Une voie de signalisation complète, différente entre cellules normales et cancéreuses
Pour confirmer le contrôle sur la progression du cycle cellulaire qu’exerce la voie de signalisation de l’actine branchée, nous avons traité de nombreux types cellulaires avec CK-666, l’inhibiteur du complexe Arp2/3. Toutes les cellules non transformées que nous avons testées arrêtent de proliférer en réponse à l’inhibition des réseaux d’actine branchée. Plus particulièrement, des cellules primaires épithéliales du sein sont encore plus sensibles à la présence d’actine branchée que des cellules immortalisées telles que les MCF10A. Ce résultat suggère que la voie de l’actine branchée corticale est d’autant plus indispensable que les cellules sont normales. A l’inverse, toutes les cellules transformées que nous avons traitées se sont révélées être résistantes à l’inhibition du complexe Arp2/3 et sont capables d’entrer en phase S sans réseaux d’actine branchée. Nous pouvons ainsi constater que la sensibilité des cellules à l’inhibition des réseaux d’actine branchée est dépendante de leur degré de transformation. Les cellules primaires sont très sensibles, les cellules immortalisées un peu moins et les cellules cancéreuses sont résistantes. Nous pouvons ainsi en déduire que le contrôle exercé par la voie de signalisation de l’actine branchée corticale est perdu dans les cellules transformées.
Pour comprendre comment les cellules transformées deviennent résistantes à l’inhibition des réseaux d’actine branchée, nous avons étudié la signalisation de la voie en aval de Coro1B. Nous avons montré, par cytométrie en flux, que les cellules normales sont bloquées en phase G1 du cycle cellulaire lorsque les réseaux d’actine branchée sont inhibés. C’est logique, puisque c’est en phase G1 que les réseaux d’actine branchée exercent leur contrôle sur la prolifération et la migration. La transition de la phase G1 vers la phase S est médiée par différentes protéines (cf. introduction). Nous avons montré que les cellules déplétées des gènes suppresseurs de tumeurs RB1 ou p21 sont capables d’entrer en phase S alors même que le complexe Arp2/3 est inhibé. De plus, l’inhibition d’ARP2/3 induit la stabilisation de p21 et l’hypophosphorylation de Rb. Nous avons également montré que la déplétion de Coro1B stabilise p21. p21 et Rb sont donc des effecteurs des réseaux d’actine branchée qui signalent à la cellule de progresser dans le cycle cellulaire.
-D
ISCUSSION-
107 Pour compléter la voie de signalisation et comprendre comment Coro1B transmet le signal de prolifération à p21, nous avons interrogé les bases de données de voies de signalisation et identifié WISp39 comme une protéine unique faisant le lien entre Coro1B et p21 (Jascur et al. 2005; Howell et al. 2015). La déplétion de WISp39 rend le cycle cellulaire des cellules MCF10A insensible à CK666, comme l'inactivation de p21 et Rb. Nous avons donc découvert la voie de signalisation complète entre Rac et p21, puisque tous les intermédiaires identifiés font des interactions directes entre eux.
Figure 23 : La voie de signalisation de l’actine branchée corticale, complètement disséquée, régule la progression dans le cycle cellulaire
Bien que la voie de signalisation de l’actine branchée corticale, que nous avons disséquée, apparaisse linéaire, nous n’ambitionnons pas qu’elle soit complète. Nous pensons que d’autres protéines complexifient la voie et ajoutent un niveau de régulation supérieur. Par exemple, la déplétion de Cortactine diminue de moitié la progression en phase S. Son effet n’est pas similaire à celui de Coro1B, mais il peut être indirect. En stabilisant les branches induites par le complexe Arp2/3, Cortactine accentue la liaison entre Coro1B et le complexe Arp2/3 constitué d’ARPC1B et donc augmente le signal de prolifération. Bien que p21 et Rb transmettent le signal de prolifération, ce ne sont probablement pas les seules protéines à intervenir en aval des réseaux d’actine branchée. Il est rapporté que des fibroblastes de souris déplétés du complexe Arp2/3 sont capables de progresser dans le cycle cellulaire lorsque le gène suppresseur de tumeur Arf est inactivé (Wu et al. 2012). De même, l’inactivation de p53 rend des fibroblastes de rats insensibles à la Cytochalasine D, un inhibiteur de la polymérisation d’actine (Rubtsova et al. 1998). Nous avons ainsi cherché à savoir si d’autres protéines peuvent lever l’inhibition de la prolifération due à l’inhibition des réseaux d’actine branchée. Nous avons pour cela réalisé un screen genome-wide pour identifier les gènes qui rendent les cellules MCF10A insensibles à l’inhibition d’Arp2/3. Plus de 50 protéines sont sorties positives du screen dont certaines ont des rôles inconnus mais présentent toutes les caractéristiques pour intervenir dans la voie de signalisation de l’active branchée corticale. Un projet est déjà en cours pour étudier l’implication, dans la voie de signalisation, de l’un de ces gènes, qui semble se comporter comme un gène suppresseur de tumeur.
