Composition en chaînes lourdes de myosine des fibres musculaires de type II chez le porc

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Composition en chaînes lourdes de myosine des fibres musculaires de type II chez le porc

Louis Lefaucheur, Patrick Ecolan

To cite this version:

Louis Lefaucheur, Patrick Ecolan. Composition en chaînes lourdes de myosine des fibres musculaires

de type II chez le porc. Productions animales, Institut National de la Recherche Agronomique, 1998,

11 (2), pp.152-154. �hal-02685622�

CaractŽrisation des diffŽrents types de fibres musculaires dans plusieurs esp•ces : production et utilisation dÕanticorps monoclonaux dirigŽs

contre les cha”nes lourdes de myosine rapide IIa et IIb

INRA Groupe NoŽ, SociŽtŽ Biocytex

INRA Groupe NoŽ : B. Picard, L. Lefaucheur, B. Fauconneau, H. RŽmignon, Y. Cherel, E. Barrey

Biocytex : J. Nedelec

RŽsumŽ

Des anticorps monoclonaux dirigŽs contre les cha”nes lourdes de myosine (MHC : myosin heavy chain) de diffŽrentes esp•ces dÕanimaux : bovin, porc, poisson, pou- let, dinde, cheval ont ŽtŽ produits. Ils ont ŽtŽ testŽs par immunohistologie sur des coupes de muscle squelettique chez le bovin, le porc, le poisson, le poulet et la dinde et par ELISA chez le cheval. Les diffŽrents anticorps retenus dans ce projet permettent de nouvelles applications pour lÕŽtude du muscle squelettique. En par- ticulier deux anticorps monoclonaux peuvent •tre utilisŽs pour classer par immu- nohistologie les fibres IIA et IIB : lÕun reconnaissant les MHC I et IIb chez le bovin et le cheval et les MHC I, IIb et IIx chez le porc, lÕautre reconnaissant les MHC IIa et IIx chez le porc. DÕautres anticorps ont permis de rŽvŽler une hŽtŽrogŽnŽitŽ dans la composition en myosine des fibres des muscles blanc et rouge de poisson, mais Žgalement dans la composition en myosine rapide des muscles de poulet et de dinde, sans toutefois permettre dans ces deux esp•ces une distinction prŽcise des fibres IIA et IIB. De plus, chez la truite arc-en-ciel, un anticorps rŽagit plus spŽcifiquement contre les myosines des petites fibres tŽmoins dÕune myogŽn•se de novodans le muscle blanc. Cependant il nÕa pas ŽtŽ possible dÕobtenir des anti- corps spŽcifiques des fibres IIA et IIB utilisables en particulier en dosage ELISA ; cette obtention demeure un objectif important pour la poursuite des travaux.

Le muscle squelettique est constituŽ de dif- fŽrents types de fibres qui interviennent dans la contraction. Les proportions de ces types de fibres influencent les caract•res dÕintŽr•t zoo- technique, notamment la qualitŽ organolep- tique de la viande dans la plupart des esp•ces et la performance sportive chez les animaux de course. La mise au point de mŽthodes de caractŽrisation des diffŽrents types de fibres permettra dÕŽtudier plus prŽcisŽment les rela- tions entre typologie et caractŽristiques mus- culaires, afin de mieux ma”triser celles-ci.

Chez les oiseaux comme chez les mammi- f•res, trois principaux types de fibres sont gŽnŽralement dŽcrits. Ce sont les types I (rouge lent oxydatif), IIA (rouge rapide oxydo- glycolytique) et IIB (blanc rapide glycolytique)

(tableau 1). Cette typologie repose sur un polymorphisme des cha”nes lourdes de la myosine (MHC = Myosin Heavy Chain). En effet, la myosine, qui reprŽsente environ 50 % des protŽines myofibrillaires, est une molŽ- cule de grande taille composŽe de 2 cha”nes lourdes (200 kDa) et de 4 cha”nes lŽg•res (de 15 ˆ 30 kDa) (figure 1). CÕest au niveau des cha”nes lourdes que se trouve lÕactivitŽ ATPasique de la molŽcule, qui fournit lÕŽner- gie nŽcessaire ˆ la contraction. JusquÕˆ prŽ- sent 10 isoformes diffŽrentes de MHC ont ŽtŽ identifiŽes (Pette et Staron 1990), les princi- pales sont MHC I, IIa et IIb contenues respec- tivement dans les fibres classŽes I, IIA et IIB (tableau 1).

Les techniques utilisŽes classiquement dans les diffŽrentes esp•ces pour le typage des fibres reposent sur des mŽthodes histochi- miques appliquŽes sur coupes de muscles.

Elles sont basŽes sur lÕinhibition sŽlective de lÕactivitŽ ATPasique myofibrillaire situŽe au niveau des t•tes des cha”nes lourdes de myo- sine (type contractile lent/rapide) (Brooke et Kaiser 1970) et/ou sur la corŽvŽlation de lÕacti- vitŽ dÕune enzyme du mŽtabolisme ŽnergŽ- tique, la succinate dŽshydrogŽnase (type mŽta- bolique oxydatif/glycolytique) (Peter et al 1972). LÕemploi de ces techniques est long et fastidieux, et donne des rŽsultats plus ou moins difficiles ˆ interprŽter. La possibilitŽ dÕobtenir des anticorps spŽcifiques de diffŽ- rents types de cha”nes lourdes de myosine a ŽtŽ dŽmontrŽe dans plusieurs esp•ces. Ces anticorps peuvent •tre utilisŽs en immunohis- tochimie sur coupes, en substitution des mŽthodes dÕhistochimie, mais, surtout, ils peu- vent •tre employŽs dans dÕautres techniques telles que le Western-blot et le dosage ELISA.

Ce dernier offre lÕavantage dÕ•tre quantitatif, plus reprŽsentatif de lÕensemble du muscle quÕune coupe histologique, et de pouvoir •tre appliquŽ sur un grand nombre dÕŽchantillons.

DiffŽrents anticorps sont commercialisŽs, cependant, jusquÕen 1995, aucun anticorps spŽcifique des isoformes MHC IIa et IIb nÕŽtait disponible dans le commerce pour aucune esp•ce. Aussi, plusieurs Žquipes INRA se sont associŽes ˆ la sociŽtŽ Biocytex afin de produire des anticorps monoclonaux spŽcifiques des iso- formes de myosine IIa et IIb chez le bovin, le porc, le poisson, le poulet, la dinde et le cheval, dans le cadre dÕun projet nommŽ Ç NoŽ È. La dŽmarche suivie ainsi que les rŽsultats obte- nus sont dŽcrits dans ce dossier. De plus, les applications possibles sont dŽtaillŽes pour cha- cune des esp•ces concernŽes.

RŽfŽrences

Brooke M.M., Kaiser K., 1970. Muscle fiber type : how many and what kind ? Arch. Neurology, 23, 369-370.

Peter J.B., Barnard R., Edgerton V.R., Gillespie C.A., Stempel K.E., 1972. Metabolic profiles of three fiber types of skeletal muscle in guinea pigs and rabbits.

Biochem., 11, 2627-2633.

Pette D., Staron R.S., 1990. Cellular and molecular diversities of mammalian skeletal muscle fibers. Rev.

Physiol. Biochem. Pharmacol., 116, 1-76.

146

/ C. JURIE, J. NƒDELEC, B. PICARD

C. JURIE, J. NƒDELEC

, B. PICARD INRA Laboratoire Croissance

et MŽtabolismes des Herbivores, Theix, 63122 Saint-Gen•s Champanelle

*

Biocytex, 140, Chemin de lÕArmŽe dÕAfrique, 13010 Marseille

Figure 1. Schéma d’une molécule de myosine.

Tableau 1. Caractéristiques contractiles et métaboliques des trois principaux types de fibres musculaires.

Type de fibres Lentes = I Rapides

IIA IIB

Cha”ne lourde de myosine I IIa IIb

ActivitŽ ATPasique faible forte forte

MŽtabolisme oxydatif oxydo-glycolytique glycolytique Chaînes lourdes

Extrémités COOH

Chaînes légères

Extrémités NH2

AA A A AA A A

C C

N N Queue Tête

(2 hélices α enroulées)

Production des anticorps monoclonaux spŽcifiques des cha”nes lourdes de myosine

Le principe de production des anticorps monoclonaux consiste ˆ extraire la myosine des muscles dÕanimaux des diffŽrentes esp•ces, ˆ la purifier et ˆ lÕinjecter ˆ des sou- ris (immunisation) censŽes fabriquer des anti- corps contre la myosine. LorsquÕune bonne rŽponse en anticorps est obtenue, les lympho- cytes splŽniques (cellules de la rate qui pro- duisent des anticorps) sont fusionnŽs avec des cellules dÕune lignŽe de myŽlome (immor- telles) gr‰ce ˆ lÕaddition de polyŽthyl•ne gly- col qui induit la fusion membranaire. Les lymphocytes ayant fusionnŽ avec les cellules de myŽlome sont repŽrŽs en culture sur un milieu sŽlectif et sont appelŽs hybridomes.

Chaque hybridome est testŽ pour la produc- tion dÕanticorps anti-myosine. Si la rŽponse est positive, la culture est clonŽe, cÕest-ˆ-dire rŽpartie dans des plaques multipuits de telle sorte quÕil nÕy ait quÕune cellule par puits,

celle-ci Žtant ˆ la fois immortelle et produc- trice dÕanticorps (monoclonal) (figure 1).

