TP4 EFFET DE LA TEMPERATURE SUR LA PHOSPHATASE ALCALINE
OBJECTIF : étudier l'influence de la température sur la vitesse de la réaction enzymatique ainsi que la stabilité de l'enzyme soumise à une température dénaturante.
1.
ORGANIGRAMME
Conditions opératoires pour les manipulations :
Tampon TGN pH = 10,5
Températures de mesure d'activité = 37°C ou variable Volume réactionnel 2,5 mL dont 0,05 mL de PAL Cinétique en 2 points Δt = 2 minutes
Réactif d'arrêt : NaOH, volume de lecture au spectrophotomètre : 3,5 mL εMpnp = 17 500 L /mol/cm à λ = 405 nm
(1) Influence de la température sur la vitesse initiale maximale avec [PNPP] = 4 mmol/L ; PAL = 50µl (2) Cinétique d'inactivation thermique de l'enzyme ; détermination de l'activité résiduelle à 37°C avec
[PNPP] = 4 mmol/L
(3)Manipulations annexes : mesure de l'activité en cinétique continue et mesure de la cinétique de préincubation
2. REACTIFS
TGN tampon Glycine-NaOH pH 10,5 ; 0,1 M PNPP* paranitrophènyl phosphate à 10 mmol/L
PAL solution de phosphatase alcaline diluée en eau physiologique
NaOH à 2 mol/L
MgCI2 à 10-2 mol/L
Le PNPP s'hydrolyse rapidement de manière non enzymatique. La solution stock doit être impérativement conservée dans la glace.
Rappel : NaOH à 2 mol/L : R : 35 ; S : 26-37 739-45
3. MANIPULATIONS
3.1. Influence de la température sur la vitesse initiale maximale
Diluer éventuellement la solution de PAL en fonction des essais préalables.
Préparer une série de tubes à essai selon la procédure opératoire ci-après (tubes "essais" et tubes "
blancs ").
Les réactions à chaque température (mesurée avec précision) seront effectuées tout au long de la séance de travaux pratiques, en parallèle avec les autres manipulations. Utiliser un bain par binôme : commencer par la température la plus basse et, après chaque étude, régler le bain à la température d'étude supérieure, voisine de celles préconisées mais mesurées avec précision. Commencer la préincubation suivante dès le début de la montée en température.
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Procédure opératoire :
PNPP => 1 mL
MgCI2à 10-2 mol/L =>0,25 mL eau déminéralisée =>0,2 mL
TGN => 1 mL homogénéisation: préincubatign à θ °C environ 5 minutes PAL (dilué ? ??) => 50 µL homogénéisation
Δt = 2 minutes à θ°C
NaOH =>1 mL homogénéisation puis placer dans la glace
blanc-réactifs :1 blanc (sans PAL mais avec 0,25 mL d'eau déminéralisée) par température (à traiter comme chaque essai et en parallèle car PNPP thermolabile).
Ordre de grandeur des température θ à tester : 25 ; 30 ; 35 ; 40 ; 45 ; 50 ; 55
Sortir les tubes de la glace environ 15 min avant la lecture au photomètre. Lecture à 405 nm contre l'air (ou contre chaque blanc-réactifs sans enzyme).
3.2. Cinétique d'inactivation thermique à θ °C ( θ variant de 50 à 60°C) Procédure opératoire :
Préparer une série de tubes à essais Ad ; A0 ; A1 ; A2 ; A3 ; A5 ; A7 ; A10 ; A15 contenant : 1 mL de TGN
0,25 mL de MgCl2
0,20 mL d'eau
0,05 mL de PAL (diluée ? ?) homogénéiser
(L'indice "d" représente la durée d'exposition à la température inactivante, égale respectivement à : 0 ,1, 2, 3, 5, 7, 10, et 15 minutes).
