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- indicano inequivocabilmente la malignità di un tumore
- sono la principale causa di morbilità e mortalità nei pazienti con tumore maligno
breast cancer deadly metastasis www.slidetube.it
Dall’Invasione alla Metastasi: processo multistep
STEP EVENTO
1. Perdita delle adesioni omotipiche tra le cellule del tumore primitivo
2. Invasione della ECM
3. Angiogenesi
4. Intravasazione
5. Extravasazione
6. Impianto nella nuova sede
Schematizzazione del processo metastatico
• Inefficienza del processo metastatico: ogni step può essere limitante
• Ogni step può d’altra parte rappresentare un bersaglio terapeutico
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Step 1
Perdita delle adesioni omotipiche tra le cellule del tumore primitivo
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Molecole di adesione
cell.-cell. e cellula-matrice4 famiglie:
1. Caderine(Ca2+ dip) 2. Integrine (Ca2+ dip) 3. Ig–like (Ca2+ INDIP.) 4. Selectine
Le caderine e le integrine collegano la superficie cellulare al citoscheletro
(attraverso filamenti intermedi e actina) trasmissione della forza meccanica
attivazione di pathway MAPK, PKC e IP3
Vi è una sovrapposizione funzionale tra integrine e GF nel ricevere i segnali ambientali che regolano proliferazione, apoptosi, motilità e differenziamento
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Caderine
Interazioni omotipiche Calcio dipendenti
Glicoproteine transmembrana di tipo monomerico
1- dominio extracellulare:
•sito di legame omotipico
•diversi siti di legame per il Ca2+
2-dominio intracellulare:Lega le catenine
TIPO TESSUTI STRUTTURA INTRAC. BP FILAMENTI
CITOPLASM
E-caderina P-caderina
Cellule epiteliali
Giunzioni aderenti
Catenine, Alfa actinina
Actina
Caderina desmosomiale
Epidermide e placenta
desmosomi Desmoplachinepak oglobina
Keratina;
desmina N-caderina Nervo,
muscolo, lente
Giunzioni aderenti
Catenine, alfa actinina, vinculina
actina
Zonula adherens
Desmosoma
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L’associazione delle caderine al citoscheletro avviene attraverso le
catenine
:Es: caderina - - beta catenina - - alfa catenina - - actina Le associazioni celula-cellula mediate da caderine e catenine sono fondamentali per:
- regolazione della motilità - proliferazione
- differenziamento
- inibizione da contatto
Ruolo della beta catenina nel pathway Wnt
Il 20% dei tumori del colon è dovuto a mutazioni della beta catenina che la rendono priva dell’aggancio per il complesso di distruzione
(dominante)
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Integrine
Cell to Cell AND Cell to Matrix Binding Calcium dependent adhesion molecules Proteine eterodimeriche di membrana con 2 subunità legate in modo NON covalente
Il nome “integrine” deriva dalla ipotesi che questa famiglia “integri” i segnali trasmessi dai ligandi extracellulari con :
-la mobilità citoscheletro-dip.
-cambiamenti di forma -risposte fagocitarie
…
…
• VLA o CD49a-hCD29 Mediano l’attacco ala ECM
(eccezione VLA4, che lega VCAM-1)
• LFA-1 o CD11a-cCD18
Mediano l’adesione dei leucociti (CR3 e CR4 mediano
l’extravasazione dei leucociti; inoltre CR3 lega C3b e il fibrinogeno)
• altre sottofamiglie: legano la ECM e le proteine della coagulazione
Le integrine formano EMIDESMOSOMI
alfa-actinina, talina, vinculina
Collegamento tra segnali di adesione e espressione genica
Stresses absorbed by the cytoskeleton activate key intracellular signaling molecules physically residing on cytoskeletal components.
mechanical forces are
transmitted from the ECM via integrins appropriate ligands
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Esempi di
alterazioni
delle adesioni in cellule di tumore maligno2. Alterazioni integrine
Le cellule tumorali possono anche produrre integrine non fisiologiche
Es: l’integrina β3, a seguito di splicing alternativo, può agire come anti-integrina e facilitare la migrazione cellulare, e quindi le metastasi
1. Alterazioni Caderine : c’è una relazione quasi costante tra riduzione dell’espressione di caderine e malignità cellulare!
