Thesis
Reference
Production and functional role of Interleukin-1 receptor antagonist in immune and inflammatory responses in vivo
LAMACCHIA, Céline
Abstract
La famille de l'IL-1 était composée jusqu'à peu de quatre membres, trois d'entre eux possédant des propriétés pro-inflammatoires, l'IL-1α (IL-1F1), l'IL-1β (IL-1F2) et l'IL-18 (IL-1F4), le quatrième étant l'antagoniste du récepteur de l'IL-1, l'IL-1Ra (IL-1F3).
Récemment, sept nouveaux membres de la famille de l'IL-1 ont été identifiés de part leur homologie en terme de séquences, de structure tridimensionnelle (3D), de récepteurs et de voies de signalisation intracellulaires : les IL-1F5 à IL-1F10 et l' IL-33 (IL-1F11) (8-15).
LAMACCHIA, Céline. Production and functional role of Interleukin-1 receptor
antagonist in immune and inflammatory responses in vivo. Thèse de doctorat : Univ.
Genève, 2009, no. Sc. 4117
URN : urn:nbn:ch:unige-25545
DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:2554
Available at:
http://archive-ouverte.unige.ch/unige:2554
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UNIVERSITÉ DE GENÈVE
Section de chimie et biochimie FACULTÉ DES SCIENCES Département de biochimie Professeur J. GRUENBERG
Département de pathologie et d’immunologie FACULTÉ DE MÉDECINE Laboratoire de rhumatologie Professeur C. GABAY
Production And Functional Role Of Interleukin-1 Receptor Antagonist In Immune And Inflammatory Responses In Vivo
THÈSE
Présentée à la Faculté des sciences de l’Université de Genève pour obtenir le grade de Docteur ès sciences, mention biochimique
par
Céline LAMACCHIA
de
France
Thèse N° 4117
GENÈVE
Atelier de reprographie des Hôpitaux Universitaires de Genève
2009
REMERCIEMENTS
Je tiens à remercier en tout premier lieu Cem Gabay pour m’avoir accueilli au sein de son laboratoire et pour la confiance qu’il m’a accordée durant ces quatre années. Je le remercie de tout cœur pour m’avoir guidée, encouragée et conseillée avec honnêteté, patience et une remarquable diplomatie. Sa grande disponibilité, sa rigueur scientifique, ses qualités d’enseignant et son enthousiasme m’ont permis de travailler dans les meilleures conditions, de progresser et de mieux appréhender les facettes du métier. Merci chef !
La deuxième personne que je tiens à remercier est Gaby Palmer, une personne passionnée par la recherche et passionnante. Plus qu’une cheffe ou une collègue, je crois avoir trouvé en elle une amie qui m’a aidé aussi bien dans le travail que dans la vie lorsque j’en avais besoin, notamment lors de mes grands doutes « existentiels ». Je la remercie pour m’avoir laissé la liberté nécessaire à l’accomplissement de mes travaux, tout en y gardant un œil critique et avisé. Merci Gaby pour ton implication dans ce travail de thèse, pour ton aide, ta patience et disponibilité, tes nombreux et très bons conseils et ton soutien sans faille.
J'espère que cette thèse sera un remerciement à la hauteur du soutien et de la confiance dont tous deux ont fait preuve en mon égard.
Je remercie également Jean Gruenberg, mon répondant de la Faculté des Sciences et membre du Jury, pour m’avoir accueilli, écouté et conseillé durant ces quatre années.
Merci à Gilles Chiocchia qui a accepté avec enthousiasme de faire partie du Jury de thèse.
Merci pour la lecture de ce manuscrit et l’évaluation de mon travail.
Je tiens à remercier Danielle Burger qui a accepté avec joie de juger mon examen hors-thèse.
Je n’oublierais pas nos sympathiques moments passés à Montréal !
A tous les membres (actuels ou passés) du laboratoire de rhumatologie qui n’ont jamais hésité à partager leurs connaissances, leurs résultats et leur main d’œuvre pour la réalisation de ce travail de thèse. Tout d’abord, je tiens à exprimer ma profonde gratitude au « tas de filles » : merci Dom pour ton dynamisme, ta bonne humeur et ta participation à la partie expérimentale
de ma thèse ; merci Emi pour ta gaité quotidienne, ta motivation et ton aide technique ; merci Audrey et Loraine pour votre gentillesse, votre soutien moral et expérimental ; merci aussi à Françoise, Lilian, Gisela, Vanessa et Solenne. N’oublions pas les quelques « hommes » qui ont été de passage, ou qui ont survécu et sont toujours dans ce labo de filles : merci Jean- Marc, le « survivant », pour ton soutien moral et tes conseils de médecin…et de chercheur qui m’ont beaucoup aidé lors de la dernière ligne droite de ma thèse ; merci aussi à David le Nancéen, et à Sébastien.
Une pensée émue pour toutes les personnes avec qui j’ai partagé un café, un repas, un apéro…
pendant ces quatre années : merci à Maïna qui s’est occupée de ma vie culturelle ; merci à Claudia qui s’est occupée de ma vie sportive, festive et bien sûr scientifique ; merci à Cricri, à sa joie de vivre, à ses blagues et super proverbes… ; et merci à Toitoine qui m’a fait découvrir la meilleure fondue du monde et de très bons vins.
Merci également aux membres du Département de patho-immuno pour leur accueil, leurs conseils et collaborations. Pour résumer, quatre années dans la bonne humeur et dans un environnement propice à la recherche.
Je remercie toutes les personnes malencontreusement non citées qui ont participé de prés ou de loin à la réalisation de ce travail.
Je tiens à dédier cette thèse aux personnes les plus chères qui ont supporté mon indisponibilité :
A mes parents, qui m’ont soutenu pendant mes neuf années d’études. Merci pour votre confiance irréprochable et votre amour. Cette thèse est en grande partie la vôtre.
A ma sœur Claire, qui a toujours été là pour m’écouter, me conseiller et me soutenir moralement. Merci soeurette.
A Sébastien pour son irremplaçable soutien. Merci de m’avoir tenu la main jusqu’aux dernières lignes de ce manuscrit, d’avoir supporté mon humeur « de fin de thèse » et d’avoir cru en moi tout au long de mes études.
A mes grands-parents
RÉSUMÉ EN FRANÇAIS
Introduction
Les différents membres de la famille de l’interleukine (IL)-1 et leurs récepteurs
La famille de l’IL-1 était composée jusqu’à peu de quatre membres, trois d’entre eux possédant des propriétés pro-inflammatoires, l’IL-1α (IL-1F1), l’IL-1β (IL-1F2) et l’IL-18 (IL-1F4), le quatrième étant l’antagoniste du récepteur de l’IL-1, l’IL-1Ra (IL-1F3).
Récemment, sept nouveaux membres de la famille de l’IL-1 ont été identifiés de part leur homologie en terme de séquences, de structure tridimensionnelle (3D), de récepteurs et de voies de signalisation intracellulaires : les IL-1F5 à IL-1F10 et l’ IL-33 (IL-1F11) (8-15).
1) Les agonistes IL-1α et IL-1β
L’IL-1α et l’IL-1β sont synthétisés à partir de deux gènes différents situés sur le bras long du chromosome 2. Malgré leur faible homologie de séquence protéique (27 %), ces deux cytokines partagent une structure 3D similaire décrite comme un tonneau composé de 12 feuillets β (16-18). Ces cytokines sont synthétisées dans un premier temps sous forme de précurseurs d’environ 31 kDa dépourvus de peptide signal (pro-IL-1α et pro-IL-1β) qui seront ensuite spécifiquement clivés soit par une protéase de la famille des calpaïnes dans le cas du pro-IL-1α, soit par la caspase-1 dans le cas du pro-IL-1ß, afin de générer des formes matures de 17 kDa (mIL-1α et mIL-1β) et des fragments N-terminaux de 16 kDa (19-21). La maturation du pro-IL-1β et la sécrétion de sa forme mature sont dépendantes de l’activation de la caspase-1 (21). L’activité de cette enzyme dépend de son recrutement et de sa dimérisation au sein d’un complexe multiprotéique appelé inflammasome (22). Par ailleurs, le peptide N-terminal ainsi que la forme précurseur non secrétée de l’IL-1α peuvent être transloqués dans le noyau grâce à leur séquence de localisation nucléaire (NLS) située dans la région N-terminale. Sous forme intranucléaire, pre-IL-1α peut exercer différentes fonctions avec pour effet une modulation de la migration et de la croissance cellulaire, l’apoptose, la production de cytokines et l’activation de NF-κB (23-31). L’IL-1α peut également être associée à la membrane après myristoylation et agir par voie autocrine et paracrine (32-35).
