RÉSUMÉ Summary
La détection de la maladie résiduelle prend une place prépondérante dans la prédiction du devenir des patients atteints de myélome multiple. Lorsqu’elle repose sur la recherche des plasmocytes myélomateux, elle est actuellement effectuée par des techniques de cytométrie en flux ou de séquençage haut débit. La tomographie par émission de positons complète ces informations en recherchant des foyers tumoraux focaux ou extramédullaires à l’issue du traitement.
Ces différentes stratégies, leurs avantages et inconvénients, ainsi que leur valeur pronostique, sont évoqués dans cette revue.
Mots-clés : Next-Generation Sequencing – Cytométrie en flux – TEP-scan.
The detection of minimal residual disease has gained an increasing place in the prediction of multiple myeloma patients’ outcome. When it relies on the detection of tumoral plasma cells, it is currently performed in flow cytometry of by Next-Generation Sequencing. Positron emission tomography completes this information by evaluating focal bone or extramedullary areas that remain positive. These strategies, their pros and cons as well as their prognostic value, are described in this review.
Keywords: Next-Generation Sequencing – Flow cytometry – PET-scan.
La maladie résiduelle
Minimal residual disease
B. Hébraud*, M.C. Béné**
* Service d’hématologie clinique, CHU de Toulouse.
** Laboratoire d’hématologie, CHU de Nantes.
Depuis le début des années 2000, la prise en charge du myélome multiple (MM) a drastique- ment changé, avec une complète refonte des stratégies de première ligne, qui associent désormais des triplettes thérapeutiques à base d’inhibiteurs du protéasome, d’IMiD (Immunomodulating Drugs) et de dexaméthasone en induction, suivies d’une consolida- tion par autogreffe chez les sujets éligibles (1-2). Ces progrès thérapeutiques associés à une amélioration des soins de support ont conduit à une nette amélioration des données de survie chez les patients (3). De fait, il a été constaté une augmentation du pourcentage de patients très bons répondeurs, voire en réponse com- plète (RC), selon les critères standard (4). La notion de RC traduit en effet une meilleure survie comparativement aux patients n’atteignant pas ce statut (5). Cependant, les évaluations par électrophorèse/immuno-électropho- rèse standard, plus ou moins associées à la normalisa- tion du ratio de chaînes légères d’immunoglobulines plasmatiques et à l’analyse médullaire, déterminent non pas des patients très longs répondeurs ou “guéris”, mais simplement un groupe de patients qui rechutent moins vite. Ainsi, il s’est avéré que de nouveaux outils étaient nécessaires pour évaluer la réelle profondeur de la réponse atteinte par ces patients, toujours plus nombreux, mais constituant un groupe hétérogène. Les premières recherches de maladie résiduelle (Minimal
Residual Disease) [MRD] ont été menées par le groupe italien ayant développé la RQ-PCR (6) et par le groupe espagnol en cytométrie en flux (CMF) [7].
Pertinence clinique des premières approches
Dans l’expérience italienne (6), les cas de 39 patients en RC après une induction et une autogreffe et avec un suivi de 7 ans ont été étudiés. La survie des patients a été analysée selon leur niveau de MRD avec un seuil de 10–5. La survie globale (SG) était de 72 % versus 48 % pour les patients avec MRD négative ou positive res- pectivement. Ce travail était une première illustration de la possibilité de différencier les sujets en RC après autogreffe. De façon concomitante, B. Paiva et le groupe espagnol (7) ont étudié 295 patients après transplan- tation en CMF. La technique de cytométrie utilisée était relativement simple, avec 3 tubes de 4 anticorps monoclonaux. En fonction de la négativité ou de la positivité de la MRD, la survie sans progression (SSP) était cependant, là encore, de 71 versus 37 mois, et la SG médiane était non atteinte versus 89 mois. La même tendance était observée chez les patients en RC, confir- mant la puissance prédictive de la MRD par rapport aux critères standard d’évaluation de la réponse.
permet d’atteindre le seuil de sensibilité le plus bas.