-D
ISCUSSION-
108 Un checkpoint responsable de la transformation cellulaire
Chez la levure, un checkpoint morphogénétique retarde la progression dans le cycle cellulaire lorsque la polarité de la cellule est perturbée (Lew & Reed 1995). Des changements environnementaux tels qu’une augmentation de la température ou de l’osmolarité entrainent une perturbation dans le cytosquelette d’actine et l’activation de ce checkpoint (Chowdhury & Gustin 1992). La perturbation de l’actine est monitorée par ce checkpoint (McMillan et al. 1998) et induit un arrêt de la progression du cycle cellulaire (McMillan et al. 1999), empêchant la prolifération anarchique des levures. Un tel checkpoint impliquant le cytosquelette d’actine n’est pas connu dans les cellules de mammifères...
Dans la littérature, il n’y a pas de définition exacte d’un checkpoint du cycle cellulaire ni des critères qu’il doit remplir. Par analogie avec le checkpoint du fuseau mitotique (Musacchio 2011), nous pensons que la voie de signalisation de l’actine branchée peut être considérée comme un checkpoint. Ils détectent tous les deux que l’organisation du cytosquelette est satisfaisante. En mitose, la ségrégation des chromosomes via les microtubules est vérifiée. En phase G1, la génération de réseaux d’actine branchée au cortex de la cellule est sentie. Ils induisent tous les deux un arrêt du cycle dans les cellules normales, si le cytosquelette n’est pas correctement assemblé. Les cellules sont bloquées en métaphase si un chromosome n’est pas aligné correctement sur la plaque métaphasique ou en phase G1, si les stimuli environnementaux n’induisent pas la génération d’actine branchée au lamellipode ou au cortex. Enfin, ils sont tous les deux perdus dans les cellules cancéreuses. Le checkpoint du fuseau mitotique est outrepassé dans les cellules cancéreuses qui progressent en mitose avec des défauts de distribution des chromosomes menant, par exemple, à des cellules aneuploïdes. Les cellules cancéreuses outrepassent également le checkpoint de l’actine branchée corticale, rentrant en phase S sans la régulation des stimuli extérieurs. Nous pouvons ainsi considérer la voie de signalisation de l’actine branchée corticale comme un checkpoint du cycle cellulaire, nécessaire aux cellules normales et perdu dans les cellules cancéreuses.
Contre-intuitivement, les cellules tumorales ne prolifèrent pas plus rapidement que les cellules normales (Buehring et al. 1976). De même, la migration des cellules cancéreuses n’est pas plus efficace que celle des cellules non transformées (Maiuri et al. 2012). En réalité prolifération et migration des cellules transformées sont dérégulées. Notre hypothèse est que le checkpoint de l’actine branchée qui régule à la fois migration et prolifération est impliqué dans la transformation cellulaire. Les caractéristiques de la transformation cellulaire ont été décrites par Hanahan et Weinberg. La plupart des cellules cancéreuses partagent les capacités suivantes : l’autosuffisance envers les signaux de prolifération, l’insensibilité à l’inhibition de la prolifération dépendante de la densité cellulaire, l’invasion tissulaire et métastatique, l’acquisition d’un potentiel de réplication illimité, l’induction d’angiogenèse, et la résistance à la mort cellulaire programmée.
-D
ISCUSSION-
109 Figure 24 : Implication du checkpoint de l’actine branchée corticale dans les principales propriétés des cellules cancéreuses (Modifié d’après (Hanahan & Weinberg 2000)).
Une dérégulation de la voie de signalisation de l’actine branchée pourrait ainsi être responsable des trois premières propriétés des cellules cancéreuses citées ci-dessus. En effet, le checkpoint de l’actine branchée intègre les signaux des facteurs de croissance avec la mécanotransduction induite par les adhérences de la cellule. Une altération dans cette voie de signalisation est donc susceptible d’induire la perte d’inhibition de la prolifération par contact et l’insensibilité aux facteurs de croissance. De plus, l’actine branchée est déterminante dans l’induction de la migration et de l’invasion cellulaire. En effet, dans les cellules tumorales, le complexe Arp2/3 est détourné et contribue à la formation de structures d’invasions telles que les invadopodes (Nürnberg et al. 2011; Monteiro et al. 2013; Yamaguchi et al. 2005). Ainsi une dérégulation du checkpoint de l’actine branchée corticale est totalement à même d’induire la transformation cellulaire.
