Le checkpoint de l’actine branchée corticale contrôle la progression du cycle cellulaire

HAL Id: tel-02927782

https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-02927782

HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci-entific research documents, whether they are pub-lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.

L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.

Le checkpoint de l’actine branchée corticale contrôle la

progression du cycle cellulaire

Nicolas Molinie

To cite this version:

Nicolas Molinie. Le checkpoint de l’actine branchée corticale contrôle la progression du cycle cellulaire. Biologie cellulaire. Université Paris Saclay (COmUE), 2018. Français. �NNT : 2018SACLS232�. �tel-02927782�

Le checkpoint de l’actine branchée

corticale contrôle la progression

du cycle cellulaire

Thèse de doctorat de l'Université Paris-Saclay

préparée à l’Université Paris-Sud

École doctorale n°577

Structure et dynamique des systèmes vivants (SDSV)

Thèse présentée et soutenue à Palaiseau, le 15 juin 2018, par

M. Nicolas Molinié

Composition du Jury : Pr. Oliver Nüsse

Professeur, Uni. Paris Sud, LCP – UMR 8000 Président Pr. Arnaud Echard

DR, Institut Pasteur, CNRS – UMR 3691 Rapporteur Dr. Thierry Dubois

DR, Institut Curie, Dép. de recherche translationnelle Rapporteur Dr. Christine Tran Quang

CR, Institut Curie, CNRS – UMR 3348 Examinateur Dr. Matthieu Piel

DR, Institut Curie, CNRS – UMR 144 Examinateur Pr. Alexis Gautreau

DR, Ecole Polytechnique, CNRS – UMR 7654 Directeur de thèse

NNT

:

2018S

A

C

LS232

-

I

-

3

- Remerciements -

Je tiens, en premier lieu, à remercier chaleureusement Alexis Gautreau pour m’avoir accueilli au sein de son équipe en 2014. J’ai eu le plaisir d’effectuer mes quatre années de thèse sous sa direction. Sa constante disponibilité, son enthousiasme sans faille envers mon travail et son immense compétence scientifique ont fait de cette thèse une expérience inoubliable, qui va façonner sans aucun doute mon avenir professionnel.

Je remercie Monsieur Oliver Nüsse d’avoir accepté de présider mon jury, et l’attention qu’il a portée à mon travail dans le cadre de l’école doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants. Je remercie également tous les membres du jury : Messieurs Arnaud Échard et Thierry Dubois en tant que rapporteurs et Madame Christine Tran-Quang et Monsieur Matthieu Piel comme examinateurs.

Un particulièrement grand merci à Nathalie Rocques, Dominique Lallemand et Stéphane Romero de m’avoir supporté à tour de rôle, pour nos discussions et vos conseils avisés ! Je remercie également tous les autres membres de l’équipe présents ou passés pour leur soutien, pour la bonne humeur régnant au sein du labo et qui ont fait de cette thèse une expérience humaine très enrichissante : Anna, Sai, Artem, Angelina, Elise, Gleb. Enfin, merci à tous les membres du laboratoire de Biochimie pour leur accessibilité, leur gentillesse et leur aide.

Ce travail n’aurait pas été possible non plus sans le soutien inconditionnel que m’ont apporté mes parents, mon frère et mes amis qui ont tout fait pour s’intéresser à mes recherches et comprendre les tenants et les aboutissants du doctorat. Enfin, je remercie du fond du cœur Charlène, qui partage ma vie depuis plus de dix ans, qui est devenue ma femme, qui m’a encouragé, m’a accompagné (et aidé !) le week-end au labo, mais a aussi dû supporter mes absences, mes réveils à l’aube et retour tardifs. Merci de ton amour et de ta compréhension.

Je remercie la Ligue contre le Cancer et la fondation ARC pour la recherche sur le cancer pour leur soutien financier.

T

ABLE DES MATIERES

- Introduction - ... 6

I La régulation de la prolifération cellulaire ... 9

1) Le cycle cellulaire et ses phases ... 9

i. L’interphase (G1, S, G2) ... 10

ii. La mitose... 11

iii. La phase de quiescence ou G0 ... 13

2) Les contrôles moléculaires du cycle cellulaire ... 14

i. La progression du cycle cellulairea ... 14

ii. L’inhibition du cycle cellulaire ... 16

iii. Les checkpoints du cycle cellulaire ... 18

3) Les contrôles extracellulaire de la proliferation ... 20

i. Les facteurs de croissance ... 21

ii. La matrice Extracellulaire ... 23

iii. Les contacts intercellulaires ... 25

II La migration cellulaire ... 29

1) Le rôle et les différents types de migration ... 29

i. Le rôle physiologique de la migration ... 29

ii. La migration amiboïde ... 29

iii. La migration mésenchymateuse ... 30

2) L’actine ... 32

i. Généralités ... 32

ii. Les réseaux d’actine linéaire ... 33

iii. Les réseaux d’actine branchée ... 33

3) Le complexe Arp2/3 ... 35

- Position du sujet -... 60

- Résultats - ... 66

- Discussion - ... 98

I La polymérisation d’actine branchée contrôle la progression du cycle ... 100

II L’actine branchée corticale intègre les signaux extracellulaires ... 103

III L’actine branchée corticale est critique en cancérologie ... 106

- Références - ... 114

-

I

-

-

I

-

-

I

-

8 « Cellula ». C’est par ce terme qu’en 1667 Robert Hooke décrivit pour la première fois l’unité structurelle et fonctionnelle des êtres vivants. Au moyen d’un microscope rudimentaire, il observa que le liège est formé par l’assemblage de cavités, délimitées par des parois de cellulose. En 1839, presque 200 ans plus tard, le botaniste Mattias Schleiden et le zoologiste Theodor Schwann établissent la théorie cellulaire, selon laquelle tous les êtres vivants sont formés de cellules : certains sont formés d’une seule cellule, ce sont les organismes unicellulaires ; d’autres sont formés de plusieurs cellules morphologiquement différentes, les pluricellulaires. Contemporain de la découverte de la génétique par Gregor Mendel et de la théorie de l’évolution par Charles Darwin, le développement de la théorie cellulaire marque une réelle révolution dans la communauté scientifique. Jusque-là, les micro-organismes étaient supposés apparaître spontanément à partir de matière inorganique. Plus généralement, l’origine des cellules composant les êtres vivants plus développés restait inconnue. Cependant, en 1855, Rudolf Virchow dément la théorie de la génération spontanée et formule l’axiome « omni cellula e cellula ». Toute cellule provient d’une autre cellule.

L’ensemble des étapes nécessaires au développement d’un organisme se nomme morphogénèse. La seule prolifération cellulaire ne suffit pas pour expliquer comment les cellules vont former un organisme. Un organisme n’est, en effet, pas seulement constitué de l’enchevêtrement de cellules. Au contraire, certaines d’entre elles doivent se déplacer vers des tissus spécifiques pour ensuite y former des organes. Ce processus est appelé la migration cellulaire.

Les mécanismes régulant la génération de nouvelles cellules sont regroupés sous le nom de cycle cellulaire et les molécules intervenant dans la régulation de la progression dans ce cycle ont été identifiées. Les signaux extracellulaires qui contrôlent la prolifération et la migration cellulaire sont déciphérés et mettent en jeu des voies de signalisation mutuelles.

La première partie de cette thèse consiste en une synthèse bibliographique des connaissances actuelles du cycle cellulaire, de sa régulation ainsi que de la migration cellulaire. Etant donné la grande complexité de certains mécanismes moléculaires, j’ai essayé de me concentrer sur les régulations fondamentales au risque d’omettre certains détails.