La CMF et le NGS sont donc les 2 approches les plus performantes, avec des avantages et des contraintes propres à chacune (tableau I). À ces 2 méthodes bio- logiques s’est récemment adjointe la tomographie par émission de positrons (TEP-scan), conduisant à disposer de 3 approches complémentaires d’évaluation de la masse tumorale résiduelle.
Next-Generation Sequencing
Le NGS repose sur le fait que, chez chaque patient atteint de MM, les plasmocytes tumoraux sécrètent la même immunoglobuline monoclonale, caractérisée par un réarrangement spécifique des gènes codant pour les domaines variables de ses chaînes lourde et légère.
Pour la recherche de ces réarrangements, une biblio- thèque de sondes est utilisée sur un prélèvement diagnostique dans un premier temps afin d’identifier ce réarrangement spécifique (surtout sur la chaîne lourde, mais aussi éventuellement sur la chaîne légère). Cette exploration s’effectue idéalement sur des plasmocytes triés à partir d’un prélèvement de volume important de sang médullaire (l’hémodilution n’est pas un souci en raison du tri). L’ADN extrait des plasmocytes triés est utilisé pour cette recherche après amplification et séquençage. Dans un deuxième temps, une amplifi- cation par PCR du réarrangement spécifique, ensuite séquencé sur de multiples amplicons, fera l’objet du suivi. Dans ce cas, l’ADN de l’ensemble des cellules médullaires recueillies est extrait et utilisé. Il est alors important d’éviter l’hémodilution. En raison de l’am- plification majeure générée par la PCR, le niveau de détection après séquençage haut débit, en utilisant 6 µg d’ADN, est de l’ordre de 10–6.
Cytométrie en flux
Les techniques de CMF ont évolué avec les progrès de la cytométrie multiparamétrique. La combinaison de plus grands nombres de marqueurs dans un seul tube a permis d’optimiser l’utilisation de l’échantillon prélevé chez le malade. Globalement, les plasmocytes sont caractérisés par la coexpression de 2 antigènes membranaires, CD38 et CD138. Les plasmocytes tumoraux perdent le plus souvent l’expression de CD19, qui persiste sur la majorité des plasmocytes normaux. De plus, certains antigènes de différenciation sont exprimés de façon aberrante (perte ou acquisition) sur les plasmocytes tumoraux (figure 1).
Enfin, la recherche de la monotypie des chaînes légères sur les immunoglobulines intracytoplasmiques renforce la qualité de l’identification des plasmocytes tumoraux.
D’une manière générale, les hématies de l’échantillon de moelle sont lysées (technique macrovolume) et les cellules nucléées recueillies après centrifugation.
Un premier marquage est réalisé pour les antigènes membranaires. Si la monotypie est explorée, il faut alors perméabiliser les cellules et ajouter des anticorps diri- gés contre les chaînes kappa et lambda. Cela implique une série de lavages qui peut conduire à une perte cellulaire aléatoire, celle-ci ne dépassant cependant pas un demi-log.
2 × 10 cellules : 12 µg d’ADN 2 à 5 × 10 cellules
Échantillons congelés Échantillons frais
Plusieurs jours, séries Quelques heures
Nécessité du prélèvement de diagnostic Prélèvement diagnostique pas nécessaire Standardisation (trousse) “Backbone” consensuel,
variations selon les groupes Informativité : 92 % des patients Informativité : 100 % des patients
Centralisé Centralisé ou bedside
Pas d’interférence du traitement
par anti-CD38 Stratégies pour contourner la perte de CD38
Figure 1. Expression des antigènes de différenciation sur les plasmocytes myélomateux.
CD19+
(%)
5,4
64,4
32,5
52,4
19,3 24,1
3,6
CD56+ CD28+ CD27– CD20+ CD117+ CD33+
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
En 2013, A.C. Rawstron et al. (8) ont publié les résultats de l’essai MRC Myeloma IX. Dans ce travail, un tube explorant uniquement des marqueurs membranaires avait été utilisé, issu des recommandations de l’Euro- pean Myeloma Network. Ce panel combinait CD45, CD19, CD38, CD138, CD56 et CD27. Un deuxième tube était utilisé en cas de détection de 20 à 50 évé- nements, combinant CD200, CD117, CD81 et CD52.