Pour chaque tube Ad :
Dénaturation thermique : boucher le tube avec du papier d'aluminium et le laisser séjourner d minutes à 0°C (prévoir un ordre minimisant la durée de la manip). Placer le tube ensuite dans la glace pendant quelques minutes.
Détermination de l'activité enzymatique: (organiser les mesures par séries avec un décalage pour l'addition des réactifs déclenchant et d'arrêt).
– mettre les tubes à préincuber 5 minutes à 37°C ;
– ajouter 1mL de PNPP 0,01M préalablement préchauffé à 37°C (joue ici le rôle de réactif déclenchant) ; homogénéiser ;
– après Δt = 2 minutes, arrêter la réaction par addition de 1mL de NaOH et mélanger (vortex).
Les lectures seront effectuées contre un blanc-réactifs (temps t = 0) sans enzyme mais contenant du PNPP préincubé, incubé et additionné de soude, selon les conditions opératoires.
4. EXPLOITATION DES RESULTATS 4.1. Vm - f (température)
– Tracer la courbe ΔA / minutes = f (température de réaction), la commenter et l'analyser ; déterminer la température optimale
– En utilisant astucieusement un tableur-grapheur, tracer la courbe : In(ΔA/minute) = f(1/T(en Kelvin) pour les températures correspondant à la partie ascendante de la courbe précédente (loi d'Arrhénius)
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– Déterminer l'énergie d'activation (au sens d'Arrhénius) de la réaction enzymatique
– Établir le coefficient de correspondance entre les activités enzymatiques déterminées à 2 températures : 30°C et 37°C par exemple. En préciser l'intérêt.
4.2. Cinétique d'inactivation thermique
– Tracer la courbe ΔA/ min = f(durée d'exposition à 0°C), ainsi que la courbe ln(Ad/A0) = f(durée d'exposition à 0°C)
– Quel est l'ordre de la réaction d'inactivation? Déterminer le temps de demi-vie de l'enzyme à θ°C.
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Manipulations annexes
Mesure de l'activité par cinétique continue
Procédure opératoire : (2 essais)
Préincuber à 37°C, dans une cuve plastique bouchée par du parafilm et adaptée à un flotteur :
PNPP => 1 mL
MgCI2 à 10-2 mol/L => 0,25 mL eau déminéralisée => 0,2 mL
TGN => 1 mL ; homogénéisation par retournements Déclencher la réaction en ajoutant 50µL de PAL, homogénéisation par retournements Remarque : variantes opératoires :
• préincuber à 37°C chacun des 4 réactifs séparément dans leurs flacons, verser (rapidement) les volumes indiqués dans la cuve. Il est préférable de préincuber dans le porte-cuve du spectro, environ 1 min, à 37°C avant l'ajout de l'enzyme.
• préincuber les réactifs dans un tube à hémolyse, ajouter l'enzyme, mélanger (retournements ou vortex) et verser dans la cuve.
Suivre la réaction 1min à l'aide du menu cinétique du spectrophotomètre Ultrospec Pharmacia (à programmer).
Valider la phase stationnaire de chaque essai, en déduire la ΔA/min ; valider la répétabilité des résultats selon la procédure ISO 5725-6 ; avec σr = 0,002,unités d'absorbance/min.
Déerminer la concentration catalytique en U/mL d'enzyme. Exprimer l'incertitude ; incertitude type : CV = 4 %.
Donnée de la photométrie d'absorption moléculaire : blanc réactif = air ou réactif à t= 0
Cinétique de préincubation
Verser 2,5 mL d'eau déminéralisée (à température ambiante) dans un tube. Y placer un thermomètre (également à température ambiante : noter la température).
Plonger ce tube dans le bain marie à 37°C et toutes les 10s noter la température jusqu'à atteindre 37°C.
(le test peut aussi être réalisé à d'autres températures) ; faire un essai avec un tube en verre et un tube en plastique.
Tracer la courbe : température = f (temps), analyser et déterminer le temps minimal de préincubation.