Les cellules MCF10A-DCIS.com dérivent des cellules immortalisées MCF10A mais forment des tumeurs lorsqu’elles sont implantées dans les souris (Miller et al. 2000; Hu et al. 2008). Ces cellules progressent dans le cycle cellulaire lorsque les concentrations en facteurs de croissance ou les adhérences cellulaires ne sont pas optimales. L’activation de la voie de signalisation de l’actine branchée corticale (via Rac activé ou l’inhibition d’Arpin) entraine des réponses aux stimuli environnementaux similaires à celles de cellules transformées MCF10A-DCIS.com. Nous nous attendons donc à retrouver la voie de signalisation du checkpoint de l’actine branchée corticale activée dans les cancers.
-D
ISCUSSION-
110 Le checkpoint de l’actine branchée : un outil diagnostique et thérapeutique
L’étude de l’expression des composants de la voie de signalisation du checkpoint de l’actine branchée corticale suggère qu’elle est très fréquemment altérée dans les cancers. Au laboratoire, nous avons déjà montré que 7% des patientes atteintes d’un cancer du sein ont une sous-expression de l’inhibiteur Arpin qui est corrélée à une faible survie et 40% ont une sur-expression de l’activateur du complexe Arp2/3 NCKAP1, une sous-unité du complexe WAVE, qui est également corrélée à un mauvais pronostic (Lomakina et al. 2016) (en annexe). Dans notre étude, nous avons montré que la grande majorité des sous-unités du complexe Arp2/3 est sur-exprimé dans la même cohorte de 438 patientes et que ces sur-expressions sont associées à un mauvais pronostic pour les patientes. Plus particulièrement, ARPC1B, responsable de la localisation spécifique des réseaux d’actine branchée au cortex, est sur-exprimé chez plus de 30% des patientes, et est un facteur de très mauvais pronostic. Les autres composants de la voie de signalisation de l’actine branchée ont déjà été décrits dans la littérature pour être dérégulés dans les cancers. Rb et p21 sont des gènes suppresseurs de tumeurs et sont donc par définition altérés dans les cancers par une perte de fonction. WISp39, qui transmet le signal entre Coro1B et p21, est également sur-exprimé dans le cancer du sein (Nelson et al. 2015) et comme attendu sa sur-expression est cette fois un marqueur de bon pronostic puisqu’il est décrit pour stabiliser p21 et donc induire l’arrêt du cycle cellulaire. Enfin en amont de la voie de signalisation, la GTPase Rac1 est un oncogène fréquemment activé par des mutations dans le mélanome (jusqu’à 10 % des cas ; Hodis et al. 2012) et l'expression d'une forme oncogénique de Rac1 suffit à transformer les cellules MCF10A (Kawazu et al. 2013). Ainsi nous pouvons constater que toutes les dérégulations de la voie de signalisation de l’actine branchée corticale sont dans le sens d’une activation de la voie. Les inducteurs tels que Rac, WAVE, Arp2/3 notamment l’isoforme ARPC1B, et Coro1B sont surexprimés alors que les inhibiteurs tels qu’Arpin et les gènes suppresseurs de tumeurs sont sous-exprimés. Cette activation de la voie au niveau de ses différents composants permet aux cellules tumorales d’outrepasser le checkpoint de l’actine branchée et, par la suite, de former des métastases en se disséminant dans l’organisme. La voie du checkpoint de l’actine branchée peut donc être utilisée comme un outil de diagnostic et de pronostic très important. Il serait intéressant de poursuivre l’étude de l’expression des gènes du checkpoint de l’actine branchée corticale de façon systématique chez les mêmes patients. On pourrait ainsi définir le pourcentage de patients qui ont la voie de signalisation activée sur ses différents effecteurs et ainsi établir une signature de la dérégulation du checkpoint de l’actine branchée corticale.