Le panel de l’Intergroupe francophone du myélome (IFM), développé à Nantes (9), est une combinaison très proche de marqueurs membranaires (CD45, CD19, CD38, CD138 et un mélange de CD56 et de CD28 conjugués au même fluorochrome). Cependant, pour faciliter la détection des plasmocytes tumoraux, la mono typie afférente est recherchée concomitam- ment après perméabilisation. Dans la proposition du consortium EuroFlow (10), 2 tubes très similaires sont préconisés, l’un entièrement membranaire et l’autre associant cette recherche intracytoplasmique :
✓CD45, CD19, CD38, CD138, CD56, CD27, CD117 et CD81 ;
✓CD45, CD19, CD38, CD138, CD56, CD27, kappa et lambda.
Les stratégies d’analyse sont également assez dif- férentes selon les groupes, reposant notamment, pour
le consortium EuroFlow, sur un thésaurus de moelles normales, alors que la stratégie de l’IFM recherche directement les compartiments monotypiques sur la base de l’expression ou non de CD19 et de CD56/CD28.
TEP-scan
Le TEP-scan est la technique la plus récemment pro- posée dans l’évaluation de la MRD. Alors que cette technologie s’est rapidement imposée dans le contexte des lymphomes, elle a mis du temps à trouver sa place dans l’exploration du MM. Plusieurs études (11, 12) ont montré la capacité du TEP-scan, au moins équiva- lente à celle de l’imagerie par résonance magnétique (IRM), à établir la documentation initiale des atteintes osseuses de la maladie. Ensuite, son rôle pronostique, selon le nombre de lésions initiales et surtout selon la disparition soit précoce soit post-autogreffe (ou consolidation) des atteintes osseuses initiales, s’est trouvé renforcé. Il faut noter que, pour cette pathologie éminemment focale et pouvant présenter des loca- lisations extramédullaires, l’imagerie peut effective- ment compléter avantageusement, voire corriger, des résultats encourageants de MRD négative médullaire correspondant en fait à une aspiration médullaire dans un territoire non envahi.
Figure 2. Courbes de survie en fonction de la MRD déterminée en NGS : positif versus négatif (A) et selon le seuil de détection (B).
MRD + MRD –
Suivi (mois) Mois
Patients à risque MRD – MRD + A (%)
100
75
50 p < 0,001
25
00 12 24 36 48 50
0 509
89 331
121 204
109 134
90 72
35 14
= 10–4 [10–5 ; 10–4] [10–6 ; 10–5]
< 10–4 B (%)
100
75
50 p < 0,001
25
0 0 12 24 36 48
MRD négative avaient de meilleurs résultats de SSP et de SG. De façon plus intéressante, en utilisant un seuil de sensibilité à 10–5, les patients en RC à l’issue du traite- ment avaient une SSP de 131 mois, versus 35 mois chez les patients ayant une MRD positive. Des données en cours de publication (14), étudiant des patients issus de l’essai IFM 2009, montrent un gain majeur chez les sujets ayant atteint une MRD non détectable au seuil de 10–6 (figure 2A). Cette étude présente l’intérêt de descendre jusqu’à 10–6 (figure 2B), au lieu du 10–5 recommandé. En effet, il apparaît clairement que le cut-off le plus prédictif quant au devenir des patients et permettant d’obtenir une courbe avec un aspect de pseudo-plateau s’obtient pour un seuil de 10–6. Ces premières données laissent entrevoir cette notion de plateau et l’identification de patients très longs répondeurs, voire guéris.
Les études en CMF vont dans le même sens, avec le message simple que plus la MRD est détectable, moins le pronostic est favorable. Dans l’étude MRC Myeloma IX (8), 19 % des patients avaient une MRD néga- tive en fin d’induction, et 62 % à J100 postautogreffe, à un seuil de 10–4. Avec un seuil de 2,5 × 10–5, l’étude de l’IFM (15) a clairement montré ce bénéfice pour les 68 % de patients ayant obtenu une MRD négative (figure 3).