Les récepteurs de l’IL-1 appartiennent à la superfamille des immunoglobulines et comprennent trois molécules: le récepteur de type I (IL-1RI), le récepteur de type II (IL-1RII)
et la protéine accessoire (IL-1RAcP). L’IL-1RI et l’IL-1RAcP possèdent une longue région cytoplasmique ayant une homologie avec le domaine intracellulaire de la famille des récepteurs Toll (TLR) et responsable de la transduction du signal de l’IL-1. IL-1RI et IL- 1RAcP s’associent dès la liaison de l’IL-1α (pro- et mIL-1α) ou de l’IL-1β (mIL-1β uniquement) pour former un complexe trimoléculaire capable de déclencher une cascade d’activation de différentes kinases pour aboutir à l’activation des facteurs de transcriptions NF-κB et AP-1, et à la transcription de nombreux gènes (36-38). Ainsi, on sait que l’IL-1 est impliquée dans les réponses immunitaires (ex : prolifération et différentiation des lymphocytes), ainsi que dans les processus inflammatoires (ex : recrutement des leucocytes, production de prostaglandines et de NO). Il existe différents mécanismes physiologiques pour réguler l’activité biologique de l’IL-1. En effet, le contrôle peut se situer au niveau de sa synthèse et de sa maturation, de la sensibilité des cellules cibles (nombre de récepteurs membranaires), ou encore au niveau de la quantité de récepteurs « leurres » incluant l’IL-1RII et les récepteurs solubles. En effet, l’IL-1RII possède un court domaine cytoplasmique et n’est pas en mesure de transmettre un signal. Il peut cependant lier l’IL-1 et fonctionne ainsi comme un leurre (ou decoy receptor en anglais) (39). De même, les formes solubles de l’IL- 1RII et IL-1RAcP, générées après clivage protéolytique de la partie extracellulaire et retrouvées dans le sérum, servent à neutraliser l’IL-1 (36, 40, 41). Enfin, l’inhibiteur naturel IL-1Ra joue un rôle essentiel dans la régulation de l’activité de l’IL-1.
2) L’antagoniste IL-1Ra
L’IL-1Ra a été cloné en 1990 et décrit comme étant le troisième membre de la famille de l’IL- 1. Cet inhibiteur naturel existe sous différentes isoformes : une forme secrétée (sIL-1Ra) et trois formes intracellulaires (icIL-1Ra1, 2 et 3) (42, 43). Ces isoformes sont synthétisées à partir d’un même gène situé également sur le chromosome 2 à proximité des gènes de l’IL-1 (44, 45). L’IL-1 et son antagoniste ont une structure 3D similaire (46, 47). L’utilisation alternative du premier exon (ic1 ou s) suivie d’un épissage alternatif de l’ARN permet de produire soit icIL-1Ra1 ou sIL-1Ra (48). sIL-1Ra possède un peptide signal, qui peut être clivé pour donner lieu à une forme mature secrétée glycosylée (17-22 kDa) (49). Cette isoforme est principalement produite par les cellules myéloïdes telles que les macrophages/monocytes et les neutrophiles, les hépatocytes, les chondrocytes articulaires et les fibroblastes synoviaux stimulés (50-54). La fonction principale de sIL-1Ra est d’inhiber l’interaction spécifique de l’IL-1 avec son récepteur membranaire IL-1RI. En effet, l’IL-1Ra lie IL-1RI, mais ne permet pas le recrutement de l’IL-1RAcP et n’induit donc pas de signal
intracellulaire. L’IL-1Ra inhibe la liaison de l’IL-1 à son récepteur de manière compétitive avec pour résultat une inhibition des effets biologiques de l’IL-1 (55). Cependant, un large excès d’IL-1Ra est nécessaire pour inhiber l’IL-1, d’une part à cause d’un nombre conséquent de récepteurs IL-1RI présents à la surface cellulaire et d’autre part, parce que la persistance d’un faible nombre de récepteurs non bloqués suffit pour conserver une activité résiduelle de l’IL-1 (56-58). Le rôle de sIL-1Ra est très étendu étant donné sa capacité à agir localement sur les cellules voisines ou sur des tissus situés à distance. Il a été démontré que sIL-1Ra est produite telle une protéine de la phase aiguë (APP) en grandes quantités par les hépatocytes après un stimulus inflammatoire (52, 59). De ce fait, les hépatocytes sont considéré comme une source majeure d’IL-1Ra lors de phénomènes inflammatoires locaux (hépatiques) et systémiques. L’icIL-1Ra1 contient un peptide signal incomplet et, par conséquent, correspond à une protéine cytoplasmique non glycosylée de 18 kDa (60). Elle est produite constitutivement par les cellules épithéliales, et suite à la stimulation des cellules endothéliales, des fibroblastes dermiques et synoviaux, et des macrophages. L’icIL-1Ra2 est également le produit d’un épissage amenant à une protéine dont la taille prédite est de 25 kDa.
Toutefois, seul l’ARNm de cette isoforme intracellulaire a été mis en évidence jusqu’à présent (61). Enfin, l’icIL-1Ra3 correspond à une protéine de 16 kDa synthétisée par initiation alternative de la traduction principalement à partir de l’ARNm de sIL-1Ra. Cette isoforme a été décrite dans des lysats de macrophages stimulés par lipopolysaccharides (LPS) et les hépatocytes (52, 62, 63). Les rôles biologiques des isoformes intracellulaires de l’IL-1Ra restent encore très peu connus. Ces dernières peuvent être relâchées par les cellules lors de certaines conditions telles que la lyse cellulaire ou la déformation mécanique et par activation de récepteurs purinergiques P2X7, et pourraient ainsi inhiber le signal de l’IL-1 via leurs interactions avec le récepteur membranaire IL-1RI (64-67). Différentes observations suggèrent qu’elles ont aussi des fonctions intracellulaires indépendantes d’une interaction avec l’IL-1RI in vitro (25, 68-71). Cependant, de nos jours, aucun effet indépendant du récepteur n’a été observé in vivo (72, 73).
3) La balance entre l’IL-1 et l’IL-1Ra en pathologie
Le rôle de l’IL-1 a été bien étudié dans la réponse immune, et en particulier dans la défense de l’hôte contre certains microorganismes (ex : Listeria monocytogenes), mais aussi dans la régulation du métabolisme (74-76). De plus, de nombreuses observations cliniques incriminent l’IL-1 comme étant une cause majeure de lésions tissulaires associés à un processus inflammatoire, dont la sévérité est corrélée avec les taux d’IL-1. Ainsi, l’IL-1 est
impliquée dans la destruction de l’os et du cartilage constatée dans l’arthrite, dans des processus de fibrose dus à l’inflammation chronique, dans la formation de plaques d’athérosclérose et dans la maladie du greffon contre l’hôte (74, 75, 77). Les effets délétères de l’IL-1 sont aussi particulièrement évidents dans le choc septique (74, 78, 79). Considérant son effet stimulateur sur les lymphocytes, la responsabilité de l’IL-1 dans certaines maladies auto-immunes n’est pas surprenante. En oncologie, le rôle de l’IL-1 est plus controversé puisqu’elle peut favoriser ou inhiber la croissance d’une tumeur selon le type de cellule maligne concernée (75). Certaines de ces situations pathologiques inflammatoires sont associées à un faible ratio IL-1Ra/IL-1 tandis que l’administration exogène d’IL-1Ra (anakinra, Kineret®), de même que de récepteurs solubles (IL-1 trap (rilonacept, Arcalyst®)) ou d’anticorps spécifiques dirigés contre IL-1β (canakinumab, ACZ885) ou IL-1RI (AMG- 108), permet une amélioration des symptômes et du pronostic. Ceci met en évidence l’effet protecteur de l’IL-1Ra contre les réponses inflammatoires démesurées causées par l’IL-1.