• Diminuzione dell’espressione di E-caderina
• Mutazioni della E-caderina (+ raro. Studio su famiglia di Neozelandesi…)
• Catenine non funzionali
Effetti delle alterazioni: atipie, capacità invasiva e metastatica, segnali di differenziazione-trasformazione
Distacco della cellula dal tumore primitivo e invasione dei tessuti circostanti!
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Le chemochine sono una famiglia di
citochine proinfiammatorie a basso peso molecolare, che legano G-proteins
coupled receptors con 7 eliche trans- membrana.
La loro funzione primaria è la chemoattrazione e l’attivazione di specifici leucociti in varie risposte infiammatorie, ma si è scoperto che esse sono coinvolte in tutte le fasi dello sviluppo tumorale (incluse invasione, angiogenesi e extravasazione in siti
specifici)
Ciascun recettore per le chemochine può legarne più di un tipo, ma solo dello stesso gruppo. Perciò, vi sono 4 classi di recettori (CR, CXCR…)
ALTRE MOLECOLE IMPLICATE NEL PROCESSO METASTATICO:
Le chemochine
3Decoy-receptors:
-DARC (lega ERL+ (glutammato-leucina-arg.) -D6
-CCX-CKR
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Step 2
Invasione della ECM
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BM = membr. basale
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Degradazione enzimatica della ECM
Le cellule tumorali producono esse stesse o inducono i macrofagi infiltranti e i fibroblasti a produrre proteasi
3 classi di
proteasi
:1. Proteasi a Serina: uPA o urochinasi 2. Proteasi a Cisteina
3. Collagenasi: MMPs
La produzione di MMPs e di altre proteasi è guidata anche da
chemochine (es. CXCL8 induce l’espressione del gene per MMP2) le chemochine hanno un ruolo anche nella invasione della ECM
Man mano che la ECM viene degradata, essa (formata da collagene, glicoproteine e proteoglicani)
espone domini proteici cripticie invia segnali di crescita positivi e negativi alle cellule tumorali, che regolano - angiogenesi (VEGF),
- crescita tumorale (FGF2 e TGFbeta) - chemotassi.
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FUNZIONI (NUMEROSE) DELLE MMPs
The matrix metalloproteinases (MMPs) form a family of multidomain zinc endopeptidases.
MMPs promote tumour progression not only through ECM degradation, as originally thought, but also
through signalling functions:
MMPs
•counter apoptosis
•orchestrate angiogenesis
•regulate innate immunity
•promote metastasis and tumour growth.
As a result, stromal and immune-defence responses eventually fail, resulting in immune-cell evasion, phenotypic evolution of metastases, chemotherapeutic resistance and further tumour dissemination.
TIMPs The main physiological inhibitors of the MMPs are the tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs), which form tight 1:1 complexes
with their cognate MMP catalytic domains, but do not considerably distinguish between the different MMPs,
except for the weak activity of TIMP-1 for the MT-MMPs.
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Through disruption of cell–cell contacts, MMPs also initiate epithelial–mesenchymal transition and genomic instability!
MMP3 cliva il dominio extracell di E-caderina, promuovendo la EMT!
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Transizione epitelio- mesenchimale = EMT
The E-cadherin cell junctions disintegrate, and the cells change from a relatively cuboidal shape to a flattened elongate shaped configuration.
Leading edge protrusions adhere to the surrounding ECM and the actin-myosin cytoskeletal complex contracts to pull the cell ahead.
