Correction mai 2011
Pour répondre à ce sujet, il fallait connaître un peu de biologie des champignons filamenteux et de la levure Saccharomyces cerevisiae.
- Pour montrer qu’un seul des 7 transporteurs est requis pour croitre sur cellulose ou
dextrine, il faut déléter un par un les 7 gènes et observer la croissance des 7 souches (comparée avec celle de la souche sauvage) sur du milieu avec de la cellulose ou de la dextrine comme seule source de carbone. Pour ceci, il faut transformer la souche sauvage indépendamment avec des cassettes contenant un marqueur de sélection (résistance à un antifongique par exemple) bordé des séquences 5’ amont et 3’ aval des 7 gènes à déléter. Le délétant est vérifié par Southern Blot. Finalement, il faut complémenter le mutant NCU8114 avec l’allèle sauvage NCU8118+ pour être sûr que le phénotype est bien dû à la délétion. (3 points)
- Pour montrer que la conjonction de l’absence des deux transporteurs résulte dans une
mauvaise croissance sur cellobiose, il faut construire le double mutant. Pour ceci, soit on croise les deux mutants entre eux et dans la descendance on peut récupérer le double mutant, soit on réalise la deuxième délétion dans la souche portant la première délétion (dans ce cas, il faut un deuxième marqueur de sélection pour la transformation). (2 points)
- Pour exprimer les deux transporteurs dans la souche de S. cerevisiae exprimant la bêta-
glucosidase, il faut dans un premier temps construire la souche receveuse. Pour ceci, on peut par exemple insérer par transformation dans le génome de la levure, une cassette contenant (un marqueur de sélection restaurant par exemple une prototrophie) et un gène chimère comprenant un promoteur de levure, suivi de la séquence codante de la bêta-glucosidase NCU00130 et d’un terminateur de transcription. L’expression de la bêta-glucosidase peut être suivie au niveau ARN par un Northern Blot et au niveau de la protéine par un Western Blot. Eventuellement, sa séquence codante peut être fusionnée en phase avec celle de la GFP, l’expression est alors suivie au microscope par
fluorescence. L’expression des transporteurs peut se faire en suivant la même démarche en utilisant des plasmides portant des marqueurs de sélection différents. (3 points)
- Pour tester la capacité à pousser sur dextrine comme seule source de carbone, il faut
mettre la levure sur du milieu qui contient tout ce qu’il faut pour qu’elle pousse (source d’azote, de phosphate etc.) et de la dextrine comme seule source de carbone. Seule la souche exprimant les transporteurs pousse. (1 points)
- Pour mesurer la production d’alcool, il faut doser l’alcool produit après fermentation (à
l’éthylomètre par exemple) et comparer la quantité mesurée avec celle déduite des stœchiométries des réactions enzymatiques. (3 points)
L’aspect pratique du résultat est évident pour l’industrie de la production du bioéthanol. La souche de S. cerevisiae ainsi produite peut utiliser du cellobiose pour faire de l’alcool. C’est donc un premier pas pour fermenter des matières plus complexes que des sucres simples et à terme directement la biomasse végétale. (4 points)
Pourtant, si ces résultats semblent encourageants, il reste du chemin à parcourir.
L’efficacité de la dégradation de la dextrine n’est pas mentionnée (probablement qu’elle est très faible), et encore moins celle de la cellulose. Notez que les levures ne sont pas les organismes les plus appropriés pour dégrader la matière solide (c’est probablement la raison pour laquelle elles n’ont pas la batterie enzymatique de Neurospora). En effet, les hyphes mycéliens sont plus adaptés pour ce but. Soit, il faudra des prétraitements pour que les levures fermentent la biomasse (pulvérisation par exemple). Ceci peut se révéler couteux et/ou polluant. Soit, il faudrait modifier des champignons filamenteux, tel que Neurospora, pour qu’ils fermentent, plutôt qu’ils ne respirent la biomasse végétale. (4 points)