Plusieurs modèles animaux ont permis de mieux observer les conséquences d’un déséquilibre entre ces 2 cytokines in vivo. Ainsi, un déficit en IL-1RI ou caspase-1 protège contre un choc septique, alors qu’un déficit complet en IL-1Ra est associé à une forte susceptibilité au choc septique (76, 80, 81). En revanche, une surexpression d’IL-1Ra a un effet protecteur lors d’une inflammation systémique (76). Une surexpression d’IL-1α engendre le développement d’une polyarthrite par destruction sévère du cartilage (82). De plus, une déficience totale en IL-1Ra conduit à l’apparition spontanée de polyarthrite dans un fond génétique spécifique (83).
4) Les autres membres de la famille de l’IL-1
L'IL-18 a été initialement identifiée comme étant un « facteur induisant l'IFN-γ » dans le sérum et le foie de souris traitées avec la bactérie Propionibacterium acnes (84, 85). Ses modes d’action et de sécrétion, sa conformation 3D (feuillets β) critique pour la liaison aux récepteurs de la famille de l’IL-1, de même que la structure de ses récepteurs suggèrent que l'IL-18 appartient à la superfamille de l’IL-1 (1, 86, 87). L’IL-18 est produite sous la forme d’un précurseur inactif de 23 kDa (pro-IL-18) dénué de peptide signal. La caspase-1 permet par clivage la formation d’un peptide mature biologiquement actif de 18 kDa (mIL-18) (87).
Comme pour l’IL-1, le complexe formé par les récepteurs de l'IL-18 (IL-18R) se présente sous la forme d’un hétérodimère composé de la sous-unité IL-18Rα responsable de l’interaction avec son ligand et de la sous-unité accessoire IL-18Rβ (1). La voie de signalisation d'IL-18 est similaire à celle de l'IL-1 (1). IL-18BP est un récepteur soluble qui
entre en compétition avec la ligation d'IL-18 au complexe membranaire formé par IL-18Rα et IL-18Rβ, et agit donc en tant qu’inhibiteur naturel (7, 88). IL-18 est secrétée par des cellules hématopoïétiques (ex : macrophages, cellules dendritiques) et non hématopoïétiques (ex : cellules épithéliales, chondrocytes, ostéoblastes). C’est une cytokine qui possède des activités pléiotropiques qui joue un rôle important aussi bien dans l’immunité innée que dans l'immunité acquise (1, 88). Comme l’IL-1, IL-18 est impliquée dans la pathogénèse de nombreuses maladies inflammatoires chroniques et auto-immunes (1, 88).
Récemment, la famille de l’IL-1 s’est agrandie suite à la découverte de 6 nouvelles cytokines (IL-1F5 à IL-1F10). Ces dernières ont été identifiés grâce à la recherche d’homologues de l’IL-1 dans les bases de données génomiques (8, 9). Leurs gènes sont situés sur le chromosome 2 à proximité des gènes de l’IL-1 et l’IL-1Ra (5). Le gène codant pour l’IL-1F7 n’a pas été trouvé chez la souris. Leur structure secondaire a été prédite et semble être composée de 12 feuillets β, pouvant se replier pour former une structure tertiaire en tonneau β comme pour l’IL-1 et l’IL-1Ra (89, 90). L’expression (ARNm) de ces différents homologues est assez bien décrite dans la littérature. En revanche, on y trouve très peu d’informations concernant la production des protéines endogènes. IL-1F6, IL-1F8 et IL-1F9 se lient au récepteur IL-1Rrp2 et induisent des signaux pro-inflammatoires (12, 91, 92). La transduction du signal nécessite le recrutement de la protéine accessoire IL-1RAcP (91). L’IL-1F5 au contraire semble agir comme un antagoniste de récepteur IL-1Rrp2 et bloquer ainsi les effets biologiques d’IL-1F6, IL-1F8 et IL-1F9 (12, 91-93). La surexpression d’IL-1F6 dans les kératinocytes induit un phénotype inflammatoire de type psoriasis chez des souris transgéniques. Cette atteinte cutanée est transitoire et est significativement exacerbée lorsque ces souris sont croisées avec des souris knockout n’exprimant pas IL-1F5. IL-1F6 est aussi présent dans le lésions de psoriasis chez l’homme suggérant un rôle de l’IL-1F6 dans l’inflammation cutanée et le psoriasis (94). IL-1F7 pourrait inhiber l’activité d’IL-18 (95).
L’ARN messager de l’IL-1F8 est exprimé lors de l’arthrite chez l’homme ainsi que chez la souris, et stimule in vitro la production de cytokines pro-inflammatoires par les chondrocytes articulaires et les synoviocytes, suggérant un rôle de cet homologue dans la réponse inflammatoire au cours de l’arthrite (92). Très peu d’études ont été réalisées sur IL-1F9 et aucune fonction biologique n’a été décrite pour l’IL-1F10 (96). De nos jours, la production et les fonctions de ces nouvelles cytokines et de leurs récepteurs in vitro et in vivo sont très peu connues et restent à investiguer.
L’IL-33 (IL-1F11) est le dernier membre décrit de la famille de l’IL-1 (9). Contrairement à la majorité des gènes IL-1Fs, celui codant pour l’IL-33 (IL-1F11) est localisé sur le chromosome 9 chez l’homme et 19 chez la souris. L’IL-33, comme l’IL-1β, est produit sous forme d’un précurseur (pro-IL-33) de 30kDa, qui pourrait être clivé par la caspase-1 pour générer une forme mature (mIL-33) de 17kDa (9). Cependant, le site de clivage est peu conservé entre les espèces et la maturation du pro-IL-33 par la caspase-1 reste à être confirmée (97). L’IL-33 mature a été identifiée comme étant le ligand d’un récepteur jusqu'alors orphelin, T1/ST2 (9, 98). L’activité biologique du pro-IL-33 pour ce récepteur reste à définir. De nombreuses études avaient décrit T1/ST2 comme un marqueur de surface sélectif des cellules T helper (Th)2 et comme un médiateur important des réponses immunes de type Th2 (99). T1/ST2 est aussi exprimé par les mastocytes, les basophiles et les eosinophiles (100-102). En accord avec ces observations, différents groupes, dont le nôtre, ont pu montrer récemment que l’IL-33 exerce des activités immuno-modulatrices et pro-inflammatoires, notamment dans le contexte de l’arthrite (103, 104). D’autre part, pro-IL-33 exerce des effets intracellulaires. En effet, ce dernier se trouve dans le noyau des cellules qui le produisent et agit comme un régulateur de la transcription (97). L’IL-33, comme l’IL-1α, semble donc être une cytokine “à double rôle”
qui pourrait agir en tant que facteur nucléaire intracellulaire et cytokine pro-inflammatoire.
Buts de l’étude
Differents types cellulaires, tels que les hepatocytes, les cellules myeloides, les chondrocytes, les cellules endotheliales et épitheliales ainsi que les adipocytes, sont capables de produire l’IL-1Ra. Des résultats d’études menées in vitro indiquent que cette cytokine est produite en grandes quantités par les hépatocytes en réponse au LPS bactériens et à des cytokines dont l’IL-1. Ces observations suggèrent que les hépatocytes sont la source majeure d’IL-1Ra circulant lors d’une inflammation systémique. Cependant, cette hypothèse n’a pas été formellement vérifiée. Par ailleurs, la littérature actuelle, basée essentiellement sur des résultats in vitro, suggère que les cellules myéloïdes sont la source principale d’IL-1Ra dans les organes lymphoïdes et également au niveau des articulations arthritiques, pouvant ainsi contribuer à la régulation de la réponse immune et au contrôle de l’inflammation articulaire dans le contexte de l’arthrite. Cependant, la contribution relative de l’IL-1Ra produit par ces cellules par rapport à d’autres types cellulaires reste très peu connue in vivo. Notre projet de recherche a pour but de mieux comprendre le rôle biologique ainsi que la contribution de l’IL-
1Ra produit par les cellules myéloïdes et les hépatocytes dans la régulation de la réponse immune et inflammatoire in vivo à travers les deux objectifs spécifiques suivants :
- But A : Définir la production et le rôle fonctionnel de l’IL-1Ra produit par les cellules myéloïdes dans l’arthrite induite au collagène de type II (CIA) chez la souris.