Protocole expŽrimental

Extraction de myosine purifiŽe

Pour chaque esp•ce, lÕextraction de myosine a ŽtŽ effectuŽe ˆ partir dÕun Žchantillon de 1 g de muscle, congelŽ et conservŽ ˆ Ð 80 ^oC.

Toutes les Žtapes de lÕextraction ont ŽtŽ rŽali- sŽes ˆ + 4 ^oC afin dÕinhiber lÕaction des pro- tŽases.

Pour Žviter des variations dues aux diffŽ- rentes techniques de purification utilisables, toutes les extractions de myosine purifiŽe ont ŽtŽ rŽalisŽes par la m•me personne du labora-

toire Croissance et MŽtabolismes des Herbi- vores de lÕINRA. Au dŽpart, deux techniques ont ŽtŽ testŽes, une technique utilisant un tampon Guba-Straub classique (Pearson et Young 1989) et une technique dŽcrite par Martone et al (1986). Bien que diffŽrentes dans la composition de leurs tampons dÕextra- ction, ces deux techniques sont basŽes sur le m•me principe, qui repose sur les propriŽtŽs chimiques de la myosine, ˆ savoir que celle-ci est soluble ˆ haute force ionique (> 0,23), inso- luble ˆ faible force ionique et poss•de la pro- priŽtŽ dÕhydrolyser lÕATP.

LÕŽchantillon est tout dÕabord broyŽ et homogŽnŽisŽ dans un tampon de faible force ionique pour extraire les protŽines. Apr•s centrifugation, le culot contenant la fraction protŽique myofibrillaire est repris dans un tampon de haute force ionique afin de solubi- liser la myosine. De lÕATP est ajoutŽ pour dis- socier les complexes actine-myosine et donc libŽrer la myosine. Apr•s une nouvelle cen-

trifugation, permettant entre autres dÕŽlimi- ner lÕactine dans le culot, celle-ci nÕŽtant pas soluble ˆ haute force ionique, le surnageant contenant la myosine est rŽcupŽrŽ. La myo- sine est ensuite prŽcipitŽe par addition dÕEDTA pour la technique de Pearson et Young (1989) ou de KHCO₃pour la technique de Martone et al (1986), ces deux produits permettant de diminuer ainsi la force ionique. Cette Žtape sÕest rŽvŽlŽe la plus importante dÕun point de vue quantitatif. En effet, le rendement en myosine avec la prŽci- pitation au KHCO₃est bien supŽrieur ˆ celui obtenu avec la prŽcipitation ˆ lÕEDTA. La mŽthode de Martone et al(1986) donnant un meilleur rendement et de plus Žtant plus rapide a ŽtŽ retenue. Ces deux derni•res Žtapes, solubilisation de la myosine et prŽci- pitation avec KHCO_3, sont rŽalisŽes une deuxi•me fois afin de purifier et de concen- trer la myosine. Le culot final, obtenu apr•s centrifugation, est repris avec un tampon de Figure 1. Production des anticorps monoclonaux.

Antigène = extrait de myosine

AA AA

Cellules de myélome (immortelles)

Cellules spléniques productrices d'anticorps

Polyéthylène glycol

Fusion cellulaire

Hybridomes : cellules productrices d'anticorps et immortelles Dépistage des anticorps

Ensemencement de microplaques de culture Culture sur milieu de sélection

Rate

148

/ C. JURIE, J. NƒDELEC, B. PICARD

SpŽcificitŽ Hybridome Isotype

Esp•ces Immunoglobulines (µg/ml))

anti-myosine totale S5 7E6 IgG1 κ(2,8) bovin, cheval, porc

anti-MHC I S4 9G11 IgM κ(64) cheval

S4 17F7 IgG1 κ(6,8) poulet

S5 7F10 IgG2b κ(140) dinde

anti-MHC II S5 15F4 IgG1 κ(8) bovin, cheval

S4 10G9 IgG1 κ(22) cheval

S5 14B3 IgG (56) et IgG2b κ(6,1) porc

S4 8E6 IgG1 κ(8) poisson

S5 16D12 IgM κ(92) poulet

anti-MHC II mosa•que S5 8F3 IgG2b κ(94) poulet

S5 8H2 IgG1 κ(22) dinde

S5 7D4 IgG1 κ(26) dinde

S5 11D6 IgG1 κ(3,6) dinde

anti-myosine (mosa•que) S4 10H9 IgG1 κ(31) poisson

anti-MHC I + IIb S5 8H2 IgG1 κ(22) bovin, cheval, porc

anti-MHC IIa + IIx S5 7D4 IgG1 κ(26) porc

anti-MHC IIb S4 10B6 IgG2b κ(0,064) bovin

S4 9H5 IgG1 (22) et IgM κ(12) poulet

Tableau 1. Caractéristiques des hybridomes retenus par l’ensemble des espèces.

solubilisation, additionnŽ de glycŽrol ˆ raison de 50 % et conservŽ ˆ Ð 20 ^oC.

Les extractions de myosine purifiŽe en vue de lÕimmunisation ont ŽtŽ rŽalisŽes sur des Žchantillons de muscles ne contenant que des isoformes de cha”nes lourdes rapides (MHC IIa, MHC IIb) :

- le muscle cutaneus truncipour le bovin et le cheval (bien que ce muscle ne soit pas enti•rement rapide chez ce dernier) ;

- le semitendinosuspour le porc ;

- le posterior latissimus dorsipour la dinde et le poulet ;

- le muscle blanc de poisson.

De plus, des extractions de myosine purifiŽe ont ŽtŽ rŽalisŽes en vue du tri : le muscle mas- seter(MHC I) pour le bovin, le pectoralis major (MHC IIb) pour le poulet et la dinde, le dia- phragma(MHC I, MHC IIa) pour le cheval.

Afin de vŽrifier la puretŽ des myosines obte- nues, une Žlectrophor•se en gel de polyacryla- mide ˆ 12 % en prŽsence de dŽtergent SDS (Laemmli 1970) a ŽtŽ rŽalisŽe pour chacune des esp•ces. Les rŽsultats obtenus ont montrŽ que lÕextraction faite contenait des traces dÕautres protŽines myofibrillaires (troponine et/ou tropomyosine).

Immunisation

Six souris (S1 ˆ S6) de la souche BALB/C femelles ‰gŽes de six semaines ont ŽtŽ immu- nisŽes chacune par 4 injections dÕextraits de myosine sur une pŽriode de 79 jours. Les immunisations ont ŽtŽ rŽalisŽes de la fa•on suivante : S1 et S2 ont re•u un mŽlange des extraits de myosine de bovin et de cheval ; S3 et S4 ont re•u un mŽlange des extraits de myo- sine de poisson et de dinde ; S5 et S6 ont re•u

un mŽlange des extraits de myosine de porc et de poulet. Lors des trois premi•res injections (ˆ J0, J21 et J42) chaque souris a ŽtŽ immuni- sŽe avec deux fois 20 µg de myosine des deux esp•ces diffŽrentes. La premi•re injection (J0) a ŽtŽ rŽalisŽe en prŽsence dÕadjuvant complet de Freund et les deux injections suivantes (J21 et J42) en prŽsence dÕadjuvant incomplet de Freund (lÕadjuvant de Freund est une Žmul- sion dÕantig•ne dans lÕhuile capable dÕaugmen- ter non spŽcifiquement la rŽponse immuni- taire ˆ un antig•ne ; il contient aussi des mycobacterium tuberculosistuŽes, lÕadjuvant incomplet nÕen contient pas). La derni•re injection (J79) a ŽtŽ rŽalisŽe en intraveineux avec deux fois 10 µg de myosine en PBS stŽrile trois jours avant la fusion cellulaire.

Le choix dÕimmuniser les souris avec deux types de myosine a ŽtŽ dictŽ par des impŽra- tifs dÕorganisation du travail. Ce choix nÕest pas g•nant car le syst•me immunitaire des mammif•res est habituŽ ˆ rŽpondre ˆ des sti- mulations variŽes et simultanŽes. La sŽlection des anticorps spŽcifiques de chaque myosine est rŽalisŽe par la suite : les anticorps sont testŽs sŽparŽment sur chaque myosine ayant servi ˆ lÕimmunisation. Il est cependant clair que les diffŽrentes myosines ont un fort niveau dÕhomologie dans leur sŽquence, aussi, certains anticorps monoclonaux produits pourront reconna”tre des sŽquences com- munes ˆ toutes les myosines.

Testage des sŽrums polyclonaux

Des prŽl•vements sanguins ont ŽtŽ rŽalisŽs sur les souris apr•s immunisation ˆ J37 et J57. Les sŽrums contenant les anticorps ont ŽtŽ testŽs en ELISA (dosage quantitatif immunoenzymatique) sur les diffŽrents ex-

traits de myosine par la sociŽtŽ Biocytex. Ils ont Žgalement ŽtŽ testŽs en immunohistochi- mie sur des coupes de muscles de chaque esp•ce par le laboratoire Croissance et MŽta- bolismes des Herbivores (INRA).

Les rŽsultats dÕELISA et dÕimmunohistochi- mie montrent que les souris S3, S4, S5, S6 ont dŽveloppŽ une rŽponse forte contre les myo- sines. Quelle que soit lÕesp•ce, leurs sŽrums contiennent des anticorps capables de recon- na”tre diffŽrents types de MHC. Au vu de lÕin- tensitŽ de la rŽponse, seuls les lymphocytes des souris S4 et S5 ont ŽtŽ retenus pour rŽali- ser une fusion.

