clostridium perfringens type A spores to germination by lysozyme. J. of Bacteriol. 116, 500- 502.

ADAMS D., (1973b). Requirement for sensiti- vity to lysozyme by Clostridium perfringens spores heated at ultrahightemperature.

Appl. Microbiol. 27, 97-801.

ADAMS D., (1974). Heated injury of bacterial spores. Adv. Appl. Microbiol. 23, 245-260.

ANDO Y., (1975). Effect of lysozyme on ionic forms of spores of Clostridium perfringens type A. J. of Bacteriol. 794-795.

ANDO Y., TSUZUKI T., (1983). Mechanism of chemical manipulation of the heat resis- tance of Clostridium perfringens spores. J.

of Appl. Bacteriol. 54, 197-202.

ANDO Y., TSUZUKI T., (1986). The effect of hydrogen peroxide on spores of Clostri- dium perfringens. Lett. Appl. Microbiol. 2, 65-68.

BARACH J.T., ADAMS D.M., SPECK M.L., (1974). Recovery of heated clostridium perfringens type A spores on selective media. Appl. Microbiol. 28, 793-797.

BARACH J.T., FLOWERS R.S., ADAMS D.M., (1975). Repair of heat-injured Clostridium perfringens spores during outgrowth.

Appl. Microbiol. 30, 873-875.

BRAUX, A. S., MINET J., TAMANAI – SHA- COORI Z., RIOU G., CORMIER M., (1997).

Direct enumeration of injured Escherichia coli cells harvested onto membrane filters.

J. Microbiol. Methods. 31, 1-8.

CASSIER M., SEBALD M., (1969). Germina- tion lysozyme dépendante des spores de Clostridium perfringens ATCC 3624 après traitement thermique. Ann. Inst. Pasteur Paris. 117, 312-324.

CHEN, Y., MIYATA S., MAKINO, S., &

MORIYAMA, R., (1997). Molecular characterization of a germination-specific mira- midase from Clostridium perfringens S40 spores and nucleotide sequence of the corresponding gene. J. Bacteriol. 179 (10), 3181-3187.

DUNCAN C.L., LABBE R.G., ROBERT R., (1972). Germination of heated and alkali-

altered spores of Clostridium perfringens type A by lysozyme and an initiation pro- tein. J. of Bacteriol. 109, 550-555.

DUNCAN C.L. STRONG D.H., (1968). Impro- ved medium for sporulation of Clostridium perfringens. Appl. Microbiol. 16, 82-89.

FLOWERS, R.S., ADAMS D.M., (1976). Spore membrane(s) as the site of damage within heated Clostridium perfringens spores. J.

of Bacteriol. 125, 429-434.

GOULD G.W., (1984). Injury and repair mechanisms in bacterial spores. In: The revival of injured microbes. Academic Press. 199-215.

IONESCO H., (1978). Initiation de la germination des spores de Clostridium perfringens par lysozyme. C R Acad. Sci. Paris série D. 659-661.

MOSSEL D. A. A., & CORRY J. E. L., (1977).

Detection and enumeration of sublethally injured pathogenic and index bacteria in foods and water processed for safety. Ali- menta-Sonderausgabe. 19-34.

SHIMAMOTO S., MORIYAMA R., SUGIMOTO K., MIYATA S., MAKINO S., (2001). Partial characterization of an enzyme fraction with protease activity which converts the spore peptidoglycan hydrolase (SleC) precursor to an active enzyme during germination of Clostridium perfringens S40 spores and analysis of a gene cluster involved in the activity. J. of bacteriol. 12, 3742-3751.

SPECK M. L., RAY B., (1977). Effect of free- sing and storage on microorganisms in forzen foods – a review. J. Food Prot. 40, 333-336.

TAN E. T., (1993). Clostridium perfringens, optimisation de la sporulation : conditions physico-chimiques et récupération de spores inoculées en milieux modèles.

Mastère Spécialisé en Biotechnologie et Hygiène des aliments ENSIA.

URAKAMI K., MIYATA S., MORIYAMA R., SUGIMOTO K., MAKINO S., (1999). Ger- mination – specific cortex-lytic enzymes from Clostridium perfringens S40 spores:

time of synthesis, precursor structur regu- lation of enzymatic activity. FEMS Micro- biol. Lett. 173 (2): 467-473.

Article pp.175-184 du Vol.25 n°3 (2005)

L’ALIMENTATION ET LA VIE

Revivification de spores

de Clostridium perfringens stressées par un traitement thermique sublétal,

dans une matrice alimentaire, avant analyse microbiologique

A. Boubetra*, F. Billaux*

2.1 Espèces bactériennes

2.2 Milieux de dénombrement

2.3 Diluants

2.4 Matrices

2.5 Lysozyme

2.6 Essais de revivification

2.7 Plan d’expériences

4.1 Plan d’expériences n° 1

4.2 Plan d’expériences n˚ 2

4.3 Plan d’expériences n° 3

A. Boubetra, F. Billaux