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Impact du niveau de ploïdie et de l’évolution des génomes sur le contrôle de la fréquence et de la distribution des évènements de recombinaison chez les
Brassicas
Alexandre Pelé
To cite this version:
Alexandre Pelé. Impact du niveau de ploïdie et de l’évolution des génomes sur le contrôle de la fréquence et de la distribution des évènements de recombinaison chez les Brassicas. Agronomie. Agro- campus Ouest, 2016. Français. �NNT : 2016NSARC125�. �tel-01492127v2�
Impact du niveau de ploïdie et de l’évolution des génomes sur le contrôle de la fréquence et de la distribution des événements de recombinaison chez les Brassicas
Maria MANZANARES-DAULEUX
Professeure, AGROCAMPUS OUEST, UMR INRA-UR1-AO IGEPP / présidente
Raphaël MERCIER
Directeur de recherche, INA-PG / rapporteur Andrew LEITCH
Professeur, University of London Queen Mary / rapporteur
Jacques DAVID
Professeur, SupAgro / examinateur Anne Marie CHEVRE
Directrice de recherche, INRA Rennes / directrice de thèse
Thèse AGROCAMPUS OUEST sous le label de l’Université Européenne de Bretagne pour obtenir le grade de DOCTEUR D’AGROCAMPUS OUEST
Spécialité Biologie et Agronomie
ThèseC-125 —2016-27 • PELÉ Alexandre
Alexandre PELÉ •
10 novembre 2016Impact du niveau de ploïdie et de l’évolution des génomes sur le contrôle de la fréquence et de la distribution des évènements de recombinaison chez les Brassicas
AGROCAMPUS OUEST • Institut supérieur des sciences agronomiques, agroalimentaires, horticoles et du paysage
65 rue de Saint-Brieuc – CS84215 – F-35042 Rennes Cedex Tél. : 02 23 48 50 00
www.agrocampus-ouest.fr
ÉCOLE DOCTORALE • Vie-Agro-Santé (VAS) LABORATOIRE D’ACCUEIL • Institut de génétique, environnement et protection des plantes (IGEPP) Impact du niveau de ploïdie et de l’évolution des génomes sur
le contrôle de la fréquence et de la distribution des événements de recombinaison chez les Brassicas
La recombinaison méiotique via les Crossing-Overs (COs) est le principal mécanisme permettant le brassage de la diversité génétique. Cependant, le nombre et la position des COs entre paires de chromosomes homologues sont stric- tement régulés, limitant la séparation des loci en sélection variétale. Dans le cas du colza B. napus, l’utilisation d’allo- triploïdes (AAC, 2n=3x=29), issus du croisement entre le colza (AACC, 2n=4x=38) et l’un de ses progéniteurs B. rapa (AA, 2n=2x=20), permet d’augmenter considérablement le nombre de COs entre chromosomes homologues A. L’objec- tif de cette étude était de déterminer les conséquences d’une telle variation sur la distribution des COs le long des chromosomes ainsi que d’identifi er des facteurs régulant ce phénomène. Suite à la production et à la caractérisation cyto- génétiques d’hybrides F1 présentant différents caryotypes, la recombinaison homologue a été évaluée par des analyses génétiques via des marqueurs SNPs physiquement ancrés sur l’ensemble du génome A. Nous avons montré que l’addi- tion du génome C chez les allotriploïdes conduit toujours à (1) la formation de COs surnuméraires, dont le nombre varie fonction des méioses mâle/femelle et du fond génétique, (2) une modifi cation des profi ls de recombinaison, notamment au voisinage des centromères, et (3) une réduction de l’intensité d’interférence. De plus, nous avons révélé que le contrôle génétique de ces variations est imputé à des chromosomes C spécifi ques et aurait divergé dans un contexte polyploïde.
Nous avons donc identifi é un levier permettant d’optimiser le brassage de la diversité génétique chez le colza.
Impact of ploidy level and genome evolution on the control of the frequency and distribution of recombination events in Brassicas
Meiotic recombination via crossovers (COs) is the main mechanism responsible for mixing genetic diversity. However, the number and position of COs between the pairs of homologous chromosomes are strictly regulated, limiting the loci separation in plant breeding. In the case of the rapeseed B. napus, the use of allotriploids (AAC, 2n=3x=29), resulting from the cross between rapeseed (AACC, 2n=4x=38) and one of its progenitors B. rapa (AA, 2n=2x=20), allows a substantial increase of the number of COs between homologous A chromosomes. The objective of this study was to determine the consequences of such a variation on the distribution of COs along the chromosomes and to identify factors regulating this phenomenon. Following the production and cytogenetic characterization of F1 hybrids with different karyotypes, homologous recombination was assessed by genetic analyzes via SNPs markers physically anchored on the whole A genome.
We showed that the additional C genome in allotriploids always leads to (1) the formation of extra COs, for which the number depends on the male/female meiosis and the genetic background, (2) the modifi cation of the recombination landscapes, especially in the vicinity of centromeres, and (3) the decrease of CO interference. In addition, we revealed that the genetic control of these variations is assigned to specifi c C chromosomes and could have evolved in a polyploid context.
We have therefore identifi ed a way to optimize the shuffl ing of genetic diversity in rapeseed breeding.
INRA 2012
Mots-clés : Brassicas, crossing-over, évolution des génomes, interférence, méiose, polyploïde, recombinaison
Keywords: Brassicas, crossover, genome evolution, interfe- rence, meiosis, polyploid, recombination
Malika AINOUCHE
Professeure, Université Rennes1 / membre invitée
A toi mon Dédé
Après ces trois années passées au sein de l’équipe “Biodiversité et Polyploïdie” de l’UMR IGEPP de l’INRA du Rheu, c’est un merveilleux chapitre de ma vie qui s’achève.
