LEUCOCYTURIE ET INFECTION URINAIRE

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REPUBLIQUE DU BENIN

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MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

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UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI

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ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY CALAVI

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CENTRE AUTONOME DE PERFECTIONNEMENT

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OPTION : ANALYSES BIOMEDICALES

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RAPPORT DE STAGE DE FIN DE FORMATION POUR L’OBTENTION DU DIPLOME DE LICENCE PROFESSIONNELLE

THEME

Réalisé par :

MEVODJO Pascaline A.

Tutrice : Superviseur :

Olivia M. HOUNGBEGNON Prof. Honoré S. BANKOLE

Master en Analyses Biomédical Microbiologiste

Doctorante EPAC/UAC Professeur Titulaire des Universités

EPAC/UAC

Année Académique 2016-2017 1^ère Promotion

LEUCOCYTURIE ET INFECTION

URINAIRE

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MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

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UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI

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ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY CALAVI

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CENTRE AUTONOME DE PERFECTIONNEMENT

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DIRECTEUR : Professeur Mohamed SOUMANOU DIRECTEUR ADJOINT : Professeur Clément AHOUANNOU CHEF CAP : Monsieur Christophe AWANTO

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LISTE DES ENSEIGNANTS

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N^° Noms et prénoms Matières enseignées

1 AGBANGNAN Pascal Méthodologie de recherche

2 AHOYO Angèle Théodora

Microbiologie médicale et TP Microbiologie Médicale, Santé Publique, Hygiène Hospitalière 3 AKOWANOU Christian D. Physique

4 AKPOVI Casimir

Biologie cellulaire, Physiologie

cellulaire, Biochimie métabolique des lipides et enzymologie

5 ALAMOU Eric Biostatistique

6 ALITONOU Guy Chimie organique

7 ANAGO Eugénie Biochimie clinique

8 ATCHADE Pascal Parasitologie médicale et appliquée- appliquée

9 BANKOLE Honoré Bactériologie médicale et TP Bactériologie médicale

10 DOUGNON Victorien Déontologie médicale et méthodologie de la recherche

11 FAH Lauris

Histologie médicale, biochimie métabolique des glucides et immuno- hématologie

12 FANOU Brice Armand TP microbiologie médicale et Assurance Qualité en biologie médicale

13 HOUNSOSSOU Hubert Anatomie générale

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ENSEIGNANTS PERMANENTS (suite)

14 KLOTOE Jean ROBERT

Santé et sécurité au laboratoire, Equipement biomédicaux, cytologie sanguine et hémostase

15 LOKO Frédéric Biochimie analytique 16 LOZES Evelyne

Immunologie générale et immunopathologie

17 SEGBO Julien

Biochimie structurale, Biologie moléculaire et Biologie moléculaire appliquée

18 SENOU Maxime Histologie Spéciale et hémopathies 19 TCHOBO Fidèle Paul Chimie générale

20 YADOULETON Anges Entomologie médicale 21 YEHOUETOME Boniface Microbiologie générale

LISTE DES ENSEIGNANTS NON PERMANENTS N^O Noms et prénoms Matières enseignées

1 AGBANNON Tiburce Gestion des entreprises et gestion hospitalière

2 AGOSSOU Gilles Droit de travail

3 DESSOUASSI Noël Biophysique des solutions 4 HOUNNOU Hyppolite Mathématiques

5 KOUNASSO Gabriel Informatique médicale

6 YOVO Kokou Paulin Toxicologie et pharmacologie

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DEDICACE

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A tous ces scientifiques qui œuvrent sans cesse pour le bien-être de la population mondiale.

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REMERCIEMENTS

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Au père céleste pour ses innombrables grâces.

A mon père MEVODJO Louis, puisse le Seigneur t’accorder longue vie, afin que tu jouisses des fruits de tes efforts.

A ma mère HOUETO Julienne Pascaline, pour ton soutien maternel. Que Dieu te bénisse et te protège.

A mes frères et sœurs, merci

A mon époux HONFO Charlemagne, sincère merci.

A mes filles, ce travail est un exemple

Au Professeur BANKOLE Honoré S., qui n’a ménagé aucun effort pour la réalisation de ce travail, malgré ses multitudes occupations. Puisse l’Eternel vous accorder longévité et prospérité.

Nous ne dérogerons pas à la règle en manifestant notre reconnaissance à ceux qui, de près ou de loin, nous ont aidés dans la réalisation de ce travail. Aussi, nous exprimons notre gratitude et nos sincères remerciements à l'endroit de : Notre tutrice de stage, Madame HOUNGBEGNON M. Olivia pour votre attention, soyez bénie.

Au responsable de la section de bactériologie du Laboratoire National, Madame WHANNOU Germaine, pour vos conseils et les efforts consentis dans la réalisation de ce travail.

Au Docteur AGBANKPE Jérrold

A tout le personnel du Laboratoire National de Santé, recevez nos sincères gratitudes.

A mes camarades de promotion pour la convivialité et l’esprit de soutien qui règnent entre nous depuis le début de notre formation à l’EPAC

Aux autorités et enseignants du CAP et de l’EPAC, recevez ici le témoignage de notre profonde gratitude.

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HOMMAGES

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A SON EXCELLENCE MADAME LA PRESIDENTE DU JURY

C’est un honneur pour nous que vous acceptiez de présider le jury malgré vos préoccupations. Veuillez recevoir nos hommages respectueux.

AUX HONORABLES MEMBRES DU JURY

Nous sommes très heureux de vous avoir dans ce jury. Vos critiques et suggestions sont vivement attendues pour améliorer ce travail. Hommage à vous.

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LISTE DES ABREVIATIONS

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ECBU : Examen Cytobactériologie Bactériologie des Urines

EMB : Eosine Bleu de Méthylène

CLED : Cystine-Lactose-Electrolyte-Déficience

IU : Infection Urinaire

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LISTE DES TABLEAUX

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TABLEAU I : Répartition des échantillons d’urines en fonction de la leucocyturie ………...30 TABLEAU II : Répartition des échantillons d’urines en fonction de la

bactériurie

………..31

TABLEAU III : Répartition des échantillons d’urines en fonction du résultat de l’examen microbiologique

………32

TABLEAU IV : Différentes espèces bactériennes isolées.

………33

TABLEAU V : Répartition des échantillons d’urines en fonction de la bactériurie et du sexe des patients. ………...35 TABLEAU VI : Répartition des échantillons d’urines en fonction de la bactériurie et de la leucocyturie.