- But B : Définir la production et le rôle fonctionnel de l’IL-1Ra produit par les hépatocytes dans le contrôle d’une réponse inflammatoire systémique induite par une injection de LPS chez la souris.
Pour ce projet, nous avons crée deux lignées de souris knockout (KO) conditionnelles chez lesquelles l’expression du gène codant pour l’IL-1Ra (il-1rn) est invalidée spécifiquement soit dans les cellules myéloïdes (IL-1RaΔM), soit dans les hépatocytes (IL- 1RaΔH) en utilisant le système de recombinaison Cre/loxP. Ces lignées ont été générées à partir de souris IL-1Ra floxées, chez lesquelles l’exon 2 du gène il-1rn, commun à toutes les isoformes d’IL-1Ra, est entouré par deux sites loxP, permettant ainsi l’excision de l’exon par la cre-recombinase.
Résultats
1) Création et caractérisation d’une lignée de souris floxées au niveau du gène codant pour l’IL-1Ra
La lignée IL-1Ra floxée (IL-1Raflx/flx) est le résultat d’une stratégie mise au point par les membres du laboratoire en collaboration avec la firme Genoway (Lyon, France). Nous avons dans un premier temps vérifié que l’incorporation des sites loxP ne perturbe pas l’expression de la protéine d’intérêt. Pour cela, nous avons examiné l’expression de l’IL-1Ra au niveau de l’ARN messager (RNase protection assay, RPA) et la production de la protéine (Western-blot et ELISA) dans différents tissus (foie, rate, poumons et peau) et dans la circulation 4h après une injection intra-péritonéale (i.p.) de LPS dans des souris IL-1Ra floxée homozygotes (IL- 1Raflx/flx) ou hétérozygotes (IL-1Raflx/+) et des souris de type sauvages (WT). Nous avons montré que les concentrations d’IL-1Ra dans le sérum et dans les différents tissus sont comparables entre les trois génotypes. D’autre part, les analyses par RPA et Western-blot ont montré que la transcription et la traduction des différentes isoformes d’IL-1Ra étaient
équivalentes pour les trois groupes de souris. L’ensemble de ces résultats indiquent que l’expression de l’IL-1Ra n’est pas affectée par la présence des sites LoxP.
2) Création et caractérisation de deux lignées de souris IL-1Ra knockout conditionnelles a) Génération et caractérisation des souris IL-1RaΔM
Le modèle CIA nécessite l’utilisation de souches de souris particulières, telles que la souche DBA/1, portant l’haplotype H2q du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMHII). Etant donnée que les souris IL-1Raflx/flx ont été créées dans un fond génétique mixte (129S2/SvPasCrl x C57/BL6J), nous avons procédé à cinq croisements successifs de cette lignée dans le fond DBA/1. Les souris issues de ces croisements ont ensuite été croisées avec des souris transgéniques (tg) exprimant la cre-recombinase sous le contrôle d’un promoteur (lysozymeM) dirigeant l’expression du transgène spécifiquement dans les cellules myéloïdes (105). Ces souris tg étant commercialisées dans un fond C57/BL6J, elles ont été transférées sur six générations dans le fond DBA/1 avant d’être croisées avec les souris IL-1Raflx/flx. Par l’utilisation de trois techniques différentes (PCR quantitative, RPA et ELISA), nous avons démontré une excision efficace (>90%) et spécifique de l’exon 2 du gène il-1rn par la cre- recombinase et une diminution de plus de 90% de l’expression de l’IL-1Ra (ARNm et protéine) dans les cellules myéloïdes des souris IL-1RaΔM. Les analyses ont été réalisées sur les neutrophiles péritonéaux, ainsi que les macrophages et les cellules dendritiques différenciées ex vivo à partir de la moelle osseuse isolée de souris IL-1RaΔM et de souris WT (groupe contrôle).
b) Création et caractérisation des souris IL-1RaΔH
Etant donné l’influence du fond génétique sur le développement des processus inflammatoires, nous avons généré les souris IL-1Raflx/flx dans un fond génétique C57BL/6J pur. Afin de diminuer de manière significative le temps d’attente et le nombre de souris utilisées, nous avons utilisé la méthode du « speed congenics » (106). Pour cela, nous avons sélectionné et validé 88 paires d’oligonucléotides répartis tout le long du génome et spécifiques de microsatellites polymorphes entre les lignées C57BL/6J Rj et 129S2/SvPasCrl (106). En bref, cette approche consiste à cribler pour chaque génération le génome de plusieurs souris hétérozygotes et l’animal dont le pourcentage en génome receveur est le plus élevé est utilisé comme fondateur pour créer la génération suivante.
La lignée de souris IL-1RaΔH a ensuite été crée par croisement des souris IL-1Raflx/flx en fond C57BL/6J pur avec des souris tg exprimant la cre-recombinase sous le contrôle du promoteur de l’albumine, dirigeant l’expression du transgène spécifiquement dans les hépatocytes. Ces dernières sont commercialisées en fond C57BL/6J (107).
En utilisant différentes méthodes, nous avons montré une excision efficace (>90%) et spécifique de l’exon 2 du gène il-1rn par la cre-recombinase dans les hépatocytes isolés du foie de souris IL-1RaΔH.
Les souris totalement déficientes en IL-1Ra (IL-1Ra-/-) ont un développement normal mais ont une courbe de croissance inférieure à celle des souris WT. Elles présentent des difficultés respiratoires et sont quelques fois dans un état prostré (73, 76, 81). En revanche, les souris IL- 1RaΔM et IL-1RaΔH ont une apparence générale ainsi qu’une courbe de croissance similaire à celles des souris WT, suggérant que l’IL-1Ra produit par les cellules myéloïdes ou les hépatocytes n’est pas requis pour la prise de poids et l’état général des souris en absence d’un stimulus inflammatoire spécifique.
3) L’IL-1Ra produit par les cellules myéloïdes contrôle le développement et la sévérité de l’arthrite en modulant la réponse immune
L'inflammation articulaire dans la polyarthrite rhumatoïde (PR), quelqu’en soit la cause, résulte de l’infiltration de la synoviale par des cellules inflammatoires (lymphocytes T, lymphocytes B, monocytes/macrophages et neutrophiles) qui viennent renforcer le potentiel inflammatoire des synoviocytes résidants. A un stade plus tardif de l’inflammation, les cellules activées de la lignée myéloïdes produisent de grandes quantités d'IL-1, de TNF-α, d’autres cytokines pro-inflammatoires et des chimiokines. Le degré d’infiltration et d’activation de ces cellules corrèle avec la douleur ressentie au niveau de l’articulation, le statut inflammatoire général du patient ainsi que de la progression des dégâts articulaires (108, 109). De nombreuses études réalisées in vitro ont montré que les monocytes/macrophages activés sont également capables de produire de l’IL-1Ra, mais que la balance physiologique IL-1/IL-1Ra est généralement en faveur de l’IL-1 dans la PR (50, 51, 110-113). Par ailleurs, il a été décrit que l’administration systémique d’IL-4 chez des animaux arthritiques inhibe la production de cytokines pro-inflammatoires par les cellules myéloïdes et stimule la production et la sécrétion d’IL-1Ra favorisant ainsi la régression de la maladie (114, 115). Par conséquent, la production d’IL-1Ra par les cellules myéloïdes semble jouer un
rôle clé au niveau de l’articulation (116-118). Cependant, la contribution relative de l’IL-1Ra produit par les cellules myéloïdes par rapport aux autres sources cellulaires locales et systémiques de cette cytokine telles que les fibroblastes synoviaux, les cellules endothéliales et les hépatocytes dans les mécanismes inflammatoires articulaires reste très peu connue.