-

I

-

9

I La régulation de la prolifération cellulaire

Le cycle cellulaire est une série d’évènements moléculaires, suivant un ordre chronologique précis, entrainant la division d’une cellule mère en 2 cellules filles identiques. Il permet le contrôle spatio-temporel de la prolifération cellulaire. Processus essentiel lors du développement embryonnaire, il est également indispensable à l’homéostasie cellulaire des tissus différenciés. Preuve de son importance biologique fondamentale, les mécanismes de régulation de la division cellulaire sont très bien conservés au cours de l’évolution (Cross et al. 2011). La division cellulaire a fait l’objet de très nombreuses études sur des modèles biologiques très variés tels que des cellules de mammifères en culture, des levures, des ovocytes d’étoiles de mer et des embryons d’oursins (Nurse 2000). La multiplication des études, la complémentarité des approches, le partage d’outils moléculaire, et la concordance des résultats a permis l’émergence d’un modèle général du contrôle moléculaire de la prolifération cellulaire. Cette découverte a été couronnée en 2001 par le Prix Nobel de Physiologie et de Médecine décerné aux Britanniques Tim Hunt et Paul Nurse et à l’Américain Leyland Hartwell.

Les mécanismes de contrôle du cycle cellulaire sont très complexes et impliquent un grand nombre de protéines différentes qui interviennent transitoirement, mais dans un ordre précis. Toutes ces protéines permettent de réguler et contrôler la succession des différentes étapes du cycle cellulaire.

1) Le cycle cellulaire et ses phases

Le cycle de division de la majorité des cellules consiste en 4 processus coordonnés et orchestrés dans le temps : croissance cellulaire, réplication de l’ADN, distribution des chromosomes dupliqués entre les cellules filles et division cellulaire à proprement parler. Ces processus sont coordonnés dans un ordre chronologique précis, si bien que l’on peut diviser le cycle cellulaire en 2 grandes étapes : l’interphase et la mitose. Correspondant à la séparation des chromosomes et à la cytokinèse (division du cytoplasme), la mitose a été la première étape définie du cycle cellulaire grâce à sa particularité morphologique. L’interphase est la phase de croissance et de duplication de l’ADN, indispensable pour permettre la division d’une cellule mère en 2 cellules filles, génétiquement identiques. L’interphase est elle-même subdivisée en 3 phases : G1, S et G2 (Howard & Pelc 1951) (Mitchison & Salmon 2001).

-

I

-

10 i. L’interphase (G1, S, G2)

Le cycle cellulaire fut décrit en 2 phases morphologiquement distinctes. L’intervalle de temps entre deux divisions cellulaires a d’abord été appelée « intermitosis » puis « resting phase », autrement dit phase de repos. Les avancées technologiques des années 1950 ont permis de montrer que cette phase était en réalité active, puisque la réplication de l’ADN a lieu pendant une partie limitée de l’interphase. La phase S, pour synthèse de l’ADN, est ainsi séparée de la mitose par 2 intervalles, G1 et G2.

Figure 1 : Le cycle cellulaire

Sous l’effet de signaux mitogènes, les cellules entrent dans le cycle cellulaire pour se diviser. L’interphase est constituée des phases G1, S et G2. Elle permet à la cellule de croitre et de dupliquer son ADN pour préparer l’étape de division cellulaire appelée mitose. Après s’être divisées, en absence de signaux mitogènes, les cellules entrent en phase G0, une phase de quiescence.

La phase G1 (pour Gap 1) est la première phase du cycle cellulaire. Elle succède à la mitose et précède la phase S. C’est en phase G1 que la cellule décide ou non de débuter un nouveau cycle(Coller 2007). Si tel est le cas, elle se prépare à toutes les étapes à venir du cycle cellulaire (Massagué 2004). Elle redevient métaboliquement active pour subvenir à ses besoins au cours des phases suivantes (Lee & Finkel 2013). La transcription et la traduction, ralenties voire stoppées pendant la mitose, recommencent notamment pour synthétiser les protéines nécessaires à la réplication de l’ADN (Walters et al. 1972). Cette phase est surtout marquée par la croissance cellulaire et la multiplication des organelles. A ce stade, la cellule est déjà capable de remplir toutes ses fonctions. La durée de la phase G1 varie considérablement en fonction du type cellulaire. Elle dure généralement une dizaine d’heures mais peut-être beaucoup plus courte. En effet, en fonction

-

I

-

11 des stimuli reçus par les cellules, qu’ils soient prolifératifs ou antiprolifératifs, les cellules peuvent retarder leur progression dans le cycle ou en sortir et entrer en phase de quiescence (phase G0, cf. chapitre iii).

Pour qu’une cellule mère puisse donner 2 cellules identiques, il faut que son ADN soit dupliqué. C’est le rôle de la phase S (Takeda & Dutta 2005). Elle va utiliser les ressources produites en phase G1 pour synthétiser les nouveaux chromosomes. Brièvement, la réplication de l’ADN est initiée à différentes origines de réplication avec l’ouverture de la double hélice par des hélicases et la synthèse d’ADN par des polymérases. Enfin, l’ADN une fois dupliqué est ré-empaqueté par des histones. La cellule, encore diploïde (2n) en G1, devient ainsi progressivement tétraploïde (4n) à la fin de la phase S. La durée de la phase S est généralement de 8 heures mais peut varier en fonction de la quantité d’ADN à dupliquer ainsi que du nombre de sites de réplications actifs.

Une fois que l’ADN est totalement répliqué, la cellule va entrer en phase G2 du cycle cellulaire. C’est la deuxième phase de croissance du cycle cellulaire. Son rôle est similaire à celui de la phase G1 pour la phase S. La cellule doit en effet se préparer à la division mitotique. Pour cela, elle va synthétiser de nombreuses protéines nécessaires à la condensation des chromosomes en mitose et croitre en masse pour que, après division, les cellules filles soient identiques à la cellule mère en G1. Les microtubules, qui seront utilisés pour distribuer les chromosomes en mitose, sont assemblés. De même, les 2 centrosomes auxquels s’attacheront les microtubules sont formés. Il s’agit de la phase la plus courte de l’interphase puisqu’elle ne dure qu’environ 4 heures.

Les 2 phases de croissance, G1 et G2, bien que nécessaires à une prolifération cellulaire efficace, ne sont pas toujours indispensables. En effet, le cycle cellulaire des cellules embryonnaires précoces ne dure que 30 minutes et ne contient ni de G1 ni de G2 (Murakami & Vande Woude 1998). Le cytoplasme des cellules mères est divisé en 2 cellules, plus petites, sans que la cellule mère n’ait pu croître. Les cellules embryonnaires ont pour particularité de se diviser très rapidement, sans que leur cycle cellulaire ne soit contrôlé par les signaux extracellulaires.

Alors qu’en interphase le matériel génétique se trouve dans le noyau de la cellule, l’ADN va dès la première étape de la mitose se distribuer passivement dans la cellule entière à la suite de la rupture de l’enveloppe nucléaire (Georgatos et al. 1997). L’interphase prépare ainsi les cellules à la division mitotique.

ii. La mitose

La mitose correspond à la phase du cycle cellulaire où la cellule mère se divise en 2 cellules filles génétiquement identiques. Alors que l’interphase est divisée en 3 phases distinctes, la mitose est classiquement découpée en 5 périodes (Mitchison & Salmon 2001).

La première période est la prophase. Elle est définie par la condensation de l’ADN en chromosomes sous forme de 2 chromatides sœurs. A partir des centrosomes, dupliqués et séparés au

-

I

-

12 cours de l’interphase, le fuseau mitotique se forme dans le cytoplasme. La rupture de l’enveloppe nucléaire correspond au début de la prométaphase. Les microtubules formant le fuseau mitotique peuvent alors entrer dans la région nucléaire. On en distingue différents types : les microtubules astraux qui irradient dans toutes les directions vers le cortex depuis les centrosomes, les microtubules kinétochoriens qui s’attachent aux chromosomes via les kinétochores et les microtubules polaires qui, à partir de chaque centrosome, stabilisent le fuseau mitotique en s’associant entre eux. Les chromosomes sont ensuite tirés de part et d’autre par les microtubules kinétochoriens ce qui aboutit à leur alignement au niveau de la plaque équatoriale. C’est la métaphase. Les chromatides sœurs de chaque chromosome sont séparés lors de l’anaphase et ils migrent alors vers un des 2 pôles de la cellule. Lors de la télophase les chromosomes fils se trouvent à chaque extrémité de la cellule et les microtubules kinétochoriens auxquels ils étaient attachés disparaissent. Une nouvelle enveloppe nucléaire se forme à chaque pôle de la cellule autour des chromosomes, qui commencent à se décondenser. Enfin, lors de la cytokinèse, la membrane cytoplasmique s’invagine au milieu de la cellule et aboutit à la scission de la cellule en 2 cellules filles identiques.