Celui-ci m’a permis de m’épanouir et fut une fantastique aventure tant sur le plan scientifique qu’humain, ce pourquoi je tiens à remercier chaleureusement les nombreuses personnes intervenues pendant ces trois années.
Avant d’entamer les remerciements de chacune des personnes ayant contribuée de près ou de loin à ce travail, je tiens à remercier l’ensemble des membres de mon jury, constitué de Raphaël Mercier, Andrew Leitch, Jacques David, Malika Ainouche et Maria Manzanares Dauleux, d’avoir accepté d’évaluer mon travail de thèse. Malika, Maria, je me dois de vous adresser des remerciements particuliers. Malika, tu faisais déjà partie du jury m’auditionnant pour l’obtention de la bourse INRA-BAP région Bretagne qui m’a permis de réaliser les travaux présentés dans ce Manuscrit, et je te remercie mille fois d’avoir cru en moi pour mener à bien ce projet. Maria, tu m’as formé (M2 amélioration des plantes et semences), conseillé (sur mon avenir) mais également conduit à rencontrer ma future directrice de stage, puis de thèse, lorsque je t’ai parlé de ma volonté de travailler sur la recombinaison, et pour tout cela je te suis sincèrement reconnaissant.
Comment ne pas poursuivre ces remerciements avec toi Anne-Marie (Chèvre). Tu auras été ma directrice de stage puis de thèse et bien plus que cela. Je me souviens parfaitement de notre première rencontre, toi me parlant de triploïdes, d’hybrides d’addition et de ta volonté de faire ce fameux “lien physique” avec la fréquence de recombinaison. Autant te l’avouer tout de suite, je suis parti de cet entretien la tête bien remplie sans être certain d’avoir tout compris au sujet de stage de Master 2 que tu me proposais. Pourtant, si le challenge de comprendre ce sujet était attrayant, c’est bien ta personne qui m’a définitivement convaincu de le mener à bien. En effet, en partant de cet entretien j’ai tout de suite eu le sentiment qu’avec toi “everything gonna be alright” comme dirait Bob Marley. Cela s’est très vite vérifié car autant que je me souvienne tu as toujours été là au cours de ce stage, puis de cette thèse, et même en congrès où tu m’as accompagné. J’ai bénéficié avec toi d’un encadrement exceptionnel et tu m’as accordé la liberté nécessaire à mon épanouissement.
Merci pour ton soutien, ta confiance, tes encouragements, ta positive attitude et tout simplement ta bienveillance qui m’a donné la force et la motivation de mener à bien ce projet.
Merci de m’avoir supporté (ce qui n’est pas une mince affaire) et de m’avoir remonté le moral aussi bien lors de résultats inattendus, où tu m’as enseigné la résilience face à l’échec, que sur le plan humain quand j’ai traversé des moments difficiles. J’ai apprécié chacun des moments passés en ta compagnie comme nos “ch’ta clopes” extrêmement prolifiques scientifiquement.
J’ai énormément appris à ton contact comme dessiner des cercles; pas pour faire de l’art plastique mais pour organiser mes idées. Tu auras été pour moi une véritable “maman de recherche” et tu vas énormément me manquer, mais je suis certain que nous resterons en contact encore longtemps.
Difficile de continuer ces remerciements sans mentionner Mathieu Rousseau-Gueutin.
En effet, même si tu n’es arrivé au sein de l’équipe qu’à la fin de ma première année de thèse, je te dois beaucoup car tu t’es immédiatement investi dans mon projet. Par tes idées et ta vision différente de celle d’Anne-Marie, je sais que ma thèse a gagné en qualité grâce à toi.
Merci également pour tout le temps que tu m’as accordé, comme dans la correction de mes drafts d’articles et d’avoir su me ménager (et me supporter) lorsqu’il fallait réécrire certains paragraphes. Merci aussi pour tes conseils avisés, ton soutien, ainsi que pour tous les bons moments que l’on a passés ensemble, comme lors de notre road trip à San Francisco après le congrès Plant & Animal Genome aux USA. Je garde plein de bon souvenir de ce super voyage avec toi et j’espère qu’on aura l’occasion de s’en faire d’autres. Par ailleurs, il va falloir que l’on finisse notre série (Les 100) que l’on a commencé là-bas, bref tout un tas de raisons pour continuer à rester en contact !
Sans chacun des membres de l’équipe “Biodiversité et Polyploïdie” ce travail n’aurait pu être aussi aboutit. Un grand merci à Gwenn Trotoux, Marie Gillet, Maryse Lodé, Sylvie Nègre, Jérôme Morice, Virginie Huteau, Olivier Coriton, Joseph Jahier, Frédérique Eber, Gwenaëlle Deniot et Cyril Falentin, qui m’ont apporté leur aide et connaissances pour mener à bien ce projet. Vous avez tous participé à ma formation en suivi des plantes, cytogénétique, biologie moléculaire et/ou bio-informatique et je vous en suis sincèrement reconnaissant. Un merci particulier à ceux qui m’ont apporté leur aide lors des gros travaux de prélèvement de feuilles, 3.000 plantes c’est loin d’être peu et grâce à vous j’ai pu tester toutes les hypothèses loufoques de ma thèse ! Merci également aux différents stagiaires et CDD qui ont fait partie de l’équipe pendant plusieurs mois et ont contribué significativement à l’avancé de mes
souhaite énormément de réussite dans vos projets futures, et vous remercie encore pour votre implication et la riche expérience humaine que vous m’avez offerte.