Dans un premier temps, nous avons observé que les cellules myéloïdes, incluant les macrophages et les cellules dendritiques, sont une source importante d’IL-1Ra en réponse à un stimulus inflammatoire in vitro. Dans un deuxième temps, nous avons réalisée une expérience d’arthrite induite au collagène (CIA) chez les souris IL-1RaΔM afin d’évaluer la production et le rôle de l’IL-1Ra dérivé des cellules myéloïdes dans le contrôle de l’inflammation articulaire. Ce modèle murin est dépendant de l’IL-1 et présente de nombreuses similitudes pathologiques et immunologiques avec la PR chez l’homme. Ce modèle est basé sur l’induction d’une réaction auto-immune contre le collagène de type II (CII), un composant majeur du cartilage articulaire, suite à l’immunisation par du collagène hétérologue (119). Après une immunisation unique au CII, les souris IL-1RaΔM ont développé une forme plus précoce et plus sévère d’arthrite que les souris contrôles. L’analyse histologique des genoux, en accord avec les résultats cliniques, a montré que l’inflammation, la dégradation du cartilage ainsi que le nombre de neutrophiles sont significativement plus élevés chez les souris IL-1RaΔM que les souris contrôles. De façon surprenante, les quantités d’IL-1Ra sont restées élevées dans les genoux arthritiques malgré une déficience de production de cette cytokine par les cellules myéloïdes, suggérant que d’autres cellules, telles que les fibroblastes synoviaux, contribuent à la production locale d’IL-1Ra. Cependant, celle- ci n’a apparemment pas été suffisante pour contrebalancer l’effet de l’IL-1 sur l’inflammation articulaire et les dégâts tissulaires.
D’autre part, nos résultats in vivo indiquent clairement que les cellules myéloïdes contribuent à la production d’IL-1Ra dans les organes lymphoïdes. De plus, la prolifération ex vivo des lymphocytes T isolés à partir des ganglions lymphatiques inguinaux, ainsi que la production d’IFN-γ en réponse à la stimulation par l’antigène (CII) étaient augmentées chez les souris IL- 1RaΔM en comparaison à des souris contrôles. En accord avec d’anciens résultats, nous supposons que l’adjuvant utilisé lors de l’immunisation favorise une réponse immune de type Th1, et par conséquent une production d’IFN-γ (120, 121). Récemment, il a été montré que l’IL-1 n’agit pas directement sur la différentiation des lymphocytes de type Th1, mais augmente l’expansion de ces cellules in vivo (122, 123). Par conséquent, nous supposons dans notre modèle que l’adjuvant active les cellules présentatrices d’antigène (APCs), conduisant à
la production d’IL-12p70 et donc à la différentiation de clones Th1. Un environnement déficient en IL-1Ra conduit à une activation excessive des voies de signalisation de l’IL-1RI, et pourrait ainsi entraîner une expansion incontrôlée des clones Th1, et donc à une production excessive d’IFN-γ, ce qui en retour pourrait contribuer au développement de l’arthrite. Il est possible que l’IL-1, en synergie avec un ou plusieurs médiateurs inflammatoires, augmente aussi la production d’IL-12p70 par les APCs, contribuant également à une réponse Th1 augmentée.
Nos résultats montrent également que la production d’IL-17 a tendance à être plus élevée chez les souris IL-1RaΔM que chez les souris contrôles. Très récemment, Chung et al. ont montré que l’IL-1 joue un rôle critique dans la différentiation, la prolifération et la maintenance de la lignée Th17 (122). En accord avec ces résultats, notre étude suggère qu’une déficience de production d’IL-1Ra par les cellules myéloïdes conduit à une augmentation de la réponse Th17 contribuant aussi au développement d’une arthrite plus sévère.
Conclusion de notre étude : L’ensemble de nos résultats montrent que l’IL-1Ra produit par les cellules myéloïdes joue un rôle clé dans le contrôle du développement et de la sévérité de l’arthrite en modulant la réponse immune médiée par les lymphocytes T.
Quelques perspectives : La contribution relative des lymphocytes Th1 et Th17 dans le développement de la CIA n’a pas été définie par notre étude. Afin d’examiner le rôle pathogénique respectif de ces cellules, nous proposons de les isoler de souris arthritiques IL- 1RaΔM et de les transférer dans des souris RAG déficientes. D’autre part, l’expression et la production des différentes isoformes d’IL-1Ra par les cellules T n’a pas encore été examiné en détail. Dans le contexte de nos résultats, il serait intéressant de savoir si ces cellules sont capables de produire et secréter l’IL-1Ra et comment sa production est régulée. Dans le cas où les cellules T produisent cette cytokine, il serait également important de définir la fonction biologique de l’IL-1Ra dérivé de ces cellules en physiologie normale et dans le contrôle des réponses (auto)immunes et inflammatoires. Finalement, il serait aussi intéressant de déterminer le rôle de l’IL-1Ra produit par les cellules myéloïdes dans un modèle ne faisant pas intervenir la réponse immune cellulaire (lymphocytes T), en utilisant un modèle d’arthrite passif induit par le transfert de sérum avec activité pro-arthritique (modèle KxB/N).
4) L’IL-1Ra circulant est produit par plusieurs sources cellulaires en réponse à l’endotoxine et l’IL-1Ra dérivé des hépatocytes n’est pas critique pour la survie dans un modèle expérimental de choc septique
Dans l’étude précédente, nous avons démontré que les cellules myéloïdes représentent une source importante d’IL-1Ra in vitro et in vivo, et que l’IL-1Ra produit par ces cellules joue un rôle majeur dans la pathogénèse de l’arthrite en modulant la réponse immune. D’autres types cellulaires sont capables de produire cet antagoniste et pourraient ainsi influencer la réponse inflammatoire en contrôlant la balance IL-1/IL-1Ra. Des résultats d’études menées in vitro indiquent que les hépatocytes humains produisent de grandes quantités d’IL-1Ra en réponse à l’IL-1β et l’IL-6, telle une APP (52, 59). Une corrélation entre la production hépatique d’IL- 1Ra et ses taux circulants a été mise en évidence après injection de LPS chez la souris (59).
Dans cette expérience, la quantité totale d’IL-1Ra dans le foie s’est avérée six et dix fois plus élevée que celle produite dans les poumons et la rate, respectivement. Par conséquent, ces données suggèrent que les hépatocytes pourraient représenter la source majeure d’IL-1Ra circulant lors d’une inflammation systémique.
Dans cette seconde étude, nous avons examiné la production et le rôle fonctionnel de l’IL-1Ra produit spécifiquement par les hépatocytes dans un modèle d’inflammation systémique induit par l’injection de LPS. Les hépatocytes primaires de souris sont capables de produire et sécréter de grandes quantités d’IL-1Ra après avoir été stimulés in vitro soit par du LPS, soit par de l’IL-1β et l’IL-6. Dans le cadre de notre modèle, cela suggère que la production in vivo d’IL-1Ra par les hépatocytes peut être due à un effet direct du LPS et/ou à une stimulation indirecte médiée par l’IL-1β et l’IL-6, deux cytokines pro-inflammatoires maintenant bien connues pour jouer un rôle clé dans l’induction des APPs par le foie. Nous avons également démontré que les hépatocytes sont la source majeure d’IL-1Ra hépatique en réponse à un stimulus inflammatoire in vivo. Cependant, de manière surprenante, l’inhibition spécifique de l’expression du gène il-1rn dans les hépatocytes a conduit seulement à une baisse partielle (~60%) des taux d’IL-1Ra circulant en réponse à une haute dose de LPS (10 mg/kg), suggérant que d’autres sources cellulaires contribuent aux taux élevés d’IL-1Ra circulant dans ce modèle. Des études précédentes ont montré qu’un déficit complet en IL-1Ra est associé à une forte susceptibilité au choc septique (76, 81). Pourtant, la susceptibilité au LPS des souris IL-1RaΔH n’a pas été différente de celle des souris WT, suggérant que l’IL-1Ra produit par les hépatocytes n’est pas critique pour la survie dans ce modèle de choc septique. Ces observations suggèrent que dans les souris IL-1RaΔH, l’IL-1Ra circulant résiduel (~40%) est
suffisant pour contrebalancer les effets pro-inflammatoires de l’IL-1 lors d’une endotoxinémie. Cependant, nous ne pouvons exclure une éventuelle contribution des taux locaux d’IL-1Ra produit et présent dans différents organes, pour la survie des souris IL- 1RaΔH.
