Production des anticorps monoclonaux spécifiques des chaînes lourdes de myosine

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Catherine Jurie, J. Nédelec, Brigitte Picard

To cite this version:

Catherine Jurie, J. Nédelec, Brigitte Picard. Production des anticorps monoclonaux spécifiques des

chaînes lourdes de myosine. Productions animales, Institut National de la Recherche Agronomique,

1998, 11 (2), pp.146-149. �hal-02695973�

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Ce dernier offre lÕavantage dÕ•tre quantitatif, plus reprŽsentatif de lÕensemble du muscle quÕune coupe histologique, et de pouvoir •tre appliquŽ sur un grand nombre dÕŽchantillons.

DiffŽrents anticorps sont commercialisŽs, cependant, jusquÕen 1995, aucun anticorps spŽcifique des isoformes MHC IIa et IIb nÕŽtait disponible dans le commerce pour aucune esp•ce. Aussi, plusieurs Žquipes INRA se sont associŽes ˆ la sociŽtŽ Biocytex afin de produire des anticorps monoclonaux spŽcifiques des isoformes de myosine IIa et IIb chez le bovin, le porc, le poisson, le poulet, la dinde et le cheval, dans le cadre dÕun projet nommŽ Ç NoŽ È. La dŽmarche suivie ainsi que les rŽsultats obtenus sont dŽcrits dans ce dossier. De plus, les applications possibles sont dŽtaillŽes pour chacune des esp•ces concernŽes.

RŽfŽrences

Brooke M.M., Kaiser K., 1970. Muscle fiber type : how many and what kind ? Arch. Neurology, 23, 369-370.

Peter J.B., Barnard R., Edgerton V.R., Gillespie C.A., Stempel K.E., 1972. Metabolic profiles of three fiber types of skeletal muscle in guinea pigs and rabbits.

Biochem., 11, 2627-2633.

Pette D., Staron R.S., 1990. Cellular and molecular diversities of mammalian skeletal muscle fibers. Rev.

Physiol. Biochem. Pharmacol., 116, 1-76.

C. JURIE, J. NƒDELEC^*, B. PICARD INRA Laboratoire Croissance

et MŽtabolismes des Herbivores, Theix, 63122 Saint-Gen•s Champanelle

*Biocytex, 140, Chemin de lÕArmŽe dÕAfrique, 13010 Marseille

Figure 1. Schéma d’une molécule de myosine.

Tableau 1. Caractéristiques contractiles et métaboliques des trois principaux types de fibres musculaires.

Type de fibres Lentes = I Rapides

IIA IIB

Cha”ne lourde de myosine I IIa IIb

ActivitŽ ATPasique faible forte forte

MŽtabolisme oxydatif oxydo-glycolytique glycolytique Chaînes lourdes

Extrémités COOH

Chaînes légères

Extrémités NH2

AA A A AA A A

C C

N N Queue Tête

(2 hélices α enroulées)

Production des anticorps monoclonaux spŽcifiques des cha”nes lourdes de myosine

Le principe de production des anticorps monoclonaux consiste ˆ extraire la myosine des muscles dÕanimaux des diffŽrentes esp•ces, ˆ la purifier et ˆ lÕinjecter ˆ des souris (immunisation) censŽes fabriquer des anticorps contre la myosine. LorsquÕune bonne rŽponse en anticorps est obtenue, les lymphocytes splŽniques (cellules de la rate qui pro- duisent des anticorps) sont fusionnŽs avec des cellules dÕune lignŽe de myŽlome (immortelles) gr‰ce ˆ lÕaddition de polyŽthyl•ne glycol qui induit la fusion membranaire. Les lymphocytes ayant fusionnŽ avec les cellules de myŽlome sont repŽrŽs en culture sur un milieu sŽlectif et sont appelŽs hybridomes.

Chaque hybridome est testŽ pour la production dÕanticorps anti-myosine. Si la rŽponse est positive, la culture est clonŽe, cÕest-ˆ-dire rŽpartie dans des plaques multipuits de telle sorte quÕil nÕy ait quÕune cellule par puits,

celle-ci Žtant ˆ la fois immortelle et produc- trice dÕanticorps (monoclonal) (figure 1).

Protocole expŽrimental

Extraction de myosine purifiŽe

Pour chaque esp•ce, lÕextraction de myosine a ŽtŽ effectuŽe ˆ partir dÕun Žchantillon de 1 g de muscle, congelŽ et conservŽ ˆ Ð 80 ^oC.

