Caractérisation moléculaire du Yam virus X (YVX) et du Yam necrosis virus
(YNV), deux nouveaux virus des genres potexvirus et sadwavirus infectant
les ignames en Guadeloupe, et mise au point d’outils de diagnostic
Isabelle Acina-Mambole
a, Lydiane Bonheur
a, Fabiola Anzala
b, Rose-Marie Gomez
b, David Lange
b, Chantal Faure
c, Denis
Filloux
d, Philippe Roumagnac
d, Armelle Marais
c, Thierry Candresse
c, Claudie Pavis
b& Pierre-Yves Teycheney
aaCIRAD-Bios, UMR AGAP, Station de Neufchâteau, 97130 Capesterre-Belle-Eau, Guadeloupe bINRA, UR1321 ASTRO, Domaine Duclos, 97170 Petit Bourg, Guadeloupe
cINRA & Université de Bordeaux, UMR 1332 BFP, 71 Avenue Edouard Bourleaux, 33883 Villenave d'Ornon, France dCIRAD-Bios, UMR BGPI, TA A-54 / K, Campus Intnl de Baillarguet, 34398 Montpellier, France
teycheney@cirad.fr PlAMV NP 620836 NanMV AAX19931 TVX NP 702988 HdRSV ADE10202 HVX YP 002308464 ClYMV NP 077079 AVX YP 002647027 AltMV ACS28233 PapMV NP 044330 LaMMV BAJ17497 PVX AAF89747 SchVX YP 002341559 OpVX YP 054407 CVX NP 148778 ZVX YP 054402 BaMV BAI94830 FoMV ABW25048 PhVX YP 001655010 LVX YP 263303 MVX YP 224134 SMYEV CAE12227 NVX YP 446992 Yam virus X WClMV NP 620715 CymMV AAB71853 PAMV NP 619745 PepMV ACJ74171 AlsVX YP 319827 LeVX YP 001960940 MalMV YP 667844 AV3 YP 001715612 NMV NP 040778 100 100 84 100 98 100 100 92 97 93 99 92 99 95 77 98 98 75 92 96 77 98 0.05 Nepovirus Fabavirus Comovirus Cheravirus Torradovirus Sequivirus Waikavirus Sadwavirus BRSV NP 734035 TBRV NP 958841 GCMV YP 002000610 CyNSV NP 734017 ToRSV AAD50649 CLRV ACZ65483 TobRV NP 919040 AYRSV CAJ33467 MeMMV BAJ16223 BRV NP 734045 GBLV YP 004429254 RRV AAQ77238 PRMV AAB69867 GFLV ACZ58632 ArMV YP 054443 BBWV1 NP 951030 BBWV2 AAD38152 GeMV BAD99001 CPSMV NP 734062 SqMV NP 734012 TuRSV ACX53644 BPMV AF394608 CPMV NP 734057 BBTMV ADI60054 RCMV NP 620468 CRLV AAW92113 ALSV NP 734022 StPV AAZ76594 SLRSV YP 227373 TTV ACB47566 ToChV ACU01024 TCSV YP 003097229 ToMaV YP 001976147 MCDV NP 734456 RTSV NP 734463 PYFV NP 734447 CNDV ACJ04421 Yam necrosis virus SMoV NP 733954 BlRNV YP 654561 SDV NP 734025 NIMV BAA74537 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 78 100 100 92 98 100 100 100 100 100 100 92 99 77 100 99 84 98 93 90 87 77 0.1
Organisations génétique, phylogénie et détection du Yam mosaic virus X (YVX)
YVX-R YVX-F
réplication mouvement capside TGB2
TGB3
RdRp
TGB1 CP AAA
615 pb
C. Détection du YVX par direct binding reverse transcription PCR (DB-RT-PCR)
L: Marqueur de taille d’ADN 100 pb (Promega); 1: échantillon infecté (D. trifida) ; 2: contrôle négatif (échantillon sain); 3: échantillon infecté (D. trifida); 4: contrôle négatif (mélange réactionnel); 5: contrôle positif de RT-PCR (50ng d’ARN totaux extraits de plante infectée); 6: contrôle positif de PCR (10 ng d’ADN plasmidique contenant une partie du génome du YVX cloné).