Conclusions de cette étude : L’ensemble de nos résultats suggèrent que l’IL-1Ra circulant est produit par plusieurs sources cellulaires en réponse à l’endotoxine et que l’IL-1Ra produit par les hépatocytes n’est pas critique pour la survie lors dans ce modèle de choc septique.
Perspectives : Nos résultats préliminaires suggèrent que les cellules myéloïdes sont aussi une source importante d’IL-1Ra circulant en réponse au LPS. Par conséquent, nous avons l’intention d’étendre notre étude sur l’inflammation systémique induite par l’endotoxine en utilisant des souris IL-1RaΔM, ainsi que des souris double KO conditionnelles chez lesquelles l’expression d’IL-1Ra est invalidée spécifiquement dans les hépatocytes et les cellules myéloïdes (IL-1RaΔM+H). Ces deux lignées ont été récemment générées dans notre laboratoire dans un fond pur C57BL/6J. Nous proposons également 1. d’examiner le rôle de l’IL-1Ra produit par les hépatocytes ou par les cellules inflammatoires dans différents modèles d’inflammation hépatique (ex : hépatite alcoolique) et 2. de confirmer l’hypothèse selon laquelle l’IL-1Ra est une protéine de la phase aigüe dans un modèle d’inflammation stérile induite par injection d’IL-1β recombinant.
Des modèles animaux aux pathologies humaines
La plupart des modèles d’arthrite actuellement utilisés chez la souris sont fortement dépendants de l’IL-1. En revanche, seulement un nombre limité de patients avec PR répond aux biothérapies visant à inhiber l’activité de cette cytokine. Cette différence pourrait être due à la complexité de la maladie chez l'homme. En effet, la maladie PR est très hétérogène dans sa présentation clinique, son évolution et son pronostic, de même que dans sa réponse aux traitements. Il semble que différents paramètres, incluant des facteurs génétiques et environnementaux influencent la susceptibilité ainsi que la sévérité de cette maladie (124, 125). Par conséquent, il est illusoire de penser qu’un seul modèle murin puisse représenter toute la complexité de la PR. Cependant, ces modèles se sont révélés être de bons outils qui ont conduit à d'importantes conclusions sur la pathogenèse de la PR et à l'élaboration de
stratégies thérapeutiques. Dans ce travail de thèse, nous avons constaté que les cellules myéloïdes jouent un rôle clé dans le contrôle de la balance IL-1/IL-1Ra dans le contexte d’un modèle d’arthrite dépendant de l’IL-1. Même si nous ne pouvons pas extrapoler ces résultats à tous les patients avec PR, on peut supposer qu’ils pourraient s’appliquer à un sous-groupe pour lequel l’IL-1 est un élément pathogénique majeur.
De même, les approches thérapeutiques visant à modifier la balance IL-1/IL-1Ra conduisent à des effets bénéfiques dans différents modèles animaux de sepsis (80, 81). Toutefois, seuls certains patients atteints de sepsis sévère répondent positivement à l’administration d’IL-1Ra recombinant (anakinra, Kineret®) (126-128). Comme pour la PR, il existe une grande hétérogénéité chez ces patients. Par conséquent, il faut être conscient qu’à l’heure actuelle, aucun modèle animal n’est capable de représenter tous les aspects de la maladie humaine.
Néanmoins, malgré les limitations de ces différents modèles animaux, ils représentent des outils importants et indispensables pour comprendre la complexité des mécanismes moléculaires qui ont lieu au cours de la septicémie. L’utilisation de souris IL-1Ra KO conditionnelles peut donc nous apporter d’importantes informations concernant la production d’IL-1Ra et son rôle fonctionnel au cours d’un processus d’inflammation systémique.
Conclusion
Ce travail de thèse définit la production ainsi que la fonction biologique de l’IL-1Ra produit par deux types cellulaires différents dans des processus inflammatoires et immunitaires. Nos résultats apportent la première preuve in vivo démontrant que les hépatocytes et les cellules myéloïdes sont deux sources importantes d’IL-1Ra en réponse à un stimulus pathogénique.
De nos jours, l’IL-1Ra peut être considéré comme une cytokine clé du système immunitaire inné, capable de réguler les fonctions de la réponse immune adaptative. Les cellules myéloïdes modulent sa production afin de maintenir une balance physiologique adéquate entre l’IL-1 et l’IL-1Ra, qui contribue à prévenir le développement d’une inflammation résultant d’une réponse immunitaire excessive ou auto-immune. Dans ce travail, nous démontrons également que les hépatocytes sont la source majeure d’IL-1Ra dans le foie.
Cependant, ces cellules ne représentent pas la source unique d’IL-1Ra circulant lors d’un choc endotoxique, reflétant ainsi la complexité du système cellulaire impliqué dans la production de cette cytokine anti-inflammatoire. Finalement, nous démontrons que les hépatocytes, comme source d’IL-1Ra, ne jouent pas un rôle crucial pour la survie dans un modèle
expérimental de choc septique. Nos études futures viseront à définir le rôle d’autres sources potentielles d’IL-1Ra dans ce modèle de sepsis.
Cette thèse illustre également l’utilité, ainsi que les limites des modèles murins expérimentaux. Les souris génétiquement modifiées, telles que les souris KO conditionnelles générées dans ce travail, représentent des outils précieux contribuant à notre compréhension de la pathogénèse de nombreuses maladies humaines.
CONTENTS
LIST OF FIGURES……… 4
LIST OF TABLES……….. 5
ABREVIATIONS……… 6
INTRODUCTION : The IL-1 family of cytokines and IL-1 Receptors... 10
I) Classical IL-1 family cytokines, receptors and biological functions………... 11 I.1) The agonists: IL-1α and IL-1β………. 12 I.1.1) gene and protein structure………. 12 I.1.2) gene expression... 14 I.1.3) protein maturation and secretion……….. 16 I.1.4) biological activities... 20
I.2) The antagonist: IL-1Ra……… 23 I.2.1) gene and protein structure……… 24 I.2.2) gene expression……… 26 I.2.3) protein maturation and secretion……….. 28 I.2.4) biological activities………... 28
I.3) Balance between IL-1 and IL-1Ra in normal physiology……….. 30
I.4) Balance between IL-1 and IL-1Ra in disease………. 31 I.4.1) IL-1 and IL-1Ra in rheumatoid arthritis………... 34 I.4.1.a) Rheumatoid arthritis………. 34 I.4.1.b) IL-1/IL-1Ra imbalance in rheumatoid arthritis………... 37 I.4.1.c) Experimental models of rheumatoid arthritis………... 37 I.4.1.d) Excess IL-1 signaling in experimental arthritis………... 41 I.4.1.e) Inhibition of IL-1in experimental arthritis……… 42 I.4.1.f) IL-1Ra deficiency in experimental arthritis………... 44 I.4.2) IL-1 and IL-1Ra during sepsis and septic shock……….. 46
I.4.2.a) Sepsis and septic choc: definitions………. 46 I.4.2.b) LPS and sepsis……… 47 I.4.2.c) IL-1 and IL-1Ra balance in sepsis……….. 50 I.4.2.d) Acute phase response and acute phase proteins……….. 52 I.4.2.e) IL-1Ra is an acute phase protein……….52
I.4.3) IL-1 and IL-1Ra in autoinflammatory diseases……… 53
I.5) IL-1Ra allelic polymorphisms and disease………. 54
I.6) Treatment of human diseases with IL-1Ra……… 56
I.7) IL-18………... 59 I.7.1) gene and protein structure………. 60 I.7.2) gene expression………. 60 I.7.3) protein maturation and secretion……….. 61 I.7.4) biological activities ……….. 62
II) New IL-1 family members, receptors and biological functions……….. 65