-D
ISCUSSION-
111 Puisque le checkpoint de l’actine branchée corticale peut être responsable de la transformation cellulaire, nous nous sommes demandé s’il n’était pas possible d’inhiber la voie de signalisation, dans les cancers, pour bloquer la prolifération des cellules. Nous nous sommes ainsi intéressés au potentiel thérapeutique de cette voie de signalisation. Les cellules cancéreuses activent de différentes façons la voie et passent ainsi outre le checkpoint. Inhiber la voie de signalisation dans celles qui ont perdu les gènes suppresseurs de tumeurs n’aurait aucun effet, puisque leur progression dans le cycle n’est plus régulée. En effet, les cellules cancéreuses que nous avons testées sont toutes résistantes à l’inhibition des réseaux d’actine branchée. En revanche, les cellules qui activent la voie de signalisation en amont du complexe Arp2/3 sont de bonnes candidates pour inhiber la voie de signalisation. Bloquer la formation de réseaux d’actine branchée permettrait d’inhiber leur prolifération et leur migration anarchiques. Un moyen efficace est d’utiliser l’inhibiteur du complexe Arp2/3, CK666, pour bloquer la polymérisation d’actine dans les cellules. Nous avons cherché des cellules dont la voie de signalisation est activée. Nous avons récupéré des lignées de carcinomes mammaires et de fibrosarcomes qui expriment toutes de manière endogène une forme oncogénique de Rac1 (Kawazu et al. 2013). Toutes ces lignées transformées n'entrent plus en phase S en réponse à l'inhibiteur d'Arp2/3, alors que les autres lignées transformées y sont insensibles. De même les cellules transformées par Rac1 ne forment plus de foyers de transformation, lorsqu’elles sont traitées par CK-666 pendant plusieurs jours, alors que les autres cellules cancéreuses continuent de proliférer. Nos résultats suggèrent donc que l’inhibition du complexe Arp2/3 pourrait être utilisée en tant que thérapie ciblée contre les tumeurs dont la voie de signalisation de l’actine branchée est activée au niveau du complexe Arp2/3 ou en amont. En effet, si le checkpoint est dérégulé en aval du complexe Arp2/3, bloquer son activation n’aurait pas d’effet spécifique sur la voie de signalisation.
Il serait intéressant de valider le rôle thérapeutique de l’inhibition d’Arp2/3 sur des xénogreffes de lignées cellulaires génétiquement modifiées, de telle sorte que la voie de signalisation de l’actine branchée soit activée (expression de la forme oncogénique de Rac1 ou sur-expression des complexes WAVE et Arp2/3 ou sous-expression d’Arpin). Grâce à des xénogreffes dérivées de patients, il serait également instructif de comparer des cellules de mélanomes avec RAC1 muté et des carcinomes mammaires présentant la signature de dérégulation d'Arp2/3 à des tumeurs contrôles, dans un protocole de traitement à base de l'inhibiteur d'Arp2/3. Notre espoir est de contrôler la progression tumorale et la formation des métastases chez les patientes en utilisant la signature du checkpoint de l’actine branchée corticale comme biomarqueur de réponse à l’inhibition du complexe Arp2/3.
Etudier le potentiel thérapeutique de l’inhibition des réseaux d’actine branchée dans le mélanome est également une perspective intéressante. Les mélanomes sont des cancers de mauvais pronostics. Ils sont souvent dus à des mutations de la kinase BRAF ou de son activateur NRAS (Vogelstein et al. 2013). Les cancers mutés pour BRAF sont traités par le vemurafenib, une thérapie ciblée contre BRAF, avec une bonne efficacité. Toutefois, les métastases se reforment en moins d’un
-D
ISCUSSION-
112 an, à cause de mutations conférant des résistances secondaires. Un des mécanismes de résistance implique l’activation de Rac (Van Allen et al. 2014; Watson et al. 2014). En outre, il n’existe pas de thérapie ciblée pour les patients ayant une mutation de NRAS. Les cellules mélanocytaires transformées par NRAS ont besoin de Rac pour proliférer et métastaser (Li et al. 2011). Comme NRAS, Rac n’est pas propice à être une bonne cible thérapeutique, puisqu’un inhibiteur bloquerait son activité catalytique et la maintiendrait dans son état actif, lié au GTP. Nous pensons que la voie de signalisation dépendante d’Arp2/3 est requise pour la formation de mélanomes. Rac y est, en effet, souvent muté et le complexe Arp2/3 est surexprimé dans les mélanomes malins mais pas dans les nævi bénins (Kashani-Sabet et al. 2009). Le rôle du complexe Arp2/3 dans les mélanomes et le potentiel thérapeutique de son inhibition mériteraient d’être étudiés dans de futurs projets.