Par contre, les souris S1 et S2, immunisŽes avec les myosines de cheval et de bovin, ont beaucoup moins bien rŽpondu. Les sŽrums obtenus nÕont pas permis de distinguer les myosines, ceci dans toutes les esp•ces, m•me chez le bovin et le cheval. Ces sŽrums ne contiennent donc pas dÕanticorps capables de reconna”tre les MHC. Il a donc ŽtŽ dŽcidŽ de poursuivre lÕimmunisation des souris S1 et S2 afin dÕaugmenter leur rŽponse ˆ lÕantig•ne.

Par la suite, les lymphocytes de la souris S2 ont ŽtŽ fusionnŽs, mais sans succ•s.

Fusion

Les fusions cellulaires ont ŽtŽ rŽalisŽes selon le protocole modifiŽ de Kšhler et Mil- stein (1975). Les hybridomes ont ŽtŽ prŽparŽs par fusion entre les splŽnocytes dÕune souris immunisŽe (S4 et S5) et les cellules de myŽ- lome X63 Ag8/653 ou celles du myŽlome SP2/0-Agl4. Les deux types de cellules ont ŽtŽ mŽlangŽs selon un rapport 5:1 en prŽsence dÕune solution ˆ 40 % de polyŽthyl•ne glycol de poids molŽculaire 1500 selon le protocole dŽcrit ˆ la figure 1. Les hybridomes (cellules productrices dÕanticorps et immortelles) ont ŽtŽ ensuite ensemencŽs dans des micro- plaques de culture.

Testage des surnageants des hybridomes

Le surnageant des puits contenant une seule cellule (clone) visible au microscope a ŽtŽ testŽ pour la production dÕanticorps spŽci- fiques de la myosine par dosage ELISA rŽa- lisŽ par la sociŽtŽ Biocytex. De plus, chaque Žquipe INRA a testŽ environ 50 hybridomes, les m•mes pour les 6 esp•ces, issus de la fusion S4 (poisson + dinde) ou S5 (poulet + porc), en ELISA (Picard et al 1994) pour lÕŽquipe cheval ou en immunohistologie

pour les Žquipes bovin, dinde, poisson, porc, poulet.

RŽsultats

Les hybridomes testŽs se rŽpartissent selon 4 groupes :

- des hybridomes qui ne reconnaissent aucune myosine ;

- des hybridomes qui reconnaissent ˆ la fois les myosines rapides et les myosines lentes ;

- des hybridomes qui ne reconnaissent que les myosines rapides, sans distinction entre les fibres de type IIA et les fibres de type IIB ; - quelques hybridomes (2 ˆ 3) par esp•ce qui diffŽrencient 2 populations de fibres rapides.

Chaque Žquipe a sŽlectionnŽ 4 hybridomes parmi les plus intŽressants. Ils ont ŽtŽ ˆ nouveau testŽs en immmunohistologie sur plusieurs muscles prŽsentant des caractŽris- tiques contractiles diffŽrentes, mais Žgale- ment en ELISA, en Western Blot ou en cul- tures de cellules, selon les esp•ces. En dŽfinive, seuls les hybridomes dont les carac- tŽristiques sont dŽcrites dans le tableau 1 ont ŽtŽ retenus. LÕutilisation possible des anti- corps monoclonaux produits par ces hybri- domes est dŽtaillŽe dans les articles ci-apr•s pour chacune des esp•ces concernŽes.

RŽfŽrences

Kšlher G., Milstein C., 1975. Continuous cultures of fused cells secreting antibody to predefined specifi- city. Nature, 256, 495-497.

Laemmli U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the baxteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

Martone C.B., Busconi L., Folco E.J., Trucco R.E., Sanchez J.J., 1986. A simplified myosin preparation from marine fish species. J. Food Sci., 51, 1554-1555.

Pearson A.M., Young R.B., 1989. 3. Proteins of thick filament. In : B.S. Schweigert and S.L. Taylor (eds), Muscle and meat biochemistry. Academic press Inc., San Diego, California.

Picard B., LŽger J., Robelin J., 1994. Quantitative determination of type I MHC in bovine muscle with anti myosin monoclonal antibodies. Meat Sci., 36, 333-343.

Les Žtudes concernant les qualitŽs organo- leptiques de la viande bovine se focalisent sur la tendretŽ car cÕest le crit•re le plus impor- tant pour le consommateur. Parmi les fac- teurs dŽterminant cette tendretŽ, le type de fibres joue un grand r™le. En effet, la vitesse de maturation dŽpend de la composition en fibres (Valin 1988). Actuellement, la tendretŽ de la viande prŽsente une grande variabilitŽ qui est la consŽquence de la diversitŽ de lÕŽle- vage bovin fran•ais. DiffŽrentes Žtudes ont en effet montrŽ que les conditions dÕŽlevage (‰ge, sexe, race, niveau ŽnergŽtique et nature de la ration...) modifient la composition en fibres des muscles (Geay et Renand 1994). Aussi, lÕobjectif des recherches sur la croissance musculaire des bovins est de dŽcrire la mise en place des fibres durant le stade fÏtal et de prŽciser lÕinfluence des diffŽrents facteurs sur la composition en fibres des muscles durant la vie post-natale. Ces Žtudes nŽcessitent une mŽthode fiable pour classer les diffŽrents types de fibres. Les techniques dÕimmunohis- tochimie, de Western-blot et de dosage ELISA sont couramment utilisŽes et ont permis dÕob- tenir des rŽsultats importants (Picard et al 1994 et 1995). Cependant, les anticorps dispo- nibles dans le commerce ne permettent pas dÕidentifier spŽcifiquement les fibres IIA et IIB. Il appara”t indispensable de disposer dÕanticorps pour suivre la diffŽrenciation et lÕŽvolution de ces fibres. Cet article fait le point sur les possibilitŽs quÕoffrent les anti- corps obtenus dans le projet NoŽ concernant ces applications.

CaractŽrisation des anticorps

Les 50 anticorps retenus apr•s un premier tri ont ŽtŽ testŽs en immunohistologie. Pour cela des coupes sŽriŽes transversales de 10 µm dÕŽpaisseur ont ŽtŽ mises en contact pendant 30 minutes avec le premier anticorps (surna- geant pur), rincŽes avec du tampon phos- phate, puis incubŽes pendant 30 minutes avec le second anticorps fluorescent (lapin anti-IgG de souris couplŽ au FITC, Jackson Immuno- tech) diluŽ au 1/30 dans du tampon phos- phate. Les coupes ont ŽtŽ lavŽes avec le tam- pon phosphate et montŽes entre lame et lamelle avec du mowiol. A lÕissue de ce testage sur des Žchantillons de 3 muscles de bovin adulte (Cutaneus trunci : MHC IIa et IIb ; Diaphragma: MHC I et IIa ; Semitendinosus: MHC I, IIa et IIb) et sur le muscle Longissimus dorsi de fÏtus bovin (‰gŽ de 210 jours), une dizaine dÕanticorps a ŽtŽ rete- nue. Tr•s rapidement, quelques anticorps retestŽs avaient perdu de leur rŽactivitŽ et ont ŽtŽ abandonnŽs. En dŽfinitive, 4 anticorps ont ŽtŽ retenus. LÕintensitŽ de leur rŽponse en immunohistologie est dŽcrite dans le tableau 1.

Les 2 anticorps monoclonaux S5 8H2 et S5 15F4 ont Žgalement ŽtŽ testŽs en Western, en ELISA et en culture de cellules. Leur rŽponse suite ˆ ces diffŽrentes techniques est positive et cohŽrente avec la rŽponse obtenue en immunohistologie.

S5 8H2est un tr•s bon anticorps tant pour lÕintensitŽ de la rŽponse que pour lÕinforma- 150

/ B. PICARD, M.-P. DURIS, C. JURIE

B. PICARD, M.-P. DURIS, C. JURIE

INRA Laboratoire Croissance

et MŽtabolismes des Herbivores, Theix, 63122 Saint-Gen•s Champanelle

CaractŽrisation des cha”nes lourdes de myosine dans le muscle de bovin

Anticorps S5 8H2 S5 15F4 S4 10B6 S5 7E6

Muscle de bovin adulte Cutaneus trunci

IIA - +++ - +

IIB +++ +++ ++ +

Diaphragma

I +++ - - +

IIA - +++ - +

Semitendinosus

I ++ - - +

IIA - +++ - +

IIB ++ +++ ++ +

Muscle de fÏtus bovin culard (210 j) Longissimus dorsi

I ++ - - ?

II ++ ++ ++ ?

SpŽcificitŽ anti-I+IIb anti-II anti-IIb anti-myosine

Tableau 1. Réactivité des anticorps monoclonaux anti-chaîne lourde de myosine avec les différents types de fibres (I, IIA, IIB) dans le muscle de bovin. L’intensité de la réponse est notée : +++ très forte ; ++ forte ; + faible ; - négative ; ? non testé.

tion quÕil donne. Il est ˆ la fois anti-MHC I et anti-MHC IIb (figure 1). Il permet la classifi- cation des fibres I et des fibres IIB et donc des fibres IIA par diffŽrence. Il rŽpond ainsi ˆ lÕob- jectif de dŽpart : diffŽrencier les fibres IIA et IIB. Il permet la distinction de 2 populations de fibres rapides chez le fÏtus d•s 260 jours de gestation. Il peut •tre utilisŽ en immuno- histologie, en Western-blot et en culture de cellules, aussi bien chez le fÏtus que chez lÕadulte. Par contre, il ne peut pas •tre utilisŽ en ELISA bien quÕil donne une rŽponse, car il nÕexiste pas de muscle tŽmoin enti•rement MHC I + IIb permettant de rŽaliser une gamme Žtalon.

