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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Vanderhaeghen, P. (1996). Caractérisation de gênes de récepteurs olfactifs exprimés dans la lignée mâle des mammifères (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.

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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté de Médecine

Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Nucléaire Promoteur: G. Vassart

CARACTERISATION DE GENES DE RECEPTEURS OLFACTIFS EXPRIMES DANS LA LIGNEE GERMINALE MALE DES

MAMMIFERES.

U '

Pierre Vanderhaeghen

^070 BRUXELLES

» 555-6-1-70

Mémoire présenté en vue de l’obtention du titre d’Agrégé de l’Enseignement

Supérieur

Année Académique 1995-96

FACULTE DE MEDECINE

Epreuve publique pour l’obtention du titre légal d’agrégé de l’enseignement supérieur

Pierre VANDERHAEGHEN

Docteur en Médecine, Chirurgie et Accouchements

défendra publiquement le jeudi 9 mai 1996 à 18 heures, une thèse d’agrégation intitulée :

«CARACTERISATION DE GENES DE RECEPTEURS OLFACTIFS EXPRIMES DANS LA LIGNEE GERMINALE MALE DES MAMMIFERES»

M. VANDERHAEGHEN fera une leçon sur le sujet suivant :

«LA GENESE DES CONNEXIONS NEURONALES AU COURS DU DEVELOPPEMENT»

Auditoire Claude (local F2.204)

route de Lennik 808 - 1070 Bruxelles

Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Nucléaire Promoteur: G. Vassart

CARACTERISATION DE GENES DE RECEPTEURS OLFACTIFS EXPRIMES DANS LA LIGNEE GERMINALE MALE DES

MAMMIFERES.

Pierre Vanderhaeghen

Mémoire présenté en vue de l’obtention du titre d’Agrégé de l’Enseignement

Supérieur

Armée Académique 1995-96

bonne lecture!

C’est d’abord au Professeur Dumont que je dois d’avoir pu me former au sein de l’IRIBHN. Il est sans doute le seul -avec Nanou- a n’avoir jamais douté un seul instant de l’intérêt de mon sujet: son dynamisme et sa clairvoyance ont été pour moi d’une aide précieuse.

Gilbert Vassart m’a donné ma chance au sein de son équipe et m’a guidé tout au long de mon travail avec intelligence et générosité. Sa capacité à faire germer le doute dans l’esprit du plus enthousiaste n’a d’égale que son talent à remotiver le plus découragé...et en plus, il fait téléphoniste: que demander de plus? C’est un vrai saint, ce Don Vassarto...

Marc Parmentier m’a initié à la biologie moléculaire avec maîtrise, bienveillance, ...et humour. Toujours disponible dans les moments difficiles, il m’a cependant laissé une grande liberté d’initiative. Son sens de l’ironie (que nous partageons pas mal) et de l’informatique (que nous partageons très peu) me furent tous deux (parfois même simultanément) d’un grand secours.

Au cours de ces quatre années, j’ai vécu en (mini)-satellite au sein du C5.131, devenu le

« Temple des Transgéniques ». Je voudrais ici rendre hommage à tous les membres de ce

labo, passés présents et à venir, qui ont subi avec stoïcisme mes vocalises du matin, mes

sifflements de l’après-midi, et mes jurons du soir. Merci donc de m’avoir supporté, et

Mention Spéciale pour Catherine et Stéphane: leur amitié laissera des traces bien au-delà

des quatre murs du Bâtiment C, même si nos sujets de conversation respectifs furent

souvent assez différents...

maxiprep...), Olivier (le King du RPA et des transfections « en tandem »), Franck (Boudiou la Biomolle!), Michel (le mousquetaire du Cytosenseur), Marie-Jeanne (mais que ferions nous sans toi?).

Les cartes A se ramassent à la pelle, tu vois, je n’ai pas oublié: c’est le moment de saluer ceux qui ont contribué de façon majeure à l’aboutissement de cette thèse, en me permettant chaque midi une détente gastronomique et intellectuelle de haut-vol: Marc Abra (l’Empereur de la contrepèterie, mais si mais si) et Pit VRTG (la meilleure basse de Wemmel et le rire le plus discret à l’Ouest de Strombeek-Bever).

Enfin, il me faut remercier tous les membres de l’IRI, jeunes et moins jeunes, qui m’ont aidé à un moment ou l’autre de ce travail en me faisant bénéficier de leurs compétences et de leurs encouragements, sans compter ni leur temps ni leur énergie.

Je tiens aussi à remercier Roberte Menu et Pascale Halleux pour leur aide et leurs conseils lors de mes incursions «morphologiques», ainsi que Jean-Louis Coureur pour son fantastique travail iconographique.

Et puis, il y a ceux sans qui je ne serais pas là, ou sans qui ce ne serait pas la peine d’y être:

mes parents, ma famille, et mes potes...

...et enfin il y a Nanou et Julie. L’une comme l’autre m’ont supporté sans relâche avec

ardeur et tendresse, en me permettant de passer chaque étape difficile dans la (quasi)

sérénité, tout en me rappelant les choses vraiment importantes: c’est bien sûr à elles que je

dédie les lignes qui vont suivre.

I. INTRODUCTION p.l

A. PREAMBULE p.l

B. LA FAMILLE MULTIGENIQUE DES RECEPTEURS

COUPLES AUX PROTEINES G p.2

1. Diversité des ligands / mode de fonctionnement général p.2

a) Le cycle des proteines G p.3

b) Les mécanismes de terminaison du signal p.5 2. Classification / structure / relations structure-fonction p.6

a) Classification et structure p.6

b) Bases moléculaires de l’interaction ligand-recepteur p.ll c) Bases moléculaires de l’interaction récepteur-proteines G p.l2 d) Bases moléculaires de l’activation du récepteur p.l2 3. Pléiotropie et spécificité de la transduction intracellulaire p.l3 4. Les récepteurs G-couplés: une famille nombreuse et ses orphelins p.l7 a) Stratégies de clonage et d’identification p.l7

b) Les récepteurs orphelins p.l8

C. BIOLOGIE DE LA TRANSDUCTION DES SIGNAUX OLFACTIFS

CHEZ LES MAMMIFERES p.l9

1. Anatomie fonctionnelle du système olfactif p.l9 2. La transduction des signaux olfactifs p.20 a) la cascade de transduction des signaux olfactifs p.20

b) La terminaison du signal p.26

c) Le facteur de transcription Olf-1 et les gènes

« spécifiques de l’olfaction » p.27 3. La famille des récepteurs olfactifs p.28 a) Identification par clonage moléculaire p.28 b) Taille et diversité structurelle de la famille p.29

c) Organisation chromosomique p.31

d) Le profil d’expression des récepteurs olfactifs p.32

(a) Un neurone, un récepteur? p.33

f) Aspects fonctionnels des récepteurs olfactifs p.38

D. BIOLOGIE DE LA TRANSDUCTION DU CHIMIOTROPISME

GAMETIQUE p.41

1. Les invertébrés et vertébrés marins p.41 a) Les invertébrés: le modèle de l’oursin p.43 (a) Les peptides chémoattractants p.43

(b) Les récepteurs p.44

(c) Cascade de transduction et modèle explicatif du

chimiotropisme p.45

b) Les protochordés et vertébrés marins p.49

2. Les mammifères p.50

a) Le chimiotactisme gamétique chez les mammifères p.50 b) Contrôle de la mobilité du spermatozoide p.56