Le EMT è una fonte di CAFs (fibroblasti tumore-associati)
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Figure 12: Schematic illustration of interactions in the
lamellipodium. Lamellipodia are formed by the generation of an actin meshwork through the initiation of actin polymerisation by the
addition of actin monomers (red dots) at the cell membrane. Protein complexes recruited to the membrane control the polymerisation process in response to signaling stimuli. Other actin-binding proteins serve to cross-link the actin network. Turnover of the lamellipodium components occurs through the depolymerisation of most of the actin filaments towards the base of the lamellipodium by destabilising and severing factors (scissors).
Motilità della cellula tumorale in vitro
Figures 11A-E: Some members of the tip complex in lamellipodia and filopodia.
Figure 17: Adhesion dynamics at the rapidly migrating front of a B16 mouse melanoma cell moving on laminin
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La motilità della cellula tumorale in vivo è diversa da quella in vitro
!In vivo le cellule tumorali si muovono ad alte velocità (15micrometri/minuto) e possono cambiare rapidamente forma e direzione.
Focal adhesions characteristic of cell–matrix interactions are not usually seen in vivo, because they take many minutes to form
In base ai dati attuali, vi sono tre distinte modalità di migrazione in vivo:
Modalità allungata (tipica dele cellule mesenchimali)
Modalità con lamellipodi (tipica dei leucociti)
Modalità collettiva (usata durante la morfogenesi epiteliale)
Alcune cellule tumorali possono compiere uno switch tra le diverse modalità.
Es: colon carcinoma cells with an elongated mesenchymal phenotype can be converted to amoeboid motility by knockdown of SMurF1, an e3 ubiquitin ligase that targets rHOA for degradation.
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Microambiente prometastatico
Non tutte le cellule di un tumore maligno sono mobili, e le cellule mobili non sono
uniformemente distribuite.
(ETEROGENEITA’ DELLA POPOLAZIONE TUMORALE)
In modelli animali di metastasi, metodiche di in vivo imaging hanno mostrato l’associazione tra la presenza di macrofagi (richiamati da prodotti delle cellule tumorali) e la presenza di cellule invasive
I macrofagi possono promuovere il comportamento invasivo producendo EpidermalGF
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Si è dimostrato che il macchinario di polimerizzazione dell’actina è più attivo nelle cellule tumorali mobili rispetto a quelle non mobili.
2 meccanismi, provocano iperespressione del suddetto macchinario:
1. Aumentata attività del complesso ArP2/3 (per attivaz. Di EGFR) 2. Aumentata attività della cofilina
Experimental interference with either
ArP2/3 or cofilin function can reduce tumour metastasis in mouse models of melanoma and breast cancer
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Once actin has polymerized, the phosphorylation of myosin light chain (MLC) promotes interactions
between myosin and F-actin that generate contractile force.
Receptors, such as epidermal growth factor receptor (EGFR), capable of sensing chemotactic gradients, are shown in yellow.
Activation of these receptors can promote ARP2/3- and cofilin- dependent actin polymerization, Many kinasescan phosphorylate MLC; however, in the context of amoeboid cell
motility, regulation by ROCK (Rho-associated coiled coil containing kinase) is particularly important.
ROCK can either:
•directly phosphorylate MLC or
•phosphorylate and inhibit the phosphatase of MLC (MYPT)
ROCK-dependent contraction of the cell cortex also enables the cell to squeeze between collagen fibres and will generate hydrostatic pressure within the cell that may aid cell protrusion. Cell-matrix adhesion molecules are diffusely localized around the cell.
Contraction of cortical acto–myosin can also generate points of constriction in the cell body that enable cells to squeeze between and around collagen fibres.
Squeezing
between collagen fibres abrogates the requirement to cleave the fibres .The relationship between matrix proteolysis and cell motility is more complex than was initially thought!