S5 15F4 est un tr•s bon anticorps anti- MHC rapides (MHC IIa et IIb) (figure 1) qui peut •tre utilisŽ aussi bien en immunohistolo- gie (chez le fÏtus et lÕadulte), quÕen ELISA, en Western et Žgalement en culture de cellules.

De ce point de vue en effet, S5 15F4 est dÕun intŽr•t tout particulier car lÕanticorps anti- MHC rapides F113 15F4 commercialisŽ par Biocytex ne donne aucune rŽponse en culture.

De plus, alors que chez lÕadulte ils reconnais- sent les m•mes cellules, ces deux anticorps anti-myosines rapides donnent des rŽsultats diffŽrents au stade fÏtal : S5 15F4 reconna”t des cellules qui jusquÕˆ prŽsent nÕŽtaient reconnues par aucun autre anticorps.

S4 10B6, anticorps anti-MHC IIb (figure 1), fait partie des hybridomes qui ont perdu rapi- dement de leur rŽactivitŽ, mais qui donnaient lors des premiers essais de tr•s bons rŽsultats en immunohistologie, en ELISA et en culture.

En rŽalitŽ cet hybridome est tr•s peu concen- trŽ et mŽrite dÕ•tre reclonŽ.

S5 7E6est un anti-myosine totale qui pour- rait •tre utilisŽ en vue dÕun dosage quantitatif de la myosine totale dans diffŽrents muscles.

Conclusion

LÕutilisation des anticorps S5 8H2 (anti- I+IIb) et S4 10B6 (anti-IIb) permettra de dis- tinguer les fibres IIA des fibres IIB et donc de prŽciser les diffŽrentes Žtapes de mise en place de ces fibres musculaires durant la vie fÏtale ainsi que leur Žvolution avec lÕ‰ge et sous lÕinfluence des diffŽrents facteurs dÕŽle- vage. De plus, il a dŽjˆ ŽtŽ possible, gr‰ce ˆ lÕanticorps S5 8H2 (anti-I+IIb) de mettre en Žvidence une population importante de fibres hybrides, appelŽes IIAB, reprŽsentant environ 10 % des fibres totales (Picard et al 1998).

LÕŽtude de ces fibres est un point important pour comprendre comment se produisent les changements de types de fibres. DÕautre part, S5 8H2 a Žgalement ŽtŽ retenu pour dÕautres esp•ces, en particulier lÕesp•ce porcine. Pour cette esp•ce il est anti-I+IIb+IIx. Bien que lÕisoforme MHC IIx nÕait pas pu •tre encore identifiŽe chez le bovin, plusieurs arguments nous am•nent ˆ supposer son existence. Selon HŠmŠla•nen et Pette (1995), dans les muscles squelettiques de mammif•res, plus la taille de lÕanimal est importante, plus la concentration

de lÕisoforme MHC IIx est ŽlevŽe et inverse- ment pour MHC IIb. De plus, MHC IIx a un Žpitope commun avec MHC IIb (Schiaffino et al1989), ce qui pourrait expliquer que jusquÕˆ prŽsent ces deux isoformes aient ŽtŽ confon- dues et laisse supposer que S5 8H2 serait Žga- lement anti-I+IIb+IIx chez le bovin avec une proportion tr•s importante de MHC IIx dans les muscles de bovin. Enfin, parmi les diffŽ- rents types de fibres prŽsents ˆ 210 jours de vie fÏtale, un type nÕŽtait reconnu par aucun anticorps parmi ceux existants jusquÕˆ prŽ- sent, ceci dans tous les muscles de bovin culard et dans le Cutaneus trunci de bovin non culard (Picard et al1995). Les anticorps S5 8H2 et S5 15F4marquent ces cellules qui ne sont reconnues par aucun autre anticorps ; ils apportent donc une information supplŽ- mentaire quant ˆ la caractŽrisation de ces fibres inconnues.

Les diffŽrents anticorps retenus dans ce pro- jet permettent donc de nouvelles applications pour lÕŽtude du muscle de bovin. Cependant lÕobjectif initial, ˆ savoir lÕobtention dÕanticorps spŽcifiques des MHC IIa et IIb utilisables en particulier en dosage ELISA nÕa pas ŽtŽ atteint et demeure un besoin important.

RŽfŽrences

Geay Y., Renand G., 1994. Importance de la variabi- litŽ gŽnŽtique et du mode dÕŽlevage des bovins sur les caractŽristiques musculaires et les qualitŽs orga- noleptiques de leur viande. 1^res Rencontres Recherches Ruminants, 177-182.

Figure 1. Révélation immunohistologique des chaînes lourdes de myosine dans le muscle Semitendinosus de bovin à l’aide des anticorps issus du projet Noé.

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152

/ L. LEFAUCHEUR, P. ECOLAN

L. LEFAUCHEUR, P. ECOLAN INRA Station de Recherches Porcines, 35590 Saint-Gilles

Composition en cha”nes lourdes de myosine des fibres musculaires de type II chez le porc

Les trois types de fibres musculaires clas- sŽes I, IIA et IIB par les techniques histoenzy- matiques existent dans les muscles squelet-

Figure 1. Coupes transversales sériées de muscle longissimus dorsi chez un porc de 100 kg de poids vif.

A) ATPase après préincubation à pH 4,35. B) Révélation de l’activité de la succinodéshydrogénase. C-F) Détection histoimmunologique des MHC à l’aide d’anticorps issus du projet Noé. Les chiffres 1, 2 et 3 repèrent 3 fibres homologues sur les différentes coupes sériées. Barre d’échelle : 50 mm.

tiques du porc au poids commercial dÕabattage (Lefaucheur et al 1991). Cette typologie repose sur un polymorphisme des cha”nes lourdes de la myosine (MHC) (Schiaffino et Reggiani 1996). Chez diverses esp•ces de laboratoire, quatre MHC ont ŽtŽ identifiŽes dans le muscle squelettique adulte : I, IIa, IIx et IIb (BŠr et Pette 1989, Schiaffino et al 1989, DeNardi et al 1993). Ces auteurs ont ainsi montrŽ que les fibres classŽes IIB lors- quÕelles sont typŽes par la mŽthode ATPase constituent une population hŽtŽrog•ne en regard de leur composition en MHC. A notre connaissance, la caractŽrisation du polymor- phisme des MHC de type II nÕa pas ŽtŽ rŽali- sŽe chez le porc, notamment en raison de lÕab- sence dÕanticorps spŽcifiques de chacune des isoformes de MHC. Ce texte rapporte les rŽsultats dÕhistoimmunologie obtenus avec les anticorps anti-MHC sŽlectionnŽs dans le pro- jet NoŽ.

Conditions expŽrimentales

LÕŽtude a ŽtŽ rŽalisŽe sur le musclelongissi- mus dorsi(LD) et la partie rouge du muscle semitendinosus(STR) chez des porcs femelles de race Large White abattus ˆ 100 kg de poids vif (165 jours dÕ‰ge). Les Žchantillons de muscle ont ŽtŽ prŽlevŽs environ 30 minutes apr•s lÕabattage, congelŽs par immersion dans de lÕisopentane refroidi par de lÕazote liquide et stockŽs ˆ Ð 80 ^oC jusquÕaux analyses histo- logiques.

Des coupes transversales sŽriŽes de 10 µm dÕŽpaisseur ont ŽtŽ rŽalisŽes ˆ lÕaide dÕun microtome ˆ congŽlation (Ð 20 ^oC). La colora- tion ATPase apr•s une prŽincubation de la coupe ˆ pH 4,35 a permis dÕidentifier les fibres de types I, IIA et IIB (Brooke et Kaiser 1970).

LÕactivitŽ de la succinodŽshydrogŽnase (SDH) est rŽvŽlŽe sur une coupe sŽriŽe (Nachlas et al 1957), elle permet de distinguer des fibres rouges (r), intermŽdiaires (i) et blanches (w) (figure 1B). Les colorations histoimmunolo-

giques sont rŽalisŽes ˆ lÕaide dÕanticorps monoclonaux anti-MHC issus du projet NoŽ : S5 7D4, S5 8H2, S5 14B3, et S5 7E6). La liai- son des anticorps est visualisŽe par lÕactivitŽ peroxydase ˆ lÕaide du kit Vectastain ABC (Laboratoires Vector, rŽfŽrence PK 4002).

RŽsultats et discussion

Dans les 2 muscles ŽtudiŽs, la coloration ATPasique rŽv•le trois types de fibres : des fibres colorŽes en noir (type I), en blanc (type IIA) ou en gris (type IIB) (figures 1A et 2A).

Les proportions de fibres de type I, IIA et IIB sont respectivement de 10 %, 6 % et 84 % dans le muscle LD, et 40 %, 25 % et 35 % dans le muscle STR. Les fibres de types I et IIA sont toujours riches en SDH (type r). En revanche, les fibres IIB constituent une popu- lation hŽtŽrog•ne en regard de la coloration SDH. Dans le muscle LD, environ 12 % des fibres IIB sont de type mŽtabolique intermŽ- diaire (IIBi), et 88 % sont de type blanc (IIBw). Dans le muscle STR, 100 % des fibres IIB sont de type mŽtabolique intermŽdiaire (IIBi) ou rouge (IIBr).