………36

TABLEAU VII : Répartition des espèces bactériennes isolées en fonction

du sexe

………...37

TABLEAU VIII : Répartition des échantillons d’urines en fonction de la leucocyturie et du résultat de l’examen microbiologique

………38 TABLEAU IX : Répartition des échantillons d’urines des patients en fonction de la leucocyturie et des bactéries isolées…….39

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LISTE DES FIGURES

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Figure 1 : Répartition des échantillons d’urines en fonction du sexe des patients ………29 Figure 2 : Répartition des échantillons d’urines en fonction des intervalles

d’âges des patients………...29 Figure 3 : Répartition des échantillons d’urines en fonction des intervalles

d’âges et du sexe des patients………34

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SOMMAIRE

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INTRODUCTION

I. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 1. INFECTION URINAIRE

2. LEUCOCYTURIE

3. EXAMEN CYTOBACTERIOLOGIE DES URINES II. CADRE, MATERIEL ET METHODES

1. CADRE 2. MATERIEL 3. METHODES

III. RESULTATS ET COMMENTAIRE 1. RESULTATS

2. COMMENTAIRE

CONCLUSION ET SUGGESTIONS REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ANNEXES

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RESUME-ABSTRACT

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Réalisé par MEVODJO Pascaline A. Page xix RESUME

Le présent travail a eu pour objectif général de contribuer à l’amélioration du diagnostic des infections urinaires.

Pour ce faire, 48 échantillons d’urines de patients reçus au Laboratoire National ont été analysés. La leucocyturie a été d’abord déterminée lors de l’examen microscopique à l’état frais et tous les échantillons d’urines ont ensuite fait l’objet d’analyse bactériologique. Au terme des manipulations 17,64% des échantillons d’urines à leucocyturie non significative ont présenté une culture positive. A l’inverse, 6,45% des échantillons d’urines à leucocyturie significative ont montré une culture négative.

En conclusion, si d’une manière générale une relation peut être établie entre leucocyturie significative et présence d’agent pathogène dans les urines, il n’en demeure pas moins qu’une leucocyturie non significative puisse caractériser un échantillon d’urine pathologique

Mots clés : Leucocyturie, infection urinaire

ABSTRACT

The present work has had for general objective to contribute to the improvement of the diagnosis of urinary tract infections.

To do this, 48 samples of urine of patients received at the National Laboratory were analyzed. The leucocyturie was first determined during the microscopic examination to the State fee and all the urine samples were then the subject of bacteriological analysis. At the end of manipulations 17.64% of samples of urine to leucocyturie insignificant have presented a positive culture. Conversely, 6.45% of the samples of urine to significant leucocyturie showed a negative culture.

In conclusion, if in a general way a relationship can be established between significant leucocyturie and presence of pathogen in the urine, it remains no less than a leucocyturie not significant can characterize a urine sample pathological condition

Key words: Leucocyturie, urinary tract infection

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INTRODUCTION

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Les infections urinaires constituent un motif fréquent de consultation et de prescription en médecine. Elles représentent la deuxième infection bactérienne après les infections pulmonaires [1]. De nombreuses études montrent que les infections urinaires touchent environ 40 % à 50 % des femmes dans le décours de leur vie et qu'un tiers des femmes fera une infection urinaire avant 24 ans [2]. Au Bénin, en 2012, le nombre de cas d’infections urinaires a été évalué à 14583 et à 3724 nombre de cas respectivement chez les femmes et chez les hommes [3].

Souvent considérées comme banales et bénignes, les infections urinaires peuvent avoir des conséquences pathologiques sévères d’ordre général pouvant aboutir à la stérilité et à l’insuffisance rénale chez les deux sexes [9, 17,18]. Il convient alors de prendre en charge correctement ces infections. Cette prise en charge passe par un bon diagnostic de laboratoire.

Le diagnostic biologique repose sur l’examen cytobactériologique des urines qui impose des conditions rigoureuses de prélèvement, de conservation et de réalisation [4]. L’examen cytobactériologique des urines comporte plusieurs étapes, dont chacune présente une importance capitale. Au nombre de ces étapes, on note la cytologie ; elle consiste à étudier les différents types de cellules retrouvées dans les urines (hématies, leucocytes, cellules épithéliales et la présence possible de cristaux et de bactéries) [5].En effet un échantillon d’urines est qualifié de pathologique quand il contient au moins 10⁴ leucocytes par mililitre d’urines [6].

Une telle assertion, n’écarte- t-elle pas, des cas avérés d’infections urinaires ?

C’est la problématique que pose le présent travail dont l’objet général est de contribuer à l’amélioration du diagnostic des infections urinaires.

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Spécifiquement il s’agit de :

- Evaluer la leucocyturie dans les échantillons d’urines de patients suspectés d’infection urinaire.

- Réaliser l’examen bactériologique des échantillons d’urines de tous ces patients suspectés d’infection urinaire.

- Comparer les résultats de la leucocyturie à ceux de l’examen bactériologique.

Le présent document a été rédigé, en dehors de l’introduction et de la conclusion, en trois chapitres essentiels .Le premier a abordé les généralités sur les infections urinaires et la leucocyturie. Dans le deuxième chapitre, le matériel et les méthodes ont été décrits. Enfin les résultats et le commentaire ont été présentés dans le dernier chapitre.

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I. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

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Les infections urinaires sont des affections qui se caractérisent par la présence des bactéries en concentration anormale dans les voies urinaires [6]

.Elle est fréquente chez le nourrisson, le jeune enfant, la femme enceinte et l’homme. Elle regroupe un ensemble de pathologies symptomatiques ou non, caractérisées par l’infection du tractus urinaire ou de ses annexes [7].

1.1. Différents types d’infections urinaires

Elles sont généralement classées en deux catégories à savoir les infections urinaires simples et les infections urinaires compliquées [8].

1.1.1. Infections urinaires simples

Ce sont des infections survenant chez des patients sans facteurs de risques de complications [19].Les infections urinaires de la femme n’ayant aucun terrain particulier, aucune maladie associée et aucune anomalie organique ou fonctionnelle de l’arbre urinaire peuvent être qualifiées d’infection urinaire simple [8].

1.1.2. Infections urinaires compliquées

C’est une infection survenant chez une personne ayant au moins un facteur de risque pouvant rendre l’infection plus grave et le traitement plus compliqué [8].

1.2. Physiopathologie

L’urine est physiologiquement stérile mais constitue un bon milieu de culture des bactéries après sa colonisation.

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1.2.1. Différentes sortes de mode de contamination

Il existe trois modes de contamination des urines : Rétrograde, hématogène et iatrogène [7].