Toutes les Žtapes de lÕextraction ont ŽtŽ rŽali- sŽes ˆ + 4 ^oC afin dÕinhiber lÕaction des pro- tŽases.

Pour Žviter des variations dues aux diffŽ- rentes techniques de purification utilisables, toutes les extractions de myosine purifiŽe ont ŽtŽ rŽalisŽes par la m•me personne du labora-

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toire Croissance et MŽtabolismes des Herbi- vores de lÕINRA. Au dŽpart, deux techniques ont ŽtŽ testŽes, une technique utilisant un tampon Guba-Straub classique (Pearson et Young 1989) et une technique dŽcrite par Martone et al (1986). Bien que diffŽrentes dans la composition de leurs tampons dÕextra- ction, ces deux techniques sont basŽes sur le m•me principe, qui repose sur les propriŽtŽs chimiques de la myosine, ˆ savoir que celle-ci est soluble ˆ haute force ionique (> 0,23), inso- luble ˆ faible force ionique et poss•de la pro- priŽtŽ dÕhydrolyser lÕATP.

LÕŽchantillon est tout dÕabord broyŽ et homogŽnŽisŽ dans un tampon de faible force ionique pour extraire les protŽines. Apr•s centrifugation, le culot contenant la fraction protŽique myofibrillaire est repris dans un tampon de haute force ionique afin de solubi- liser la myosine. De lÕATP est ajoutŽ pour dis- socier les complexes actine-myosine et donc libŽrer la myosine. Apr•s une nouvelle cen-

trifugation, permettant entre autres dÕŽlimi- ner lÕactine dans le culot, celle-ci nÕŽtant pas soluble ˆ haute force ionique, le surnageant contenant la myosine est rŽcupŽrŽ. La myosine est ensuite prŽcipitŽe par addition dÕEDTA pour la technique de Pearson et Young (1989) ou de KHCO₃pour la technique de Martone et al (1986), ces deux produits permettant de diminuer ainsi la force ionique. Cette Žtape sÕest rŽvŽlŽe la plus importante dÕun point de vue quantitatif. En effet, le rendement en myosine avec la prŽci- pitation au KHCO₃est bien supŽrieur ˆ celui obtenu avec la prŽcipitation ˆ lÕEDTA. La mŽthode de Martone et al(1986) donnant un meilleur rendement et de plus Žtant plus rapide a ŽtŽ retenue. Ces deux derni•res Žtapes, solubilisation de la myosine et prŽci- pitation avec KHCO_3, sont rŽalisŽes une deuxi•me fois afin de purifier et de concen- trer la myosine. Le culot final, obtenu apr•s centrifugation, est repris avec un tampon de Figure 1. Production des anticorps monoclonaux.

Antigène = extrait de myosine

AA AA

Cellules de myélome (immortelles)

Cellules spléniques productrices d'anticorps

Polyéthylène glycol

Fusion cellulaire

Hybridomes : cellules productrices d'anticorps et immortelles Dépistage des anticorps

Ensemencement de microplaques de culture Culture sur milieu de sélection

Rate

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SpŽcificitŽ Hybridome Isotype

Esp•ces Immunoglobulines (µg/ml))

anti-myosine totale S5 7E6 IgG1 κ(2,8) bovin, cheval, porc

anti-MHC I S4 9G11 IgM κ(64) cheval

S4 17F7 IgG1 κ(6,8) poulet

S5 7F10 IgG2b κ(140) dinde

anti-MHC II S5 15F4 IgG1 κ(8) bovin, cheval

S4 10G9 IgG1 κ(22) cheval

S5 14B3 IgG (56) et IgG2b κ(6,1) porc

S4 8E6 IgG1 κ(8) poisson

S5 16D12 IgM κ(92) poulet

anti-MHC II mosa•que S5 8F3 IgG2b κ(94) poulet

S5 8H2 IgG1 κ(22) dinde

S5 7D4 IgG1 κ(26) dinde

S5 11D6 IgG1 κ(3,6) dinde

anti-myosine (mosa•que) S4 10H9 IgG1 κ(31) poisson

anti-MHC I + IIb S5 8H2 IgG1 κ(22) bovin, cheval, porc

anti-MHC IIa + IIx S5 7D4 IgG1 κ(26) porc

anti-MHC IIb S4 10B6 IgG2b κ(0,064) bovin

S4 9H5 IgG1 (22) et IgM κ(12) poulet

Tableau 1. Caractéristiques des hybridomes retenus par l’ensemble des espèces.

solubilisation, additionnŽ de glycŽrol ˆ raison de 50 % et conservŽ ˆ Ð 20 ^oC.