Notre étude établit, pour la première fois, le rôle critique de l'actine branchée corticale dans la progression dans le cycle cellulaire, et les mécanismes par lesquelles l'actine branchée transmet ce signal. La voie de signalisation, que nous avons disséquée, permet d’intégrer aux lamellipodes les signaux extracellulaires solubles et mécaniques. Lorsque les conditions sont optimales, la cellule, sous le contrôle de Rac, va générer de nouveaux réseaux d’actine branchée au cortex de la cellule qui vont être reconnus spécifiquement par Coro1B qui va alors engager la progression en phase G1 via les régulateurs du cycle cellulaire p21 et Rb. De manière concomitante, dans les cellules qui doivent migrer, la génération d’actine branchée au cortex va induire la formation de lamellipodes. Cette voie de signalisation joue ainsi le rôle de checkpoint du cycle cellulaire en phase G1. Les cellules tumorales outrepassent ce checkpoint au cours du processus de transformation, que ce soit par l’activation de Rac ou par la dérégulation de l’expression des autres composants de la voie de signalisation. Enfin, nos résultats montrent qu’il serait judicieux d’utiliser la découverte de la voie de signalisation du checkpoint de l’actine branchée corticale comme outil diagnostic, pronostic et thérapeutique.
-D
ISCUSSION-
-R
EFERENCES-
-R
EFERENCES-
116 Abella, J.V.G. et al., 2015. Isoform diversity in the Arp2/3 complex determines actin filament
dynamics. Nature Cell Biology.
ABERCROMBIE, M. & HEAYSMAN, J.E., 1954. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. II. Monolayering of fibroblasts. Experimental cell research, 6(2), pp.293–306. Abercrombie, M., Heaysman, J.E. & Pegrum, S.M., 1970. The locomotion of fibroblasts in culture.
3. Movements of particles on the dorsal surface of the leading lamella. Experimental cell
research, 62(2), pp.389–98.
Van Allen, E.M. et al., 2014. The genetic landscape of clinical resistance to RAF inhibition in metastatic melanoma. Cancer Discovery, 4(1), pp.94–109.
Bell, P.B., 1977. L O C O M O T O R Y B E H A V I O R , CONTACT INHIBITION , A N D PATTERN F O R M A T I O N OF 3T3 A N D P O L Y O M A V I R U S - T R A N S F O R M E D 3T3 CELLS IN CULTURE Time-Lapse Cinemicrography Culture Chambers Used for Filming. , 74(6), pp.963–982.
Benham-Pyle, B.W., Pruitt, B.L. & Nelson, W.J., 2015. Mechanical strain induces E-cadherin-dependent Yap1 and -catenin activation to drive cell cycle entry. Science.
Besson, A., Dowdy, S.F. & Roberts, J.M., 2008. CDK Inhibitors: Cell Cycle Regulators and Beyond. Developmental Cell, 14(2), pp.159–169.
Blow, J.J. & Dutta, A., 2005. Preventing re-replication of chromosomal DNA. Nature Reviews
Molecular Cell Biology, 6(6), pp.476–486.
Bovellan, M. et al., 2014. Cellular control of cortical actin nucleation. Current Biology, 24(14), pp.1628–1635.
Bray, D. & White, J.G., 1988. Cortical flow in animal cells. Science (New York, N.Y.), 239(4842), pp.883–8.
Buehring, G.C., Williams, R.R. & Buehrlng, G.C., 1976. Growth Rates of Normal and Abnormal Human Mammary Epithelia in Cell Culture Growth Rates of Normal and Abnormal Human Mammary Epithelia in Cell Culture1. , 36(October), pp.3742–3747.
Bugyi, B. & Carlier, M.-F., 2010. Control of Actin Filament Treadmilling in Cell Motility. Annual
Review of Biophysics, 39(1), pp.449–470.
C. M. Lo, H. B. Wang, M. Dembo, and Y.L.W., 2000. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate, vol. 79, no. 1, pp. 144–152, 2000. Biophysical Journal, 79(1), pp.144–152. Cai, L. et al., 2007. Coronin 1B Coordinates Arp2/3 Complex and Cofilin Activities at the Leading
Edge. Cell.
Campellone, K.G. et al., 2008. WHAMM Is an Arp2/3 Complex Activator That Binds Microtubules and Functions in ER to Golgi Transport. Cell, 134(1), pp.148–161.
Carlier, A.M. et al., 1997. Factor ( ADF / Cofilin ) Enhances the Rate of Actin Depolymerizing Filament Turnover : Motility Implication in Actin-based. The Journal of Cell Biology, 136(6), pp.1307–1322.
-R
EFERENCES-
117 Chang, F. et al., 2006. FAK Potentiates Rac1 Activation and Localization to Matrix Adhesion Sites:
A Role for betaPIX. Molecular Biology of the Cell, 18(1), pp.253–264.
Chellappan, S.P. et al., 1991. The E2F transcription factor is a cellular target for the RB protein.