1.2.1.1. Mode de contamination rétrograde

Il est le plus fréquent. Il est lié à la colonisation de l’urètre par des bactéries normalement présentes dans le colon, le périnée ou sillon balano- prénuptial. Classifiquement les germes sont dans ce cas des bacilles à Gram négatif. Chez la femme, les IU sont plus fréquentes en raison de la brièveté de l’urètre. La vidange vésicale est loin des principaux mécanismes de défense contre l’infection urinaire. Elle peut être rendue inefficace par une diurèse insuffisante ou par des mictions trop espacées ou une vidange incomplète qu’elle soit d’origine organique ou fonctionnelle. La contamination la plus fréquente du rein, se fait par voie urinaire rétrograde. Dans ce groupe on distingue les urétrites, les cystites et les pyélonéphrites aiguës [7,9].

Cystites

Ces infections sont localisées dans la vessie et sont souvent d’origine bactérienne. Elles sont toujours ascendantes.

Urétrites

Ce sont des infections touchant uniquement les urètres, canal de sortie de la vessie, ayant une fonction excrétrice au niveau des deux sexes et de plus chez l’homme une fonction reproductrice .Il s’agit essentiellement d’une infection transmissible chez l’homme et que la femme peut aussi en souffrir.

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Ce sont des infections urinaires bactériennes présumées ascendantes, avec atteinte du parenchyme rénal. Elles sont potentiellement graves et peuvent être la cause des lésions rénales et de diffusion systématique.

1.2.1.2. Mode de contamination hématogène

Il est beaucoup plus rare. Il est susceptible de survenir lors des bactériémies à Staphylocoque, de candidoses généralisées ou dans le cadre de la tuberculose.

1.2.1.3. Mode de contamination iatrogène

Il est lié à toute manœuvre urologique susceptible d’introduire des germes dans les urines. Ces germes sont souvent rencontrés dans les centres hospitaliers.

1.3. Facteurs favorisants

On distingue des facteurs hygiéno-diététiques, des facteurs généraux et des facteurs locaux.

1.3.1. Facteurs hygiéno-diététiques

Ils sont représentés par une diurèse insuffisante, une constipation, et chez la femme, le rapport sexuel qui provoque une ouverture transitoire de l’urètre.

1.3.2. Facteurs généraux

Ils sont liés à la diminution des défenses immunitaires ou dans le cadre d’une hémopathie ou chez le sujet dénutri, comme chez la femme enceinte ou ménopausée.

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1.3.3. Facteurs locaux

Ils comprennent les obstacles organiques ou fonctionnels sur les voies excrétrices, les anomalies de l’anatomie périnéale, les pathologies génitales, les uropathies obstructives, les reflux vésico- urétéraux et les malformations.

Chez les nouveaux nés, la stase urinaire est le principal facteur favorisant les IU.

1.3.4. Facteurs mécaniques

Ces facteurs sont les compressions par l’utérus gravide et le reflux vésico- urétral favorisé par l’étirement des urètres.

Progestérone

Elle inhibe le péristaltisme des voies urinaires et diminue le tonus sphinctérien urétro-vésical.

Œstrogènes

Elles induisent l’hyperhémie du trigone qui favorise l’adhérence des germes sur l’urothélium.

1.3.5. Facteurs chimiques

L’alcalinisation des urines gravidiques et la glycosurie physiologique en sont les principaux.

1.3.6. Autres facteurs locaux

Il s’agit entre autre de l’augmentation de la pullulation microbienne vulvo-périnéale gravidique et des facteurs non spécifiques : brièveté de l’urètre, malformation des voies urinaires, diabète maternel, antécédents d’infection urinaire, infections cervico-vaginales et la drépanocytose [7,10]

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Les symptômes des IU sont souvent non spécifiques, en particulier chez le nouveau-né et le nourrisson.

Le diagnostic doit être systématiquement évoqué devant toute fièvre sans foyer infectieux partent [9]. Parfois, elles n’entrainent aucun symptôme en particulier chez les personnes âgées. Typiquement, l’infection de la vessie se manifeste par des brûlures pendant les mictions et des besoins fréquents d’uriner. Les urines sont parfois troubles, hémorragiques et ou malodorantes. Il existe souvent une douleur ou une pesanteur dans le petit bassin. L’infection de l’urètre se manifeste de la même façon que la cystite. L’infection du rein est responsable des signes généraux tels que : les fièvres élevées, les frissons et l’altération de l’état général. Parfois sont également présentent les signes de la cystite. L’infection de la prostate se traduit par des brûlures à la miction, des besoins fréquents et des faibles volumes d’urines [7].

1.5. Evolution des Infections Urinaires

Les IU font courir de nombreux risques. Si elles sont basses, elles peuvent en cas de retard thérapeutique évolué vers une infection urinaire hôte. Toute IU avec fièvre peut se compliquer de septicémie, avec risque de choc septique qui nécessite une prise en charge en réanimation [3].

1.6. Bactériologie

Les germes uropathogènes, les plus fréquemment observés dans les infections de villes sont les entérobactéries. Certains germes uropathogènes ne font pas partie de la flore habituelle.

D’autres germes parfois identifiés dans les échantillons d’urines ne sont pas uropathogènes. Il s’agit de lactobacille, du streptocoque alpha-hémolytique et des anaérobies.

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Les fréquences d’isolement des germes uropathogènes les plus courants sont E. coli 60 à 80%, Proteus mirabilis 5 à 10 % et Staphylococcus saprophiticus 5 à 7 %, Klebsiella spp 1 à 5 %.

Il existe des germes pouvant être plus rarement responsables d’infections urinaires. Il s’agit du bacille de Koch, qui nécessite une recherche spécifique, de Chlamydia et du Mycoplasme qui sont généralement associés aux urétrites [7,11].

2. LEUCOCYTURIE

Encore appelée pyurie, la leucocyturie est la présence de leucocytes dans les urines. La présence de globules blancs est considérée comme normale jusqu’à 10⁴ leucocytes par mililitre d’urines. Une valeur supérieure sera considérée comme un signe d’infection urinaire. Elle peut être détectée par une bandelette ou un examen cytobactériologique des urines [12].

2.1. Leucocyturie aseptique

On parle de leucocyturie aseptique lorsque la valeur de leucocytes dépasse 10⁴ leucocytes par ml d’urines sans souche bactérienne observable après mise en culture. La cause la plus fréquente est une infection en voie de guérison, soit une infection par mycobactéries peut être à l’élévation de leucocytes sans être révélée par l’ECBU [12].

2.2. Leucocyturie isolée

La leucocyturie est dit isolée si elle ne s’accompagne d’aucun signe d’infection urinaire, ni d’aucune autre valeur au sein de l’urine notamment le nombre d’hématies, le niveau de nitrites, etc. Si elle est isolée, elle peut être témoin d’une infection urinaire dite « décapitée » par un traitement antibiotique [12].