Figure 2 : La mitose

L’étape de division cellulaire est caractérisée par la condensation de l’ADN en chromosomes (prophase), la mise en place du fuseau mitotique et la rupture de l’enveloppe nucléaire (prométaphase), l’alignement des chromosomes au niveau du fuseau mitotique (métaphase), leur séparation (anaphase) puis leur ségrégation aux pôles cellulaires (télophase). Enfin la mitose s’achève par la scission de la cellule mère en 2 cellules filles identiques (Cytokinèse).

-

I

-

13 Les cellules filles nouvellement nées vont alors à nouveau entrer en phase G1. Comme précisé précédemment, la phase G1 est critique quant au futur des cellules. Elles doivent en effet intégrer les signaux environnementaux et décider de poursuivre l’avancée dans le cycle cellulaire ou en sortir (Zetterberg et al. 1995).

iii. La phase de quiescence ou G0

En sortie de mitose, différents types cellulaires ont été décrits sortant du cycle cellulaire en réponse à des changements environnementaux qui ne sont plus propices à la prolifération. Ces cellules entrent alors dans un état quiescent également appelé phase G0 du cycle cellulaire (Zetterberg & Larsson 1985). La majorité des cellules d’un organisme vivant sont retrouvés à l’état quiescent in vivo (Smith & Martin 1973). Bien que certaines cellules différenciées ne se divisent plus (cellules du muscle squelettique par exemple), d’autres continuent de se diviser pendant toute la vie de l’organisme (cellules souches hématopoïétiques) (Zhang et al. 2003). D’autres enfin ne se divisent que pour réparer une lésion ou compenser la mort d’autres cellules (cellules de la peau par exemple). Les cellules quiescentes ont longtemps été considérées comme dormantes, attendant d’entrer à nouveau dans le cycle cellulaire. Toutefois il a été décrit que les cellules en phase G0 sont toujours métaboliquement actives et qu’elles peuvent remplir leur rôle cellulaire bien qu’elles soient sorties du cycle cellulaire (Lemons et al. 2010). La phase G0 peut être un état transitoire qui est levé lorsque les conditions environnementales redeviennent optimales ou qu’un tissu a besoin d’être regénéré à la suite d’un traumatisme (Martin 1997). Les cellules peuvent alors rentrer à nouveau dans le cycle cellulaire en phase G1. Il peut également s’agir d’un état définitif, par exemple lorsque le programme génétique de la cellule l’impose (Schneider et al. 1988).

Nous venons de voir le rôle essentiel du cycle cellulaire. En régulant les mécanismes de la division cellulaire, il permet de maintenir l’homéostasie tissulaire et de réguler la croissance cellulaire lors d’évènements tels que la réparation et la régénération. Pour être fiable, un tel processus doit être contrôlé de façon précise dans le temps en fonction des phases du cycle cellulaire. Différents mécanismes de régulation, que nous allons introduire, existent. Dans un premier temps, nous allons voir quels sont les mécanismes moléculaires qui permettent de réguler le cycle cellulaire de telle sorte que chaque phase se déroule l’une après l’autre, dans le bon ordre, et qu’elles s’exécutent parfaitement. Dans un second temps, nous verrons quels signaux extracellulaires activent ou inhibent l’entrée ou la progression dans le cycle cellulaire.

-

I

-

14 2) Les contrôles moléculaires du cycle cellulaire

Alors que les différentes phases du cycle cellulaire ont été décrites dans les années 1950, ce n'est que dans les années 1970 que l'on a découvert qu'un système de régulation particulier agit comme le contrôleur du cycle pour conduire la cellule à travers chacune des phases (Johnson & Rao 1970; Rao & Johnson 1970).

i. La progression du cycle cellulaire

Tous les événements se produisant dans chaque phase du cycle cellulaire sont le résultat de réactions enzymatiques spécifiques et contrôlées finement. Ces protéines doivent être activées ou synthétisées au bon moment dans le cycle. Par exemple, pour que la, réplication d’ADN puisse avoir lieu en phase S, il faut que les enzymes qui synthétisent les nucléotides s’incorporant dans l’ADN soient préalablement synthétisées en phase G1 (Heichman & Roberts 1994). Il en est de même pour la progression du cycle cellulaire, régulée positivement par des protéines kinases appelées CDKs (Cyclin-Dependant kinases). Leur fonction est d’activer ou d’inactiver par phosphorylation des protéines spécifiques au bon moment dans chacune des phases du cycle cellulaire (Malumbres & Barbacid 2009). Comme certaines protéines kinases, les CDKs modifient la conformation de leur protéine cible par phosphorylation. Cependant, les CDKs ne fonctionnent pas seules, mais sous forme d’un complexe de 2 sous-unités. En tant que monomère, elles n'ont, en effet, aucune activité enzymatique. Son activation nécessite l’association avec une autre protéine, qui fonctionne comme un activateur allostérique (Morgan 1995). La première sous-unité du complexe est la sous-unité catalytique, correspondant donc à la kinase CDK. La seconde sous-unité qui active la CDK est une

cycline (Evans et al. 1983). Elle permet également de cibler les substrats spécifiques de la kinase.

Figure 3 : Complexe Cycline – CDK

Les complexes Cycline-CDK sont les régulateurs clés de la progression dans le cycle cellulaire. Ils sont composés de deux sous-unités : la sous-unité kinase (CDK) et la sous-unité régulatrice (Cycline).

-

I

-

15 Les cyclines ont d’abord été identifiées comme des régulateurs clés du cycle cellulaire lorsqu’on a observé qu’elles subissaient un cycle de synthèse et de destruction subtilement régulé. Elles sont, en effet, produites ou dégradées à des moments spécifiques du cycle. Au contraire, les CDKs ont un niveau d’expression constant durant les différentes phases (Morgan et al. 1997). C’est donc la présence de la sous-unité cycline qui procure la régulation temporelle du complexe

Cycline-CDK. Lorsque la cycline est synthétisée, elle se lie à la sous-unité kinase et l’active (Pines 1993).

Il existe de nombreux CDKs et cyclines qui s’associent et peuvent former une multitude de complexes cycline-CDK différents (Van Den Heuvel et al. 1993). Le but n’étant pas de lister toutes les combinaisons possibles, la figure 4 récapitule les complexes essentiels régulant la progression du cycle et la phase au cours de laquelle ils interviennent. Brièvement, le cycle cellulaire peut être vu comme un cycle cycline-Cdk dépendant. L’activation de CDK4 ou CDK6 par la cycline D est la première étape de la phase G1. Ce complexe ainsi formé induit la synthèse de la cycline E qui va à son tour activer CDK2. Lorsque l’activité du complexe cyclineE-CDK2 atteint un niveau critique, il déclenche la transition de la phase G1 vers la phase S. Durant la phase S, la cycline A en s’accumulant va se lier à CDK2 et induire la réplication de l’ADN. La cycline B est alors synthétisée jusqu’en G2 et en activant CDK1, le complexe va déclencher l’entrée en prophase. Ce modèle du contrôle du cycle cellulaire dans lequel chaque phase est régulée par un complexe Cycline-CDK particulier commence a été révisité depuis la découverte de redondance fonctionnelle entre certaines cyclines et certains CDK (Hochegger et al. 2008).