Les extractions de myosine purifiŽe en vue de lÕimmunisation ont ŽtŽ rŽalisŽes sur des Žchantillons de muscles ne contenant que des isoformes de cha”nes lourdes rapides (MHC IIa, MHC IIb) :

- le muscle cutaneus truncipour le bovin et le cheval (bien que ce muscle ne soit pas enti•rement rapide chez ce dernier) ;

- le semitendinosuspour le porc ;

- le posterior latissimus dorsipour la dinde et le poulet ;

- le muscle blanc de poisson.

De plus, des extractions de myosine purifiŽe ont ŽtŽ rŽalisŽes en vue du tri : le muscle mas- seter(MHC I) pour le bovin, le pectoralis major (MHC IIb) pour le poulet et la dinde, le dia- phragma(MHC I, MHC IIa) pour le cheval.

Afin de vŽrifier la puretŽ des myosines obte- nues, une Žlectrophor•se en gel de polyacryla- mide ˆ 12 % en prŽsence de dŽtergent SDS (Laemmli 1970) a ŽtŽ rŽalisŽe pour chacune des esp•ces. Les rŽsultats obtenus ont montrŽ que lÕextraction faite contenait des traces dÕautres protŽines myofibrillaires (troponine et/ou tropomyosine).

Immunisation

Six souris (S1 ˆ S6) de la souche BALB/C femelles ‰gŽes de six semaines ont ŽtŽ immu- nisŽes chacune par 4 injections dÕextraits de myosine sur une pŽriode de 79 jours. Les immunisations ont ŽtŽ rŽalisŽes de la fa•on suivante : S1 et S2 ont re•u un mŽlange des extraits de myosine de bovin et de cheval ; S3 et S4 ont re•u un mŽlange des extraits de myosine de poisson et de dinde ; S5 et S6 ont re•u

un mŽlange des extraits de myosine de porc et de poulet. Lors des trois premi•res injections (ˆ J0, J21 et J42) chaque souris a ŽtŽ immuni- sŽe avec deux fois 20 µg de myosine des deux esp•ces diffŽrentes. La premi•re injection (J0) a ŽtŽ rŽalisŽe en prŽsence dÕadjuvant complet de Freund et les deux injections suivantes (J21 et J42) en prŽsence dÕadjuvant incomplet de Freund (lÕadjuvant de Freund est une Žmul- sion dÕantig•ne dans lÕhuile capable dÕaugmen- ter non spŽcifiquement la rŽponse immunitaire ˆ un antig•ne ; il contient aussi des mycobacterium tuberculosistuŽes, lÕadjuvant incomplet nÕen contient pas). La derni•re injection (J79) a ŽtŽ rŽalisŽe en intraveineux avec deux fois 10 µg de myosine en PBS stŽrile trois jours avant la fusion cellulaire.

Le choix dÕimmuniser les souris avec deux types de myosine a ŽtŽ dictŽ par des impŽra- tifs dÕorganisation du travail. Ce choix nÕest pas g•nant car le syst•me immunitaire des mammif•res est habituŽ ˆ rŽpondre ˆ des sti- mulations variŽes et simultanŽes. La sŽlection des anticorps spŽcifiques de chaque myosine est rŽalisŽe par la suite : les anticorps sont testŽs sŽparŽment sur chaque myosine ayant servi ˆ lÕimmunisation. Il est cependant clair que les diffŽrentes myosines ont un fort niveau dÕhomologie dans leur sŽquence, aussi, certains anticorps monoclonaux produits pourront reconna”tre des sŽquences com- munes ˆ toutes les myosines.

Testage des sŽrums polyclonaux

Des prŽl•vements sanguins ont ŽtŽ rŽalisŽs sur les souris apr•s immunisation ˆ J37 et J57. Les sŽrums contenant les anticorps ont ŽtŽ testŽs en ELISA (dosage quantitatif immunoenzymatique) sur les diffŽrents ex-

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traits de myosine par la sociŽtŽ Biocytex. Ils ont Žgalement ŽtŽ testŽs en immunohistochi- mie sur des coupes de muscles de chaque esp•ce par le laboratoire Croissance et MŽta- bolismes des Herbivores (INRA).