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L’ECBU est un examen biologique qui permet faire la cytologie (la numération des leucocytes, hématies, des cellules épithéliales, la présence de cristaux ou non) et des bactéries. Il est fréquemment demandé par le clinicien lors d’une suspicion d’infection urinaire ou pour contrôler l’efficacité d’un traitement antibiotique.

Cet examen se déroule en 3 phases : la phase pré- analytique, la phase analytique et la phase post-analytique [13].

3.1. Phase pré-analytique

Cette phase constitue l’ensemble des procédures que le technicien adopte depuis l’accueil du patient jusqu’à l’obtention des urines et de son acheminement vers le laboratoire. Elle nécessite beaucoup de précautions car la qualité du résultat en dépend.

3.1.1. Prélèvement et conservation des urines

L’objectif est de recueillir l’urine vésicale, normalement stérile, en évitant sa contamination lors de la miction par la flore commensale qui colonise l’urètre et la région périnéale .Chez l’enfant, obtenir un échantillon d’urines de qualité est plus difficile encore que chez l’adulte [4].

Chez l’adulte

L’échantillon doit être prélevé sur les urines du milieu du jet afin d’éviter les souillures. Le contact de l’urine avec la muqueuse est minimisé en écartant les grandes lèvres chez la femme.

Le recueil doit être précédé d’une toilette périnéale soigneuse et d’un séchage. Toute trace d’antiseptique ou de savon doit être éliminée car

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l’antiseptique entrainé dans l’urine peut diminuer artificiellement le nombre de germes.

L’urine doit être prélevée le matin au réveil, le patient élimine le premier jet des urines et recueille les urines du milieu du jet environ 25 ml dans un pot stérile reçu au laboratoire. Le prélèvement doit être acheminé au laboratoire dans les heures qui suivent.

NB : l’urine ayant séjourné au moins 4 h dans la vessie [7].

Chez l’enfant

Les difficultés de recueil urinaire chez l’enfant sont liées au jeune âge et l’absence d’acquisition de la propreté. Le cas le plus difficile est celui du nouveau-né chez qui le recueil se fait par l’application de l’urinocol collé autour des organes génitaux externes après une désinfection soigneuse. Chez la petite fille, la proximité anatomique entre l’orifice externe de l’urètre et l’anus peut compromettre la qualité du recueil et entrainer de nombreux cas de faux positifs.

La poche doit être changée toutes les 30 minutes s’il n’y a pas d’urines. Dans tous les cas, et quel que soit le sexe, la ponction sous-pubienne reste le moyen le plus sûr d’obtenir un échantillon d’urines interprétable [7].

Dans l’idéal, les urines recueillies doivent être ensemencées dans les 20minutes. Elles ne doivent jamais être conservées plus de 2heures à température ambiante, ou à défaut, conservées à + 4°C pour une durée maximale de 24heures [4].

3.2. Phase analytique

Elle se déroule au laboratoire par l’identification du prélèvement et du processus analytique proprement dit qui comprend : l’examen macroscopique, l’examen microscopique, l’isolement et l’identification de la bactérie en cause ainsi que son antibiogramme en vue d’un traitement adéquat.

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Il consiste à décrire l’aspect des urines selon la couleur, l’odeur, la turbidité et la consistance du culot de centrifugation.

3.2.2. Examen microscopique

C’est l’ensemble des observations microscopiques faites à l’état frais et à l’état coloré (coloration de Gram) à partir du culot de centrifugation réalisé à 3000 tours / minute pendant 10 minutes.

Etat frais

L’état frais renseigne sur la cytologie (cellules épithéliales, hématies et leucocytes), la présence ou non des cristaux, de mucus des œufs et larves des parasites [13].

Etat coloré

Il permet d’apprécier la forme (Cocci ou bacilles), le type de Gram (Gram négatif ou Gram positif) et la disposition des bactéries.

3.2.3. Isolement et identification

L’examen microscopique à l’état coloré oriente le technicien dans le choix des milieux de culture afin d’isoler la bactérie dans le but de son identification par la réalisation des tests biochimiques.

L’isolement est une technique qui vise à favoriser la multiplication des bactéries sur des milieux nutritifs comme la gélose Chapman, la gélose Eosine Bleu de Méthylène (EMB) et le Bouillon Cœur-Cervelle (BCC) lorsqu’elles proviennent d’un milieu à faible concentration et la gélose Cystine Lactose Electrolyte Déficient (CLED) qui permet de faire la numération des bactéries [13].

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L’identification de la bactérie est essentielle pour confirmer l’infection bactérienne et orienter le choix d’un traitement. Elle est basée sur la réalisation des différents tests biochimiques.

3.3. Phase post analytique

C’est la phase de l’interprétation des résultats obtenus, leur transcription sur le bulletin d’analyse du patient, dans le registre du laboratoire et le rendu des résultats [13, 14,15].

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2. CADRE, MATERIEL ET

METHODES

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1. CADRE

1.1. Cadre institutionnel

L’Ecole polytechnique d’Abomey-Calavi, constitue notre cadre institutionnel. Elle comporte plusieurs départements dont le département de Génie de Biologie Humaine ou nous avons suivi notre formation en Analyses Biomédicales(ABM) pendant trois ans.

1.2. Cadre technique

Notre stage s’est déroulé au laboratoire national de santé de Cotonou, situé dans l’enceinte du Ministère de la santé.

1.2.1. Attributions

Le laboratoire national de santé est chargé de :

- Pratiquer et développer les méthodes d’analyses biologiques dans le but de diagnostic et de recherche ;

- Organiser et mettre en œuvre les enquêtes de surveillance épidémiologique des maladies en général et des maladies transmissibles en particulier ;

- Pratiquer toutes les analyses de sante publiques en collaboration avec les structures concernées ;

- Assurer l’organisation des stages pratiques des étudiants en provenance des structures agréées de formation ainsi que le recyclage et la formation en cours d’emploi des techniciens de laboratoire d’analyses biomédicales ;

- Organiser et participer aux analyses de santé publique et aux investigations toxicologiques diverses ;

- Etudier et faire appliquer la réglementation sur les conditions d’ouverture et de fonctionnement des laboratoires d’analyses biomédicales publics et privés.

(38)

de santé.

Figure N°1: Organigramme du laboratoire national de santé.