Plus généralement, je tiens à remercier tous les personnes de l’IGEPP que j’ai côtoyées au cours de ces trois années. Il m’est difficile de citer tout le monde mais je tiens à tous vous remercier pour votre soutien, nos discussions ou tout simplement pour votre bonne humeur. Merci d’abord à toutes les personnes de l’administration et notamment à Martine Launay et Pascale Le-Neve pour leur aide tout au long de ma thèse. Merci ensuite à toutes les personnes des serres et installations expérimentales qui se sont considérablement investis dans l’entretien de mes nombreuses plantes et plus particulièrement à Patrick Rolland qui m’a rendu bien des services. Un grand merci à Philippe Duffé pour son aide précieuse en début de thèse et de toujours avoir pris le temps de répondre à mes (nombreuses) questions. Merci également à Sophie Paillard, Régine Delourme ou encore Antoine Gravot pour nos discussions toujours très enrichissantes sur le plan scientifique et parfois un peu plus éloignées de la science (n’est-ce pas Sophie !). Enfin, merci à l’ensemble des doctorants et CDDs qui font, ou ont fait, partie du “Bureau du Fond” et avec qui j’ai partagé chacune de mes journées à l’INRA. Merci aussi bien aux anciens (Séverine Lemarié, Berline Fopa- Fomeju, Anne-Sophie Bouchet, Pascal Faes ou encore Carole Giorgetti), qu’à ceux encore présents (Yoann Aigu, Sylvain Dechaumet, Benjamin Liégard, Thanina Azibi et Erwan Corlouer), pour tous ces très bons moments ainsi que nos débats (scientifiques évidemment…
:p) provoqués notamment par les questions “existentielles” de Yoyo.
J’aimerais également remercier les personnes extérieures à l’UMR IGEPP qui ont participé à cette formidable aventure. D’abord, merci à chacun des membres de mon comité de thèse, constitué de Pierre Sourdille, Mélanie Jubaut, Armel Salmon, Frédéric Lecerf, Mathieu Falque, Christine Mézard et Éric Jenczewski, pour chacune de vos idées ou remarques qui ont permis d’orienter une partie de mon travail. Je tiens à adresser des remerciements un peu plus poussés à certains membres de ce comité. Un grand merci à mon tuteur VAS, Frédéric Lecerf, pour ses précieux conseils concernant mon avenir post-thèse ainsi que pour avoir eu la patience de m’initier au langage PERL (autant l’avouer, pas une mince affaire…). Un grand merci également à Christine Mézard pour nos discussions hors comité ainsi que de m’avoir donné l’opportunité de présenter mes résultats de recherche au XXIVème congrès Plant & Animal Genome. Un immense merci à Éric Jenczewski pour
chacune de nos discussions et surtout pour chacun de tes encouragements. J’ai pris énormément de plaisir lors de chacun de nos échanges et j’espère que l’on aura des opportunités de travailler ensemble à l’avenir (un post-doc par exemple… non non ce n’est pas un appel du pied :-p). Pour conclure sur les membres de mon comité, je tiens également à remercier Mathieu Falque pour son aide précieuse lors de la rédaction d’un de mes articles mais aussi pour sa grande pédagogie, comme lorsqu’il a cherché à m’expliquer le phénomène obscur de l’interférence. En dehors des membres de mon comité de thèse, je souhaiterais également remercier Olivier Martin pour sa contribution à l’un de mes papiers et pour sa disponibilité lors de nos échanges sur l’interférence et ce même à des heures tardives. De plus, je tiens à remercier l’ensemble du personnel de la plateforme GENTYANE et plus particulièrement Charles Poncet et Amélie Bertin pour avoir conduit un travail colossal lors de l’extraction ADN et du génotypage de l’ensemble de mes plantes. Enfin, un immense merci aux enseignants-chercheurs de l’unité pédagogique SVE de l’université de Rennes1 pour m’avoir permis de réaliser une mission d’enseignement au cours de ma thèse. Merci notamment à Alain Bouchereau, Laurent Leport et Francisco Cabello pour leurs conseils avisés et pour m’avoir donné le goût de l’enseignement.
Pour finir, je tiens à remercier mes proches, famille, conjointe et amis, qui m’ont soutenu, encouragé et supporté pendant ces trois années. Cette thèse c’est aussi grâce à vous tous ! J’ai une pensée particulière pour toi mon “Dédé” qui m’a poussé à aller aussi loin dans mes études. Tu ne pourras pas lire ni me voir soutenir cette thèse mais c’est à toi que je souhaite la dédicacer car penser à toi à chaque moment difficile ou stressant a été une véritable source de motivation et le sera pour tout ce que j’entreprendrai à l’avenir, merci pour tout.