(a) L’AMPe p.57

(b) Le calcium p.58

(c) Cibles en aval et régulation croisée p.60

ïï. CONTEXTE ET BUTS DU TRAVAIL p.62

lïl. ETUDE DU PROFIL D’EXPRESSION TISSULAIRE DES GENES DE

RECEPTEURS OLFACTIFS CHEZ LE CHIEN p.64

A. SPECIFICITE D’EXPRESSION TISSULAIRE:

ETUDE AU NIVEAU DES ARN MESSAGERS p.65

B. ETUDE DU PROFIL D’EXPRESSION PROTEIQUE

DU RECEPTEUR OLFACTIF DTMT p.66

Olfactory Receptors Are Displayed on dog Mature Sperm Cells p.72

IV. GENERALISATION A L’ENSEMBLE DES MAMMIFERES p.86

V. DISCUSSION GENERALE p.l21

VI. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES p.l28

Références p.l33

PKA: protéine kinase A PKC: protéine kinase C

GRX: kinase de récepteur G-couplé IP3 : Inositol triphosphate

AMPc: AMP cyclique

PCR: réaction en chaîne à la polymérase

RPA: expérience de protection à la Rnase

PAF: Platelet Activating Factor

I. INTRODUCTION

A. PREAMBULE

Les travaux exposés dans ce mémoire sont difficilement classables dans un seul domaine établi de la biologie moléculaire ou cellulaire. Ils découlent de la surprenante découverte de hasard, réalisée dans notre laboratoire, de la présence de transcrits de gènes de récepteurs couplés aux protéines G exprimés dans les cellules germinales mâles, et qui se sont révélés par la suite appartenir à une grane famille multigénique de récepteurs olfactifs.

Postulant que ces récepteurs pourraient être impliqués dans la détection de signaux

chémotactiques par les gamètes mâles, nous avons tenté d’accumuler les arguments

expérimentaux soutenant ou contredisant cette hypothèse. Afin de mieux faire comprendre les

justifications et les implications de ce travail, il nous a paru utile de présenter, en guise

d’introduction, les éléments essentiels des trois domaines -fort disparates en apparence- qui se

rattachent à notre étude: les récepteurs G-couplés, la transduction des signaux olfactifs, et la

transduction des signaux médiant le chimiotropisme gamétique. Cette introduction n’a donc

pas la prétention de faire un relevé exhaustif des connaissances en ces matières, mais plutôt

d’en exposer les éléments essentiels, ainsi que certains aspects particuliers en relation avec

notre étude.

B. ^{L a famille} MULTIGENIQUE DES RECEPTEURS COUPLES AUX

PROTEINES G

Tous les organismes vivants ont élaboré au cours de leur évolution des systèmes de détection moléculaire leur permettant de s’informer de l’état de leur environnement et d’adapter leur comportement en conséquence. Les récepteurs des messages externes à l’organisme, ainsi que ceux des molécules de signalisation endogènes, sont le plus souvent localisés à la membrane plasmique des cellules, à l’exception notable de ceux appartenant à la famille des récepteurs aux stéroïdes. Chez les métazoaires, ces récepteurs membranaires peuvent être regroupés en différentes classes, selon leur structure moléculaire et leur mode de fonctionnement. On peut ainsi distinguer les récepteurs à activité tyrosine kinase ou phosphatase, guanylate-cyclase, sérine-thréonine kinase, les récepteurs canaux, les récepteurs activateurs de tyrosine kinases, et les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG).

1. DIVERSITE DES LIGANDS / MODE DE FONCTIONNEMENT GENERAL DE L’ACTIVATION ET DE L’EXTINCTION DU SIGNAL

Les récepteurs couplés aux protéines G constituent Tune des plus anciennes et des plus

nombreuses familles multigéniques, comptant plus de mille membres dans notre génome

(Fraser et al., 1994; Parmentier et al., 1995; Bockaert, 1995). Une grande variété de ligands

endogènes (ions, acides aminés, amines biogéniques, nucléosides et nucléotides, peptides,

hormones glycoprotéiques, lipides) ou exogènes (composés odorants ou sapides, phéromones,

photons, drogues, médicaments, ...) agissent sur nos cellules via l’interaction avec un

récepteur de ce type.

a) LE CYCLE DES PROTEINES G:

Contrastant avec la diversité de leurs ligands, les récepteurs couplés aux protéines G

partagent le même mode de fonctionnement. Celui-ci implique la collaboration avec des

protéines de transduction localisées à la face interne de la membrane plasmique, et régulées

par les nucléotides guanyliques; les protéines G (Emala et al., 1995). Ces protéines

trimériques (résultant de l’assemblage de trois sous-unités: a, (î, et y), une fois activées par les

récepteurs, vont permettre la transduction du signal vers l’intérieur de la cellule, via la

stimulation ou l’inhibition d’une variété d’effecteurs intracellulaires (adenylate-cyclases,

phosphodiestérases, phospholipases, canaux). Les sous-unités a possèdent un site unique de

haute affinité pour les nucléotides guanyliques (GTP et GDP). Cette liaison du GTP ou du

GDP régule de façon déterminante leur conformation, respectivement active ou inactive. Ces

protéines possèdent également une activité enzymatique GTPase intrinsèque, responsable de

leur inactivation rapide. Les deux autres sous-unités, p et y, forment un complexe stable qui

constitue dès lors une seule entité fonctionnelle. Les principes de base du cycle d’activation

des protéines G sont schématisés sur la Figure 1, et peuvent être résumés comme suit. A l’état

basal, le récepteur et la protéine G (sous forme trimérique liant le GDP) sont en général

inactifs. Après liaison d’un agoniste spécifique, le récepteur activé va interagir avec la

protéine G et induire la libération du GDP. Après un stade très transitoire où la protéine a ne

lie plus aucun nucléotide, le GTP (dont la concentration intracellulaire est plus importante)

vient occuper le site nucléotidique vide. Il s’ensuit la dissociation du récepteur, de la protéine

a liant le GTP, et du complexe Py. Ces deux derniers vont alors stimuler indépendamment

leurs effecteurs, avant que l’hydrolyse du GTP, catalysée par les sous-unités a, ne favorise

leur réassociation et ne marque ainsi la fin de leur activation.

Figure 1:

Cycle d’activation d’une protéine G par un récepteur. La protéine G est inactive dans l’état n°l (la sous-unité a lie le GDP). Le récepteur stimule la libération du GDP. L’état n°2 est caractérisé par l’absence de liaison de nucléotide. Cet état est transitoire, car le GTP s’associe rapidement au site vide de nucléotide. On observe alors la dissociation du complexe récepteur, a-GTP, et Py (état n°3). Les deux sous-unités vont alors activer des effecteurs, El et E2.

L’hydrolyse du GTP lié à a met fin à l’activation de l’effecteur El. Le mode d’inactivation de

E2 est ineonnu (? sur la figure). (D’après Bockaert et al., 1995).

b) LES MECANISMES DE TERMINAISON DU SIGNAL:

Plusieurs boucles de rétrocontrôle sont responsables de la désactivation des récepteurs et protéines G. On peut les distinguer en fonction de leur cinétique d’action (rapide ou lente), de leur spécificité (désensibilisation homologue, spécifique d’un signal, ou hétérologue, de spécificité croisée avec d’autres signaux), et de leur niveau d’action (protéine G, récepteur).

Au niveau des protéines G, c’est l’activité GTPase intrinsèque (qui est en outre stimulée par certains effecteurs (Taussig et al., 1993)) qui détermine leur inactivation rapide. Des mutations conférant aux protéines G une activation constitutive (c’est-à-dire indépendamment de tout stimulus) sont responsables de pathologies humaines, et semblent bien résulter dans la plupart des cas d’une déficience en activité GTPase (Bockaert, 1995). A plus long terme, la répression de l’expression (Milligan, 1995), ou l’augmentation la dégradation (Lohse, 1993) des protéines G sont responsables d’une régulation négative.