Plusieurs autres publications confirment l’intérêt de la CMF pour l’évaluation de la MRD dans le MM (16-18).
L’étude de P. Moreau et al. (données ASH 2015, étude IMAJEM ancillaire de l’essai IFM2009) a de plus montré que les patients dont le TEP-scan est négatif à l’issue de la consolidation ont un meilleur devenir (12), et ces don- nées ont été confirmées par d’autres études (figure 4).
Vers un algorithme ?
En raison des avantages et des inconvénients des techniques disponibles, il est possible de proposer une stratégie en étapes pour le suivi des patients, en dehors des grands essais cliniques. Indépendamment des explorations visant à suivre le pic de l’immunoglobuline monoclonale, la CMF semble avoir la première place dans une telle stratégie. Elle est rapide, sensible et détecte facilement les patients ayant un niveau de MRD encore important. Les techniques de préparation et d’utilisation des échantillons pour la CMF permettent de préserver une partie des cellules sous forme de culot sec. Pour un patient chez lequel la MRD devient
plus de cellules médullaires, un examen en TEP-scan pourrait confirmer la disparition de tous les territoires initialement atteints ou, au contraire, montrer la rémanence de foyers médullaires ou extramédullaires.
Figure 4. Courbes de survie en fonction de la MRD en TEP. Normalisation avant l’entretien.
0 0,2 0,4 0,6 0,8
p = 0,003
94,6 %
69,9 % 1,0
0 10 20 30 40
Figure 3. Courbes de survie en fonction de la MRD en CMF, seuil de 2,5 × 10–5 (d’après Roussel et al.).
MRD + Total MRD –
Suivi (mois) Patients à risque
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0 0 6 12 18 24 30 36 42
31 30 30 30 27 24 23 1
1. Attal M, Harousseau JL, Stoppa AM et al. A prospective, randomized trial of autologous bone marrow transplantation and chemotherapy in multiple myeloma. Intergroupe Français du Myélome. N Engl J Med 1996;335(2):91-7.
2. Moreau P, Hulin C, Macro M et al. VTD is superior to VCD prior to intensive therapy in multiple myeloma: results of the prospective IFM2013-04 trial. Blood 2016;127(21):2569-74.
3. Kumar SK, Dispenzieri A, Lacy MQ et al. Continued improvement in survival in multiple myeloma: changes in early mortality and outcomes in older patients. Leukemia 2014;28(5):1122-8.
4. Durie BG, Harousseau JL, Miguel JS et al., for the International Myeloma Working Group. International uniform response criteria for multiple myeloma. Leukemia 2006;20(9):1467-73.
5. Kapoor P, Kumar SK, Dispenzieri A et al. Importance of achieving stringent complete response after autologous stem-cell transplantation in multiple myeloma. J Clin Oncol 2013;31(36):4529-35.
6. Ferrero S, Ladetto M, Drandi D et al. Long-term results of the GIMEMA VEL-03-096 trial in MM patients receiving VTD consolidation after ASCT: MRD kinetics’ impact on survival.
Leukemia 2015;29(3):689-95.
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8. Rawstron AC, Child JA, de Tute RM et al. Minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry in multiple myeloma: impact on outcome in the Medical Research Council Myeloma IX Study. J Clin Oncol 2013;31(20):2540-7.
9. Robillard N, Béné MC, Moreau P et al. A single-tube mul- tiparameter seven-colour flow cytometry strategy for the detection of malignant plasma cells in multiple myeloma.
Blood Cancer J 2013;3:e134.
10. Flores-Montero J, Sanoja-Flores L, Paiva B et al. Next gene- ration flow for highly sensitive and standardized detection of minimal residual disease in multiple myeloma. Leukemia 2017;31(10):2094-103.