ADN : Acide Désoxyribonucléique
ADNc : Acide Désoxyribonucléique complémentaire APC/C : Anaphase Promoting Complex/Cyclosome ARNi : ARN interférent
BAC : Bacterial Artificial Chromosome CDB : Cassure Double-Brin
CDK : Cyclin Dependent Kinase CO : Crossing-Over
CS : Complexe Synaptonémal djH : double jonction de Holliday EA : Elément Axial
EC : Elément Central EL : Elément Latéral ET : Elément transposable FDR : First-Division Restitution
FISH : Fluorescent In Situ Hybridization IMR : Intermediate Meiotic Restitution LF : Low Fractionated
MF1: Most Fractionated MF2 : Medium Fractionated miARN : micro-ARN NCO : Non Crossing-Over
NPR : Nodule Précoce de Recombinaison NTR : Nodule Tardif de Recombinaison Pb : Paire de bases
Ph1 : Pairing homoeologous 1
PrBn : Pairing regulator in Brassica napus QTL : Quantitative Trait Loci
RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism SDR : Second-Division Restitution
SDSA : Synthesis-Dependant Strand Annealing SEC : Second End Capture
SNP : Single Nucleotide Polymorphism WGD : Whole Genome Duplication
INTRODUCTION GÉNÉRALE ……… 1
CHAPITRE I. SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE ……….... 3
I. LA RECOMBINAISON MÉIOTIQUE ……….………. 4
I.1. La méiose, processus clé de la reproduction sexuée .……….……..…...……. 4
I.1.1. Prophase I de méiose, vers l’appariement des homologues ………....…….…….... 5
I.1.1.1. La mise en place de l’axe chromosomique …...………... 6
I.1.1.2. L’installation de la Synapsis ..………...………… 7
I.1.1.3. Les chiasmas, ultime connexion entre homologues …...……….………... 8
I.1.2. Progression de la méiose, vers la formation de gamètes équilibrés ……...………….… 9
I.2. Des cassures à la réparation, les mécanismes moléculaires de la recombinaison ….…. 10 I.2.1. L’initiation: la formation des Cassures Double-Brin de l’ADN ……….... 11
I.2.2. La maturation des Cassures Double-Brin de l’ADN ………... 13
I.2.3. L’invasion simple brin ……….……….……… 14
I.2.4. Les produits de la recombinaison méiotique …….…….……...……… 16
I.2.4.1. Les COs de Classe I dits “Interférents” ..……...……… 16
I.2.4.2. Les COs de Classe II dits “Non Interférents” .….……....…………...……...……... 18
I.2.4.3. Les Non Crossing-Overs .………..………...…………..…... 18
I.3. Régulation de la recombinaison méiotique ………..……….…….. 19
I.3.1. Comment détecter les évènements de recombinaison ? ……….. 20
I.3.2. Une limitation du nombre de Crossing-Overs ………..……… 21
I.3.2.1. Les voies anti Crossing-Overs ..……...……… 22
I.3.2.2. Le phénomène d’interférence ………...……..……….……….... 23
I.3.3. Une distribution non homogène des Crossing-Overs ………..……… 24
I.3.3.1. Facteurs génomiques ...……….…...………... 25
I.3.3.2. Facteurs épigénétiques ..………...………...………….……...……..… 26
I.3.4. Comment moduler le nombre et la distribution des Crossing-Overs ? ..………..……. 27
II. LA RECOMBINAISON MÉIOTIQUE CHEZ LES POLYPLOÏDES ..……….……..……. 28
II.1. La polyploïdie chez les Angiospermes ……….………..……..……… 29
II.1.1. Définition ....………..……….……….……….. 29
II.1.2. Formation des polyploïdes ……….……….…………... 29
II.1.3. Importance et avantages évolutifs .….……….…...……….………….. 30
II.1.4. Dynamique des génomes polyploïdes …..……….….…….…. 32
II.1.4.1. Des modifications structurales ...……….…...………... 33
II.1.4.2. Des modifications fonctionnelles ....……..……….……...……..… 36
II.2. Le challenge de la méiose chez les polyploïdes ....…..……… 38
II.2.1. La recombinaison méiotique chez les autopolyploïdes ……….……….…… 38
II.2.2. La recombinaison méiotique chez les allopolyploïdes ……….………... 40
II.2.2.1. Régulation de la recombinaison homéologue ...………. 40
II.2.2.2. Régulation de la recombinaison homologue .….……....………….……....………… 41
III. LE COLZA, MODÈLE POLYPLOÏDE D’ÉTUDE DE LA RECOMBINAISON …………..………… 43
III.1. Origine, importance économique et amélioration du colza ……….… 43
III.2. Structuration du génome du colza ……….……… 45
III.3. La recombinaison méiotique chez le colza ..………. 46
III.3.1. Régulation de la recombinaison homéologue ....……….……….…………..…… 46
III.3.2. Régulation de la recombinaison homologue ……….……... 48
IV. OBJECTIFS DE LA THÈSE ……….………..……...…. 50
CHAPITRE II. EXTRACTION DE LA COMPOSANTE DIPLOÏDE AADU COLZA B. NAPUS … 52 I. PRÉAMBULE ………...………...……… 53
II. ARTICLE 1: “The poor lonesome A subgenome of Brassica napus L. var. Darmor (AACC) may not survive without its mate” …...………...…………..…..………. 54
III. CONCLUSION ....……….………..………..……… 66
CHAPITRE III. IMPACT DU NIVEAU DE PLOÏDIE SUR LA RECOMBINAISON ……… 67
I. PRÉAMBULE ...………..……….. 68
II. ARTICLE 2: “A polyploid ticket to overcome the crossover number limit and dramatically reshape crossover landscapes” ...……….………..……… 70
III. RÉSULTATS COMPLÉMENTAIRES: “Étude de l’état de compaction et de méthylation de l’ADN chez les hybrides AA et AAC” ………..………..……… 109
IV. CONCLUSION .………..…… 112
CHAPITRE IV. IMPACT DE L’ÉVOLUTION DES GÉNOMES SUR LA RECOMBINAISON ... 113
I. PRÉAMBULE ...……….………...……… 114
II. ÉTUDE DES DÉTERMINANTS GÉNÉTIQUES IMPLIQUÉS DANS LES VARIATIONS DE RECOMBINAISON CHEZ LES HYBRIDES AAC..………..……..………. 116
III. CONCLUSION ………..……… 136
CHAPITRE V. DISCUSSION GÉNÉRALE …….……….……… 137
I. APPORTS ET PERSPETIVES POUR LA RECOMBINAISON ………..…..……….. 138
I.1. Origine et Classes des COs surnuméraires ………..……….……..…..…… 138
I.2. Désignation des nouveaux sites de recombinaison ……….……..…..……. 140
I.3. Identification de déterminants génétiques ………..….….…...……. 142
II. APPORTS ET PERSPETIVES POUR LA POLYPLOÏDIE ……….……….………. 144
II.1. Évolution des génomes dans un contexte polyploïde ……….…..…………..……… 144
II.2. La voie triploïde dans la formation de B. napus ..……….……..…...…. 145
III. APPORTS ET PERSPETIVES POUR LA SÉLECTION VARIÉTALE .……….………. 147
III.1. Enrichir la diversité génétique chez B. napus .………..…… 147
III.2. Optimiser le brassage génétique de la diversité chez B. napus ………. 148
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES …….………. 150
CHAPITRE I.