Au niveau des récepteurs, la terminaison de l’activation se déroule selon deux modalités

principales, elles aussi différenciées selon leur cinétique: la désensibilisation ou découplage

fonctionnel (phénomène rapide), et la régulation négative du nombre de récepteurs

(phénomène à long terme). La désensibilisation rapide résulte principalement de la

phosphorylation du récepteur. Celle-ci peut résulter de l’action de kinases dépendantes de

seconds messagers, comme la PKA ou la PKC (Lohse, 1993). Il en résulte une

désensibilisation hétérologue du récepteur. La phosphorylation est aussi le fait de la

collaboration de deux protéines spécialisées dans la désensibilisation homologue: les kinases

de récepteurs G-couplés (ou GRK, qui phosphorylent sélectivement les formes activées de

RCPG), et les arrestines (Lefkowitz, 1993; Haga et al., 1994). Il existe au moins six formes de

GRK et quatre formes d’arrestine, qui présentent chacune un profil d’expression qui lui est

propre, et sans doute une spécificité de substrat différente (Steme-Marr and Benovic, 1995).

Ansi, la rhodopsine-kinase (GRKl) est préférentiellement exprimée dans la rétine, où elle phosphoryle sélectivement la rhodopsine activée. Cette phosphorylation va permettre la liaison de l’Arrestine-l, elle-même responsable de l’inhibition de toute interaction entre rhodopsine et protéine G. A plus long terme, la diminution de réponse d’un récepteur à son ligand est assurée par la régulation négative (« dovm-regulation »), qui se traduit par une diminution du nombre de récepteurs activables à la membrane plasmique. Cette régulation, dépendante des seconds messagers, peut se dérouler à plusieurs niveaux (dégradation des récepteurs, déstabilisation de leur ARN messager, répression de l’expression de leur gène) (Lohse, 1993).

2. CLASSIFICATION / STRUCTURE / RELATIONS STRUCTURE- FONCTION

a) C lassification et structure :

En fonction de leur structure primaire, les RCPG ont été classés en trois grandes sous-

familles: La première comprend les récepteurs métabotropiques au glutamate et les senseurs

du calcium extracellulaire, la deuxième comprend une fraction des récepteurs peptidiques

(dont les récepteurs au glucagon et à l’hormone parathyroïdienne), et la troisième, de loin la

plus nombreuse, comprend tous les autres groupes. Au sein de chacun de ces groupes, les

différents récepteurs présentent des similitudes de structure primaire importantes, en

particulier dans les domaines supposés transmembranaires (cf infra). L’analyse structurale

réalisée par l’alignement et la comparaison de leur séquence en acides aminés permet de

définir des groupes de RCPG (Figure 2).

Figure 2:

Dendrogramme représentant les similitudes existant entre les différents groupes de récepteurs couplés aux Protéines G clonés à ce jour, dans les trois familles structurelles. Les dendrogrammes ont été réalisés par le programme d’alignement multiple Pile up de GCG.

L’analyse tient compte, pour chaque récepteur, d’un segment de 120 acides aminés recouvrant

les trois premiers segments transmembranaires, à l’exclusion du domaine amino-terminal

extracellulaire. (D’après Parmentier et al., 1995).

Cette classification est le plus souvent corrélée avec les classifications pharmacologiques des récepteurs (par exemple, tous les récepteurs aux amines biogéniques constituent un groupe structural homogène), mais cette règle peut souffrir quelques exceptions (par exemple, le récepteur à la mélatonine est structurellement le plus apparenté à certains récepteurs peptidergiques).

Il faut noter ici que certaines molécules réceptrices non apparentées à la famille des RCPG interagissent cependant avec des protéines G trimériques, comme par exemple un des récepteurs spermatiques à la protéine ZP3 de l’enveloppe de l’ovule (Gong et al., 1995).

Tous les RCPG présentent une structure tridimensionnelle commune, dite à sept domaines transmembranaires. Chaque récepteur est en effet constitué d’une chaîne polypeptidique monomérique comprenant sept segments hydrophobes agencés en autant d’hélices a transmembranaires, séparées par trois boucles intra- et trois boucles extracellulaires (Figure 3). Cette structure particulière est analogue à celle de la bactériorhodopsine, une protéine bactérienne photoactive liant le rétinal, dont la strucure tridimensionnelle a pu être déterminée par cryomicroscopie à haute résolution (Henderson et al., 1990). Cette structure a servi de base à toutes les modélisations moléculaires de récepteurs couplés aux protéines G, qui ont trouvé une première eonfirmation expérimentale par l’obtention de la structure bidimensionnelle « projetée » de la rhodopsine (Schertler et al..

1993).

I làO<?Lf*O '«) Cl ^Cl (Il (fc> If <:>

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Organisation transmembranaire des récepteurs G-couplés. Le récepteur à la thyrotropine est

représenté à titre d’exemple. Les caractéristiques structurales rencontrées chez la plupairt des

récepteurs de cette famille sont indiquées. Les sites de glycosylation sont représentés par des

Y, les sites de phosphorylation par la PKA et la PKC par P.

b) BASES MOLECULAIRES DE L’INTERACTION LIGAND-RECEPTEUR:

L’étude des relations structure-fonction de ces récepteurs s’est surtout centrée sur quelques récepteurs utilisés comme modèles, comme les récepteurs adrénergiques, muscariniques, ou la rhodopsine (strader et al., 1994; Hibert et al., 1993). Dans le cas de ces récepteurs, des expériences de mutagénèse dirigée et de modélisation ont démontré le rôle prépondérant des domaines transmembranaires dans la liaison des ligands. Les sept domaines transmembranaires sont étroitement accollés, formant ainsi une poche hydrophobe profondément enfouie dans la membrane plasmique, où vient se loger le ligand spécifique.

Certains résidus-clés de la poche de liaison on pu être identifiés. C’est le cas par exemple du résidu Aspartyl-113, présent dans le domaine transmembranaire 111 des récepteurs catécholaminergiques, et qui est responsable de l’interaction spécifique avec le groupement aminé des ligands correspondants.

Pour d’autres récepteurs, le site de liaison inclut également les boucles extracellulaires, comme c’est le cas pour certains récepteurs peptidiques (substance P, interleukine 8). Enfin, certains récepteurs lient leur agoniste via un grand domaine N-terminal extracellulaire, tels les récepteurs des hormones glycoprotéiques, du glutamate, et du calcium (Parmentier et al., 1995).

Il est intéressant de noter que certains récepteurs possèdent plusieurs sites de liaison en

fonction du ligand considéré, comme c’est le cas pour le récepteur NKl à la Substance P, qui

possède, en sus d’un site spécifique de liaison de son ligand physiologique, deux autres sites

indépendants responsables de la liaison d’un agoniste et d’un antagoniste de synthèse

(Bockaert, 1995).

C) BASES MOLECULAIRES DE L’INTERACTION RECEPTEUR-PROTEINES G:

Les bases moléculaires des interactions récepteurs-protéines G sont moins bien établies.

Pour la plupart des récepteurs étudiés à ce jour, les boucles intracellulaires, et en particulier la troisième, semblent contenir les domaines essentiels d’interaction avec les protéines G. La spécificité d’interaction entre un récepteur et différentes protéines G dépend également des boucles intracellulaires, n’impliquant parfois qu’un nombre très limité de résidus (Strader et al., 1994); cependant, aucune donnée ne permet à l’heure actuelle de prédire la spécificité d’un récepteur donné pour l’une ou l’autre protéine G sur la seule base de sa séquence.

d) BASES MOLECULAIRES DE L’ACTIVATION DU RECEPTEUR / NOTION

d ’ activation constitutive :

Si la dissection moléculaire de la liaison du récepteur à ses ligands, ou de l’interaction avec les protéines G a fortement progressé au cours de ces dernières années, les mécanismes responsables du couplage entre la liaison de l’agoniste et l’activation du récepteur restent une énigme. Qu’est ce qui différencie un récepteur activé d’un récepteur au repos? Quelle est la nature des changements conformationnels que subit un récepteur après la liaison d’un agoniste ou d’un antagoniste? L’approche expérimentale de ces problèmes cruciaux s’avère difficile.