Questo spiegherebbe perché i farmaci inibitori delle MMPs non hanno un effetto determinante nel contrastare la metastatizzazione
In vivo i complessi actomiosinici sono “corticali”
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Step 3
Angiogenesi
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1. Angiogenesi vs vasculogenesi
Riparazione delle ferite, ciclo
mestruale Sviluppo embrionale
L’angiogenesi che si verifica nel tumore non è fisiologica
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Nuovo modello di angiogenesi: 2 possibilità
Molecole coinvolte
nella formazione dei vasi:
-VEGF -VEGFR-2
-FGF-2 (ruolo ausiliario) Molecole coinvolte nella stabilizzazione
-angiopoietine (Ang1 e Ang2) -PDGF (reclutam. cellule muscolari lisce)
-TGF beta (deposiz. proteine ECM)
Ang1+Tie2 - reclutamento cellule periendoteliali - maturazione vasi
- quiescenza cellule endoteliali
Ang2+Tie2 sensibilizzazione cellule endoteliali al VEGF
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Figure 1. HIF-1 promotes the survival of HCs, hematopoietic cells, which supply VRGF.
HIF-1 (hypoxia inducible factor-1) is a key transcriptional regulator for hypoxic regulation of
embryonic vascular development.
HIF-1 is an oxygen-sensitive, dimeric complex composed of HIF-1 alpha and HIF-1 beta/ARNT (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator)
subunits.
• During conditions of normoxia, HIF-1 beta is found in the nucleus, while HIF- 1 alpha is cytoplasmic and rapidly degraded by a ubiquitin-proteosome system.
• In mammalian cells, reduced oxygen levels permit the accumulation of HIF- 1 alpha protein in the cytoplasm.
Subsequently, HIF-1 alpha translocates to the nucleus, engages HIF-1 beta, and forms the HIF-1 complex that initiates VEGF transcription and mRNA stabilization.
Formation of the HIF-1 complex typically occurs during solid tumor formation (increased oxygen
demand) and fetal development (inadequate oxygen deliver)
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Endostatin is a broad spectrum angiogenesis inhibitor and may interfere with the pro-angiogenic action of growth factors such as bFGF/FGF-2 and VEGF
Fattori anti - angiogenetici
Angiostatine
formate a partire dal plasminogeno da MMP2, MMP3, MMP7, MMP9 e MMP12
Endostatina
derivata dal collagene XVIII ad opera di MMP3, MMP9, MMP12, MMP13 and MMP20
Arrestina
Canstatina
Tumastatina
derivata dalla proteolisi dell collagene IV.
Trombospondina
Ad essere determinante è il BILANCIO tra fattori pro-angiogenetici e fattori anti - angiogenetici
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Step 4
Intravasazione
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I GRADIENTI CHEMOTATTICI PARTECIPANO ALL’INDUZIONE DELL’INTRAVASAZIONE
Es. I macrofagi tumore-associati spesso si raggruppano
attorno ai vasi e ai margini del tumore e possono stabilire un gradiente di EGF nell’ambiente che attrae le cellule tumorali nei vasi e così promuove l’intravasazione
(EGFR è sensibile al gradiente chemotattico)
L’intravasazione può essere un processo attivo o passivo
ATTIVO
passivo
VEGF-A enhances spontaneous metastasis by inducing intravasation of heterogeneous tumor cell clusters, surrounded by vessel wall elements, via an invasion independent
mechanism. Oncogene (2007)
micronodular structure of the VEGF-A tumor and the coverage of these nodules by pericytes and endothelial cells
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In vitro analysis
has shown that interstitial flow can establish autocrine gradients that signal through CC chemokine receptor 7 (CCR7) to drive cell movement in the same direction as the interstitial flow. However, it remains unclear
wheather movement directed towards lymphatic vessels depends on interstitial pressure in vivo In situ imaging has unambiguously
demonstrated that
GFP-labelled tumour cells can form part of the lumen of blood vessels.
This behaviour is thought to
be associated with the expression of some genes usually
restricted to endothelial cells by tumour cells.
In these cases entry into the
bloodstream may simply involve the detachment of a tumour cell that is forming part of a vessel wall.
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3 vie di disseminazione:
1. Linfatica 2. Ematica
3. Attraverso le superfici e le cavità
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Una volta in circolo, le cellule tumorali formano aggregati per - Adesione omotipica tra celule tumorali
- Adesione eteropica tra cellule tumorali e piastrine
la formazione di tali aggregati favorisce la sopravvivenza e la capacità di impianto
Infatti: una volta in circolo, le cellule tumorali si fermano rapidamente nei capillari
Arrest can be caused by:
- the large physical size of tumour cells relative to the capillary lumen.