Figure 1. Déroulement de la méiose ..………... 4
Figure 2. Déroulement de la Prophase I de méiose ..………... 6
Figure 3. Le “bouquet” chez Bombix mori en début de Prophase I de méiose ……….. 8
Figure 4. De la Métaphase I à la formation des gamètes ……… 9
Figure 5. Formation et maturation des cassures doubles brin de l’ADN .……… 11
Figure 6. Chargement des recombinases et invasion de la molécule homologue .………... 14
Figure 7. Voies de formation des Crossing-Overs et Non Crossing-Overs ………. 16
Figure 8. Identification cytologique des Crossing-Overs de Classe I et II chez la tomate .……….. 20
Figure 9. Nombre moyen de Crossing-Overs par chromosome et par méiose chez différents eucaryotes…….. 21
Figure 10. Fréquence de recombinaison en cM par Mb le long de chromosomes de différents eucaryotes …… 24
Figure 11. Voies de formation des gamètes non-réduits au cours de la méiose ..………. 29
Figure 12. Voies de formation possibles des auto- et allotétraploïdes .………..….. 30
Figure 13. Relation entre les évènements de polyploïdisation et la diversification de groupes d’Angiospermes.31 Figure 14. Origine des évènements de polyploïdisation chez les plantes ..………...…... 32
Figure 15. Evolution structurale des génomes de plantes après les différents évènements de polyploïdisation . 33 Figure 16. Représentation du cycle des végétaux suite à un évènement de polyploïdisation ..……… 34
Figure 17. Mécanisme lié à la réduction du nombre de chromosomes chez les polyploïdes ..………. 33
Figure 18. Représentation schématique du fractionnement .………....………...………. 35
Figure 19. Représentation des différents biaisd’expression chez les allopolyploïdes ……… 36
Figure 20. Déroulement de la méiose chez les auto- et allopolyploïdes stabilisés …………...………. 39
Figure 21. Le triangle de U ..………..……….……….. 43
Figure 22. Evènements de polyploïdisation chez les espèces de Brassicas actuelles ..………….…..…………. 45
Figure 23. Evolution de la structure des chromosomes chez 5 espèces actuelles de Brassicaceae ………. 45
Figure 24. Organisation des sous-génomes ancestraux des Brassicas ..……….…………..………… 46
Figure 25. Relations d’homéologie entre les génomes de B. rapa et B. oleracea ……… 47
CHAPITRE II. Figure 1. Schematic representation of the two strategies used to extract the diploid AnAn component of Brassica napus cv. Darmor (AnAnCnCn, 2n=38) from an initial cross with Brassica rapa cv. C1.3 (ArAr, 2n=20) ..…… 56
Figure 2. Evolution of the percentages of pollen mother cells (PMCs) in Brassica allotriploid hybrids showing the expected regular meiotic behavior, with 10 bivalents (II) and nine univalents (I), in metaphase I along the different generations in strategies 1 (in blue) and 2 (in red) ..………... 58
Figure 3. Evolution of seed number per 100 pollinated flowers among the different generations from: (a) triploid AAC hybrids obtained with strategies 1 (in blue) and 2 (in red); and (b) diploid plants after selfing (in black) or backcrosses to Brassica napus (in purple) for strategy 2 ……….. 58
Figure 4. Characterization of one diploid An/rAn/r hybrid produced from the fifth generation of the second strategy for: (a) meiotic behavior showing 10 bivalents; (b) pollen fertility (fertile grains stained in red by Aceto- Carmine); and (c) flower morphology ……….………..… 59 Figure 5. Circos diagram illustrating the homozygous Brassica napus An/An (red) and Brassica rapa Ar/Ar
(blue) as well as the heterozygous An/Ar (light purple) states, of blocks identified along the 10 A chromosomes in An/rAn/r hybrids produced in the second strategy from the fourth (An/rAn/r G4, one plant) and fifth generations (An/rAn/r G5, two plants) .……….……….. 60 Table 1. Characterization of An/rAn/r hybrids produced from the fourth (one plant) and fifth (two plants) generations of the second strategy with polymorphic single nucleotide polymorphism (SNP) and Brassica napus gene content as well as physical size provided by either An/An, Ar/Ar or An/Ar blocks identified .……….. 61 Table 2. Identification of putative introgressions from the Brassica napus Cn subgenome into the An/rAn/r hybrids produced from the fourth (one plant) and fifth (two plants) generations of the second strategy ..……… 61
CHAPITRE III.
Figure 1. Meiotic observations of AA and AAC F1 hybrids at metaphase I .………..… 75 Figure 2. Recombination rate in cM in AA and AAC F1 hybrids between (a) each of the 10 homologous A chromosomes and (b) the cumulated A chromosomes ………... 77 Figure 3. Relationship between the average number of COs per A chromosome at bivalent level and the physical size of chromosomes covered by SNP markers in Mbp for each of the AA and AAC F1 hybrids ……….. 79 Figure 4. Recombination rates along the 10 A chromosomes in cM per Mbp for the AA and AAC F1 hybrids . 81 Figure S1. Schematic representation of the production of (a) A1A2 and A1A2CO, and (b) ADA2 and ADA2CD combinations of F1 hybrids ……….………. 104 Figure S2. Frequency of COs per chromatid of the progenies deriving from the AA and AAC F1 hybrids …. 105 Figure S4. Relationship between the relative recombination rates normalized per A chromosome (%) and their relative distance from the centromeres (%) for each AA and AAC F1 hybrid ……… 106 Figure 5. Hybridation de la sonde CentBr1 et des anticorps dirigés contre la marque histone H3k9me2 et contre la méthylation de l’ADN (5-mc) en pachytène chez les hybrides A1A2 et A1A2CO ..………. 110
CHAPITRE IV.