Dans le muscle LD, lÕanticorps S5 7D4 marque fortement les fibre IIA de mani•re homog•ne, alors que les fibres IIB prŽsentent un marquage hŽtŽrog•ne (figure 1C). Les fibres IIB les plus marquŽes par lÕanticorps S5 7D4 sont celles qui prŽsentent la plus forte activitŽ SDH, elles sont gŽnŽralement en contact avec les ”lots de fibres I et IIA. La majoritŽ des fibres IIB nÕest pas reconnue par lÕanticorps S5 7D4, elles sont pauvres en SDH (IIBw) et sont les plus ŽloignŽes du centre des il™ts de fibres I et IIA. Chez diverses esp•ces de laboratoire, les fibres intitialement classŽes IIB par la mŽthode ATPase correspondent en fait ˆ un mŽlange de fibres contenant des MHC IIx et/ou IIb (BŠr et Pette 1989, Schiaffino et al 1989, DeNardi et al 1993). DÕautre part, une dimi- nution de lÕactivitŽ SDH dans lÕordre I > IIA >

IIX > IIB a ŽtŽ mise en Žvidence chez ces esp•ces (Gorza 1990). Nos rŽsultats sugg•- rent donc que lÕanticorps S5 7D4 reconna”t spŽcifiquement les MHC IIa et IIx porcines, alors que la MHC IIb, probablement prŽsente dans les fibres IIB pauvres en SDH (IIBw), situŽes ˆ la pŽriphŽrie des ”lots de fibres I- IIA-IIX, nÕest pas reconnue. Dans le muscle STR, lÕanticorps S5 7D4 marque fortement et de mani•re homog•ne les fibres IIA et IIB en ATPase (figure 2C). Ce rŽsultat sugg•re que lÕensemble des fibres IIB du muscle STR sont en fait de type IIX, en accord avec un mŽtabo- lisme oxydatif plus ŽlevŽ que celui des vŽri- tables fibres IIB du muscle LD. Cet anticorps ne reconna”t pas les fibres de type I. Des observations rŽalisŽes dans le muscle semi- tendinosuschez des fÏtus de 75 jours (nais- sance ˆ 113 jours) sugg•rent que lÕanticorps S5 7D4 ne reconna”t pas les MHC embryon- naire et fÏtale (non montrŽ). En consŽ- quence, lÕanticorps S5 7D4 semble spŽcifique des MHC IIa et IIx et peut •tre utilisŽ pour

rŽvŽler leur prŽsence chez le porc au cours du dŽveloppement. Cependant, il ne permet pas de distinguer les MHC IIa des IIx.

Dans les 2 muscles ŽtudiŽs, lÕanticorps S5 8H2 marque les fibres de type I et IIB en ATPase, et ne rŽagit pas avec les fibres de type IIA (figures 1D et 2D). Cet anticorps reconna”t donc les MHC I, IIx et IIb dans le muscle squelettique du porc de 100 kg de poids vif. Il marque lÕensemble des fibres dans le muscle semitendinosus chez des fÏtus de 75 jours (non montrŽ), suggŽrant des rŽac- tions croisŽes avec les formes de MHC embryonnaire et/ou fÏtale. De ce fait, lÕanti- corps S5 8H2 peut difficilement •tre utilisŽ pour caractŽriser le polymorphisme des MHC au cours du dŽveloppement chez le porc. En revanche, il est utile pour identifier les fibres matures qui ne renferment que la MHC IIa (fibres pures IIA).

LÕanticorps S5 14B3 marque lÕensemble des fibres de type II en ATPase dans les muscles LD et STR (figures 1E et 2E). Il reconna”t donc les MHC de type IIa, IIx et IIb chez le porc de 100 kg de poids vif. La rŽaction posi- tive avec lÕensemble des fibres de la seconde gŽnŽration dans le muscle semitendinosus chez le fÏtus de 75 jours sugg•re une rŽaction

Figure 2. Coupes transversales sériées de muscle semitendinosus chez un porc de 100 kg de poids vif.

A-F : idem figure 1.

croisŽe avec les formes embryonnaire et/ou fÏtale. Cet anticorps peut donc servir ˆ rŽvŽ- ler lÕensemble des MHC adultes de type II (IIa+IIx+IIb) apr•s la disparition des formes embryonnaire et fÏtale.

LÕanticorps S5 7E6 reconna”t toutes les MHC adultes du muscle squelettique du porc (figures 1F et 2F). Il reconna”t Žgalement les formes de MHC embryonnaire et/ou fÏtale (non montrŽ). Il prŽsente un intŽr•t en his- toimmunologie pour visualiser la totalitŽ des fibres musculaires au cours du dŽveloppe- ment.

Conclusion

Le tableau 1 rŽcapitule les propriŽtŽs des 4 anticorps utilisŽs. LÕanticorps S5 7D4 est particuli•rement intŽressant. Sa rŽaction positive homog•ne avec les fibres IIA et IIB du muscle STR, associŽe ˆ un marquage nŽga- tif dÕune sous-population de fibres IIB dans le muscle LD, sugg•re que cet anticorps recon- na”t spŽcifiquement les MHC IIa et IIx chez le porc, dŽmontrant ainsi lÕexistence dÕau moins 3 isoformes rapides de MHC dans le muscle LD de porc de 100 kg de poids vif. Les trois isoformes rapides nÕavaient jusquÕˆ prŽsent ŽtŽ observŽes que chez les petites esp•ces de laboratoires (souris, rat, lapin et cobaye). Mal-

grŽ les apports du projet NoŽ, dÕautres tra- vaux sont encore nŽcessaires pour disposer dÕanticorps spŽcifiques de chacune des MHC chez le porc.

RŽfŽrences

BŠr A., Pette D., 1989. Three fast myosin heavy chains in adult rat skeletal. Fed. Eur. Biochem. Soc., 235, 153-155.

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/ B. FAUCONNEAU, G. PABOEUF

B. FAUCONNEAU, G. PABOEUF INRA Physiologie des Poissons, Campus de Beaulieu, 35042 Rennes Cedex

Tableau 1. Marquage ou non des différentes fibres par les 4 anticorps anti-MHC dans le muscle squelettique du porc de 100 kg de poids vif.

Anticorps S5 7D4 S5 8H2 S5 14B3 S5 7E6

Type de fibres

I non oui non oui

IIA oui non oui oui

IIX oui oui oui oui

IIB non oui oui oui

Etude histoimmunologique de lÕexpression des cha”nes lourdes de myosine dans le muscle squelettique

chez la truite arc-en-ciel

Le muscle squelettique de la truite arc-en- ciel est composŽ de fibres de type lent oxydatif formant le muscle rouge superficiel et de fibres de type rapide glycolytique formant le muscle blanc profond. Ces fibres sont consti- tuŽes de diffŽrents types de myosine (Rowler- son et al 1985). A la pŽriphŽrie du muscle

blanc, des fibres de type intermŽdiaire rapide oxydo-glycolytique forment un muscle rose en continuum avec le muscle blanc profond (Row- lerson et al 1985).

Dans les jeunes stades, le muscle blanc se dŽveloppe gr‰ce ˆ la persistance dÕune myogŽ-

n•se de novo (Stickland 1983) se traduisant par la synth•se rŽguli•re de nouvelles fibres musculaires. LÕŽtude de la proportion et de la rŽpartition de fibres immatures au sein du muscle blanc est particuli•rement importante pour les recherches sur la croissance du tissu musculaire et sur la qualitŽ de la chair des poissons. Une estimation du processus peut

•tre faite par lÕanalyse de la distribution de la taille des fibres sur des coupes transversales (Kiesslinget al1991, Fauconneauet al1997).

La mise en Žvidence des petites fibres est Žga- lement possible dans de nombreuses esp•ces de poissons car elles ont des caractŽristiques intermŽdiaires entre les fibres lentes et les fibres rapides (Rowlerson et al 1985). Chez les SalmonidŽs, ces petites fibres immatures ne se diffŽrencient des autres fibres que par leur teneur plus ŽlevŽe en glycog•ne (Fauconneau et al 1994).

LÕobjectif de la production dÕanticorps anti- cha”nes lourdes de myosine est donc de rechercher des isoformes spŽcifiques expri- mŽes dans les petites fibres du muscle blanc.

LÕexistence dÕun anticorps spŽcifique permet- trait dÕenvisager lÕanalyse, notamment par des tests de type ELISA, du pourcentage de petites fibres, afin dÕŽtudier le mŽcanisme de myogŽn•se de novo, et aussi de mieux ma”tri- ser les caractŽristiques du tissu musculaire chez les SalmonidŽs.

Conditions expŽrimentales

Les poissons utilisŽs sont des truites arc-en- ciel (Oncorhynchus mykiss) juvŽniles de 2 ˆ 4 g ŽlevŽes ˆ 11 ^oC dans les structures expŽrimen- tales de lÕINRA (circuit en eau recyclŽe, INRA Rennes).

Pour les Žtudes histologiques, une tranche compl•te de la musculature squelettique est prŽlevŽe dans la partie caudale (entre la nageoire adipeuse et la nageoire anale). Ces Žchantillons sont fixŽs dans un mŽlange Žtha- nol 70^o / glycine 0,05M, pH 2, puis dŽshydra- tŽs et inclus dans de la paraffine. Des coupes transversales de 15 µm sont rŽalisŽes.

Pour les Žtudes in vitro, les muscles sque- lettiques dorsaux sont prŽlevŽs dans des conditions stŽriles et les cellules satellites sont extraites et mises en culture (Rescan et al 1994). Les cellules sont cultivŽes en prŽ- sence de sŽrum de veau fÏtal 10 % pendant 8 jours jusquÕˆ confluence et fusion en myo- tubes. Les myotubes sont fixŽs dans un mŽlange Žthanol 70^o / glycine 0,05 M, pH 2 puis stockŽs au froid (Ð 20 ^oC) jusquÕˆ ana- lyse.