Figure 4 : Association des complexes Cycline – CDK au cours des phases du cycle cellulaire Les cyclines sont différentiellement exprimées au cours du cycle cellulaire. Lorsqu’elles sont synthétisées, elles se lient à leur CDK spécifique et active leur activité kinase. L’expression cyclique des cyclines régit ainsi la formation des complexes Cycline/Cdk et la progression dans le cycle cellulaire.

-

I

-

16 La progression dans le cycle cellulaire est donc provoquée par ces complexes cycline-CDK qui activent chronologiquement leur substrat. La régulation de l’activité de ces complexes forme le cœur du système de contrôle du cycle cellulaire. Cependant, la seule régulation par le niveau d’expression des cyclines n’est pas suffisante pour expliquer la qualitéde ces contrôles. Il existe un second niveau de régulation qui va freiner la progression dans le cycle cellulaire.

ii. L’inhibition du cycle cellulaire

Les inhibiteurs des CDK ou CDKi, sont des molécules qui s’associent aux complexes cycline-CDK afin d’inhiber leur activité (Elledge & Harper 1994). Par encombrement stérique, ils empêchent les cyclines de reconnaître leur protéine cible (Russo et al. 1996).

Figure 5 : Action des inhibiteurs des complexes Cyclin-CDK

Les inhibiteurs des CDK (CDKi) se fixent sur le domaine d’interaction entre la cycline et la CDK et bloque l’activité catalytique de la sous-unité CDK.

Les CDKi peuvent être séparés en 2 classes distinctes : les généraux et les spécifiques (Besson et al. 2008). Les inhibiteurs de CDK de la famille CIP/KIP se lient à une grande variété de complexes cycline-CDK, inhibent leur activité et bloquent la progression du cycle cellulaire à différents stades. Les CDKi de cette famille ont une action plus large car ils inhibent les complexes comprenant les cyclines A, B, D et E. 3 protéines composent cette famille : p21WAF1/CIP1_{, p27}KIP/ICK/PIC2 _{et p57}KIP2_.

La seconde classe de CDKi est la famille INK4. Ils inhibent spécifiquement les complexes cycline-CDK formés de cycline-CDK4 et cycline-CDK6. Au nombre de 4, ils interviennent ainsi exclusivement durant la phase G1. Les protéines de cette famille sont p15INK4B/MTS2_{, p16}INK4A/MTS1/CDKN2/CDK4I_,

p18INK4c/INK6A _{et p19}INK4D/INK6B_{. Tous les CDKi peuvent ainsi être comparés à des freins du cycle}

cellulaire étant donné qu’ils bloquent sa progression en interférant avec les complexes cycline-CDK spécifiques de chaque phase du cycle cellulaire.

-

I

-

17 Figure 6 : La progression du cycle cellulaire et ses régulateurs

Les complexes Cycline-CDK sont spécifiques de chaque phases du cycle cellulaire. La formation de ces complexes est contrôlée de façon négative par différents inhibiteurs appelés CDKi.

En phase G1, un niveau supérieur de régulation contrôle de façon négative la progression dans le cycle cellulaire. Comme nous l’avons vu précédemment, la cellule doit synthétiser la cycline E pour activer CDK2 et permettre son passage en phase S. La transcription du gène de la cycline E nécessite un facteur de transcription appelé E2F (Mudryj et al. 1991). Dans les cellules en G0 ou en début de phase G1, bien que lié au promoteur du gène de la cycline E, E2F est inhibé par la protéine du rétinoblastome appelée Rb (Chellappan et al. 1991). Dans son état actif, non-phosphorylé, Rb se lie à E2F et bloque la transcription de la cycline E. La phosphorylation de Rb par le complexe cyclineD-CDK4/6 lève l’inhibition d’E2F, induit la transcription de la cycline E et donc la transition de la phase G1 à la phase S (Mittnacht & Weinberg 1991; Hatakeyama et al. 1994). Rb sert ainsi de frein du cycle cellulaire puisqu’il empêche la progression des cellules en phase G1. En inhibant les complexes cyclineD-CDK4/6 (et donc la phosphorylation de Rb), p15, p16, p18 et p19 sont les régulateurs majoritaires de la progression du cycle en phase G1.

-

I

-

18 Figure 7 : Régulation de la progression en G1 par la protéine du Rétinoblastome

La transcription des gènes requis pour l’entrée en phase S, tels que la Cycline E, est sous le contrôle du facteur de transcription E2F. Ce dernier est maintenu réprimé par la protéine Rb active. Au cours de la phase G1, le complexe CyclineD/CDK4 se forme et phosphoryle la protéine Rb ce qui induit son changement de conformation. pRB devient ainsi inactif et libère E2F qui va, alors, induire la transcription des gènes nécessaires à l’entrée en phase S.

Nous venons de voir que les mécanismes de contrôle du cycle cellulaire sont nombreux et complexes. Ils peuvent induire ou freiner la progression dans le cycle cellulaire. Toutefois, les évènements qui ont lieu au cours des différentes phases du cycle doivent être achevés, coordonnés et avoir lieu les uns après les autres. Par exemple, il est critique qu’une cellule ne commence pas la mitose avant que la réplication de son génome ne soit complète. Le contraire serait dramatique pour la division cellulaire, puisqu’une cellule fille n’hériterait pas d’une copie complète du matériel génomique maternel. La coordination entre les différentes phases du cycle cellulaire dépend d’un système de points de contrôle également appelés « checkpoints ». Ils préviennent l’entrée dans la phase suivante du cycle cellulaire tant que les événements de la phase en cours n’ont pas été correctement accomplis.

iii. Les checkpoints du cycle cellulaire

Il existe 3 points de contrôles majoritaires dans les cellules, qui confèrent au cycle cellulaire sa remarquable fidélité et assurent un développement normal des cellules et l’homéostasie tissulaire. Les modèles moléculaires de ces checkpoints sont très détaillés, avec une dissection précise des voies de signalisation, des modifications post-transcriptionnelles, des structures biochimiques et des cinétiques enzymatiques. Etant donné la complexité de ces modèles, nous nous concentrerons sur les concepts clés permettant de comprendre les principes de la régulation du cycle cellulaire par les checkpoints.

-

I

-

19 Dans l’ordre de la progression du cycle cellulaire, le premier checkpoint à intervenir est le checkpoint START ou point de restriction R (Pardee PNAS 1974). Il contrôle, au cours de la phase G1, l’optimalité des signaux extracellulaires, notamment la présence de facteurs de croissance (Pardee 1986; Temin 1971). Le passage du point START est un événement très régulé dans le cycle cellulaire de la levure. Il est contrôlé par les signaux extracellulaires tels que la présence de facteurs de croissance et la taille de la cellule. Par exemple, si des levures sont privées de facteurs de croissance, leur cycle cellulaire sera arrêté au niveau du checkpoint START et les cellules rentrerons dans un état quiescent au lieu de progresser en phase S (Woollard & Nurse 1995). Le checkpoint START représente ainsi un point de décision où la cellule va déterminer si suffisamment de nutriments sont disponibles pour permettre la progression dans le reste du cycle cellulaire. Originellement découvert chez les levures et nommé START, le point de restriction chez les mammifères présente peu ou prou les mêmes fonctions. En présence de facteurs de croissance, la cellule va passer le point de restriction et entrer en phase S. En effet, après avoir passé le point de restriction, la cellule perd sa dépendance aux facteurs de croissance pour le reste du cycle cellulaire (Planas-Silva & Weinberg 1997). A l’inverse, si en G1 la cellule est privée de mitogènes avant le point de restriction, le cycle cellulaire s’arrête en G1 au niveau du point de restriction. La cellule va alors entrer en phase G0 pendant une période plus ou moins longue, jusqu’à ce qu’elle soit amenée à passer le checkpoint grâce à des facteurs de croissance ou d’autres signaux extracellulaires (Zetterberg & Larsson 1985). Le rôle des facteurs de croissance et des signaux extracellulaire dans la prolifération sera abordé dans le prochain chapitre du manuscrit.