Service National des Laboratoires de Santé Secrétariat

Division : Laboratoire Central

Division : Accueil Comptabilité

Division : Assurance, qualité, Coordination, Contrôle technique et Formation continue

Division : Evaluation, Statistique et

Approvisionnement Section : Caisse

Section : Matériels et consommables Section: Bactériologie

Section : Hématologie

Section : Biochimie

Section : Sérologie

Section : Parasitologie Section : Hygiène,

Eaux et Aliments

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1.2.2. Différentes sections

Le laboratoire National de santé de Cotonou comprend les sections suivantes : la Parasitologie, l’Hématologie, la Biochimie la Sérologie et la Bactériologie.

Section de la bactériologie

Elle a pour rôle d’assurer le contrôle et la surveillance des maladies à potentiel épidémiologique. Les examens suivants y sont réalisés.

• examen cytobactériologique des sécrétions cervico- vaginales et ATB

• examen cytobactériologique des urines et ATB

• examen cytobactériologique des sécrétions urétrales et ATB

• examen bactériologique des pus et sérosités

• spermogramme

• spermoculture et ATB

• coproculture et ATB

Section de la parasitologie Les examens suivants y sont pratiqués :

• Coprologie parasitaire complète

• Recherche d’amibes, kystes, œufs et parasites

• Goutte épaisse et densité parasitaire

• Recherche des œufs de bilharzie vésicale

• Recherche des filaires

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Elle s’occupe du contrôle et de la surveillance des maladies à potentiel épidémique comme la bactériologie et certains examens y sont réalisés comme :

• Sérodiagnostic de Widal

• Sérodiagnostic de syphilis

• Sérodiagnostic de rubéole

• Sérodiagnostic de chlamydia

• Sérodiagnostic de la toxoplasmose

• Dosage de l’anticorps antistreptolysine O

• Recherche de l’antigène du virus de l’hépatite B

• Recherche de l’anticorps du virus de l’hépatite C Section de la biochimie

Les paramètres suivants y sont dosés

• Glycémie

• Urémie

• Créatininémie

• Uricémie

• Calcémie

• Magnésémie

• Triglycérides

• Gamma-GT

• Les transaminases

• Les cholestérols

• Bilirubines : totale et conjuguée

• Phosphatase alcaline

• Alpha amylase

• Protidémie

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• Ionogramme

• Electrophorèse de l’hémoglobine Section d’hématologie

• Numération formule sanguine et plaquettes

• Vitesse de sédimentation

• Numération des réticulocytes

• Temps de saignement

• Temps de coagulation

• Groupage sanguin ABO et facteur Rhésus

• Test d’Emmel 2. MATERIEL

2.1 Matériel biologique

Il a été composé de 48 échantillons d’urines des patients, sans critère d’âge ni de sexe, fréquentant le laboratoire national de santé pour recherche d’étiologie d’une infection urinaire.

2.2. Milieux de culture

- Gélose Chapman;

- Gélose EMB;

- Gélose CLED;

- Bouillon cœur- cervelle ; - Galerie rapide de Leminor.

2.3. Réactifs et colorants - Eau oxygénée ; - Réactif de Kovac’s ;

- Solution d’acide chlorhydrique dilué au 1/10^e;

(42)

- Alcool à 90°C ; - Lugol ;

- Fuchsine de Ziehl diluée au 1/10^ème.

2.4. Equipements et consommables - Etuve ;

- Microscope électrique ; - Réfrigérateurs ;

- Autoclave ;

- Balance de précision ; - Bec bunsen et gaz ;

- Flacon d’urines stérile de 50ml ; - Anse de platine calibrée ;

- Tubes secs stériles ; - Pipettes Pasteur ; - Lames et lamelles ;

- Coton cardé et hydrophile ; - Eprouvette graduée.

3. METHODES

3.1 Type et période d’étude

Il s’agit d’une étude prospective qui a porté sur des échantillons d’urines de patients suspectés d’infection urinaire. Elle a été réalisée sur une période de trois mois allant de Juin à Septembre 2017.

(43)

3.2 Préparation des milieux de culture

Les milieux de culture utilisés dans le cadre de ce travail ont été préparés selon les indications des fabricants(Annexe3).

3.3 Prélèvement

Le prélèvement a été fait dans les conditions qui évitent la contamination accidentelle du prélèvement. Ainsi, après avoir donné les consignes adéquates, un flacon stérile de 50 ml a été remis à chaque patient la veille, pour le recueil d’urines matinales ou ayant séjourné 4 heures au moins le lendemain dans la vessie.

3.3.1. Technique de prélèvement Chez l’homme

- Laver correctement les mains ;

- Faire la toilette locale avec du savon et rétraction du prépuce ; - Laver le pénis et la région du méat urinaire au savon ;

- Rincer à l’eau courante et essuyer avec un papier à usage unique ; - Eliminer le premier jet d’urines dans les toilettes ;

- Recueillir au moins 25ml d’urines du milieu du jet dans le flacon stérile après ouverture soigneuse ;

- Refermer automatiquement sans toucher le bord du flacon après le recueil ;

- et acheminer au laboratoire dans les deux heures qui suivent le recueil.

Chez la femme

- Laver correctement les mains ;

- Laver les grandes lèvres et les petites à l’eau et au savon ;

- Ecarter les jambes et éliminer le premier jet d’urines dans les toilettes ;

(44)

ouverture soigneuse ;

- Refermer automatiquement sans toucher le bord du flacon sans et acheminer au laboratoire dans les deux heures qui suivent le recueil.

3.4. Manipulations au laboratoire 3.4.1 Traitement des échantillons

Chacun des échantillons a été reparti dans deux tubes à hémolyse stériles à raison de 10ml par tube. Les tubes ont été numérotés 1 et 2.

Les tubes numérotés 1 ont servi à l’ensemencement de la gélose CLED et du bouillon nutritif ou Bile cœur cervelle. Les tubes numérotés 2, quant à eux, ont servi à faire l’état frais et à ensemencer les géloses EMB et Chapman.

Première journée

Il a été consacré aux examens macroscopique, microscopique et à la culture des échantillons d’urines.

3.4.2 Examen macroscopique

Il a consisté à apprécier l’aspect des urines notamment la couleur, la turbidité et le culot après centrifugation à 3500 tours par minute pendant 10 minutes.

3.4.3 Examen microscopique

Il regroupe l’état frais et l’examen après coloration de Gram.

Etat frais

Une goutte du culot urinaire de centrifugation a été déposée entre lame et lamelle et observée au microscope à l’objectif x 40. Il a permis de rechercher la présence de bactéries ainsi que leur mobilité et la présence de leucocytes.

(45)

La numération des leucocytes a été faite à l’état frais selon les normes suivantes :

0 à 5 leucocytes =rares leucocytes (Normal) 5 à10 leucocytes=Quelques leucocytes 10 à 20 = Nombreux leucocytes [17].