Les coupes sont dŽparrafinŽes et rŽhydra- tŽes alors que les myotubes sont utilisŽs direc- tement. Les Žchantillons sur lames sont rin- cŽs dans du tampon phosphate de sodium 0,01M pH 7,4 ; traitŽs par la saponine (0,2 % dans le tampon phosphate) et saturŽs par de lÕalbumine sŽrique bovine (0,2 % dans du tam- pon phosphate 0,01M pH 7,4). Les coupes sont ensuite mises en contact du premier anticorps

(surnageant pur ou diluŽ au 1/10) pendant une heure, rincŽes avec du tampon phosphate puis mises en contact avec le second anticorps fluorescent (anticorps anti-IgG souris couplŽ au FITC TEBU M30001) diluŽ au 1/100 dans du tampon phosphate pendant une heure. Les coupes sont lavŽes ensuite avec le tampon phosphate et montŽes entre lame et lamelle avec du mowiol.

Soixante-quinze anticorps ont ŽtŽ testŽs : 15 de la sŽrie 2 (S2 : anticorps anti-myosine de bovin et de cheval), 30 de la sŽrie 4 (S4 : anticorps anti-myosine de poisson et de dinde) et 30 de la sŽrie 5 (S5 : anticorps anti-myosine de porc et de poulet). Les rŽactions sur les fibres ont ŽtŽ classŽes sur une Žchelle de 0 ˆ 4 pour les fibres du muscle rouge (zone extŽ- rieure et intŽrieure), du muscle intermŽdiaire et du muscle blanc (petites fibres, pŽriphŽrie, pointes et intŽrieur des grandes fibres).

Principaux rŽsultats obtenus

Les anticorps issus de lÕimmunisation contre les myosines de bovin et de cheval (S2) rŽagissent pour la plupart ˆ la pŽriphŽrie des fibres. Certains anticorps issus des immunisa- tion contre les myosines de porc et de poulet (S5) rŽagissent de mani•re non spŽcifique contre lÕensemble des fibres musculaires des muscles rouge, intermŽdiaire et blanc (ex : S5 11B4, S5 7D4). Il sÕagit souvent dÕanticorps rŽagissant contre les fibres de type I et II dans dÕautres esp•ces.

Les anticorps issus des immunisations contre les myosines de truite et dinde (S4) don- nent des rŽactions plus spŽcifiques des fibres de type rapide (S4 9C4, S4 10E6, S4 8E6). Cer- tains de ces anticorps (ex : S4 8E6) rŽagissent de mani•re homog•ne dans lÕensemble des fibres rapides des muscles intermŽdiaire et blanc (figures 1a et 1b) et dans lÕensemble les myotubes des cellules satellites de muscle blanc en culture (figure 1c). Ces anticorps rŽagissent Žgalement faiblement sur des fibres pŽriphŽriques du muscle rouge et de mani•re complŽmentaire ˆ la rŽponse dÕun anticorps monoclonal anti-myosine lente du poulet (S59 ; Crow et Stockdale 1986). Il semblerait donc exister un gradient dÕexpression de myosine dans le muscle rouge, ce qui constitue un rŽsultat original, observŽ jusquÕalors dans la composition en cha”nes lŽg•res du muscle rouge (Fauconneau et al1994).

Des anticorps Žgalement issus de la sŽrie 4 (S4 10H9 et S4 10H2) sont spŽcifiques en test ELISA des myosines de truite et spŽcifiques en Western des cha”nes lourdes de myosine.

Ces anticorps rŽv•lent positivement les petites fibres et Žgalement plus faiblement la pointe des grandes fibres au sein du muscle blanc (figure 1d). Il sÕagit de la premi•re dŽmonstration dÕune hŽtŽrogŽnŽitŽ dans lÕex- pression des isoformes de myosine dans le muscle blanc chez les SalmonidŽs. Cet anti- corps ne rŽv•le que quelques rares myotubes in vitro (figure 1e).

Enfin un anticorps issu de la sŽrie 5 et rŽagissant en ELISA et en Western contre les cha”nes lourdes de myosine donne une rŽponse de type mosa•que, diffŽrente de celle dŽcrite prŽcŽdemment. Les fibres de taille intermŽdiaire et les petites fibres rŽagissent fortement ˆ la pŽriphŽrie et faiblement au centre, alors quÕaucune rŽvŽlation nÕest obser- vŽe dans les grandes fibres (figure 1f).

LÕemploi de diffŽrents anticorps semble donc mettre en Žvidence une hŽtŽrogŽnŽitŽ tr•s forte jamais suspectŽe jusquÕˆ prŽsent dans les muscles squelettiques blanc et rouge des poissons. Certains anticorps sont des can- didats intŽressants comme marqueurs des petites fibres dans le muscle blanc, qui per- mettront lÕŽtude ultŽrieure de la croissance de type hyperplasique dans le muscle.

RŽfŽrences

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/ B. FAUCONNEAU, G. PABOEUF

Figure 1. Révélation des chaînes lourdes de myosine dans le muscle squelettique de la truite arc-en-ciel (1a, 1b, 1d, 1f) et les myotubes issus de cellules satellites de muscle blanc de truite arc en ciel (1c, 1e). Les anticorps testés sont des surnageants purs : S4 8E6 (1a, 1b, 1c), S4 10H9 (1d, 1e), S5 10H6 (1f).

Chez les oiseaux domestiques, les muscles que lÕon trouve dans la cuisse et les pattes sont gŽnŽralement dŽcrits comme Žtant de type lent oxydatif. Au contraire, les muscles pectoraux (muscles du filet) sont de typologie variable. Ils prŽsentent une typologie myofi- brillaire mixte (oxydo-glycolytique ou IIA, et glycolytique ou IIB) chez les palmip•des et les oiseaux qui volent, et un caract•re compl•te- ment glycolytique (fibres musculaires 100 % IIB) chez la dinde et le poulet.

On conna”t par ailleurs les liens qui peu- vent exister entre la typologie des fibres mus- culaires et la qualitŽ de la viande en gŽnŽral.

Ainsi, dans les muscles prŽsentant diffŽrents types de fibres dans des proportions variables, la prŽsence dÕune majoritŽ de fibres de tel ou tel type a un effet sur les caractŽristiques organoleptiques et technologiques de la viande. Des Žtudes rŽcentes ont par ailleurs montrŽ que des facteurs comme la vitesse de croissance, lÕ‰ge ˆ lÕabattage, ou la conforma- tion des carcasses (augmentation du rende- ment en muscles pectoraux) pouvaient modi- fier la typologie des fibres dans certains muscles. DÕautres facteurs gŽnŽtiques, comme une plus ou moins grande susceptibilitŽ au stress, peuvent aussi entra”ner des modifica- tions de la typologie des muscles.

D•s lors, il para”t intŽressant de mieux comprendre comment les types de fibres mus- culaires se mettent en place chez lÕembryon dÕoiseau et de voir comment on pourrait ma”- triser ce facteur, notamment ˆ lÕaide de la gŽnŽtique. Pour cela, il semble indispensable de possŽder des outils de typologie fiables et facilement utilisables en grande sŽrie. LÕob- tention dÕanticorps spŽcifiquement orientŽs vers des types particuliers de fibres permet- trait dÕenvisager une telle approche, notam- ment au travers de biopsies exploitŽes en immuno-histologie (simplification des tech- niques actuelles en coupes sŽriŽes) ou avec des mŽthodes ELISA.

Mode opŽratoire

Les muscles sŽlectionnŽs (3 au total) ont ŽtŽ prŽlevŽs apr•s anesthŽsie et sacrifice dÕun poulet standard adulte (20 semaines). Les deux muscles retenus avaient les caractŽris- tiques suivantes (en histologie classique) :

Posterior latissimus dorsi(PLD) : fibres IIA et IIB ;

Pectoralis major(PM) : fibres IIB.

De plus le muscle sartorius(SART, fibres I, IIA et IIB) a ŽtŽ conservŽ pour lÕanalyse histo- logique.

Nous avons testŽ 70 anticorps issus des sŽries S4 (poisson + dinde), S5 (poulet + porc) et S2 (bovin + cheval).

LÕensemble des observations a ŽtŽ fait sur des coupes congelŽes (7 µm dÕŽpaisseur).

Apr•s un rin•age rapide dans du PBS, la coupe est mise ˆ incuber pendant 10 minutes ˆ tempŽrature ambiante en prŽsence de sŽrum normal (4 % dans du PBS) afin de blo- quer les sites non spŽcifiques. Les coupes sont ensuite mises ˆ incuber (chambre humide ˆ + 4 ^oC) pendant une nuit en prŽsence du surna- geant ˆ tester. Apr•s deux rin•ages dans du PBS, lÕanticorps secondaire (FITC) est appli- quŽ pendant une heure ˆ tempŽrature ambiante, puis les coupes sont rincŽes abon- damment au PBS et montŽes en milieu aqueux. LÕobservation au microscope est rŽali- sŽe immŽdiatement afin de rŽduire dÕŽven- tuels probl•mes issus de lÕextinction naturelle de la fluorescence.

RŽsultats de la premi•re production dÕanticorps

Dans un premier temps 5 groupes ont ŽtŽ constituŽs selon lÕefficacitŽ de marquage des diffŽrents anticorps sur les muscles PLD, PM et SART des poulets adultes (tableau 1).