Plusieurs checkpoints du cycle cellulaire contrôlent que des chromosomes endommagés ou incomplets ne soient pas répliqués et transmis aux cellules filles. Un de ces points de contrôle a lieu durant la phase G2 et prévient l’entrée en mitose tant que la réplication de l’ADN n’est pas terminée (Blow & Dutta 2005). Le checkpoint perçoit l’ADN non répliqué et génère un signal d’arrêt du cycle cellulaire. La progression du cycle cellulaire est également arrêtée en phase G2 en réponse à des dommages à l’ADN. Que ce soit en raison d’irradiations ou d’erreurs de réplication, l’ADN peut être endommagé au cours de la phase S. L’arrêt du cycle cellulaire au niveau du checkpoint de dommage à l’ADN permet alors à la cellule de réparer les erreurs ou de finir la réplication de l’ADN (Friedberg 2003). Une fois le processus achevé, la cellule va pouvoir passer le checkpoint, finir la phase G2 et entrer en mitose.

Enfin, un autre point de contrôle du cycle cellulaire qui maintient l’intégrité du génome prend place au cours de la mitose. Ce checkpoint du fuseau mitotique surveille l’alignement des chromosomes sur le fuseau mitotique en métaphase et s’assure qu’un set complet de chromosomes est distribué à chacune des cellules filles (Musacchio & Hardwick 2014). Par exemple, si un chromosome n’est pas aligné correctement sur la plaque métaphasique, la mitose va être stoppée en

-

I

-

20 métaphase avant que les chromosomes ne commencent à se ségréger dans les noyaux filles. En raison de ce checkpoint, les chromosomes ne se séparent pas avant qu’ils ne soient parfaitement alignés au niveau du fuseau mitotique et sous tension.

Figure 8 : Les checkpoints contrôlent la progression du cycle cellulaire

Les checkpoints du cycle cellulaire contrôlent que tous les évènements au cours de chaque phase du cycle cellulaire soient correctement achevés.

Le cycle cellulaire est donc contrôlé finement par des activateurs (les complexes cycline-CDK), des freins (inhibiteurs de CDK) et des points de contrôle. Ils permettent de réguler la progression du cycle de façon coordonnée, de telle sorte que tous les événements d’une phase soient achevés, avant que la phase suivante ne débute. Ces mécanismes de régulation permettent aux cellules de contrôler subtilement leur prolifération. En effet, dans leur environnement, les cellules doivent être capables d’intégrer les différents stimuli qu’elles reçoivent et en réponse décider de progresser ou non dans le cycle. La décision de proliférer, cruciale dans le développement et l’homéostasie tissulaire, ne se prend seulement quand il y a une combinaison optimale des conditions environnementales.

3) Les contrôles extracellulaire de la proliferation

En plus des signaux moléculaires intracellulaires qui coordonnent les processus dans chaque phase du cycle cellulaire, des signaux extracellulaires de l’environnement régulent la progression dans le cycle. La prolifération cellulaire est, en effet, contrôlée par des signaux solubles et des adhérences cellulaires émis, qui vont soit la stimuler ou l’inhiber. Ces signaux majeurs sont au nombre de 3 : les facteurs de croissance, l’adhérence à la matrice extracellulaire et les contacts intercellulaires. Au cours de ce chapitre, nous allons présenter les différents signaux, leur rôle sur la progression dans le cycle cellulaire ainsi que les autres rôles physiologiques qu’ils exercent.

-

I

-

21 i. Les facteurs de croissance

Le signal extracellulaire, régulant la progression du cycle cellulaire, le plus étudié est, de loin, les facteurs de croissance. Comme nous l’avons vu à propos de la phase G0, les facteurs de croissance sont critiques pour l’entrée en phase S du cycle cellulaire. Le point de restriction contrôle en effet que des facteurs de croissance sont présents dans le milieu extracellulaire pour signaler au complexe cyclineE-CDK2 d’induire la sortie de la phase G1 (Tsai et al. 1993). A l’inverse, s’il n’y a pas de facteurs de croissance, la cellule va entrer dans un état quiescent, en phase G0. Notons que cet état est transitoire, jusqu’à ce que des facteurs de croissance viennent, à nouveau, stimuler l’entrée en phase G1 (Zetterberg & Larsson 1985).

Les facteurs de croissance sont des ligands pour des récepteurs transmembranaires. La grande majorité de ces récepteurs membranaires sont à activité tyrosine kinase (Hunter & Cooper 1985; Schlessinger & Ullrich 1992). La fixation du ligand sur son récepteur au niveau du domaine de liaison extracellulaire induit la dimérisation du récepteur et sa transphosphorylation (un récepteur va alors phosphoryler le second).

Figure 9 : Activation des récepteurs aux facteurs de croissance

La liaison du ligand (le facteur de croissance) sur son récepteur entraîne sa dimérisation. Cela provoque la transphosphorylation de l’homodimère sur les résidus tyrosines. Les récepteurs ainsi activés changent de conformation ce qui libère des sites de liaison à des protéines de signalisation qui sont à leur tour activées.

Ce signal est alors transduit via différentes voies de signalisation en fonction des récepteurs activés. Il y a une centaine de gènes codants pour des facteurs de croissance qui sont séparés en superfamilles. Certains de ces facteurs de croissance sont reconnus par plusieurs superfamilles de récepteurs et ont donc un grand champ d’action dans l’organisme. D’autres ont, au contraire, des cibles plus restreintes et sont spécifiques de certains tissus. Par exemple, l’EGF (pour Epidermal Growth Factor) stimulent la prolifération des cellules de l’épiderme, l’IGF1 est semblable à l’insuline, le FGF est sécrété par et pour les fibroblastes des tissus conjonctif et le PDGF (Platelet-Direved Growth Factor) joue un rôle essentiel dans la formation des réseaux sanguins (Cross & Dexter 1991).

-

I

-

22 Les facteurs de croissance atteignent leurs cibles de multiples façons. La circulation sanguine est utilisée pour atteindre les cibles à grande distance lors de la communication endocrine. Un mécanisme paracrine est utilisé pour les libérations locales et autocrine lorsqu’une cellule répond elle-même aux facteurs de croissance qu’elle produit (Sporn & Roberts 1985).

Figure 10 : Voies de signalisation issues des facteurs de croissance

L’activation des récepteurs tyrosines kinase par les facteurs de croissance induit différentes voies de signalisation. Le complexe Grb2-Sos est recruté et induit la phosphorylation de la petite GTPase Ras qui se lie alors à la membrane. Il entraine la cascade de signalisation des MAPKinases (Raf, MEL, ERK) et l’activation de divers facteurs de transcription. La PI3K est recrutée au niveau du récepteur et active en réponse la kinase AKT qui active des voies de signalisation induisant la prolifération. Enfin la phospholipase C (PLC) transforme le PI(4,5)P2 en DiAcideGlycérol (DAG) et en Inositol1,4,5TriPhosphate (IP3).Le DAG stimule la protéine kinase C (PKC). L'IP3 agit au niveau des compartiments de stockage intracellulaire de calcium pour libérer le calcium. Le calcium agit à son tour sur différentes enzymes. La petite GTPase Rac est également activée. PIP2 active une GEF (GTP Exchange Factor) de Rac et induit l’échange de Rac-GDP en Rac-GTP et la migration cellulaire.