11. Cavo M, Terpos E, Nanni C et al. Role of 18F-FDG PET/CT in the diagnosis and management of multiple myeloma and other plasma cell disorders: a consensus statement by the International Myeloma Working Group. Lancet Oncol 2017;18(4):e206-e217.
12. Moreau P, Attal M, Caillot D et al. Prospective evaluation of magnetic resonance imaging and [18F]fluorodeoxyglucose posi- tron emission tomography-computed tomography at diagnosis and before maintenance therapy in symptomatic patients with multiple myeloma included in the IFM/DFCI 2009 trial: results of the IMAJEM Study. J Clin Oncol 2017;35(25):2911-18.
13. Martinez-Lopez J, Lahuerta JJ, Pepin F et al. Prognostic value of deep sequencing method for minimal residual disease detection in multiple myeloma. Blood 2014;123(20):3073-9.
14. Avet-Loiseau H, Lauwers-Cances V, Corre J et al. Minimal residual disease in multiple myeloma: final analysis of the IFM2009 trial. ASH 2017; abstr. 435.
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18. Flores-Montero J, de Tute R, Paiva B et al. Immunophenotype of normal versus myeloma plasma cells: toward antibody panel specifications for MRD detection in multiple myeloma.
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19. Kumar S, Paiva B, Anderson KC et al. International Myeloma Working Group consensus criteria for response and minimal residual disease assessment in multiple myeloma. Lancet Oncol 2016;17(8):e328-e346.
R é f é r e n c e s
Les auteurs n’ont pas précisé leurs éventuels liens d’intérêts.
Conclusion
L’ensemble de ces données a conduit l’International Myeloma Working Group (IMWG) [19] à prendre en compte ces avancées, même si les études sont encore peu nombreuses et qu’il faut accumuler les observa- tions dans le temps. Il apparaît clairement que nous sommes devant une révolution dans l’évaluation de la réponse aux traitements dans le MM, avec un point de post- consolidation capable de prédire des données de SSP ou de SG et d’identifier des patients très longs répondeurs, voire guéris.
Des recommandations ont été proposées, avec une puissance de MRD moléculaire ou immunophéno - typique fixée à 10–5 pour l’instant (tableau II), complé- tée par le TEP-scan. L’aspect pronostique vis-à-vis des patients est fondamental, car les différentes études sug- gèrent que tous les patients ont un devenir identique, quel que soit leur bras de traitement, du moment que la MRD est négative, “gommant” en quelque sorte l’effet du traitement sitôt que le seuil est atteint. L’obtention d’une MRD négative pourrait devenir un objectif à atteindre chez tous les patients en adaptant la straté- gie thérapeutique. Plusieurs essais cliniques fondant une partie de leur stratégie sur la MRD sont en cours
d’élaboration. ■
Tableau II. Recommandations de l’IMWG sur l’évaluation de la MRD.
Critères MRD – nécessitent une réponse complète telle que définie ci-dessous
MRD négative
persistante Négativité de la MRD médullaire (NGS ou CMF ou les 2) confirmée à au moins 1 an d’écart Les évaluations subséquentes peuvent être utilisées pour spécifier la durée de la négativité de la MRD (par exemple, 5 ans) MRD négative
en CMF Absence de plasmocytes clonaux d’immunophénotype aberrant sur les aspirations médullaires selon les SOP d’EuroFlow® pour la détection de la MRD dans le MM ou une méthode équivalente validée, avec une sensibilité d’au moins une cellule parmi 105 cellules nucléées MRD négative par
séquençage
Absence de plasmocytes clonaux par NGS sur les aspirations médullaires, la présence d’un clone étant définie par moins de 2 reads de séquençage identiques obtenus après séquençage d’ADN sur la plateforme LymphoSIGHT® ou une méthode équivalente validée, avec une sensibilité d’au moins une cellule parmi 105 cellules nucléées MRD négative
par imagerie MRD négative en CMF ou NGS et disparition de toutes les aires de captation du traceur identifiées au diagnostic ou sur un TEP-scan préalable ou diminution de SUV devenant inférieure au médiastin ou diminution de SUV devenant inférieure au tissu normal adjacent