Dans ce contexte, un dernier apport particulièrement intéressant de la mutagenèse dirigée et de

la génétique moléculaire des RCPG concerne les conséquences inattendues de certaines

mutations ponctuelles, qui confèrent au récepteur une activité intrinsèque, c’est à dire la

capacité de stimuler les protéines G en l’absence de tout ligand (Lefkowitz et al., 1993). Ainsi,

le remplacement du résidu Alanyl-293 (localisé dans la troisième boucle intracellulaire) d’un

récepteur al-adrénergique par n’importe quel autre acide aminé, confère à ce récepteur la

faculté d’activer une protéine G en l’absence de tout agoniste (Lefkowitz et al., 1993). Des

mutations conférant une activation constitutive ont été décrites pour plusieurs autres récepteurs, dont certaines sont responsables de pathologies humaines, comme par exemple les adénomes thyroïdiens résultant de mutations somatiques activatrices du récepteur à la thyrotropine (Parma et al., 1993). Plus surprenant encore, certains récepteurs (récepteur 5HT2c de la sérotonine (Barker et al., 1994), récepteur à la thyrotropine (Parma et al., 1993)), présentent une activité intrinsèque significative à l’état naturel, sans mutation. Ces différentes données suggèrent que l’état actif d’un récepteur ne constitue qu’une des conformations possibles, et que le ligand agit en rendant cette conformation plus stable, donc plus probable:

c’est l’hypothèse de la sélection conformationnelle (Kenakin, 1995). L’existence de plusieurs états conformationnels actifs distincts n’est de plus pas exclue. Les phénomènes d’activation constitutive remettent également en question les notions de base de pharmacologie concernant les agonistes et les antagonistes, en révélant l’existence d’agonistes inverses, ligands capables d’inhiber l’activité intrinsèque des récepteurs (Schütz and Freissmuth, 1992).

3. PLEÏOTROPIE ET SPECIFICITE DE LA TRANSDUCTION INTRACELLULAIRE DES SIGNAUX BIOLOGIQUES

Une question fondamentale de la transduction des signaux biologiques concerne les

bases moléculaires de la diversité et de la spécificité des processus intracellulaires engendrés

en réponse aux stimulis extérieurs. Comment une même hormone est-elle capable de générer

des signaux intracellulaires multiples, et différents en fonction de la cible cellulaire

considérée? L’apport de la biologie moléculaire a sans doute été déterminant pour tenter de

répondre à cette question, en permettant le clonage moléculaire de familles de gènes de

signalisation intracellulaire, et leur étude dans des systèmes « reconstitués » ou d’expression

hétérologue (Hedin et al., 1993). En fait, im nouveau degré de complexité est atteint à chaque

étape de la transduction du signal. Tout d’abord, la plupart des ligands agissent via plusieurs récepteurs aux propriétés pharmacologiques différentes (par exemple, pas moins de 13 récepteurs à la sérotonine ont été clonés). Une fois stimulé, chacun de ces récepteurs est capable d’activer un ou plusieurs types particuliers de protéines G. Il existe en effet plus de vingt sous-unités a différentes (regroupées en quatre familles en fonction de leur structure primaire: a^, aj, ttq, et ai

), et de multiples sous-unités Py, résultant de la combinaison de 5 sous-unités P, et 9 sous-unités y. Ces différentes sous-unités a et Py se distinguent par leurs cibles effectrices différentes, qui peuvent être multiples (par exemple les sous-unités a-, sont capables d’inhiber Tadenylyl-cyclase et d’activer un canal potassium) (Emala et al., 1995).

D’autre part, chaque effecteur lui-même existe sous plusieurs isoformes différentes (par exemple, huit formes différentes d’adenylyl-cyclase ont été clonées à ce jour, qui se distinguent drastiquement par leurs propriétés et leur régulation (lyengar, 1993)). Enfin, les seconds messagers générés peuvent eux-mêmes influencer l’activité de certains effecteurs, permettant la communication croisée entre voies de signalisation parallèles (Raymond, 1995).

La figure 4 donne une idée -partielle- de cette complexité.

riïiTn

Adénytyl-cyclase (+)

Canaux Ca'^

{+)

,2+

cGMP- Adénylyl-cyclase Canaux Ca2+

phospfio- (-) (-)

diesterase Canaux K+ Canaux K+

(+) (+) (+)

Adénytyl- Phospholipase C Echangeur Ha*l H+

cydase ( p1 ,fl3 ) (+) (-) (+) Phospholipase A 2

{+)

(CTX) (CTX, PTX) (PTX) (PTX)

N

0.3

SX-( j U

^olf

Phospholipase A2

Phospholipase C (p2, p3) (+) Adénylyl-cyclase I (-) Adénylyl-cyclase II, IV (+) Canaux K"*" (+)

P-ARKinase Ras-MAP-Kinases

Figure 4:

Diversité et fonctions des sous-unités a et Py des protéines G. Sur base de leur séquence

primaire, quatre classes de sous-unités a peuvent être distinguées: ttj, ttj, ttq, et ayi- Les

activités biologiques des membres de ces classes sont indiquées, qui peuvent être inhibées (-)

ou stimulées (+). Certaines sont ADP-rybosylées par la toxine cholérique (CT), d’autres par la

toxine pertussique (PT). Les complexes Py ont également des cibles variées qui sont indiquées

en regard. (D’après Bockaert et al., 1995).

Les différentes formes de chacun des éléments de la cascade de transduction présentent en outre un profil d’expression propre au sein des différents types cellulaires. La réponse finale d’une cellule à un signal extracellulaire dépendra donc essentiellement de la batterie spécifique de récepteurs, protéines G, et effecteurs dont cette cellule dispose. Les niveaux d’expression des différents composants de la réponse pourraient également contribuer à la spécificité cellulaire (en particulier les concentrations relatives entre récepteurs et protéines G). C’est notamment à ce niveau que les systèmes d’expression ectopiques ont montré leurs limites, toutes les réponses observées dans certaines conditions expérimentales (comme la surexpression dans des systèmes hétérologues) ne sont pas toujours physiologiques. Les mécanismes responsables de la spécificité de la réponse ne sont donc pas uniquement moléculaires, mais aussi cellulaires. Ainsi, il a été récemment proposé qu’existeraient des

« micro-domaines » membranaires où seraient concentrés spécifiquement récepteurs,

protéines G, et effecteurs interagissant physiologiquement (Neubig, 1995). En d’autres

termes, la localisation sub-cellulaire des différents composants responsables de la transduction

influencerait qualitativement la nature de la réponse intracellulaire. L’existence de ces

domaines reste hypothétique, mais constitue un champ d’investigation prometteur pour

l’élucidation des déterminants de la spécificité de la signalisation intracellulaire.