- active adherence to endothelia, even when not restricted by the diameter of the vessel.
Both types of arrest can be associated with and increased by platelet aggregation
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Step 5
Extravasazione
IL TRAFFICKING DELLE CELLULE CANCEROSE NEI VASI RISENTE
DELL’ESPRESSIONE DI SPECIFICHE MOLECOLE DI ADESIONE E DI FATTORI CHEMOTATTICI : pathway di adesione e di distacco
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In some cases metastatic tumour
cells can proliferate within the vessel, and the
increasing mass of cells in the capillary could physically disrupt the endothelium and allow tumour cells to enter the surrounding tissue
Extravasation typically occurs a few hours after attachment
to the vessel wall;
cell protrusions and deformation
of the nucleus has been observed in mammary tumour cells crossing an endothelium, implying that it is an active process
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EXTRAVASAZIONE IN SITI SPECIFICI:
il problema dell’ “homing”
Quali sono i fenomeni che spiegano la specificità?
1. Le cellule endoteliali di un particolare distretto esprimono sulla superficie delle molecole di adesione specifiche che vengono riconosciute dalle cellule
metastatizzanti
2. Organi diversi offrono condizioni più o meno favorevoli per la crescita delle metastasi di un determinato tipo di tumore (Paget’s ‘seed and soil’ hypothesis )
3. Alcuni tessuti esprimono chemochinee altre molecole chemoattrattanti che
“attirano” con un gradiente chemotattico tipi specifici di cellule cancerose
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Bibliografia essenziale
1. Illuminating the metastatic process
Erik SahaiNATURE REVIEWS | CANCER VOLUME 7 | OCTOBER 2007
2. Validating matrix metalloproteinases as drug targets and anti-targets for cancer therapy Christopher M. Overall and Oded KleifeldNATURE REVIEWS | CANCER VOLUME 6 | MARCH 2006 3. Small integrin-binding ligand N-linked glycoproteins (SIBLINGs):
multifunctional proteins in cancerAkeila Bellahcène*, Vincent Castronovo*, Kalu U. E. Ogbureke‡, Larry W. Fisher and Neal S. FedarkoNATURE REVIEWS | CANCER VOLUME 8 | MARCH 2008 |
4. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche Rosandra N. Kaplan1,2,6 et al. NATURE|VOL 438|8 DECEMBER 2005
5. Genes Associated With Breast Cancer Metastatic to Bone
Marcel Smid, JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY VOLUME 24 NUMBER 15 MAY 20 2006
6. Tumour-mediated upregulation of chemoattractants and recruitment of myeloid cells predetermines lung metastasisSachie Hiratsuka1 et al. NATURE CELL BIOLOGY VOLUME 8 | NUMBER 12 | DECEMBER 2006
7. Fibroblasts in cancerRaghu Kalluri*‡ and Michael Zeisberg*NATURE REVIEWS | CANCER VOLUME 6 | MAY 2006 8. Chemochines: key players in cancer; M. Arya et al. CURRENT MEDICAL RESEARCH AND OPINION VOL 19 2003 9. Integrin trafficking and its role in cancer metastasis; Alan G. Ramsay et al. CANCER METASTASIS REVIEW 2007 10. Cellular Mechanobiology and Cancer Metastasis; Milan Makale* BIRTH DEFECTS RESEARCH (2007)
11. TGFb Primes Breast Tumors for Lung Metastasis Seeding through Angiop.-like 4, David Padua,CELL April2008
12. A Naturally Occurring Truncated β3 Integrin in Tumor Cells - Native Anti-Integrin Involved in Tumor Cell Motility ; Rongxian Jin1 CANCER BIOLOGY & THERAPY 6:10, 1559-1568; OCTOBER 2007]; ©2007