Figure 1. Représentation schématique (a) de la production des hybrides F1 de la première combinaison et (b) de leur composition chromosomique …….……….. 116 Figure 2. Représentation schématique (a) de la production des hybrides F1 de la seconde combinaison et (b) de leur composition chromosomique ………... 116 Figure 3. Observations en Métaphase I de méiose des hybrides d’addition présentant 1 à 3 chromosomes C issus du colza B. napus cv. Darmor ………. 123 Figure 4. Diagramme circos illustrant les régions génomiques de types B. napus cv. Darmor (en rouge) et B.
rapa cv. C1.3 (en bleu) identifiées le long des 10 chromosomes AD des descendants, issus du croisement entre la plante ADAD+5CD(1,4,5,8,9) (2n=25) et B. rapa cv. Chiifu, sélectionnés pour présenter zéro à trois des chromosomes C04, C08 et C09 seuls ou en combinaison .……….. 124 Figure 5. Répartition des SNPs exploités pour la détection des crossing-overs le long des 10 chromosomes A dans les chapitres III (204 SNPs) et IV (169 SNPs) du manuscrit .………. 125 Figure 6. Fréquences de recombinaison en centimorgan (cM) chez les hybrides AA, AA+C09 et AAC entre (a.) chacun des 10 chromosomes homologues A et (b.) les chromosomes A cumulés ..………... 125 Figure 7. Fréquences de recombinaison en cM par Mb le long des 10 chromosomes A pour les hybrides AA, AA+C09 et AAC issus des deux combinaisons générées .……….. 126 Figure 8. Relations entre les fréquences de recombinaison relatives normalisées par chromosome A(%) et leur distance relative par rapport à la position des centromères (%) pour les hybrides AA, AA+C09 et AAC issus des deux combinaisons générées .………..………… 127 Figure 9. Fréquences de recombinaison en centimorgan (cM) chez les hybrides F1 générés en seconde combinaison entre (a.) chacun des 10 chromosomes homologues A et (b.) les chromosomes A cumulés……. 128
issus de la seconde combinaison générée ……… 129
CHAPITRE V.
Figure 1. Stratégie proposée pour identifier des régions génomiques sur le chromosome C09 du chou B.
oleracea cv. ‘RC34’ responsables des variations de fréquence de recombinaison entre les chromosomes homologues A observées chez les allotriploïdes …….……… 143 Figure 2. Diagramme circos illustrant la fréquence de recombinaison en cM/Mb le long des génomes A et C chez le colza B. napus ………... 148 Figure 3. Fréquence de recombinaison sur le chromosome A07 exprimée en cM/Mb (a) à partir d’un hybride diploïde AA (courbe noire) et (b) d’un hybride AAC (courbe bleue) ..….……….. 149
Certaines données supplémentaires (figures et tables), trop volumineuses, n’ont pu être intégrées dans le manuscrit
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I NTRODUCTION G ÉNÉRALE
La sélection variétale a pour but la création de nouvelles variétés capables de répondre favorablement aux demandes actuelles telles que le rendement, la qualité ou encore la résistance aux contraintes biotiques et abiotiques. Elle s’appuie pour cela sur la diversité propre à chaque espèce et à son brassage génétique dans les descendances. Cependant, le brassage génétique s’avère fortement limité, réduisant ainsi le champs des possibles en sélection variétale et contraignant les sélectionneurs à réaliser de nombreux cycles, lors desquels plusieurs centaines de plantes sont générées, afin de parvenir à la création d’une nouvelle variété. C’est au cours de la méiose, qui conduit à la formation des gamètes chez les organismes à reproduction sexuée, que ce brassage génétique est réalisé via la recombinaison méiotique. Ce processus biologique permet en effet des échanges d’information génétique entre les chromosomes parentaux (i.e. homologues) par l’intermédiaire des Crossing-Overs (COs). Cependant, le nombre mais également la position des COs le long des chromosomes font l’objet d’une régulation stricte. Ainsi, comprendre les mécanismes liés à cette régulation et identifier des facteurs permettant de moduler le nombre et la position des COs constituent des défis majeurs en vue d’optimiser le brassage génétique de la diversité et donc de limiter la taille des populations dans les schémas de sélection.
Chez les espèces polyploïdes, qui cumulent plusieurs génomes, il est possible d’augmenter le nombre de COs entre chromosomes homologues fonction du niveau de ploïdie. Un tel phénomène a été relaté dans le cas du colza Brassica napus (AACC, 2n=4x=38), un allotétraploïde composé des génomes de la navette B. rapa (AA, 2n=2x=20) et du chou B. oleracea (CC, 2n=2x=18), notamment en étudiant la recombinaison chez des hybrides allotriploïdes (AAC, 2n=3x=29), issus du croisement entre le colza et la navette.
Chez ces hybrides, présentant le génome C du chou sous forme haploïde, beaucoup plus de COs sont formés entre chromosomes homologues A que chez les hybrides AA ou AACC, offrant ainsi des perspectives avantageuses en sélection variétale. Cependant, les conséquences d’une telle variation sur la distribution des COs le long de chromosome restent à établir, tout comme les facteurs pouvant affecter cette régulation. Dans ce contexte particulier, nous avons cherché au cours de cette thèse à apporter des éléments de réponse à ces différentes questions en étudiant la distribution des COs chez les allotriploïdes et en nous
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intéressant à l’effet de l’évolution des génomes dans un contexte polyploïde, du sexe de la méiose et de chromosomes C spécifiques sur cette régulation.
Avant de présenter les résultats acquis au cours de cette thèse nous débuterons ce manuscrit par une synthèse bibliographique relatant les connaissances actuelles concernant la recombinaison méiotique et la polyploïdie. Nous nous intéresserons dans un premier temps au déroulement de la méiose ainsi qu’aux mécanismes régissant et régulant la recombinaison méiotique. Ensuite, nous développerons notamment l’importance de la polyploïdie dans le règne végétal, ses conséquences structurales et fonctionnelles sur les génomes ainsi que la recombinaison méiotique chez ces espèces. Enfin, le modèle du colza sera développé plus en détail avant de définir nos différents objectifs.