4. LES RECEPTEURS G-COUPLES: UNE FAMILLE NOMBREUSE ET SES ORPHELINS

a) S trategies de clonage et d ’ identification des R écepteurs

COUPLES AUX PROTEINES G

Les premiers récepteurs couplés aux protéines G ont été clonés après purification et

micro-séquençage de la protéine correspondante (Parmentier et al., 1995). C’est de ces

travaux pionniers que découle la notion que tous les récepteurs G-couplés présentent la même

organisation transmembranaire. Par la suite, deux stratégies de clonage ont été utilisées

principalement: l’une fondée sur l’expression de la protéine recombinante, et l’autre sur

l’homologie de structure existant entre les gènes codant pour ces différents récepteurs. Le

criblage par expression, utilisant la détection de courants ioniques en réponse à un agoniste ou

la liaison de ligands radiomarqués, a mené au clonage de plusieurs récepteurs tels celui de la

substance K (NK2), ou de l’Angiotensine (AT2). C’est cependant le clonage par homologie,

tirant parti de l’homogénéité structurelle des RCPG, qui a le plus largement contribué à

l’extension de la famille, en particulier par l’utilisation de la réaction en chaine à la

polymérase (PCR) et d’amorces nucléotidiques dégénérées correspondant aux segments les

plus conservés parmi les récepteurs couplés aux protéines G (Libert et al., 1989; Parmentier et

al., 1995). Cette méthode de clonage, développée à l'IRIBHN dans le cadre du clonage du

récepteur à la thyrotropine, a ainsi abouti au clonage de gènes codant pour plus de trente

nouveaux récepteurs.

b) L es récepteurs orphelins comme voie d ’ approche a la

DECOUVERTE DE NOUVELLES MOLECULES DE SIGNALISATION:

Ces gènes de récepteurs de fonction inconnue ont pu, dans les cas favorables, être identifiés grâce à l’homologie qu’ils présentaient avec d’autres récepteurs déjà caractérisés pharmacologiquement, révélant ainsi l’existence de nouveaux sous-types de récepteurs. Dans d’autres cas, c’est l’étude du profil d’expression de ces gènes qui a guidé leur caractérisation fonctionnelle (Parmentier et al., 1995).

La plupart des récepteurs correspondant à des entités pharmacologiques connues ont maintenant été clonés. Les ligands « orphelins », en quête d’un récepteur, se font donc de plus en plus rares, tandis que le nombre de récepteurs orphelins ne cesse d’augmenter. Certains récepteurs orphelins correspondent vraisemblablement aux quelques récepteurs connus mais non encore clonés, ou à des récepteurs de ligands à la fonction encore mal définie, ou dont l’effet biologique classique passe par des récepteurs d’autres familles (stéroïdes par exemple).

Mais pour nombre d’entre-eux, il semble réaliste de postuler que les ligands correspondants

constituent des entités moléculaires totalement inconnues à ce jour. La caractérisation

fonctionnelle de ces récepteurs orphelins pourrait donc mener à l’identification de nouvelles

molécules de signalisation et, par là, à la découverte de nouveaux réseaux de signalisation

endocrine, paracrine ou synaptique. Le récepteur ORLj et son ligand endogène constituent le

premier exemple prometteur de cette approche. Ce récepteur orphelin isolé au laboratoire, a en

effet récemment permis l’identification d’vm nouveau neuropeptide, appelé nociceptine, qui

constitue son ligand endogène, et qui serait impliqué dans le contrôle central de la douleur

(Meunier et al., 1995).

C. BIOLOGIE DE LA TRANSDUCTION DES SIGNAUX OLFACTIFS

CHEZ LES MAMMIFERES

L’odorat peut être considéré comme la modalité sensorielle la plus ancienne et la plus répandue dans le monde du vivant. Le système olfactif des mammifères constitue l’un des systèmes de détection les plus sensibles et discriminants qui soit, que seul le système immunitaire dépasse en efficacité. L’homme, par exemple, est capable de différencier environ 10000 odeurs différentes, parfois à des concentrations infra-picomolaires. L’étude de la transduction des signaux olfactifs s’est surtout centrée sur les déterminants cellulaires et moléculaires de cette sensibilité et de ce pouvoir de discrimination peu communs.

1. ANATOMIE FONCTIONNELLE DU SYSTEME OLFACTIF

Chez les mammifères, la détection des odeurs est assurée au niveau d’un épithélium pigmenté spécialisé recouvrant la paroi dorsale des cavités nasales: la muqueuse olfactive.

Cette muqueuse se compose de quatre types cellulaires principaux: les cellules sustentaculaires, les cellules basales, les cellules microvilleuses, et les neurones olfactifs (Ronnett, 1995). Les cellules sustentaculaires ou de soutien jouent vraisemblablement un rôle dans l’isolation électrique des neurones olfactifs adjacents; elles contribuent aussi à l’homéostasie du milieu extracellulaire, et à la dégradation des odorants (Burchell, 1991). Les cellules basales sont les cellules souches de l’épithelium, précurseurs des neurones olfactifs.

Les cellules microvilleuses présentent des caractéristiques neuronales (notamment un prolongement axonal), sans qu’un rôle précis ait pu leur être attribué dans la chémoréception.

Enfin, les neurones olfactifs, neurones de premier ordre du système olfactif, sont les seules

cellules du système nerveux central des vertébrés supérieurs à être en contact direct avec

l’environnement extérieur. Ils possèdent également la particularité unique de proliférer tout au long de la vie à partir des cellules souches, et donc de se régénérer à la suite de la disparition régulière des cellules différenciées. Ces cellules nerveuses bipolaires envoient leur axone unique non ramifié vers le bulbe olfactif homolatéral, et leur dendrite vers la lumière de la cavité nasale. Au contact de cette cavité, le dendrite s’élargit en une protubérance, le bouton dendritique, d’où projettent de cinq à cinquante cils dans l’épaisse couche de mucus tapissant l’épithelium. C’est au sein de ces cils que se déroule la réception et la transduction des signaux olfactifs. Les axones des neurones olfactifs (au nombre de 5 à 10 millions chez la plupart des mammifères) convergent vers le bulbe olfactif au niveau de structures de particulières: les glomérules (au nombre de 1000 à 3000). Au sein des glomérules, les terminaisons axonales établissent des synapses avec les dendrites des neurones de second ordre du système olfactif: les cellules mitrales et les cellules à panaches. Les axones de ces neurones projettent vers les régions olfactives du cortex (noyau olfactif antérieur, tubercule olfactif, cortex pyriforme, amygdale, et cortex entorhinal) où s’effectue vraisemblablement l’intégration des stimuli odorants.

2. LA TRANSDUCTION DES SIGNAUX OLFACTIFS

a) LA CASCADE DE TRANSDUCTION DES SIGNAUX OLFACTIFS

Le rôle des protéines G et de l’AMPc dans la transduction des signaux olfactifs est

suggéré depuis longtemps par des études biochimiques et électrophysiologiques (Pace et al.,

1985; Sklar et al., 1986; Bakalyar and Reed, 1990). Plus récemment, l’IP3 et le calcium ont

été proposés comme seconds messagers alternes ou adjuvants dans la transmission du signal

(Huque and Bruch, 1986; Ronnett et al., 1993; Boekhoff et al., 1990; Restrepo et al., 1990;

Breer et al., 1990). La caractérisation moléculaire, biochimique, et électrophysiologique d’une série de protéines de transduction, dont la plupart sont spécifiquement ou préférentiellement exprimées dans les cils de neurones olfactifs, a permis de définir une cascade de transduction complète de l’olfaction, depuis l’arrivée des odorants dans le mucus nasal, jusqu’à la génération du potentiel d’action dans le soma du neurone olfactif Rappelons toutefois que l’essentiel des ces études ont été réalisées in vitro (soit sur préparations de membranes de cils olfactifs, soit sur neurones olfactifs en culture primaire) et attendent donc une confirmation in vivo (qui ne devrait tarder suite à l’application des techniques de recombinaison homologue à l’étude de la transduction des signaux olfactifs).

Ce scénario est schématisé sur la figure 5.

mucus

I odorant

cil olfactif

Figure 5;

Schéma de la transduction des signaux au sein d’un neurone olfactif. Après stimulation des

récepteurs par un odorant, deux types de seconds messagers peuvent être générés: l’AMPc et

riP3. La voie de l’AMPc implique la protéine G aoif, l’adénylate-cyclase III (AC), un canal

cationique dépendant des nucléotides cycliques, et une phosphodiestérase dépendante du

calcium (PDE). La voie de riP3 implique quant à elle une protéine G d’identité encore

inconnue (G ou ), une phospholipase C spécifique (PLC), et un récepteur à l’IP3

membranaire. Les deux voies génèrent une augmentation de calcium intracellulaire, qui va

activer une conductance chlore, responsable de la dépolarisation membranaire. (D’après

Parmentier et al., 1994).