En plus de stimuler la prolifération cellulaire, les facteurs de croissance ont d’autres effets. Ils peuvent réguler la différenciation cellulaire. En effet, la plupart des cellules se différenciant au cours du développement le font en réponse à des facteurs de croissance spécifiques (Kimelman & Kirschner 1987). Les facteurs de croissance sont également connus pour induire la migration cellulaire. Durant le développement de la crète neurale, lorsque les somites sont formés, les cellules de la crète neurale deviennent sensibles au facteur de croissance BMP4 et vont se mettre à migrer (Sela-Donenfeld & Kalcheim 1999). De même, des kératinocytes, qui sont immobiles lorsqu’ils sont privés de facteurs de croissance, se remettent à migrer après incubation avec différents types de mitogènes (Tsuboi et al. 1992). En condition pathologique, la réparation d’une blessure est un autre exemple du rôle des facteurs de croissance dans la migration. Les cellules épithéliales et inflammatoire sécrètent de l’EGF et signalent aux cellules bordant la blessure de migrer pour fermer la plaie (Odland & Ross 1968).

-

I

-

23 ii. La matrice Extracellulaire

Bien que notre compréhension de la régulation du cycle cellulaire et la transduction du signal en découlant ait d'abord été définie par l'analyse des facteurs mitogènes solubles, il est maintenant clair que l’adhérence à la matrice extracellulaire est un régulateur de croissance tout aussi important (Reiske et al. 2000; Huang & Ingber 1999; Hynes 2002; Yamada & Olden 1978). In vivo, les cellules de mammifères sont intégrées dans un microenvironnement cellulaire, composé d’un réseau complexe de fibres protéiques appelé matrice extracellulaire (MEC), qui exerce un important contrôle de la prolifération cellulaire. La matrice extracellulaire joue le rôle d’intermédiaire entre le substrat auquel la cellule s’attache et la cellule elle-même. Pour proliférer, les cellules saines ont besoin d’être proprement ancré à une matrice suffisamment rigide. Des études ont en effet montré que l’adhérence à la MEC régule le passage du point de restriction en phase G1, en contrôlant l’assemblage des complexes cyclineD-CDK4/6 via la transcription de la cycline D (Zhao et al. 2001). Des fibroblastes non adhérents sont, par exemple, bloqués en phase G1, alors que les mêmes cellules rentrent en phase S lorsqu’elles peuvent s’attacher et s’étaler sur la matrice extracellulaire (Guadagno & Assoian 1991).

Les récepteurs transmembranaires impliqués dans l’adhésion cellulaire sont les intégrines. Une intégrine est capable de se lier à plusieurs ligands présents dans la matrice extracellulaire tels que la fibronectine et signale cette interaction dans la cellule à travers différentes voies de signalisation. Les composants moléculaires clés à l’adhérence cellulaire sont les contacts focaux et les kinases activées en réponse (Giancotti & Ruoslahti 1999; Mitra & Schlaepfer 2006). Ces kinases,

appelées FAK (pour Focal Adhesion Kinases), activent plusieurs cascades de signalisation incluant les MAPkinases, résultant dans l’induction de la synthèse de cycline D pour passer le point de restriction en phase G1. Au niveau de la paxiline, les contacts focaux se lient également au cytosquelette d’actine pour maintenir la cellule correctement ancrée à la matrice extracellulaire.

-

I

-

24 Figure 11 : Composition des points focaux

Les intégrines sont formées des hétérodimères α et β qui reconnaissent les protéines de la matrice extracellulaire. Les protéines paxiline et taline recrutent aux points focaux les kinases des adhérences focales (FAK) et vinculine. L’ α-actinine est une protéine du cytoquelette qui est phosphorylée par FAK, se lie à vinculine et entraine la liaison des points focaux aux filaments d’actine. Enfin la kinase Src est également recrutée aux points focaux. Inspiré de Mitra et al. 2005

.

Figure 12 : Voies de signalisation issues des points focaux

Les kinases des adhérences focales (FAK) induisent les mêmes voies de signalisation que les récepteurs tyrosines kinases activés par les facteurs de croissance.

-

I

-

25 En plus d’être indispensable à la progression du cycle cellulaire, l’adhérence au substrat est également impliquée dans de nombreuses autres réponses cellulaires. La rigidité du substrat affecte en effet la différenciation cellulaire. En cultivant des cellules souches sur des substrats de rigidité différente, on obtient des différenciations différentes. Sur des substrats mous, les cellules deviennent des neurones, alors que sur des substrats plus durs elles se différencient en cellules musculaires, voire en os sur les substrats les plus rigides (Engler et al. 2006). La perte d’adhérence peut également induire l’apoptose dans les cellules épithéliales (Ingber et al. 1986). Enfin, la migration cellulaire est finement contrôlée par l’adhérence au substrat. Grâce aux contacts focaux, les cellules sont capables de sentir les propriétés mécaniques et chimiques du substrat et, régulent la vitesse de leur migration en fonction (Gupton & Waterman-Storer 2006). Le nombre de contacts focaux varie en fonction de la quantité de matrice extracellulaire. Plus il y a de MEC, plus les points focaux sont nombreux. Lorsque leur quantité n’est pas optimale, la migration est très lente : lorsque la concentration en matrice est faible, la cellule a du mal à créer de nouveaux points focaux ; lorsqu’elle est trop concentrée, la multiplication des points focaux partout dans la cellule l’empêche de se déplacer de façon efficace. Cette capacité des cellules à se déplacer vers les zones de plus grande adhérence est appelée l’haptotaxie. De plus, des fibroblastes migrent préférentiellement vers les zones rigides d’un substrat avec un gradient de rigidité (Lo et al. 2000). C’est ce que l’on appelle la durotaxie.

iii. Les contacts intercellulaires

Au sein d’un organisme multicellulaire, les contacts intercellulaires sont essentiels pour maintenir l’homéostasie tissulaire. Cependant des cellules qui prolifèrent peuvent être bloquées dans leur cycle cellulaire si elles présentent de trop nombreuses jonctions intercellulaires. Les courbes de prolifération de cellules en cultures atteignent un plateau lorsqu’elles sont confluentes (Eagle & Levine 1967). C’est ce que l’on appelle l’inhibition de la prolifération dépendante de la densité cellulaire (Stoker & Rubin 1967). En prévenant la surprolifération, cette capacité contribue à l’organisation des cellules dans les tissus sains. Le concept a été définitivement adopté par la communauté scientifique dans les années 80 à la suite de 3 développements importants. Premièrement, il a été observé que l’incubation de fractions membranaires sur des cellules, subconfluentes cultivées avec des facteurs de croissance, ralentissaient leur prolifération (Lieberman & Glaser 1981; Whittenberger & Glaser 1977). Deuxièmement, des récepteurs membranaires d’adhésion intercellulaire ont été identifiés pour influencer la prolifération cellulaire (Niessen et al. 2011). Enfin, une voie de signalisation spécifique responsable de l’inhibition de la proliferation par contact a été découverte (Kim et al. 2011). Il s’agit de la voie Hippo, commentée dans le paragraphe suivant. Ce signal d’inhibition de la prolifération arrête les cellules dans leur cycle cellulaire en phase G1 (Levenberg et al. 1999; Nelson & Chen 2002) au niveau du point de restriction. Lorsque l’inhibition

-

I

-

26 par contact est levée, c’est-à-dire lorsque le tapis cellulaire est moins dense, les cellules sont capables d’entrer à nouveau dans le cycle cellulaire. Par exemple, lorsqu’on enlève une barrière qui maintenait des cellules confluentes bloquées en phase G1, les premières rangées de cellules vont rapidement rentrer en phase S (Streichan et al. 2014). De même, lorsqu’on augmente la surface sur laquelle des cellules confluentes sont adhérées, en étirant le substrat, les cellules entrent à nouveau dans le cycle cellulaire (Benham-Pyle et al. 2015).

Les contacts intercellulaires se font au niveau de récepteurs membranaires appelés les Cadhérines, qui se reconnaissent entre eux. Il existe différents types de cadhérines en fonction des tissus (Miyatani et al. 1989; Nose & Takeichi 1986). La E-cadhérine est spécifique des cellules épithéliales. Elle est de loin la plus étudiée et est considérée comme la cadhérine de référence. Une fois que l’interaction entre 2 cellules s’est produite via les cadhérines présentes au niveau de chaque membrane, la jonction est formée et stabilisée avec la création d’un complexe protéique et la formation de jonctions adhérentes. Ces complexes se composent de différentes protéines telles que les caténines (α et β), la vinculine et des composants du cytosquelette d’actine pour maintenir l’architecture cellulaire (Mège et al. 2006).