II.1) IL-1F6, IL-1F8, IL-1F9 and IL-1F5………... 65 II.1.1) gene and protein structure………... 65 II.1.2) gene expression………... 67 II.1.3) protein maturation and secretion………. 69 II.1.4) biological activities ………. 69
II.2) IL-1F7………... 70 II.2.1) gene and protein structure………70 II.2.2) gene expression………... 71 II.2.3) protein maturation and secretion………. 72 II.2.4) biological activities ………. 72
II.3) IL-1F10………. 73 II.3.1) gene and protein structure………... 73
II.3.2) gene expression………... 75 II.3.3) protein maturation and secretion………. 74 II.3.4) biological activities ………. 74
II.4) IL-33/IL-1F11………... 74 II.4.1) gene and protein structure………... 74 II.4.2) gene expression………... 73 II.4.3) protein maturation and secretion………. 76 II.4.4) biological activities... 77
AIMS OF THE THESIS……….79
RESULTS………. 81
Aim A. To define both the production and the functional role of myeloid cell-derived IL- 1Ra in collagen-induced arthritis (CIA)……… 81
Manuscript submitted: Myeloid-Cell Specific Interleukin-1 Receptor Antagonist Deficiency Enhances Th1 and Th17 Responses and the Severity of Arthritis………. 82
Aim B. To define both the production and the functional role of hepatocyte-derived IL- 1Ra in systemic inflammation induced by lipopolysaccharide (LPS) injection………. 119
Manuscript published: Discrimination of C57BL/6J Rj and 129S2/SvPasCrl inbred mouse strains by use of simple sequence length polymorphisms……….….120
Manuscript: Production and functional role of hepatocyte-derived interleukin-1 receptor antagonist in a model of systemic inflammation………121
DISCUSSION ………..154
REFERENCES……….164
LIST OF FIGURES
Figure 1: The IL-1 receptor family member………. 11 Figure 2: IL-1 family cytokine β-trefoil fold……… 14
Figure 3: Activation of caspase-1-dependent inflammasome and non-classical IL-1β
secretion………. 19 Figure 4: IL-1R signaling... 21 Figure 5: Regulation of IL-1 activity by IL-1 receptors……….. 22 Figure 6: IL-1RN gene, transcriptional products and IL-1Ra isoforms………... 25 Figure 7: Cartoon of a normal joint and a rheumatoid joint………. 34 Figure 8: Cells involved in the pathophysiology of rheumatoid arthritis………. 36 Figure 9: Imbalance between IL-1 and IL-1Ra in the development of auto-immunity and arthritis………... 46 Figure 10: Membrane of Gram-negative bacteria and LPS structure……….. 48 Figure 11: Schematic representation of LPS recognition and TLR4 signaling……… 49 Figure 12: Potential strategies to block the effect of IL-1……… 59 Figure 13: Structure of human IL-18……… 60 Figure 14: Ligands and receptors for the IL-18 family……… 63 Figure 15: Pleiotropic effects of IL-18………. 65 Figure 16: Genomic organization of the human and mouse IL-1 loci……….. 66 Figure 17: Crystal structure of IL-1F5 and structural model of IL-1F6………... 67 Figure 18: Genomic organization and isoforms of human IL-1F7………... 71 Figure 19: Comparison of the 3D-structural model of IL-1F10 with the crystal structure of IL-1Ra……… 73
LIST OF TABLES
Table 1: Interleukin-1 family cytokines……… 10 Table 2: Examples of disease with increased circulating IL-1Ra levels……….. 32 Table 3: Examples of experimental animal models of disease improved by recombinant IL- 1Ra administration………. 33 Table 4: Some animal models of rheumatoid arthritis……….. 38 Table 5: IL-1Ra allelic polymorphisms and disease………. 56 Table 6: Inhibition of IL-1 activity in rheumatic diseases………... 58 Table 7: The functional effects of IL-18 on immune system ………... 64
ABBREVIATIONS
AIA Antigen-induced arthritis
AP1 Activating protein-1
APC Antigen-presenting cell
APP Acute-phase protein
APR Acute-phase response
ARE (AU)-rich element
ASC Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain
ATP Adenosine triphosphate
bp base pair
CII Type II collagen
CAPS Cryopyrin-associated periodic syndrome CARD Caspase recruitment domain
CCP Cyclic citrullinated peptides C/EBP CCAAT/enhancer-binding protein
cAMP cyclic adenosine 3’,5’-cyclic monophosphate
CD Cluster differentiation
CD40L CD40 ligand
cDNA Complementary deoxyribonucleic acid CIA Collagen-induced arthritis
CIAS1 Cold-induced autoinflammatory syndrome 1
CINCA Chronic infantile neurological cutaneous and articular syndrome CNS Central nervous system
CREB cAMP response element binding protein CSN3 Third component of the COP9 signalosome
DC Dendritic cell
DNA Deoxyribonucleic acid
EAE Experimental autoimmune encephalomyelitis
EGF Epidermal growth factor
EP Endogenous pyrogen
ER Endoplasmic reticulum
ERK Extracellular signal-regulated protein kinase FCAS Familial cold autoinflammatory syndrome
FGF Fibroblast growth factor
FMF Familial Mediterranean fever
GM-CSF Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor HEV High endothelial venules
HIDS Hyperimmunoglobulinemia D with periodic fever syndrome
ICE IL-1-converting enzyme
icIL-1Ra intracellular IL-1Ra
IFN Interferon
Ig Immunoglobulin
IL Interleukin
IL-1Rrp2 IL-1 receptor related protein 2 IL-18BP IL-18 binding protein
IL-18R IL-18 receptor
IL-1Ra IL-1 Receptor antagonist IL-1RAcP IL-1 receptor accessory protein
IL-1RI IL-1R type I
IL-1RII IL-1R type II
i.p. intraperitoneal
IRAK IL-1-receptor-associated kinase
i.v. Intravenous
JNK c-jun N-terminal kinase
kDa kiloDalton
KO Knockout
LAF Lymphocyte activating factor
LBP LPS-binding protein
LEM Leukocytic endogenous mediator
LPS Lipopolysaccharides
LRE LPS response element
LRR Leucine rich repeat
MAPK Mitogen activated protein kinase MASP Marker-assisted selection protocol MCF Mononuclear cell factor
MD-2 Myeloid differentiation protein-2 MHC Major histocompatibility complex MMP Matrix metalloproteinase
mRNA messenger ribonucleic acid
MTX Methotrexate
MWS Muckle Wells syndrome
MyD88 Myeloid differentiation protein 88
NALP NACHT, LRR and PYD containing proteins
NF Nuclear factor
NFκB Nuclear factor kappa B NK cells Natural killer cells
NLR NOD-like receptor
NLS Nuclear localization sequence NMR Nuclear magnetic resonance
NOD Nucleotide-binding oligomerization domain NOMID Neonatal-onset multisystem inflammatory disease
OA Osteoarthritis
PAMPs Pathogen-associated molecular patterns PBMC Peripheral blood mononuclear cell PCR Polymerase chain reaction
PGE2 Prostaglandin E2
PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate
PYD Pyrin domain
RA Rheumatoid arthritis
RT-PCR Real-time PCR
SIGIRR Single immunoglobulin domain-containing IL-1R-related protein
sIL-1Ra secreted IL-1Ra
sIL-1RAcP soluble IL-1RAcP sIL-1RI soluble IL-1RI sIL-1RII soluble IL-1RII
SOCS Suppressor of cytokine signalling SSLP Simple sequence length polymorphism sST2 soluble ST2 receptor
ST2L (T1/ST2) Membrane-bound ST2 receptor
STAT Signal transducers and activators of transcription
TCR T cell receptor
TGF Transforming growth factor
Th Helper T
TIGIRR Three immunoglobulin domain-containing IL-1R-related protein
TIR Toll/IL-1R
TLR Toll-like receptor TNF Tumor Necrosis Factor
TNFR TNF receptors
TRAPS TNF-receptor-associated periodic fever syndrome
UTR Untranslated region
WT Wild-type
INTRODUCTION
The IL-1 family of cytokines and IL-1 Receptors
The interleukin (IL)-1 cytokine family plays an important role in inflammation and host defense, and it now comprises 11 members: IL-1α, IL-1β, IL-1 receptor antagonist (IL- 1Ra), IL-18, IL-1F5, IL-1F6, IL-1F7, IL-1F8, IL-1F9, IL-1F10, and IL-33 (Table 1).