Etat coloré

Pour chaque échantillon, un frottis a été réalisé à partir du culot urinaire et a été coloré par la méthode de Gram (Annexe 1). L’observation à l’objectif x 100 a permis d’apprécier la morphologie des bactéries ainsi que leur Gram et leur regroupement.

3.4.4. Isolement et identification

Les milieux de culture ont été choisis selon les résultats de l’examen microscopique après la coloration de Gram.

L’urine totale a été ensemencée dans le bouillon nutritif BCC et sur la gélose CLED à l’aide de l’anse de platine. Par ailleurs les géloses EMB et Chapman ont été ensemencées à partir du culot de centrifugation. Les milieux ainsi ensemencés ont été incubés à 37°C à l’étuve pendant 24heures.

Deuxième jour

Il a été consacré à la lecture des différents milieux ensemencés et à l’identification des bactéries présentes sur ces milieux.

(46)

La bactériurie a été réalisée sur le milieu CLED en comparant la densité des colonies avec une série de reproduction étalons correspondant à 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶ et 10⁷bactéries par millilitre d’urines(Annexe).

La gélose CLED convient à la multiplication des principales bactéries responsables d’infection urinaire. La bactériurie a été évaluée par la technique de l’anse calibrée. Une anse de 10µl d’urines totale est diluée dans 1ml d’eau stérile. Une anse de cette dilution est étalée sur la gélose. Une colonie correspond à 10⁴bactéries par ml [16].

3.4.6 Gram contrôle

Un Gram contrôle a été réalisé à partir des colonies observées sur les géloses EMB et Chapman dans le but de confirmer le résultat de Gram obtenu le premier jour.

3.4.7 Identification

L’identification des bactéries a été faite en utilisant la galerie de LEMINOR pour les bacilles gram négatif et la recherche des caractères biochimiques pour les cocci gram positif

Technique

- sélectionner une colonie bien isolée de la souche à tester ;

- émulsionner une partie de cette colonie dans le milieu urée-indole

(47)

- ensemencer à partir de ce milieu les géloses Kliger Hajna, Mannitol-Mobilité, et l’eau peptonnée ;

- ensemencer la gélose Citrate de Simmons à l’aide de la partie restante de la colonie ;

- incuber à l’étuve à 37°C pendant 24 heures 3.4.8 Tests biochimiques

Pour les cocci Gram positif, une série de tests biochimiques a été réalisée, notamment la recherche de la catalase, la recherche de l’oxydase, la recherche de la staphylocoagulase et de la production de la Dnase

Recherche de catalase Technique

- Déposer une goutte d’eau oxygénée sur une lame de verre porte- objet - Prélever et déposer une colonie isolée à l’aide d’une anse de platine stérile.

- Emulsionner.

Lecture

Le dégagement de bulles gazeuses signe la présence de catalase.

Recherche de Dnase Technique

- Sécher la gélose Dnase à l’étuve à 37°C

- Ensemencer la souche de staphylocoque sélectionnée, en faisant une strie d’environ 3cm de longueur.

- Incuber à 37°C pendant 24h

- Déposer une goutte d’acide chlorhydrique à 10% sur les colonies.

Lecture

Lorsque la souche est Dnase positive, une zone claire plus ou moins importante est observée autour des colonies.

Recherche de l’oxydase

(48)

-Poser le disque d’oxydase sur une lame porte objet ;

-Ajouter une goutte d’eau distillée sur le disque pour l’humidifier ;

-Prélever, avec l’effilure d’une pipette Pasteur une colonie de la bactérie à étudier et l’écraser sur le disque mouillé.

Lecture

L’apparition d’une coloration violacée signe la présence d’une oxydase.

(49)

III. RESULTATS ET COMMENTAIRES

(50)

1.1. Résultats globaux

Plus de la moitié des échantillons d’urines (64,58%) provenait des femmes.

Figure 1 : Répartition des échantillons d’urines en fonction du sexe des patients.

La tranche d’âges la plus représentée (37,50 %) est celle de 20 à 30 ans.

Figure 2 : Répartition des échantillons d’urines en fonction des intervalles d’âges des patients.

64,58 % 35,42%

Féminin Masculin

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

[0; 10[ [10; 20[ [20; 30[ [30; 40[ [40; 50[ [50; 60[ [60; 70[ [70; 80[

37,50%

Effectis

Intervalles d'âges (année)

(51)

Tableau I : Répartition des échantillons d’urines en fonction de la leucocyturie.

Nombre de leucocytes par champ

Effectifs Fréquence (%)

• Leucocytes non significatifs

Rares (0 à5)

17

35,42

35,42

• Leucocytes significatifs

Quelques (5 à10)

31 20

64,58 41,66

Nombreux (>10)

11 22,92

Total 48 100

Les échantillons d’urines avec une leucocyturie significative ont été évalués à 64,58%.

(52)

Bactériurie (/ml) Effectifs Fréquence (%)

< 10⁴ 17 35.42%

≥10⁴ 31 64.58%

Total 48 100%

Plus de la moitié (64.58%) des échantillons d’urines ont présenté une bactériurie significative.

Tableau III : Répartition des échantillons d’urines en fonction du résultat de l’examen microbiologique.

Résultats Effectifs Fréquence %

Positif 31 64,58

Négatif 17 35,42

Total 48 100

Au nombre des échantillons d’urines analysés, 64,58 (31 /48) ont donné une culture positive.

Tableau IV : Différentes espèces bactériennes isolées.

(53)

Bactéries Effectifs Fréquence (%)

• Entérobactéries 16 51,61

Escherichia coli 08 25.81%

Klebsiella pneumoniae 05 16,13%

Klebsiella rhinoscleromatis 03 9,68%

• Cocci à Gram(+) 15 48,39

Staphylococcus aureus 15 48,39 %

Total 31 100%

Les entérobactéries ont été les bactéries les plus isolées (51,61%) des échantillons d’urines analysés.

(54)

On note un taux élevé d’infection urinaire chez les patients du sexe féminin de la tranche d’âges de 20 à 30 ans.

Figure 3 : Répartition des échantillons d’urines en fonction des intervalles d’âges et du sexe des patients.

Tableau V : Répartition des échantillons d’urines en fonction de la bactériurie et du sexe des patients.

Bactériurie (/ml)

Sexe

Effectifs

M F

< 10⁴ 8

(47,06%)

9 (29,03%)

17 (35.42%)

≥10⁴ 9

(52,94%)

22 (70.97%)

31 (64.58%)

Les échantillons d’urines provenant des femmes ont présenté les plus forts taux (70,97%) de bactériurie significative.