La solubilisation des molécules odorantes, pour la plupart hydrophobes, dans le mucus hydrophile est facilité par leur liaison à une protéine de transport spécifique de la muqueuse nasale; l’OBP (Odorant Binding Protein) (Ronnett, 1995). Cette protéine, qui constitue environ 1% des protéines nasales solubles, est capable de lier à peu près n’importe quel odorant avec une faible affinité (de l’ordre du micromolaire). Elle appartient à une famille de proteines spécialisées dans le transport de petites molécules hydrophobes, comme la RBP (Retinol Binding Protein).

L’étape essentielle de la détection des molécules odorantes réside dans leur liaison à des récepteurs spécifiques, couplés aux protéines G. La nature de ces récepteurs est longtemps restée inconnue, jusqu’au clonage moléculaire d’une famille multigénique de récepteurs olfactifs, appartenant à celle des RCPG (Buck and Axel, 1991; Parmentier et al., 1992; Levy et al., 1991; Selbie et al., 1992). Les connaissances rapidement accumulées sur cette famille sont exposées dans la section suivante (C.3).

Après activation des récepteurs, deux seconds messagers différents peuvent être produits: l’AMPc ou l’IP3. Dans les deux cas, la génération de seconds messagers est extrêmement rapide et de courte durée (Boekhoff et al., 1990; Breer et al., 1990; Ronnett et al., 1993; Ronnett et al., 1991): parfois de quelques centaines de millisecondes, rarement de plus d’ime dizaine de secondes, en fonction des conditions expérimentales.

La voie de l’AMPc implique des protéines sélectivement enrichies dans les cils des

neurones olfactifs: la sous-unité de protéine G aoif,(Jones and Reed, 1989) (mais aussi la

protéine G ubiquitaire G^), l’adenylate-cyclase de type III (Sklar et al., 1986; Bakalyar and

Reed, 1990), une phosphodiestérase olfactive sensible au calcium et à la calmoduline (Beavo

et al., 1994; Yan et al., 1995), et un canal cationique hétérodimérique (perméable au sodium et

au calcium) activé par les nucléotides cycliques: le CNG^if (Olfactory Cyclic-Nucleotide- Gated Channel) (DhalEin et al., 1995; Ludwig et al., 1990; Bradley et al., 1994).

La voie de riP3, elle aussi initiée dans les cils, implique quant à elle une protéine G dont on ignore encore l’identité (sans doute Gq ou G„ (Reed, 1992a; Menco, 1995)), une phospholipase C spécifique (Abogadie et al., 1995), et un récepteur à l’lP3 (canal perméable au calcium stimulable par l’IP3) localisé dans la membrane plasmique ciliaire (Restrepo et al.,

1992).

11 convient de noter ici que les différents composants responsables de ces deux cascades sont co-localisés au sein des cils des mêmes neurones (Menco, 1995; Ronnett and Payne, 1995). Quelle que soit la cascade envisagée, il s’ensuit une augmentation de calcium intracellulaire dans les cils (Tareilus et al., 1995), elle-même responsable de l’activation de canaux chlores (de nature encore inconnue), dont l’ouverture va induire une dépolarisation membranaire (Lowe and Gold, 1995b), et par là le potentiel d’action.

L’augmentation des taux calciques intracellulaires va influencer en retour les deux cascades par plusieurs boucles de rétroaction positives et négatives (Jaworsky et al., 1995a;

Beavo, 1995; Liu et al., 1994; Chen and Yau, 1994; Wayman et al., 1995): activation de l’adenylyl-cyclase et de la phospholipase C par le calcium, activation de la phosphodiestérase, et inhibition du canal CNG^if par le complexe calcium-calmoduline.

Les rôles respectifs des deux cascades dans la transduction olfactive sont controversés

(Shepherd, 1994; Dionne and Dubin, 1994). Pour certains, ces deux voies seraient exclusives,

générées sélectivement en fonction de l’odorant considéré, et constitueraient donc une

première base à la discrimination des odeurs (Breer, 1991). Pour d’autres, elles constitueraient

deux voies simultanées et parallèles, même si leurs contributions respectives au signal final

peuvent varier en fonction de l’odorant considéré (Jaworsky et al., 1995b; Ronnett, 1995).

L’existence des deux voies conférerait alors une plus grande sensibilité au système, qui fonctionnerait comme un détecteur par coïncidence (Anholt, 1994). Dans ce contexte, certaines expériences éléctrophysiologiques récentes suggèrent que la transduction olfactive est intrinsèquement « bruyante »: les taux de base des seconds messagers du neurone olfactif fluctueraient considérablement (Lowe and Gold, 1995a). Seules les stimulations simultanées des deux seconds messagers (donc en coïncidence) seraient capables d’activer les canaux chlore sensibles au calcium (qui présentent en effet un seuil d’excitation particulièrement élévé (Lowe and Gold, 1995b)) et donc d’induire le potentiel d’action. Ce phénomène pourrait s’apparenter à celui de la résonance stochastique, par lequel le bruit confère paradoxalement une plus grande sensibilité aux systèmes de détection non linéaires (Wiesenfeld and Moss, 1995). Les déterminants biochimiques de ces activités basales ne sont pas connus, mais se situent vraisemblablement en amont des effecteurs (Lowe and Gold, 1995a), ce qui est particulièrement intéressant dans le contexte des activités constitutives rapportées pour certains RCPG ou protéines G (cf section B.l.b.).

Tout récemment, les monoxydes d’azote (NO) et de carbone (CO) ont été proposés comme médiateurs supplémentaires de la transduction olfactive (Leinders-Zufall et al., 1995).

Ils agiraient tous deux via la stimulation d’une guanylate-cyclase soluble, le GMPc ainsi

produit pouvant agir sur le canal CNGoif (Dhalan et al., 1995; Ludwig et al., 1990). D’autre

part, un récepteur membranaire, de la famille des guanylate-cyclases, a été cloné à partir de

muqueuse olfactive, et semble exprimé dans une sous-population de neurones olfactifs (Fulle

et al., 1995). Ces différentes données restent cependant trop fragmentaires pour s’intégrer

valablement à ce stade dans le schéma de transduction existant.

b) L a terminaison du signal : les enzymes de conjugaison / les

KINASES

Les signaux olfactifs se caractérisent par une décroissance extrêmement rapide des taux de seconds messagers (certaines réponses aux odorants durent moins d’une seconde). Comme pour la vision, la rapidité de terminaison du signal revêt une importance physiologique primordiale, et est donc assurée par plusieurs processus particulièrement efficaces, agissant à différents niveaux.

Le premier mécanisme évoqué est l’inactivation des odorants par modification chimique. Deux enzymes pouvant assurer une telle activité ont été isolées et clonées à partir de muqueuse olfactive: une forme olfactive de cytochrome P450-monooxygénase, et une forme d’UDP-glucoronosyltransférase (Burchell, 1991). Ces deux enzymes sont sélectivement exprimées dans les cellules sustentaculaires de la muqueuse olfactive.

La désensibilisation rapide des récepteurs semble assurée par leur phosphorylation (Boekhoff et al., 1994; Boekhoff et al., 1992), mécanisme classique pour des récepteurs G- couplés. Celle-ci semble résulter de l’action en série de la PKA et d’une kinase de RCPG particulièrement abondante dans les cils olfactifs: la P-ARK2 (P-Adrenergic Receptor Kinase- 2) (Dawson et al., 1993). L’inhibition de cette dernière kinase par des anticorps spécifiques ou des peptides inhibiteurs résulte en effet en une prolongation sensible de l’élévation des taux de seconds messagers générés en réponse à une stimulation olfactive (Dawson et al., 1993).