Table 1: Interleukin-1 family cytokines
Cytokine Systematic
name Other names Similarity to
IL-1β*
Similarity to IL-1Ra*
IL-1α IL-1F1 IL-1, EP, LAF, LEM, MCF, catabolin, osteoclast
activating factor, hemopoietin-1 27 26
IL-1β IL-1F2 IL-1, EP, LAF, LEM, MCF, catabolin, osteoclast
activating factor, hemopoietin-1 100 19
IL-1Ra IL-1F3 19 100
IL-18 IL-1F4 IFN-γ inducing factor (IGIF), IL-1γ 17 ND
IL-1F5 IL-1F5 IL-1Hy1, FIL1δ, IL-1L1, IL-1δ, IL-1H3, IL-
1RP3 26 52
IL-1F6 IL-1F6 FIL1ε 24 30
IL-1F7 IL-1F7 FIL1ζ, IL-1H4, IL-1RP1, IL-1H1 21 27
IL-1F8 IL-1F8 FIL-1η, IL-1H2 27 31
IL-1F9 IL-1F9 IL-1H1, IL-1RP2, IL-1ε 20 31
IL-1F10 IL-1F10 IL-1Hy2, FKSG75 21 37
IL-33 IL-1F11 NF-HEV, DVS27 ND ND
* Percentage amino acid sequence homology. NS, not significant. ND, not determined.
The biological functions of the “classical” IL-1 family members, including three pro- inflammatory cytokines (IL-1α, IL-1β, and IL-18) and a natural inhibitor of IL-1 activity (IL- 1Ra), have been well characterized. During the past ten years, sequencing of the human genome led to the discovery of genes that encode six additional putative ligand members of the IL-1 family, termed IL-1F5 to IL-1F10. Little is known regarding the biological function of these novel IL-1 homologues and our knowledge derives mostly from in vitro studies. IL- 33 (or IL-1F11) is the most recent addition to the IL-1 family and its designation as IL-1 family member is based on the conservation of amino acid sequence and the probable
adoption of a similar three-dimensional structure, consisting of a so-called β–trefoil fold formed by 12 sheets.
The family of IL-1 receptors (IL-1R) consists of 10 members : type I IL-1R (IL-1RI), type II IL-1R (IL-1RII), IL-1R accessory protein (IL-1RAcP), IL-18 receptor (IL-18R)α, IL- 18Rβ, IL-1R related protein 2 (IL-1Rrp2), T1/ST2, IL-1R accessory protein-like (IL-1RAPL), single immunoglobulin (Ig) domain-containing IL-1R-related protein (SIGIRR) and three immunoglobulin domain-containing IL-1R-related protein (TIGIRR). These receptors are defined as membrane-spanning proteins and all share a similar structure: at least one (SIGIRR) but usually three extracellular Ig domains, one transmembrane domain, and, with the exception of IL-1RII, a cytoplasmic domain related to the Toll-like receptor (TLR) superfamily, the Toll-like/IL-1R (TIR) domain (Figure 1). Ligands for IL-1RAPL, SIGIRR and TIGGIR have not been characterized so far and these receptors are thus considered orphan receptors.
Figure 1: The IL-1 receptor family member
IL-1R family members possess three extracellular Ig-like domains (except for SIGIRR) and an intracellular- signaling TIR domain (except for IL-1RII). Adapted from (129).
I) Classical IL-1 family cytokines, receptors and biological functions
The classical IL-1 family members consist of two agonists, IL-1α and IL-1β, a specific inhibitor called IL-1Ra, which bind to two receptors, the biologically active IL-1RI and the decoy receptor IL-1RII. The balance between IL-1 and IL-1Ra is important in preventing disease in various organs, and an excess of IL-1 can contribute to the development and severity of many inflammatory and autoimmune human diseases. IL-18 is the third classical agonist of the IL-1 family. This cytokine is related to the IL-1 family in terms of
IL-33
protein structure, precursor maturation, receptor family, signal transduction and function. IL- 18 activity is also controlled by a specific inhibitor, the IL-18-binding protein (IL-18BP), which binds to IL-18. The IL-18 receptor is similar to the IL-1 receptor complex. IL-18 provides an important link between the innate and adaptive immune responses.
I.1) The agonists: IL-1α and IL-1β
IL-1 was originally described in the 1940s as a fever-inducing substance released by activated leukocytes. At that time it was called "pyrexin" or "endogenous pyrogen (EP)"(130, 131). Other substances described for their biological activities have also been identified as being in fact IL-1: lymphocyte activating factor (LAF) which increases both lymphocyte proliferation and lymphokine production; leukocytic endogenous mediator (LEM), an inducer of several components of the acute-phase response; mononuclear cell factor (MCF) which induced prostaglandin E2 and collagenase synthesis in synovial cells; catabolin; osteoclast activating factor and hemopoietin-1 (132-135). So the term IL-1 was used to describe these various biological activities, although it was unclear whether IL-1 represents a single substance or a family of related molecules (136).
I.1.1) gene and protein structure
The first form of human IL-1 was cloned in 1984 by Auron et al. from peripheral blood monocytes (137). These authors isolated a cDNA coding for an acidic precursor polypeptide of 269 amino acids (30.7 kD) that is subsequently processed to yield a mature neutral peptide of 153 amino acids (17.3 kD) (138). A few months later, March et al.
described the cloning and expression of two distinct but distantly related cDNAs, isolated from human macrophages, encoding proteins sharing human IL-1 activity, termed IL-1α and IL-1β (139). The IL-1β sequence was identical to that previously isolated from Auron, while the IL-1α cDNA was homologous to the murine cDNA described at the same period by Lomedico (140). Like IL-1β, human IL-1α was firstly translated in the form of a precursor of 271 amino acids, and then cleaved into a mature form of 159 amino acids (139). IL-1β cDNA has also been cloned in many species including rat, rabbit, monkey, sheep, horse, cattle, cat, dog, deer, pig, chicken and carp (141). The entire genomic sequences for each IL-1 form have been reported: the human IL-1β gene is 7.8 kb (142) and the human IL-lα is 10.5 kb long (143). Both genes are located on chromosome 2 (region 2q13-2q21 in human) and contain
seven exons coding for the processed IL-1 mRNA (16). A nearly identical organization of the exon-intron structure exists also for the mouse IL-lβ gene (144). In addition of the remarkable similarity in structural organization, the nucleotide sequences of both IL-1 genes are approximately 45 % homologous, suggesting that the two genes have arisen by a duplication of an ancestral gene and subsequent divergence.
A certain degree of polymorphism exists for both IL-1α and IL-1β genes and many studies have examined the relationship between this polymorphism, cytokine gene expression in vitro, and the susceptibility to and clinical severity of diseases (145). For example, three diallelic polymorphisms in the IL-1β gene have been reported, all representing C-T base transitions, at position -511, -31 and +3953 base pairs (bp) from the transcriptional start site.
Gore et al. have reported that the frequency of IL-1β +3953 (exon 5) polymorphism was significantly increased in patients with advanced adult periodontitis compared to those with early and moderate disease (146). Furthermore, this polymorphism was associated with increased production of IL-1β by activated peripheral blood polymorphonuclear cells of patients with advanced disease. Various sites of genetic polymorphism have also been described for human IL-1α. In particular, a single nucleotide base change at position - 889 in the 5' regulatory region corresponding to the promoter is responsible for a C (IL-1A1) to T (IL-1A2) transition polymorphism (147). The rare IL-1A2 allele has been associated with juvenile rheumatoid arthritis and seems to contribute to the pathogenesis of chronic polyarthritis (147, 148). However, these findings remain to be confirmed.
Despite their low amino acid sequence homology (27 %), IL-1α and IL-1β share a similar three-dimensional structure. Resolution of the crystal structure has revealed that these two IL-1 family members are ß-barrels with a pseudo 3-fold axis, composed by 12 ß-strands organized in three trefoil units of four anti-parallel ß-strands (Figure 2) (17, 18). Six of the strands form the barrel, whereas the other six form a sort of triangular array, which closes the bottom of the barrel. This β-barrel structure is closely related to that of fibroblastgrowth factor (FGF) (149). IL-1α and IL-1β share the same topology and thus bind to the same IL-1 receptors. For example, arginine-4 and arginine-12 of mature IL-1β and IL-1α, respectively, are required for receptor binding and biological activity and occupy the same relative position in their respective crystallographic structures (150). Finally, neither IL-1β nor IL-1α precursor contains a “leader peptide” characteristic of secreted proteins, and thus they do not traffic trough the conventional endoplasmic reticulum (ER)-Golgi secretion pathway.