Dans le second chapitre, nous présenterons la création d’un matériel original obtenu via l’extraction de la composante diploïde AA du cultivar séquencé de colza ‘Darmor’. En plus d’être un matériel qui nous a été indispensable à l’étude de la recombinaison, celui-ci nous a permis de mettre en évidence l’effet de la polyploïdie sur l’évolution des génomes.
Dans le troisième chapitre, nous exposerons nos résultats portant sur l’étude de l’effet du niveau de ploïdie sur la recombinaison homologue obtenus grâce à une analyse comparée d’hybrides diploïdes AA et allotriploïdes AAC. De par cette comparaison, nous avons révélé que la présence du génome C chez les hybrides allotriploïdes conduit à une modification des profils de recombinaison entre chacune des paires de chromosomes homologues A. De plus, nous avons démontré que le nombre de COs surnuméraires formés chez les allotriploïdes diffère entre les méioses mâle et femelle ainsi qu’en fonction du fond génétique des hybrides.
Au cours du quatrième chapitre, nous présenterons nos travaux sur l’identification de chromosomes C spécifiques impliqués dans la régulation de la fréquence et de la distribution de COs. Cette étude nous a permis de montrer que le contrôle de la recombinaison méiotique chez les allotriploïdes est principalement dû au seul chromosome C09 lorsqu’il est issu du chou. Cependant, lorsqu’il est originaire du colza, nous avons déterminé qu’il n’entraine aucune variation de fréquence ou de distribution des COs, indiquant une divergence dans un contexte polyploïde.
Dans la dernière partie, l’ensemble des résultats sera discuté au regard de ce que nous avons apporté sur la régulation de la recombinaison puis sur l’impact de la polyploïdie. Nous conclurons enfin sur les nouvelles perspectives ouvertes par ces données pour l’amélioration des plantes.
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S YNTHÈSE B IBLIOGRAPHIQUE
I
CHAPITRE
Figure 1. Déroulement de la méiose. (A) Suite à une phase de réplication préméiotique de l’ADN, les jeux de chromosomes parentaux sont alors constitués chacun de deux chromatides sœurs parfaitement identiques. (B-N) Deux divisions cellulaires successives composent la méiose, chacune décomposée en quatre phases distinctes : la Prophase, la Métaphase, l’Anaphase et la Télophase. (B-J) Lors de la première division dite “réductionnelle”, les jeux de chromosomes homologues s’apparient, échangent de l’information génétique via la recombinaison méiotique, puis se séparent en deux cellules filles. (K-N) Lors de la seconde division dite “équationnelle”, les chromatides sœurs de chaque chromosome se séparent donnant ainsi quatre cellules filles qui formeront les gamètes. D’après Mercier et al. (2015).
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C HAPITRE I . S YNTHÈSE B IBLIOGRAPHIQUE
I. L
AR
ECOMBINAISONM
ÉIOTIQUELa méiose est un mécanisme hautement conservé chez les organismes à reproduction sexuée conditionnant la formation des gamètes et assurant la stabilité des génomes. Au cours de son déroulement, les chromosomes parentaux (i.e. homologues) s’alignent et échangent de l’information génétique par l’un des produits de la recombinaison méiotique: les Crossing- Overs (COs). Ces derniers sont inhérents au bon déroulement de la méiose et conduisent à la génération de diversité. Cependant, ils font l’objet d’une régulation stricte. Dans cette partie, nous allons nous attacher à décrire le processus de méiose. Puis, après avoir détaillé les mécanismes moléculaires de la recombinaison méiotique, nous décrirons enfin la régulation dont elle fait l’objet.
I.1. La méiose, processus clé de la reproduction sexuée
Apparue il y a un à deux milliards d’années et retrouvée chez la grande majorité des organismes eucaryotes (Knoll, 1992; Gupta & Golding, 1996), la méiose est une étape essentielle du cycle de la reproduction sexuée. Contrôlé de manière génétique, ce processus biologique permet de produire des gamètes haploïdes (n chromosomes), à partir d’une cellule mère diploïde (2n chromosomes), assurant ainsi la transmission de l’information génétique et le maintien du niveau de ploïdie de l’espèce lors de la fécondation (Figure 1) (Pour revue voir Zickler & Kleckner, 1999; Hamant et al., 2006; Mercier et al., 2015). Afin de procéder à la réduction de moitié du nombre de jeux de chromosomes, la méiose est toujours précédée par une unique phase de réplication de l’ADN, appelée réplication pré-méiotique. Les jeux de chromosomes homologues sont alors chacun constitués de deux chromatides sœurs parfaitement identiques. S’ensuit les deux divisions cellulaires successives qui composent la méiose, chacune ayant été découpée en quatre phases distinctes par des observations cytologiques de la structure des chromosomes: la Prophase, la Métaphase, l’Anaphase et la Télophase. Lors de la première division, dite “réductionnelle”, les jeux de chromosomes homologues s’apparient, échangent de l’information génétique via la recombinaison méiotique, puis se séparent en deux cellules filles. Enfin, les chromatides sœurs vont elles
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aussi se séparer au cours de la division dite “équationnelle” donnant ainsi quatre cellules filles.