Enfin, rappelons que le calcium, notamment par la stimulation de la phosphodiestérase olfactive et l’inhibition du canal CNGojf contribue également à l’extinction du signal.

Ces différents processus sont cependant rapidement réversibles, puisque les neurones

olfactifs désensibilisés recouvrent leur sensibilité après quelques minutes (Ronnett, 1995).

c) L e facteur de transcription O lf -1 et les genes « spécifiques

DE L’OLFACTION »:

Une série de protéines rapportées comme spécifiques du neurone olfactif ont été

caractérisées au cours de ces denières années. La première d’entre elles est l’OMP (Olfactory

Marker Protein), protéine cytoplasmique présente dans le soma et l’axone des neurones

olfactifs matures, et dont la fonction est encore inconnue (Margolis, 1980; Wensley et al.,

1995). D’autres protéines ont ensuite été décrites, toutes impliquées dans la transduction des

signaux: la sous-unité de protéine G a^if, l’adenylyl cyclase III, et le canal CNGoif (Reed,

1992a). Depuis leur description initiale, le caractère exclusivement olfactif de ces protéines a

dû être nuancé quelque peu (ttoif est présente en grandes quantités dans le striatum (Hervé et

al., 1993), mais aussi dans le pancréas et l’épididyme (Zigman et al., 1993), les transcrits de

CNGoif sont détectés dans le cervelet (El-Husseini et al., 1995), et l’adénylyl-cyclase III dans

le bulbe olfactif (lyengar, 1993)). Il n’en reste pas moins que le neurone olfactif est le site

d’expression préférentiel de ces quatre protéines. Les bases moléculaires de cette spécificité

d’expression ont été déterminées grâce à la caractérisation des séquences promotrices des

quatre gènes correspondants (Wang et al., 1993; Largent et al., 1993), ainsi que par le clonage

du facteur de transcription Olfi (Wang and Reed, 1993). Ce facteur de la famille des « Hélice-

Boucle-Hélice » est préférentiellement exprimé dans les neurones olfactifs (mais aussi dans

les lymphocytes B immatures), et semble responsable de l’expression spécifique des différents

gènes olfactifs.

3. LA FAMILLE DES RECEPTEURS OLFACTIFS

a) I dentification par clonage moléculaire

Les récepteurs olfactifs ont longtemps résisté à toutes les techniques conventionnelles

entreprises en vue de leur caractérisation moléculaire (études de liaison, purifications par

liaison covalente d’odorants (cross-linking) ou par anticorps monoclonaux spécifiques des cils

olfactifs, ...). C’est par une approche toute différente qu’ils ont pu être identifiés en 1991 par

Buck et Axel (Buck and Axel, 1991). Ces investigateurs sont partis d’une triple hypothèse: les

gènes codant pour les récepteurs olfactifs doivent être exclusivement exprimés dans les

neurones olfactifs, ces gènes doivent constituer une grande famille de gènes homologues, et

appartenir à la famille multigénique des récepteurs couplés aux protéines G. Utilisant la

technique d’amplification en chaîne par la polymérase (PCR) et des amorces dégénérées

correspondant aux segments les plus conservés parmi les récepteurs couplés aux protéines G,

ils ont ainsi cloné, à partir de muqueuse olfactive de rat, une série de cDNAs répondant à ces

trois critères. Une technique identique de clonage par homologie par PCR, mise au point deux

ans plus tôt dans notre laboratoire, avait permis de cloner à partir d’ADN génomique ou

d’ADN complémentaire humain et de chien, les gènes codant pour une série de récepteurs

couplés aux protéines G (Libert et al., 1989; Parmentier et al., 1995). Parmi ceux-ci se

trouvaient une série de gènes caractérisés par un profil d’expression limité au testicule, et qui

se sont révélés par la suite appartenir à la famille de récepteurs olfactifs décrite par Buck et

Axel (Parmentier et al., 1992). Ces observations, qui sont à l’origine du présent travail, sont

décrites en détail dans la section II. La. De même, l’essentiel des doimées concernant les

récepteurs olfactifs testiculaires est décrit dans les sections II, III, et IV.

D’autres gènes de la famille ont ultérieurement été clonés chez la souris (Ressler et al., 1993; Nef et al., 1992), le poisson-chat (Ngai et al., 1993b), et le poulet (Nef, 1993), portant à près de deux cents le nombre de séquences (partielles ou complètes) de récepteurs olfactifs disponibles actuellement.

Par ailleurs, plusieurs nouvelles familles de récepteurs couplés aux protéines G impliqués dans l’olfaction ont récemment été décrites. L’une d’elle semble impliquée dans la reconnaissance des phéromones chez les mammifères: ses différents membres sont en effet exclusivement exprimés dans l’organe voméro-nasal (Dulac and Axel, 1995). Les autres familles semblent impliquées dans la reconnaissance des odeurs et des phéromones chez le nématode C. elegans (Troemel et al., 1995). Ces nouvelles familles ne présentent aucune homologie structurelle avec celle des récepteurs olfactifs « traditionnels », et leurs fonctions précises n’ont pas encore été déterminées.

b) T aille et diversité structurelle de la famille des

RECEPTEURS OLFACTIFS

La taille de la famille multigénique des récepteurs olfactifs a été estimée sur base des résultats d’hybridation de Southern blots génomiques, et de criblages de librairies génomiques, en utilisant les sondes de récepteurs olfactifs disponibles. Buck et Axel ont ainsi estimé que cent à deux cents gènes par génome représentait un nombre minimal chez le rat.

Notre propre estimation pour l’homme et le chien est de quatre cents gènes au moins

(Parmentier et al., 1992; Parmentier et al., 1994a; Parmentier et al., 1994b). Les chiffres d’un

miller de gènes pour les mammifères et d’une centaine pour les poissons (Ngai et al., 1993b),

sont maintenant communément admis.

D’un point de vue struetural, les récepteurs olfactifs peuvent être divisés en plusieurs sous-familles. Il se pourrait que cette classification soit corrélée à l’interaction de ces récepteurs avec des classes d’odorants différents, et/ou avec des cascades intracellulaires différentes, mais aucune donnée expérimentale ne confirme actuellement cette hypothèse.

Toutes les phases de lecture ouverte des gènes de récepteurs olfactifs clonés à ce jour sont constituées d’un seul exon, codant pour une protéine de 310 à 330 acides aminés. Ces récepteurs possèdent des caractéristiques structurales indépendantes de leur espèce d’origine, même si les quelques récepteurs isolés d’espèces de poisson et d’oiseau décrits à ce jour se distinguent partiellement de ceux des mammifères (la part de cette divergence revenant à l’évolution et à d’éventuelles différences fonctionnelles reste à établir). Les pourcentages d’identité entre deux récepteurs olfactifs varient de 35 à 98% (Parmentier et al., 1994a;

Vanderhaeghen et al., 1996). L’identité entre récepteurs olfactifs et autres RCPG ne dépasse pas 30%, montrant que les récepteurs olfactifs constituent bien une sous-famille distincte au sein des RCPG. Une série de motifs protéiques sont particulièrement bien conservés parmi les différents membres de la famille, particulièrement dans les deuxième, sixième, et septième domaines transmembranaires (Parmentier et al., 1994b). D’autres régions présentent des séquences particulièrement divergentes, comme les troisième, quatrième, et cinquième domaines transmembranaires. Par analogie avec les récepteurs aux catécholamines, il a été proposé (Buck and Axel, 1991; Lancet and Ben-Arie, 1993) que ces domaines

« hypervariables » constitueraient les sites de liaison aux odorants, dont la diversité structurale est en effet très grande. La variabilité extrême de ces régions suggère même l’existence d’une pression évolutive favorisant les mutations dans ces domaines (Ngai et al., 1993b).