Figure 13 : Structures des jonctions cellule-cellule

Deux cellules épithéliales se reconnaissent au niveau des E-cadhérines. Ce sont des homodimères qui sont stabilisés par les protéines p120. Les E-cadhérines sont également liées aux protéines intracellulaires par des protéines d’ancrage, les caténine (α et β). Elles permettent l’interaction avec les filaments d’actine et leur stabilisation. Notons que les protéines Vinculine et α-actinine sont également impliqués dans l’ancrage des filaments d’actine.

Les interactions intercellulaires signalent ensuite à la cellule de proliférer via la voie de signalisation Hippo et les voies de signalisation classiques. Brièvement cette voie de signalisation

-

I

-

27 aboutit à la localisation nucléaire des facteurs de transcription YAP et TAZ qui vont induire la transcription de gènes nécessaires à la progression dans le cycle cellulaire (Dupont et al. 2011).

Figure 14 : Voies de signalisation issues des jonctions cellules-cellules

En plus des voies de signalisation dépendantes de PIK3 que nous avons déjà eu l’occasion de commenter, une autre voie de signalisation est impliquée dans l’induction de la prolifération issue des jonctions intercellulaires. Les caténines activent le gène suppresseur de tumeur Merlin (issu du gène NF2), qui à sont tour phosphoryle LATS1/2 et inactive les facteurs de transcription YAP/TAZ.

Outre leur rôle essentiel dans la prolifération cellulaire, les cadhérines sont impliquées dans un grand nombre de processus cellulaire tels que la morphogenèse, la différenciation, la prolifération et la migration (Gumbiner 1996; Takeichi 1991). Au cours du développement embryonnaire, elles influencent la différenciation cellulaire et la morphogénèse des tissus (Van Roy & Berx 2008). Lorsque l’expression de la E-cadhérine est induite dans ces cellules souches déficiente en cadhérines, il se forme uniquement des épithéliums. Si l’expression constitutive de la N-cadhérine est induite dans ces mêmes cellules, les tissus formés sont des neurones et du cartilage (Larue et al. 1996). L’inhibition de la prolifération dépendante de la densité cellulaire a longtemps été confondue avec l’inhibition de la locomotion par contact cellulaire (Mayor & Carmona-Fontaine 2010; Abercrombie & Heaysman 1954). En effet, l’inhibition de la migration à la suite d’un contact cellulaire est la première étape de l’inhibition de la prolifération (Puliafito et al. 2012). Elle consiste en 4 processus cellulaire distincts :

-

I

-

28 i) contact intercellulaire, ii) inhibition de la protrusion au point de contact, iii) nouvelle protrusion loin du contact, iv) migration dans le sens de la nouvelle protrusion. L’inhibition de la locomotion par contact est donc suivie soit de la migration cellulaire dans une direction différente de l’initiale (Bell 1977), soit par l’inhibition de la prolifération par contact si les cellules forment une couche de cellules confluentes.

Pour conclure cette première partie, nous pouvons clairement dire que la prolifération cellulaire est un processus finement régulé. Les contrôles moléculaires que sont les complexes cycline-CDK ainsi que les inhibiteurs de CDK permettent aux cellules de progresser dans le cycle cellulaire. Au cours de chaque phase du cycle, des points de contrôles vérifient que tous les processus cellulaires se sont correctement déroulés et que les cellules sont dans des conditions optimales pour proliférer. Plusieurs stimuli extracellulaires tels que les facteurs de croissance, l’adhésion au substrat et les jonctions intercellulaires exercent en effet un contrôle positif ou négatif sur la prolifération.

Nous avons montré que ces 3 stimuli régulent d’autres processus cellulaires, notamment la migration. Les facteurs de croissance ne sont pas seulement des mitogènes mais également des motogènes. De même, l’adhésion au substrat modifie la motilité des cellules et l’inhibition de la locomotion est une étape précoce de l’inhibition de la prolifération dépendante de la densité cellulaire.

-

I

-

29

II La migration cellulaire

1) Le rôle et les différents types de migration i. Le rôle physiologique de la migration

Comme nous avons pu le voir avec certains exemples dans le chapitre précédent, la migration cellulaire est essentielle au sein des organismes eucaryotes. Les cellules acquièrent la capacité de migrer tôt au cours du développement embryonnaire. Dès la gastrulation, les cellules migrent de façon collective pour former les trois feuillets embryonnaires (Weijer 2009). Les cellules de la crète neurale subissent une transition épithélio-mésenchymateuse qui les individualise et leur permet de se disséminer dans l’embryon. Elles vont alors se différencier en différents types cellulaires tels que des neurones, des myoblastes... Au cours de la vie adulte, la migration joue également un rôle clé dans l’homéostasie tissulaire ainsi que dans l’immunité et la cicatrisation. Dans la mise en œuvre de la réponse immunitaire par exemple, les lymphocytes après avoir circulé dans le flux sanguin adhèrent aux cellules endothéliales et se mettent à migrer entre les cellules jusqu’au foyer d’infection (Koster et al. 1971).

Les cellules migrent dans l’organisme selon au moins deux modes de migration distincts et exclusifs (Sanz-Moreno & Marshall 2010).

ii. La migration amiboïde

La migration amiboïde est caractérisée par une forme arrondie de la cellule, non polarisée. Elle est initiée par des protrusions membranaires appelés blebs (Friedl & Wolf 2010). Ils se forment à partir d’un épanchement de la membrane plasmique à la suite d’une rupture locale du cortex d’actine, qui maintient la membrane sous-tension. Le bleb se forme alors et permet au cytoplasme de la cellule de s’engouffrer à l’intérieur. Le cortex se reforme ensuite dans le bleb, l’arrière de la cellule se rétracte produisant ainsi le mouvement. La migration de type amiboïde dépend peu de l’adhérence au substrat et des jonctions intercellulaires (Friedl & Wolf 2003). Elle est, en effet, majoritairement utilisée par les cellules lorsqu’elles se trouvent dans des milieux confinés. En exerçant une pression sur les cellules environnantes, le bleb va se former sur le bord libre de la cellule et lui permettre d’avancer grâce à la contractilité cellulaire. Au niveau moléculaire, c’est la voie de signalisation Rho qui est impliquée dans la contractilité générant le bleb. La petite GTPase RhoA et son effecteur ROCK induisent la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine (MLC2), la myosine étant responsable de la contraction du cytosquelette d’actomyosine (Worthylake et al. 2001).

-

I

-

30 Figure 15 : Migration dépendante des blebs

Le bleb est initié par la rupture locale du cortex d’actine. La pression hydrostatique du cytoplasme propulse le fluide cytoplasmique dans la brèche et génère une extension de membrane exempte de cortex. L’expansion du bleb ralentit et le cortex se reforme sous la membrane du bleb. Enfin, la myosine est recrutée au cortex nouvellement formé et entraine la rétraction du reste du cytoplasme dans le bleb.

iii. La migration mésenchymateuse

La migration mésenchymateuse est le mode de migration le plus commun. La cellule adopte une forme allongée et polarisée. A l’avant de la cellule, se trouvent les protrusions membranaires qui vont permettre la migration, appelées lamellipodes (Krause & Gautreau 2014; Abercrombie et al. 1970). La migration dépendante des lamellipodes est composée de plusieurs étapes successives et cycliques (Sheetz et al. 1999). La membrane plasmique est, dans un premier temps, projetée dans la direction du mouvement pour former le lamellipode. Fine lamelle de cytoplasme, il s’étend sur quelques microns grâce à la polymérisation d’actine qui forme un réseau dense de filaments le maintenant. Dans un second temps, des complexes d’adhérence naissants se forment et permettent au lamellipode de s’ancrer à la matrice extracellulaire. Les filaments d’actine qui stabilisent les contacts focaux y sont générés (Johnson et al. 2015). La dernière étape consiste dans le détachement des contacts d’adhésions à l’arrière de la cellule et sa rétractation grâce à la contraction du cytosquelette d’actomyosine. La formation des lamellipodes est induite par la force générée par la polymérisation d’actine contre la membrane activée en amont par la petite GTPase Rac.