Le succès de la méiose repose sur la production de gamètes dits “équilibrés”, c’est-à- dire présentant chacun un jeu complet des chromosomes haploïdes. Toute anomalie de ségrégation des chromosomes ou des chromatides induit la production de gamètes aneuploïdes, conduisant à l’absence (monosomie) ou à l’excès (trisomie) d’un, voire de plusieurs chromosomes dans les cellules de l’individu résultant. La majorité de ces gamètes n’est pas viable dans le règne animal, et une partie est liée à différents syndromes particulièrement délétères chez l’humain tels que les syndromes de Patau (trisomie du chromosome 13), de Down (trisomie des chromosomes 16, 17 ou 21) ou encore de Turner (monosomie du chromosome X) (Pour revue voir Biancotti et al., 2010; Rutledge & Cimini, 2016). Afin d’éviter l’aneuploïdie, la méiose requiert notamment au cours de son déroulement : (1) l’établissement de connexions physiques entre les chromosomes homologues, puis (2) la bonne orientation et séparation de ces derniers ainsi que des chromatides sœurs dans quatre gamètes.
I.1.1. Prophase I de méiose, vers l’appariement des homologues
Bien que la durée de la méiose varie considérablement fonction des organismes (e.g.
de 6 heures chez la levure à plusieurs jours chez les animaux et les plantes), la Prophase I constitue l’étape la plus longue de ce processus (e.g. ±90% de la durée totale de la méiose chez la plante Arabidopsis thaliana) (Bennett et al., 1977; Armstrong & Jones, 2003). C’est au cours de cette phase que les chromosomes homologues vont s’apparier et surtout établir des connexions physiques entre eux via les Crossing-Overs (COs), produits de la recombinaison méiotique à l’origine des échanges génétiques. Avant d’initier la Prophase I, la cellule a procédé en amont à une phase de la réplication pré-méiotique. Les deux chromatides sœurs qui constituent chaque chromosome sont dès lors unies par un phénomène de cohésion.
Ce phénomène, extrêmement conservé chez les eucaryotes, est assuré par des complexes cohésines, chacun formé de quatre sous-unités dont la protéine REC8, venant encercler les chromatides sœurs sur toute leur longueur et empêcher leur dissociation précoce (Nasmyth &
Haering, 2009; Sakuno & Watanabe, 2009). Les chromosomes vont alors pouvoir entamer la Prophase I qui a été subdivisée, sur la base de l’état de compaction des chromosomes et de la structure des axes chromosomiques, en 5 stades nommés par ordre chronologique: le
Figure 2. Déroulement de la Prophase I de méiose. Les cinq étapes de la Prophase I de méiose sont classées de haut en bas par ordre chronologique d’apparition. Pour chaque étape, de gauche à droite : (1) représentations schématiques avec un zoom sur la structure des chromosomes d’après Khademian (2013), (2) observations cytologiques chez A. thaliana, au DAPI extraites de Chelysheva et al. (2012), et avec l’immunolocalisation des protéines AtASY1 (marquant les Eléments Axiaux, en rouge) et AtZYP1 (marquant les Eléments Centraux, en vert) extraites de Chelysheva et al. (2007), et (3) observations cytologiques de Nodules de recombinaison d’après Albini & Jones (1987) chez Allium avec en a et b les Nodules Précoces de Recombinaison et en c les Nodules Tardifs de Recombinaison.
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Leptotène, le Zygotène, le Pachytène, le Diplotène et la Diacinèse (Zickler & Kleckner, 1999).
I.1.1.1. La mise en place de l’axe chromosomique
La prophase I de méiose est initiée par le stade Leptotène où les chromosomes se condensent, devenant progressivement visibles sous forme de fins filaments en microscopie (Figure 2). Au cours de cette étape dynamique, l’ADN des chromatides sœurs, s’échappant des complexes cohésines, s’organise en une rangée linéaire de boucles dont les bases convergent tout le long d’un axe appelé l’axe chromosomique (Zickler & Kleckner, 1999, 2015). Les boucles d’ADN sont ainsi positionnées perpendiculairement à cet axe et, bien que leur taille varie en fonction des organismes, celles-ci se retrouvent espacées régulièrement chez l’ensemble des eucaryotes avec une densité de 20 à 30 boucles par µm (Zickler &
Kleckner, 1999; Kleckner, 2006). Les cohésines se situent quant à elles au niveau de cet axe, entre les boucles d’ADN, avec d’autres complexes protéiques appelés condensines (Pour revue voir Wood et al., 2010). Cette organisation est déterminante pour la poursuite de la méiose. Elle conditionne notamment la formation des Eléments Axiaux (EAs) et l’initiation du processus de recombinaison méiotique chez la plupart des espèces comme Schizosaccharomyces cerevisiae (Klein et al., 1999; Lin et al., 2010), Saccharomyces pombe (Molnar et al., 1995; Molnar et al., 2003), Caenorhabditis elegans (Pasierbek et al., 2003;
Lightfoot et al., 2011), Mus musculus (Revenkova et al., 2004; Novak et al., 2008; Llano et al., 2012) ou encore A. thaliana (Cai et al., 2003; Chelysheva et al., 2005; Schubert et al., 2009).
L’axe chromosomique en formation est ainsi progressivement complété par une structure linéaire qui participe à son élongation et son maintien: l’Elément Axial (EA) (Figure 2) (Zickler & Kleckner, 1999; Kleckner, 2006). Bien que l’EA soit une structure multiprotéique hautement conservée (Stack & Anderson, 2001), rares sont les protéines qui le composent à présenter une homologie de séquence entre espèces. La protéine HOP1, isolée pour la première fois chez S. cerevisiae (Hollingsworth & Byers, 1989; Schwacha &
Kleckner, 1994), est ainsi l’une des seules à trouver des homologues tels que HIM-3 chez C.
elegans (Zetka et al., 1999), HORMAD-1 et -2 chez Mus musculus (Wojtasz et al., 2009) ou encore ASY1 chez A. thaliana (Caryl et al., 2000; Armstrong et al., 2002). Le développement de l’axe chromosomique peut ainsi être visualisé en cytologie, via l’utilisation d’anticorps dirigés contre ces protéines où d’autres faisant partie des EAs (e.g. ASY3 chez A. thaliana),