réplication
RdRp AAA
YNV-F YNV-R
299 pb
Les ignames (Dioscorea spp.) constituent l’une des ressources alimentaires les plus importantes en Afrique, dans la Caraïbe, en Amérique du Sud et dans les îles du Pacifique. Les espèces cultivées hébergent de nombreux virus des genres potexvirus, carlavirus, badnavirus, cucumovirus, macluravirus et potyvirus). Deux nouveaux virus appartenant aux genres potexvirus et sadwavirus, baptisés respectivement Yam virus X (YVX) et Yam necrosis virus (YNV), ont été mis en évidence par analyses in silico d’EST d’ignames. La partie 3’ du génome de chacun de ces virus a été amplifiée par 3’RACE à partir de plantes infectées récoltées en Guadeloupe, clonée puis séquencée. Les séquences obtenues ont permis d’établir les relations phylogéniques de ces espèces virales au sein des genres potexvirus et sadwavirus respectivement. Des amorces spécifiques de chacun de ces deux virus ont été dessinées dans la région codant l’ARN polymérase ARN dépendante (RdRp) et utilisées pour la mise au point de tests de détection moléculaire par direct binding reverse transcription PCR (DB-RT-PCR) dans des broyats de feuilles. Ces outils complètent l’arsenal disponible pour le diagnostic des virus des ignames, qui constituent la principale contrainte pour la conservation et la diffusion de ressources génétiques. Ils constituent également des outils indispensables aux études de prévalence du YVX et du YNV entreprises en Guadeloupe.
L 1 2 3 4 5
500 pb 300 pb 200 pb
299 pb
C. Détection du YNV par direct binding reverse transcription (DB-RT-PCR)
L: Marqueur de taille d’ADN 100 pb (Promega); 1: échantillon infecté (D. alata) ; 2: contrôle négatif (échantillon sain); 3: échantillon infecté (D. alata); 4: contrôle négatif (mélange réactionnel); 5: contrôle positif de PCR (10 ng d’ADN plasmidique contenant une partie de l’ARN1 du YNV cloné).
A. Organisation génétique du YVX déduite de la séquence nucléotidique de la partie 3’ terminale (3164 nucléotides) de son ARN génomique. Les amorces
spécifiques YVX-F et YVX-R dessinées dans l’ORF 1 codant la RdRp sont représentées. Ces amorces permettent d’amplifier un fragment de 615 pb.
B. Position taxonomique du YVX dans le genre potexvirus : arbre phylogénique reconstruit pour la partie C terminale de la RdRp (414 acides aminés) du YVX (neighbour joining). Seules les valeurs de bootstrap
supérieures à 70% sont indiquées. Echelle : 0.05 substitution par site.
A
B
C
Conclusions & perspectives
A
B
C
Deux nouvelles espèces virales infectant les ignames ont été identifiées et leur génome a été partiellement caractérisé au plan moléculaire
Les analyses phylogéniques montrent que ces virus appartiennent respectivement aux genres potexvirus et sadwavirus
Des méthodes de de diagnostic par direct binding reverse transcription PCR (DB-RT-PCR) ont été mises au point pour chacun de ces virus
Ces outils sont actuellement utilisés pour conduire une étude de prévalence du YVX et du YNV en Guadeloupe
Des travaux sont également en cours pour compléter la caractérisation moléculaire des ARN génomiques de ces deux virus
Organisations génétique, phylogénie et détection du Yam necrosis virus (YNV)
600 pb 500 pb 400 pb 615 pb
1
2
3
4
5
6
L
A. Organisation génétique de l’ARN1 du YNV déduite de la séquence nucléotidique de sa partie 3’ terminale (1671 nucléotides). Les amorces spécifiques YNV-F et YNV-R dessinées
dans la partie de l’ARN1 codant la RdRp sont représentées. Ces amorces permettent d’amplifier un fragment de 299 pb.
B. Position taxonomique du YNV dans la famille Secoviridae : arbre phylogénique reconstruit pour la partie C terminale de la RdRp (503 acides aminés) du YNV (neighbour joining). Seules les valeurs
de bootstrap supérieures à 70% sont indiquées. Echelle : 0.1 substitution par site.