Nous avons Žgalement testŽ, dans les m•mes conditions, des anticorps produits par lÕŽquipe de Schiaffino, ce testage sÕest avŽrŽ de peu dÕintŽr•t chez lÕesp•ce poulet.

Parmi tous les anticorps, 7 ont ŽtŽ retenus (S5 10H5, S5 12D1, S5 16D12, S5 8F3, S4 14B12, S4 9H5 ET S4 17F7) qui paraissaient avoir un intŽr•t plus particulier. Ils ont donc ŽtŽ testŽs une nouvelle fois ˆ des dilutions plus importantes (1/10, 1/100 et 1/1000) afin de sÕassurer de leur spŽcificitŽ. Ces rŽsultats obtenus en histologie ont ŽtŽ confrontŽs ˆ ceux obtenus par la technique du Western- blot par la sociŽtŽ Biocytex. Les rŽsultats sont prŽsentŽs dans le tableau 2.

Pour trois anticorps, il y a une diffŽrence nette entre les rŽsultats des deux techniques.

En effet, lÕanticorps S4 9H5, par exemple, marque les fibres de type IIB en immunohis-

H. RƒMIGNON*, V. DESROSIERS INRA Station de Recherches Avicoles 37380 Nouzilly.

* Adresse actuelle : Ecole Nationale SupŽrieure Agronomique de Toulouse, BP 107, 31326 Castanet- Tolosan Cedex

Recherche dÕanticorps dirigŽs contre les diffŽrents types de fibres chez le poulet

Tableau 1. Résultats du testage des anticorps sur les muscles de poulets.

Groupe Marquage Proportion dÕanticorps

G1 Pas de marquage 19 / 70 soit 27 %

G2 Marquage de toutes les fibres rapides 36 / 70 soit 51 % G3 Marquage de toutes les fibres 9 / 70 soit 13 % G4 Marquage non homog•ne (mosa•que) 5 / 70 soit 7 % G5 Marquage du tissu conjonctif 1 / 70 soit 1 %

tologie mais donne un rŽsultat nŽgatif lors du testage en Western-blot. Or le muscle PLD, qui a ŽtŽ utilisŽ en Western-blot, est toujours dŽcrit comme contenant des fibres de type IIA et IIB chez le poulet. Le m•me type de remarque peut •tre fait pour les anticorps S5 8F3 et S5 10H5. Ces Žcarts peuvent •tre expliquŽs par une Žventuelle modification structurelle de la myosine au cours de son extraction chimique ou de lÕŽlectrophor•se sŽparative.

Par la suite, seuls les anticorps suivants ont ŽtŽ retenus car ils prŽsentaient un rŽel intŽr•t en immunohistologie et en Western-blot : S4 17F7 anti-fibre I

S5 16D12 anti-fibre rapide

S5 8F3 anti-fibre IIA (et certaines IIB) S4 9H5 anti-fibre IIB.

RŽsultats de la deuxi•me production dÕanticorps

Ces 4 anticorps ont fait lÕobjet dÕune nou- velle production que nous avons testŽe dans des conditions identiques ˆ celles prŽsentŽes prŽcŽdemment. Les rŽsultats ont ŽtŽ quelque peu modifiŽs par rapport aux prŽcŽdents car le marquage des fibres I (S4 17F7) a beaucoup faibli en intensitŽ et ceux des anticorps S5 16D12 et S5 8F3 ont disparu. Par contre le marquage anti-IIB du S4 9H5 a persistŽ cor- rectement. Pour essayer de corriger ces Žcarts de rŽvŽlation, les nouvelles productions dÕan- ticorps ont ŽtŽ utilisŽes ˆ des dilutions plus faibles (1/10 et 1/100) et avec des syst•mes de rŽvŽlation diffŽrents (Kit LSAB de Dako, Kit Vectastain de Vector Laboratories). Mais les rŽsultats nÕont pas ŽtŽ amŽliorŽs et seuls les anticorps S4 17F7 (anti-I) et S4 9H5 (anti- IIB) ont ŽtŽ retenus pour de nouveaux tests.

Ces tests supplŽmentaires ont ŽtŽ effectuŽs sur des individus et des muscles diffŽrents de ceux utilisŽs prŽcŽdemment, mais dans les m•mes conditions que lors du criblage pri- maire (utilisation de lÕanticorps diluŽ au 1/1000 et rŽvŽlation par le FITC (Sigma) au 1/500). Les muscles utilisŽs chez les diffŽrents animaux Žtaient le posterior latissimus dorsi (PLD, fibres IIA et IIB), le pectoralis major (PM, fibres IIB), le sartorius (SART) et lÕad- ducteur profond (AP) qui contiennent tous les

deux des fibres I, IIA et IIB. Les animaux uti- lisŽs Žtaient tous issus de la m•me souche et ont ŽtŽ testŽs aux ‰ges de 1 (n=4), 3 (n=4), 6 (n=4) 12 (n=4) et 20 (n=3) semaines.

Chez lÕensemble de ces individus, lÕanticorps S4 17F7(anti-I) fonctionne correctement dans lÕensemble des muscles o• des fibres lentes sont prŽsentes. On note cependant une inten- sitŽ de marquage plus ou moins forte suivant les ‰ges, le marquage paraissant plus intense ˆ partir de 3 semaines.

Pour lÕanticorps S4 9H5 (anti-IIB), les rŽsultats sont beaucoup moins facilement interprŽtables. Ainsi, on obtient 100 % de marquage correct chez 2 individus sur 3 ˆ lÕ‰ge de 20 semaines et simplement 83 % de marquage correct chez le troisi•me. Dans ce dernier cas, 17 % des fibres identifiŽes comme Žtant IIB en histologie classique ne sont pas reconnues par lÕanticorps. La proportion de fibres correctement marquŽes varie ensuite beaucoup selon lÕ‰ge, mais se situe toujours autour de 60 ˆ 70 %. Ces chiffres sont en fait le rŽsultat des moyennes calculŽes sur tous les individus dÕun m•me ‰ge pour les muscles PLD, SART et AP. De plus, chez certains indi- vidus, lÕefficacitŽ du marquage pour cet anti- corps varie en fait de 75 % ˆ 100 % (pour des champs diffŽrents pris dans le m•me muscle) dans le muscle SART ˆ 3 semaines et dans le PLD ˆ 6 semaines.

Dans le muscle PM, au contraire, le mar- quage des fibres est totalement efficace, sauf ˆ lÕ‰ge de 1 semaine o• lÕefficacitŽ est voisine de 85 %. Cette hŽtŽrogŽnŽitŽ est aussi consta- tŽe dans les autres muscles ; elle est probable- ment due ˆ un typage non homog•ne des fibres IIB ˆ cet ‰ge.

Conclusion

De fa•on gŽnŽrale, on ne peut pas retenir une compl•te spŽcificitŽ de marquage de lÕan- ticorps S4 9H5 et ce dÕun ‰ge ou dÕun muscle ˆ lÕautre.

Il faut en conclure que :

- soit lÕanticorps reconna”t un Žpitope qui nÕest pas reprŽsentŽ ˆ 100 % dans toutes les fibres IIB de tous les poulets testŽs, cÕest-ˆ- dire que lÕanticorps reconna”t une sous-classe 158

/ H. RƒMIGNON, V. DESROSIERS

Tableau 2. Confrontation des résultats de spécificité de certains anticorps en fonction de la technique d’identification des types de fibres utilisée.

Anticorps Histologie⁽¹⁾ Western-blot⁽²⁾ Observations

S4 9H5 IIB - Non concordance Western - histologie

S4 14B12 Anti-rapide + Anticorps anti-fibre rapide

S4 17F7 Anti-lent - Anticorps anti-fibre lente

S5 8F3 IIA et quelques IIB - Non concordance Western - histologie

S5 10H5 Anti-rapide - Non concordance Western - histologie

S5 12D1 Anti-rapide + Anticorps anti-fibre rapide

S5 16D12 Anti-rapide + Anticorps anti-fibre rapide

(1) - = NŽgatif : absence de marquage ; + = Positif : prŽsence de marquage.

(2) Test effectuŽ sur le muscle posterior latissimus dorsi(PLD).

de fibres particuli•res que lÕon ne distingue pas des IIB en histologie classique ;

- soit la technique dÕidentification des fibres IIB (ATPase acide classique) est imparfaite et ne permet pas de systŽmatiquement bien typer les fibres musculaires.

Il est bien difficile de choisir entre ces deux hypoth•ses car on sait que certaines fibres existent mais ne sont pas dŽtectables en histo- logie classique (cas des fibres IIx chez le porc).

On sait aussi que la typologie myofibrillaire est dans un Žtat dynamique (avec des possibili-

tŽs de passage dÕun type ˆ lÕautre) et quÕil peut donc aussi y avoir des fibres dans un Žtat intermŽdiaire de fa•on transitoire et normale.

QuoiquÕil en soit, il para”t impossible dÕes- sayer dÕutiliser ces anticorps aujourdÕhui en substitution des techniques ATPasiques clas- siques. De plus la perte totale de rŽactivitŽ des anticorps S5 16D12, S5 8F3 et la diminu- tion apparente de lÕaffinitŽ du S4 17F7 sont encore un point dÕinterrogation supplŽmen- taire sur leur spŽcificitŽ rŽelle pour les types de fibres initialement identifiŽes.