0 2 4 6 8 10 12 14

[0; 10[ [10; 20[ [20; 30[ [30; 40[ [40; 50[ [50; 60[ [60; 70[ [70; 80[

Effectifs

Intervalles d'âges (année)

Féminin Masculin

(55)

Tableau VI : Répartition des échantillons d’urines en fonction de la bactériurie et de la leucocyturie.

Leucocyturie

Bactériurie (ml)

Effectifs

< 10⁴ n (17)

≥10⁴ n (31)

• Non significative Rares

(0 à 5)

14 14 (82,35%)

03 03 (17,65%)

17 17 (35,42%)

• Significative Quelques (5à10)

03 02 (10,00%)

28 18 (90,00%)

31 20 (41,66%)

Nombreux (> 10)

01 (09,09%) 10 (90,91%) 11 (22,92%)

Une bactériurie significative a été observée avec 17,65% d’échantillons d’urines à leucocyturie non significative.

(56)

Espèces bactériennes

Sexe

Effectifs Masculin Féminin

• Entérobactéries

04 12 16 (100%)

Escherichia coli 03 05 08

Klebsiella pneumoniae 00 05 05

Klebsiella rhinoscleromatis 01 02 03

• Cocci à Gram(+) 06 09 15 (100%)

Staphylococcus aureus 06 09 15

Total 10

(32,26%)

21 (67,74%)

31 (100%)

Dans la population d’étude, les femmes (67,74%) ont fait plus d’infection urinaire que les hommes.

(57)

Tableau VIII : Répartition des échantillons d’urines en fonction de la leucocyturie et du résultat de l’examen microbiologique.

Résultat

Leucocyturie (/ml)

Effectifs

<10⁴ n=17

≥10⁴ n=31

Positif 3

(17,65%)

29 (93,55%)

32 (66,67%)

Négatif 14

(82,35)

02 (6,45%)

16 (33,33%)

6,45% des échantillons ont montré une leucocyturie significative et la culture était négative. A l’inverse la culture a été positive sur17, 65% des échantillons d’urines à leucocyturie non significative.

(58)

leucocyturie et des bactéries isolées.

Leucocyturie (/champ)

Espèces bactériennes Effectifs

<10⁴ n=17

≥10⁴ n=31

• Entérobactéries 03 13 16

(51.62)

Escherichia coli 00 08 08

(25.81%)

Klebsiella. pneumoniae 01 04 05

(16.13%) Klebsiella rhinoscleromatis

• Cocci Gram +

02

00

01

13

03 (09.68%)

15 (48,38%)

Total 03

(09,68%)

28 90,32%

31 (100%)

La plupart des bactéries (90,32%) ont été isolées lorsque la leucocyturie est supérieure à 10⁴.

(59)

2- COMMENTAIRE

Le présent travail a eu pour objectif général d’analyser la place de la leucocyturie dans la confirmation biologique d’une infection urinaire.

Sur les 48 échantillons d’urines analysés, 64,58%provenaient des femmes.

Ce taux élevé observé pourrait s’expliquer par le fait que les infections urinaires sont plus fréquentes chez les femmes compte tenu de l’anatomie de leur appareil génital. La tranche d’âges la plus représentée de cette population féminine est celle de 20 à 30 ans (41,93%) ; ceci parait normal. En effet, dans cette tranche d’âges la femme est sexuellement active et un défaut d’hygiène local peut favoriser les infections urinaires chez elle.

Le nombre d’échantillons d’urines ayant révélé une leucocyturie significative est évalué à 64,58% ; ce qui biologiquement signifie que 64,58% de la population d’étude devraient avoir une infection urinaire et par conséquent présenter une culture positive. Cela n’a pas été le cas. En effet 6,45% des patients à leucocyturie significative avait une culture négative. Il pourrait s’agir d’échantillons d’urines provenant des patients sous antibiothérapie ou sous anti- inflammatoires. Le même constat pourrait être également fait dans le cas d’une leucocyturie aseptique notamment une infection par les mycobactéries. De plus, la même situation pourrait se produire lorsque le recueil des urines est effectué pendant la phase d’incubation de l’infection. Cela pourrait être aussi dû à la présence de leucocytes génitaux dans les échantillons d’urines suite à une contamination lors du prélèvement. [12].

Sur les 31(64,58%) échantillons d’urines dont la culture était positive 3(17,65%) avait une leucocyturie non significative .Il pourrait s’agir d’une infection débutante ou une infection urinaire chez les femmes enceintes, chez les sujets âgés ou des immunodéprimés [11]. Nous pourrions avoir faire également à des cas d’infections urinaires dont les causes d’une leucocyturie non significative restent inconnues.

(60)

culture que les échantillons d’urines à leucocyturie significative, tous ces échantillons d’urines auraient été déclarés négatifs. Toutefois, il pourrait s’agir des échantillons d’urines prélevés dans les conditions non aseptiques. Cette éventualité pourrait être appuyée par le fait que la majorité de la population étudiée était constituée de femmes 64,58% et que les bactéries les plus isolées étaient des entérobactéries 51,62%. Ces entérobactéries, hôtes normaux du tube digestif de l’homme seraient isolés des échantillons d’urines du fait de la proximité des orifices anaux et urinaires chez la femme [11]. En effet, ces bactéries peuvent remonter le long de l’urètre vers la vessie et proliférer dans l’urine.

Aussi, ces échantillons d’urines prélevés dans les conditions non aseptiques pourraient-ils provenir des enfants. En effet, chez les enfants, le prélèvement d’urines est plus contraignant du fait de la nécessité d’une surveillance rigoureuse des parents lors de la miction [8].

Par ailleurs l’analyse des échantillons d’urines dont la leucocyturie était significative et que la culture était négative est estimée à 6,45%. Il pourrait s’agir des patients déjà sous antibiothérapie, chez lesquels le traitement a réussi ou que les symptômes ressentis par ceux-ci n’avaient aucun rapport avec une infection urinaire. Cette situation pose le permanent problème de présomption ou d’automédication.

Les bactéries les plus isolées étaient les entérobactéries 51,61%.Ces entérobactéries étaient surtout constituées de Escherichia coli (8/16). Ce résultat était prévisible car cette espèce bactérienne demeure la plus incriminée (80% des cas) au cours des infections urinaires.

(61)

CONCLUSION ET SUGGESTIONS

(62)

sont caractérisées par une leucocyturie significative. Cependant une leucocyturie significative ne signifie pas toujours la présence d’une infection urinaire. De même, une leucocyturie non significative n’est pas toujours synonyme d’absence d’infection urinaire. Pour ce faire, un deuxième examen doit être pratiqué dans les conditions techniques rigoureuses. Cela a pour but de confirmer les résultats positifs à leucocyturie non significative tout en tenant compte de la bactériurie et des renseignements cliniques du patient

Pour finir il parait nécessaire de faire quelques suggestions aux techniciens de laboratoire et à l’endroit du personnel soignant.