-

I

-

31 Figure 16 : Migration dépendante des lamellipodes

La migration est initiée par la protrusion du lamellipode au front de migration, via la génération d’un réseau d’actine. Le lamellipode adhère au substrat et le corps cellulaire est transloqué vers l’avant via sa contraction. Les anciennes adhérences focales se détachent ensuite du substrat à l’arrière et la cellule se rétracte.

-

I

-

32 2) L’actine

i. Généralités

L’actine est une protéine abondante et conservée chez tous les eucaryotes. Elle est retrouvée dans la cellule dans sa forme monomérique et globulaire (actine-G) qui se lie à l’ADP ou à l’ATP. L’actine-G est capable de polymériser et de former un filament (Actine-F) composé de 2 hélices enroulées (Bugyi & Carlier 2010; Holmes et al. 1990).

L’affinité entre monomères d’actine étant faible, l’initiation de la polymérisation d’actine requiert la formation d’un noyau, composé de 3 monomères d’actine. Cette étape est appelée la nucléation. Elle est suivie de l’élongation du filament d’actine qui est polarisé, structuralement avec une extrémité barbée (+) sur laquelle s’assemblent les monomères, à l’état stationnaire, et une extrémité pointue (-) où le filament dépolymérise. A cette polarisation s’ajoute une polarisation biochimique : après assemblage des sous unités liées à l’ATP, l’ATP est rapidement hydrolysé dans le filament ce qui conduit le filament à être majoritairement associé à l’ADP. C’est pourquoi ce sont les sous-unités liées à l’ADP qui se dépolymérisent. A l’état stationnaire, la vitesse de polymérisation compense la dépolymérisation.

Figure 17 : La nucléation, l’élongation et le recyclage de l’actine

La polymérisation de l’actine est initiée lorsque trois monomères d’actine-G/ATP s’assemblent en formant un noyau. L’élongation du filament se fait via l’addition de monomère d’actine-G/ATP à l’extrémité (+). L’actine dépolymérise à l’extrémité (-) et libère des monomères d’actine-G/ADP. La dynamique d’assemblage du filament est régulée par de nombreuses protéines dont les protéines de coiffes qui bloquent les filaments, les cofilines qui coupent les filaments et la profiline qui favorise l’échange de l’ADP en ATP sur les monomères d’actine.

In vivo, la polymérisation d’actine est un processus finement régulé. De multiples protéines interviennent dans le contrôle de la longueur des filaments, de leur renouvellement, de leur assemblage etc… Nous citerons très brièvement trois exemples :

 La profiline se lie à un monomère d’actine et empêche la formation d’un noyau trimérique et sa nucléation spontanée (Pollard TD 1984). Elle oriente le flux de polymérisation vers l’extrémité barbée et accélère l’échange du nucléotide ADP des sous-unités qui dépolymérisent en Actine-G/ATP.

-

I

-

33  La cofiline ou ADP (“Actin Depolymerizing Factor”), comme son nom l’indique, accélère la

dépolymérisation de l’actine au bout pointu (Carlier et al. 1997).

 Les protéines de coiffe interagissent avec les extrémités barbées et y inhibent l’élongation (Isenberg et al. 1980; Wear et al. 2003).

ii. Les réseaux d’actine linéaire

Il existe deux types de filaments d’actine dans la cellule. Les filaments linéaires sont impliqués dans des structures telles que les fibres de stress, les filopodes et l’anneau de cytocinèse (Goode & Eck 2007). La nucléation de ce type de filaments est induite par les formines. Elles sont caractérisées par les domaines FH1 et FH2 (« Formin Homology 1 & 2) qui permettent l’interaction avec les monomères d’actine-G, induisent la polymérisation d’actine et empêchent l’action des protéines de coiffe. Plus récemment, il a été décrit que les formines accélèrent la vitesse de polymérisation (Romero et al. 2004). Substrats des myosines, qui exercent des forces de contraction, les réseaux d’actine linéaires sont généralement associés à des forces de traction (Chesarone-Cataldo et al. 2011). La migration cellulaire dépendant principalement de forces exercées contre la membrane, les réseaux linéaires d’actine ne sont pas le type de réseau d’actine majoritairement impliqué dans le processus de migration cellulaire.

iii. Les réseaux d’actine branchée

Le second type de filaments d’actine dans les cellules est les réseaux d’actine branchée. Ils sont responsables de la force de poussée contre la membrane nécessaire pour induire une protrusion membranaire. Ils ont été imagés, pour la première fois, en 1999 par microscopie électronique au niveau du lamellipode (Svitkina & Borisy 1999).

Figure 18 : Les réseaux d’actine branchés au lamellipode

Microscopie électronique d’un lamellipode de kératocytes de Xénope selon une vue d’ensemble du lamellipode (a), ou en régions agrandies où les filaments branchés sont colorés (b, c, d, e, f, g). Issue de (Svitkina & Borisy 1999).

-

I

-

34 L’actine branchée a, depuis, été impliquée dans de nombreux autres processus cellulaires : au niveau du réticulum endoplasmique et du golgi (Campellone et al. 2008), autour des puits recouverts de clathrine pour la formation des endosomes (Duleh & Welch 2010), aux contacts focaux (Yamazaki et al. 2006) et aux jonctions cellules-cellules (Serrels et al. 2007). Pour générer un réseau très dense d’actine branché capable de produire une force suffisante pour étendre un lamellipode, un ensemble de phénomènes doivent être coordonnés (Disanza et al. 2005). L’élongation de nouveaux filaments d’actine à partir de filaments préexistants forment une branche. Les extrémités barbées du nouveau filament pointent vers la membrane plasmique alors que les extrémités pointues sont coiffées et limitent la dépolymérisation à l’arrière du lamellipode. Svitkina and Borisy (Svitkina & Borisy 1999) ont localisé au niveau des branches formées par les filaments, le complexe Arp2/3, déjà connu pour nucléer l’actine (Welch et al. 1997). Le complexe Arp2/3 est donc le régulateur majeur de la formation de réseaux d’actine branchée et donc de la migration.

Figure 19 : La formation d’un lamellipode

Sous le contrôle de Rac et de WAVE, le complexe Arp2/3 permet de nucléer des filaments branchés d’actine qui poussent la membrane vers l’avant. Les protéines de coiffe contrôlent la durée de vie des filaments en bloquant les extrémités barbées à l’arrière et favorisent l’élongation des filaments non-coiffés à l’avant du lamellipode. La cofiline favorise la dissociation des filaments âgés associés à l’ADP au niveau des extrémités pointues et coupe les filaments préexistants pour générer de nouvelles extrémités barbées. Enfin la profiline interagit avec les monomères d’actine liée à l’ATP et oriente la polymérisation d’actine vers les bouts barbées libres. L’activation du complexe Arp2/3 par Rac et WAVE sera discutée plus longuement dans le chapitre suivant. Schéma inspiré de (Disanza et al. 2005).

-

I

-

35 3) Le complexe Arp2/3

Le complexe Arp2/3 est traité sous forme d’une revue, publiée dans le journal Physiological reviews. Elle aborde les fonctions et régulations normales du complexe Arp2/3 et ses dérégulations dans les cancers.

-

I

-

-

I

-

-

I

-

-

I

-

-

I

-

-

I

-

-

I

-

-

I

-

-

I

-

-

I

-

-

I

-

-

I

-

-

I

-

-

I

-

-

I

-

-

I

-

-

I

-

-

I

-

-

I

-

-

I

-

-

I

-

-

I

-

-

I

-

-

I

-