Y. CHEREL, L. GUIGAND, M. WYERS INRA URA 703 DŽveloppement et Pathologie du tissu musculaire, ƒcole Nationale VŽtŽrinaire, BP 40706, 44307 Nantes Cedex 03

Anticorps anti-cha”nes lourdes de myosine : outils dÕŽtude de la rŽgŽnŽration musculaire dans lÕesp•ce dinde

La production de dindes de souche mŽdium- alourdie (m‰les de 16 semaines abattus ˆ 12 kg environ et femelles de 12 semaines abattues ˆ 7 kg) fournit des carcasses utili- sŽes en dŽcoupe. Les produits issus de cette dŽcoupe ont des valeurs commerciales diffŽ- rentes : les pectoraux procurent une viande blanche (correspondant ˆ des muscles rapides) transformŽe en escalopes ou r™tis, cÕest la partie noble ; les cuisses et, dans une moindre mesure, les ailes sont composŽes de viande rouge, correspondant ˆ des muscles mixtes rapides et lents. Ils sont ˆ lÕorigine de steak, osso bucco et blanquette. Actuellement, la transformation de la viande pour fournir des produits de charcuterie est encore peu dŽveloppŽe, m•me si cette transformation semble reprŽsenter un dŽbouchŽ dÕavenir.

Les notions de qualitŽ de la viande de dinde se rŽsument aujourdÕhui ˆ deux problŽma- tiques diffŽrentes : la premi•re concerne la couleur des muscles blancs (hŽtŽrogŽnŽitŽ de couleur ainsi que grisaillement) cÕest-ˆ-dire quasi-exclusivement les muscles pectoraux ; la seconde a trait ˆ lÕexsudation des viandes apr•s transformation. Or, les muscles pecto- raux sont des muscles homog•nes rapides, for- mŽs presque totalement de fibres de type IIB.

La production dÕanticorps permettant de dis- criminer les cha”nes lourdes de myosine (MHC) des types IIa et IIb dans le but de typer les fibres musculaires nÕa donc pas, dans lÕesp•ce dinde, lÕintŽr•t quÕelle peut avoir en termes de qualitŽ des viandes et de sŽlec- tion dans dÕautres esp•ces.

En revanche, cette production dÕanticorps prŽsente un intŽr•t en tant quÕoutil dÕŽtude de la biologie du tissu musculaire. En effet, pour lÕŽtude de la croissance du tissu musculaire

aussi bien que pour lÕŽtude de sa rŽgŽnŽration apr•s lŽsion, lÕexpression des isoformes de myosine est un excellent marqueur de la diffŽ- renciation cellulaire.

Au cours de la croissance, les fibres muscu- laires multinuclŽŽes fusionnent avec des myo- blastes issus de la prolifŽration de cellules satellites. Le nombre de noyaux des fibres cro”t, ce qui permet, par lÕintermŽdiaire des synth•ses de myofilaments, dÕaugmenter la taille de la cellule, car le rapport nuclŽo-cyto- plasmique est constant dans un type de fibre donnŽ.

Apr•s lŽsion de la fibre musculaire, les zones nŽcrosŽes sont ŽliminŽes par phagocy- tose macrophagique, puis les cellules satel- lites fournissent les myoblastes qui fusion- nent avec la fibre blessŽe ou fusionnent entre eux pour fournir des nŽo-myotubes.

Apr•s la fusion, ces nŽo-myotubes ou cer- taines portions de fibres matures synthŽtisent les protŽines contractiles avec une succession dÕisoformes qui reproduit le dŽcours temporel observŽ pendant le dŽveloppement embryon- naire. La mise en Žvidence de ces isoformes est un moyen dÕŽtude de la diffŽrenciation cel- lulaire et de lÕaction de facteurs modulant le dŽveloppement du tissu.

Nous utilisons au laboratoire, en immuno- fluorescence ou en immunohistoenzymologie, plusieurs anticorps anti-isomyosines dŽvelop- pementales dans le cadre de travaux sur la rŽgŽnŽration musculaire, et en immunocyto- chimie sur culture de cellules satellites pour caractŽriser les populations de cellules. La possession dÕanticorps anti-MHC IIa et IIb complŽterait de fa•on tr•s intŽressante la gamme existante.

Conditions expŽrimentales

Les anticorps monoclonaux anti-MHC pro- duits dans le cadre du projet NoŽ ont tous ŽtŽ testŽs sur diffŽrents muscles de dinde par immunofluorescence : les coupes rŽalisŽes au cryostat ont ŽtŽ fixŽes ˆ lÕacŽtone ˆ 4 ^oC pen- dant 30 minutes puis incubŽes avec lÕanti- corps primaire diluŽ au 1/10 et 2 % de BSA pendant 1 heure ˆ 37 ^oC puis lavŽs dans du PBS pH 7,2. Les coupes ont ensuite ŽtŽ incu- bŽes ˆ la tempŽrature de la pi•ce avec lÕanti- corps secondaire liŽ au FITC (Euromedex AP 160F) diluŽ au 1/100 pendant 1 heure.

Lorsque le signal paraissait prometteur, un contr™le ˆ une dilution de lÕanticorps primaire ˆ 1/100 a ŽtŽ rŽalisŽ.

Afin de fixer avec prŽcision le type de chaque anticorps, chacun dÕentre eux a ŽtŽ uti- lisŽ sur 4 muscles coupŽs en congŽlation : le pectoral (pectoralis major), composŽ presque exclusivement de fibres de type IIB, le PLD (posterior latissimus dorsi), composŽ dÕun mŽlange de fibres de type IIA et IIB, lÕITC (iliotibialis cranialis), formŽ dÕune zone hŽtŽ- rog•ne composŽe de fibres de type I, IIA et IIB et dÕune zone hŽtŽrog•ne composŽe de fibres de type IIA et IIB, et lÕALD (anterior latissimus dorsi), composŽ de fibres de type III.

RŽsultats

Les rŽsultats suivants ont ŽtŽ obtenus : - 1 anticorps a fourni un marquage tr•s faible des fibres squelettiques mais il mar- quait tr•s fortement les art•res prŽsentes sur la coupe (MHC spŽcifique de fibre musculaire lisse) ;

- 32 anticorps ont fourni un signal nul ou faible ;

- 1 anticorps un signal tr•s faible sur des fibres de type III (lentes) ;

- 16 anticorps un signal positif sur les fibres de type II, sans les diffŽrencier ;

- 5 anticorps pan-myosine (cÕest-ˆ-dire cou- vrant toutes les isoformes de myosine), mar- quage de toutes les fibres ;

- 3 pan-myosine avec un signal supŽrieur pour les fibres de type I (lentes) ;

- 3 pan-myosine avec un signal supŽrieur pour les fibres de type II (rapides) ;

- 3 anticorps ont fourni un signal restreint aux fibres de type II, mais en se fixant de fa•on plus marquŽe sur certaines fibres II et beaucoup plus faible sur dÕautres fibres II, aboutissant ˆ la formation dÕune mosa•que ˆ lÕobservation des coupes transversales.

Ces trois derniers anticorps, ˆ savoir S5 8H2, S5 7D4et S5 11D6, ainsi que lÕanticorps anti-I S5 7F10ont ŽtŽ retenus.

LÕanalyse en Western-blot a montrŽ que deux des anticorps anti-myosine rapide four- nissant une mosa•que en immunofluorescence Žtaient des anticorps anti-II, et que le troi- si•me Žtait un anticorps anti-IIa, mais la mosa•que observŽe ne correspond pas ˆ une distribution de fibres de type IIA et IIB, des fibres IIB Žtant positives. On peut interprŽter cette distorsion par lÕexistence de fibres conte- nant ˆ la fois des isoformes IIa et IIb corres- pondant ˆ une maturation incompl•te.

Les anticorps gŽnŽrŽs par ce projet consti- tuent des outils utilisables en immunohisto- chimie. Ils sont en cours de test sur des myo- tubes issus de la rŽgŽnŽration musculaire in vivo et sur des myoblastes en culture.

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/ Y. CHEREL, L. GUIGAND, M. WYERS

E. BARREY, J. P. VALETTE

, M. JOUGLIN

INRA Station de GŽnŽtique Quantitative et AppliquŽe, 78352 Jouy-en-Josas

* Ecole Nationale VŽtŽrinaire dÕAlfort, Laboratoire de BiomŽcanique, 94704 Maisons- Alfort Cedex

Analyse de la composition en cha”nes lourdes de myosine chez le cheval : application ˆ la sŽlection du cheval de course

La performance du cheval de course dŽpend de plusieurs facteurs biologiques interdŽpen- dants : la respiration, la circulation sanguine, le mŽtabolisme ŽnergŽtique, les contractions musculaires, la locomotion et lÕaptitude com- portementale. Les propriŽtŽs contractiles et mŽtaboliques des muscles propulseurs consti- tuent lÕun des facteurs limitants qui dŽtermi- nent la force et lÕendurance du cheval ˆ la course (Barrey 1994). La force dŽveloppŽe par les contractions musculaires dŽpend ˆ la fois du nombre total et du type de fibres qui com- posent le muscle. Chez le cheval, il existe trois

isoformes de la cha”ne lourde de la myosine : la myosine lente (MHC I), et deux myosines rapides (MHC IIa et MHC IIb). Les fibres musculaires tr•s riches en isoforme MHC IIb produisent des contractions plus puissantes mais moins durables. Une fibre musculaire peut •tre composŽe de plusieurs isoformes de la myosine (I+IIa ou IIa+IIb) et la myosine dominante dŽtermine le type de fibre parmi les types lent (I) ou rapides (IIA, IIB) lors- quÕon les observe en histologie par la mŽthode de coloration ATPase (Rivero et al 1996). Le type de fibre rapide dŽnommŽe IIC en histolo-