1 2 3 4

Figure 34 : (A) Stratégie utilisée pour la construction du vecteur d'invalidation Myt1-L. (a) La 1

étape est l'insertion des sites PacI/SmaI dans le pBKSII. (b) La 2

étape est l'insertion du bras 5' en amont de la cassette de sélection positive néomycine-Tk "NEO-Tk" dans le pCM1neo. (c) La 3

étape est l'élimination du site SmaI du pBKSII. (d) La 4

étape est l'insertion du fragment contenant le bras 5' et la cassette Neo-Tk dans le pBKSII. (e) La 5

étape est l'insertion du bras 3' en aval de la cassette Neo-Tk dans le pBKSII. (f) La 6

étape est l'insertion de la cassette de sélection négative "DTA" dans le pBKSII. (B) Schéma montrant la différence de taille entre l’allèle sauvage (9,5 kb) comprenant les trois premiers exons codants situés entre deux sites de restriction HindIII et l’allèle invalidé (7,5 kb) dépourvu des trois premiers exons codant suite à la recombinaison homologue effectuée à cet endroit. Cette différence de taille permet de retrouver les cellules ES14 positives par southern blot. (C) Représentation des amorces utilisées pour le séquençage permettant de vérifier la construction d'invalidation finale. Les détails des séquençages se trouvent dans les annexes. (D) Photos d’un gel obtenu par western blot effectué sur 40 clones ayant subis un événement de recombinaison homologue avec le vecteur cible. On observe les allèles sauvages (situés à 9kb) des différents clones criblés mais aucun allèle invalidé (situés à 7,5 kb) n’a été obtenu.

pBKSII

pMC1neo

XhoI PacI SmaI

KpnI

NEO Tk Bras court

SalI BamHI

pBKSII BamHI SmaI PstII EcoRI

pBKSII

HindIIISalI XhoI

HindIII XhoI

pBKSII PacI SmaI

pBKSII SalI

SalI DTA

Bras long PacI SmaI

Bras 5' Neo-Tk Bras 3'

DTA

220M 347 346 94M 418 348 349 419 177

pBKSII

1 2 3

4

Allèle sauvage

Allèle invalidé

HindIII HindIII

9 kb

4

C

0 7,5 kb Site reconnu par la sonde radioactive

Exons

A a

b

c d

e

f B

D

9kb-

7,5kb-