Certains des gènes isolés correspondent à des pseudogènes, en particulier chez

l’homme (Parmentier et al., 1994a; Lancet and Ben-Arie, 1993). Une fi’équence plus élévée de

pseudogènes de récepteurs olfactifs dans l’espèce humaine par rapport aux autres mammifères pourrait refléter l’importance plus modeste du sens olfactif pour la survie et la reproduction de notre espèce.

Etant donné le nombre relativement restreint de séquences disponibles par rapport à l’étendue présumée de la famille, il est difficile de déterminer aujourd’hui si certains des récepteurs clonés correspondent à des orthologues d’espèces différentes. Parmi les récepteurs G-couplés, le pourcentage d’identité entre séquences homologues de mammifères varie de 68% (récepteurs au C5a du chien et de l’homme) à 98% (récepteurs cannabinoïdes du rat et de l’homme). Des scores élévés (85-99%) sont retrouvés pour certains couples de récepteurs olfactifs d’espèces différentes, qui constituent donc des orthologues potentiels (Parmentier et al., 1994b; Vanderhaeghen et al., 1996). De tels scores sont cependant retrouvés également au sein d’une même espèce, suggérant que des duplications géniques de récepteurs olfactifs se sont déroulées après la divergence des mammifères.

c) O rganisation chromosomique

La famille des récepteurs olfactifs représente un millier de gènes, soit une proportion significative des cent mille gènes vraisemblablement codés par notre génome.. La connaissance de l’organisation chromosomique du « sous-génome olfactif » a donc des implications bien plus larges que la simple compréhension des bases moléculaires de l’odorat.

Plusieurs équipes -dont la nôtre- ont commencé à déterminer l’organisation de la famille

dans les génomes humain, de souris, et de rat. La plupart de ces données sont encore

fragmentaires et non publiées, mais il semble possible de tirer déjà quelques conclusions. Ces

différents gènes ne sont pas éparpillés dans le génome, mais regroupés en un petit nombre de

localisations, où sont concentrés plusieurs dizaines au moins de gènes différents. Le gène HGMP07E a ainsi été localisé au niveau de la région 17pl3 du génome humain (Schurmans et al., 1993) avec au moins une quinzaine d’autres gènes de récepteurs olfactifs (Ben-Arie et al.,

1994). Le bras court du chromosome 19 et la région 3pl3-3p21 (Reed, 1992b) constituent deux autres « îlots olfactifs » où sont regroupés des gènes de récepteurs olfactifs. Une organisation semblable a été rapportée chez le rat et la souris (R. Axel, données non publiées, L.Buck et al., données non publiées).

Le regroupement de ces gènes homologues dans le génome a vraisemblablement favorisé la diversification de la famille, par des phénomènes de crossing-over inégal et de conversion génique (Reed, 1992b). D’autre part, les gènes localisés au sein d’un même îlot ne présentent pas d’homologie de structure spécifique par rapport aux autres membres de la famille: ils n’appartiennent pas préférentiellement à une même sous-famille de récepteur olfactifs (même si certains d’entre eux, résultant vraisemblablement de duplications récentes, présentent des homologies très importantes). Ceci suggère que ces différents îlots résulteraient de la duplication d’un îlot ancestral, qui existait avant la divergence des mammifères (Ben- Arie et al., 1994).

d) LE PROFIL d ’ expression DES RECEPTEURS OLFACTIFS ET

l ’ encodage cellulaire de l ’ odorat

Les expériences de Northern blot (Buck and Axel, 1991), et d’hybridation in situ

(Ressler et al., 1993; Ngai et al., 1993b; Ngai et al., 1993a; Vassar et al., 1993; Strotmann et

al., 1994) réalisées dans divers laboratoires ont permis de conclure que les récepteurs olfactifs

sont exprimés exclusivement dans les neurones olfactifs matures. Des expériences

d’immunohistochimie en microscopie optique et électronique ont par ailleurs montré que les

récepteurs étaient préférentiellement localisés dans les cils (Koshimoto et al., 1992; Menco, 1995; Ronnett and Payne, 1995), ce qui constitue l’argument majeur en faveur de la nature olfactive de ces récepteurs.

Les cellules germinales mâles constituent le seul autre site d’expression de récepteurs olfactifs documenté au niveau protéique et potentiellement physiologique (Parmentier et al., 1992; Vanderhaeghen et al., 1993; Vanderhaeghen et al., 1994; Walensky et al., 1995;

Vanderhaeghen et al., 1996), qui sera discuté dans les sections II, III, et IV. Des transcrits de récepteurs olfactifs ont par ailleurs été décrits dans le tissu lingual (ou ils pourraient être impliqués dans la sensation gustative (Abe et al., 1993)) et dans certains tissus embryonnaires (R.Reed, données non publiées), mais ces observations restent isolées et fragmentaires.

(a) Un neurone, un récepteur?

La distribution des différents récepteurs au sein de la muqueuse olfactive a été étudiée de façon extensive par hybridation in situ chez le poisson-chat, le rat et la souris.

Chez ces trois espèces, chaque gène de récepteur olfactif n’est exprimé que dans une

très faible proportion des neurones olfactifs (0.1% chez les rongeurs, 1% chez le poisson)

(Ressler et al., 1993; Ngai et al., 1993a; Vassar et al., 1993). Cette observation, combinée avec

des expériences d’hybridation comparée détectant soit un seul, soit plusieurs récepteurs,

suggère fortement que chaque neurone n’exprime qu’un seul ou un très petit nombre de

récepteurs différents. La démonstration définitive de l’hypothèse « un neurone, un récepteur »

pourrait être apportée par des expériences de PCR permettant l’amplification et l’analyse des

transcrits de récepteurs olfactifs à partir d’une seule cellule: des résultats préliminaires

suggèrent qu’il pourrait bien en être ainsi (Axel, 1995). Ces observations sont à mettre en

rapport avec les données électrophysiologiques, qui suggèrent que chaque neurone olfactif est

sensible à un nombre important d’odorants différents à hautes concentrations, mais à un nombre plus limité à faible concentration (Holley and Sicard, 1994; Ressler et al., 1994a). Les récepteurs olfactifs pourraient donc également se caractériser par un spectre d’activation assez large à haute concentration d’odorant, qui se limiterait à quelques odorants à des concentrations plus faibles. Le rapport entre le nombre présumé de récepteurs olfactifs (1000) et d’odorants identifiables (10000) est d’ailleurs en faveur d’un tel spectre de sensibilité.

(b) Distribution topographique des récepteurs olfactifs dans la muqueuse et le bulbe olfactifs: l’établissement

de la « carte chimiotopique »

Le nombre limité de récepteurs olfactifs exprimés au sein d’un même neurone aurait également des implications importantes dans le codage cellulaire de l’odorat: à chaque odorant correspondrait un nombre limité de récepteurs, donc de neurones, et c’est l’identité de ces neurones qui constituerait le code cellulaire caractéristique de chaque odeur (Axel, 1995).

Comment ce code cellulaire serait-il reconnu à un niveau plus central? Pour tenter de répondre à cette question, plusieurs équipes ont étudié l’organisation topographique des récepteurs olfactifs au sein de la muqueuse et du bulbe olfactifs.

Chez le poisson (où le nombre de récepteurs ne dépasse sans doute pas la centaine), les

neurones exprimant un même récepteur sont distribués aléatoirement dans la muqueuse

olfactive (Ngai et al., 1993a). Chez les rongeurs, la situation est plus complexe, et quatre

larges zones d’expression bilatérales s’étendant le long d’un axe antéro-postérieur ont pu être

définies: chaque récepteur n’est exprimé qu’au sein d’une de ces zones, de façon bilatérale et

constante d’individu à individu (Ressler et al., 1993; Vassar et al., 1993; Strotmann et al.,

1994). Au sein de chacune de ces zones, la distribution des récepteurs est cependant aléatoire.