- Insister sur les conditions de prélèvement afin d’obtenir des échantillons d’urines de qualité.

- Ensemencer systématiquement les échantillons d’urines dont le Gram révèle la présence de germes quelle que soit la leucocyturie.

- Confirmer le résultat positif d’un échantillon d’urines à leucocyturie non significative par un examen de contrôle chez le patient.

(63)

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

(64)

Infections Urinaires et leur diagnostic par l’étude comparative ; Mémoire pour l’obtention de Bachelor Degré en sciences médicales ; 33 pages

2-KENKOUO G. 2008, Etude bactériologique des infections urinaires au centre Pasteur du Cameroun ; Mémoire pour l’obtention du diplôme d’Ingénieur statisticien ; 28 pages

3- WATTARA A. et Donald Hessou- DJOSSOU, 2014, Corrélation leucocyturie et présence d’agent pathogène dans les échantillons d’urines ; Rapport de stage pour l’obtention du diplôme de licence professionnelle ; EPAC/ UAC ; Bénin ; 67 pages

4-Agence Française de sécurité Sanitaire des Produits de Santé, 2007, Diagnostic et antibiothérapie des infections urinaires bactériennes communautaire du nourrisson et de l’enfant. Février.

http://www.infectiologie.com/site/média/documents/consensus/afssaps-inf- urinaire-enfant-reco.pdf consulté le 10 Juillet2017

5-http://www doctissimo.fr> Santé> analyses / examen cytobactériologique des urines

6-Remie, http://bactérioweb.univ /comte.Fr/bibliothèque/Remie/02-ECBU.PDF consulté le15 juillet 2017

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(65)

8-Anonyme

Infections urinaires de l’adulte et de l’enfant. Leucocyturie

http://cuen. Fr/umfv/IMG/PDF/Chapitre 21-PDF consulté le 14 juillet 2013

9-Agence Française de sécurité Sanitaire des Produits de Santé

Diagnostic et antibiothérapie des infections urinaires bactériennes communautaire du nourrisson et de l’enfant. Février 2007

http://www.infectiologie.com/site/média/documents/consensus/afssaps-inf- urinaire-enfant-reco.pdf consulté le 10 Juillet 2017

10-Anonyme

Infections urinaire au cours de la grossesse.

Faculté de la médecineULPF67000 Strasbourg. Année 2004-2005

http://wwwulpmed.Ustrasbg.fr/M2D2CIN/coursenligne/cours/obstétrique/infecti ons urinaires grossesse.pdf consulté le15 juillet

11-Boutoille D. IFSI Nantes 2011 Infections urinaires. Maladies Infectieuses et Tropicales.

http//www.psychaanalyse.com/pdf/Infections urinaires IFSI nantes.pdf.

12- Anonyme consulté Mercredi 27 Novembre 2002

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Médecine et Maladie Infectieuses. Institut Pasteur. Paris

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Simep. Paris ; 1987. p53-60

(67)

ANNEXES

(68)

COMPOSITION DES REACTIFS Violet de Gentiane

Violet de Gentiane en poudre……….1g Phénol………2g Alcool absolu ………...10mL Lugol

Iode ………1g Iodure de potassium………2g Eau distillée ………....200ml Fushine

Fushine de Ziehl……….1g Phénol………5g Alcool absolu……… …10ml Eau distillée………..100ml Eau physiologique

NaCl………...9g Eau distillée………...1000mL Mode opératoire

-Réunir le matériel de coloration

-Fixer l’étalement séché en passant le dos de la lame à la flamme

(69)

-Recouvrir la lame avec le violet de gentiane et attendre 1 mn -Rincer à l’eau de robinet

-Recouvrir la lame de Lugol et attendre 1mn -Rejeter le Lugol et rincer à l’eau de robinet

-Recouvrir la lame avec l’alcool à 90° ou à l’alcool acétone pendant 30s à 60s -Rincer abondement à l’eau de robinet

-Recouvrir la lame avec la solution de fuchsine phéniquée de Ziehl au 1/ 10 (ou à la solution de safranine) et laisser agir pendant 20s puis rincer et sécher sur un portoir

-Observer au microscope à l’objectif (x100)

(70)

Il est destiné à la mise en évidence de la production d’indole chez les bactéries qui possèdent du tryptophane à partir du tryptophane

Lecture

La production de l’indole se caractérise par l’apparition d’un anneau rouge en surface du milieu.

Test de catalase Mode opératoire

Déposer sur une lame une goutte H2O2.

Prélever une colonie isolée à parti de la gélose, avec une pipette Pasteur et la mettre en contact avec la goutte de H2O2.

-Catalase négative : Pas de formation de bulles

- Catalase positif : formation immédiate de bulles gazeuse.

(71)

ANNEXE 3 : Test de Dnase

Sur le milieu gélose à ADN ensemencer la gélose par une strie de 3cm de diamètre, à l’aide de l’anse de platine chargée de colonies.

Incuber à 37°C ou à température ambiante pendant 24 à 48 heures en position retournée.

Lecture

Recouvrir la gélose de l’acide chlorhydrique, ou de bleu de toluidine attendre 5à 10minuites et faire la lecture sur un fond noir

Dnase Positif : Présence d’un halo d’éclaircissement autour de la culture : Dnase négatif : milieu opaque

(72)

PREPARATIONS Bouillon nutritif Composition

Extrait de viande ………..………10g Peptone……….10g Chlorure de sodium………....5g Eau distillée…….………1L

pH=7,5 Gélose CLED

Mettre 36,1g de poudre dans un litre d’eau distillée et mélanger soigneusement.

Ensuite chauffer le mélange en remuant jusqu’à dissolution complète et stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes ensuite répartir la préparation dans les boites de pétri stérile

pH=7,3

Gélose Chapman

Mettre en suspension 111g de poudre dans un litre d’eau distillée Mélanger soigneusement

Chauffer jusqu’à ébullition ;

Répartir dans les flacons et stériliser à l’autoclave à 121^oC pendant 15 minutes ensuite répartir dans les boites de pétri en raison de 10 ml par boite

(73)

Gélose Eosine-Bleu de Méthylène

Mettre 37,5 g de poudre en suspension dans 1 litre d’eau distillée ; Porter à l’ébullition jusqu’à la dissolution complète ;

Répartir la préparation dans des flacons ;

Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes

ANNEXE : 5 GALERIE RAPIDE DE LEMINOR