Les rŽsultats dÕELISA et dÕimmunohistochi- mie montrent que les souris S3, S4, S5, S6 ont dŽveloppŽ une rŽponse forte contre les myosines. Quelle que soit lÕesp•ce, leurs sŽrums contiennent des anticorps capables de reconna”tre diffŽrents types de MHC. Au vu de lÕin- tensitŽ de la rŽponse, seuls les lymphocytes des souris S4 et S5 ont ŽtŽ retenus pour rŽali- ser une fusion.

Par contre, les souris S1 et S2, immunisŽes avec les myosines de cheval et de bovin, ont beaucoup moins bien rŽpondu. Les sŽrums obtenus nÕont pas permis de distinguer les myosines, ceci dans toutes les esp•ces, m•me chez le bovin et le cheval. Ces sŽrums ne contiennent donc pas dÕanticorps capables de reconna”tre les MHC. Il a donc ŽtŽ dŽcidŽ de poursuivre lÕimmunisation des souris S1 et S2 afin dÕaugmenter leur rŽponse ˆ lÕantig•ne.

Par la suite, les lymphocytes de la souris S2 ont ŽtŽ fusionnŽs, mais sans succ•s.

Fusion

Les fusions cellulaires ont ŽtŽ rŽalisŽes selon le protocole modifiŽ de Kšhler et Mil- stein (1975). Les hybridomes ont ŽtŽ prŽparŽs par fusion entre les splŽnocytes dÕune souris immunisŽe (S4 et S5) et les cellules de myŽ- lome X63 Ag8/653 ou celles du myŽlome SP2/0-Agl4. Les deux types de cellules ont ŽtŽ mŽlangŽs selon un rapport 5:1 en prŽsence dÕune solution ˆ 40 % de polyŽthyl•ne glycol de poids molŽculaire 1500 selon le protocole dŽcrit ˆ la figure 1. Les hybridomes (cellules productrices dÕanticorps et immortelles) ont ŽtŽ ensuite ensemencŽs dans des microplaques de culture.

Testage des surnageants des hybridomes

Le surnageant des puits contenant une seule cellule (clone) visible au microscope a ŽtŽ testŽ pour la production dÕanticorps spŽci- fiques de la myosine par dosage ELISA rŽa- lisŽ par la sociŽtŽ Biocytex. De plus, chaque Žquipe INRA a testŽ environ 50 hybridomes, les m•mes pour les 6 esp•ces, issus de la fusion S4 (poisson + dinde) ou S5 (poulet + porc), en ELISA (Picard et al 1994) pour lÕŽquipe cheval ou en immunohistologie

pour les Žquipes bovin, dinde, poisson, porc, poulet.

RŽsultats

Les hybridomes testŽs se rŽpartissent selon 4 groupes :

- des hybridomes qui ne reconnaissent aucune myosine ;

- des hybridomes qui reconnaissent ˆ la fois les myosines rapides et les myosines lentes ;

- des hybridomes qui ne reconnaissent que les myosines rapides, sans distinction entre les fibres de type IIA et les fibres de type IIB ; - quelques hybridomes (2 ˆ 3) par esp•ce qui diffŽrencient 2 populations de fibres rapides.

Chaque Žquipe a sŽlectionnŽ 4 hybridomes parmi les plus intŽressants. Ils ont ŽtŽ ˆ nouveau testŽs en immmunohistologie sur plusieurs muscles prŽsentant des caractŽris- tiques contractiles diffŽrentes, mais Žgale- ment en ELISA, en Western Blot ou en cultures de cellules, selon les esp•ces. En dŽfinive, seuls les hybridomes dont les carac- tŽristiques sont dŽcrites dans le tableau 1 ont ŽtŽ retenus. LÕutilisation possible des anticorps monoclonaux produits par ces hybridomes est dŽtaillŽe dans les articles ci-apr•s pour chacune des esp•ces concernŽes.

RŽfŽrences

Kšlher G., Milstein C., 1975. Continuous cultures of fused cells secreting antibody to predefined specifi- city. Nature, 256, 495-497.

Laemmli U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the baxteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

Martone C.B., Busconi L., Folco E.J., Trucco R.E., Sanchez J.J., 1986. A simplified myosin preparation from marine fish species. J. Food Sci., 51, 1554-1555.

Pearson A.M., Young R.B., 1989. 3. Proteins of thick filament. In : B.S. Schweigert and S.L. Taylor (eds), Muscle and meat biochemistry. Academic press Inc., San Diego, California.

Picard B., LŽger J., Robelin J., 1994. Quantitative determination of type I MHC in bovine muscle with anti myosin monoclonal antibodies. Meat Sci., 36, 333-343.