Criblage de mutants d'Arabidopsis et caractérisation du mutant dgl1

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mutant dgl1

Olivier Lerouxel

To cite this version:

Olivier Lerouxel. Criblage de mutants d’Arabidopsis et caractérisation du mutant dgl1. Biologie végétale. Université de Rouen Normandie, 2004. Français. �tel-01966302�

I FRM P UMR 6037

THESE

L’U.F.R. des sciences de l’Université de Rouen en vue d’obtenir un

DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE ROUEN

DOCTORAT EUROPEEN

Discipline : Biologie / Spécialité : Physiologie végétale

soutenue le 17 septembre 2004 par

Olivier LEROUXEL

Criblage de mutants d’Arabidopsis

et caractérisation du mutant dgl1

Directeur de thèse

M. P. Lerouge

Professeur, Université de Rouen

Membres du jury :

M. P-A. Balangé Professeur, Université de Rouen Président Mme C. Breton Professeur, Université de Grenoble Rapporteur M. H. Scheller Professeur, Université de Copenhague, Danemark Rapporteur

M. S. Ball Professeur, Université de Lille Rapporteur

M. L. Lehle Professeur, Université de Regensburg, Allemagne Rapporteur M. H. Höfte Directeur de Recherche, INRA, Versailles Examinateur

M. A. Driouich Professeur, Université de Rouen Examinateur

Travail effectué au sein de l’unité CNRS UMR6037, IFRMP 23, Université de Rouen, 76 821 Mont Saint Aignan Cédex

As most of you will only read this part I would like to point out that this work describe methodologies to detect altered cell wall mutant based on xyloglucan fingerprinting, seedling cell wall monosaccharide content and the characterization of the dgl1 mutant altered for a protein subunit of the N-glycan oligosaccharyltransferase complex.

Firstly, my thanks go to the members of the jury who kindly have agreed to evaluate this work. I want to thank Pr Alain-Pierre Balangé (University of Rouen), Pr Christelle Breton (University of Grenoble), Pr Henrik Vibe Scheller (Royal Veterinary and Agricultural University, Copenhagen), Pr Ludwig Lehle (University of Regensburg), Dr Herman Höfte (INRA of Versailles), Pr Steven Ball (University of Lille), Pr Azeddine Driouich (University of Rouen) and my supervisor Pr Patrice Lerouge (University of Rouen).

Among them, I would particularly thank Pr Henrik Vibe Scheller and Dr Herman Höfte for welcoming me in their labs, and giving me the opportunities to learn so many things. It was great to be part of your research team, meet all the people who make the labs alive and with whom I had many fruitful discussions.

I wish to thank Loïc Faye, the director of CNRS UMR 6037, where I have carried out this work, for giving me the opportunity to be part of his lab.

I thank also Markus Pauly and people of his group at the Max-Planck institute of Molecular Plant Physiology in Golm, for their partnership.

Ending this pH D work, my thought goes to my supervisor : Pr Patrice Lerouge, it was a wonderful time learning almost all I know now from one of the best human beings I have met during my lifetime. It was also a great pleasure to learn from such a great scientist, to see his intelligence in leading projects and to benefit from it.

I want to thank the people of the cellular biology laboratory of Herman Höfte, especially Herman himself and Grégory Mouille for sharing their huge background knowledge and strong skills in molecular plant biology with me during my training in their lab and hopefully we will have another chance to work together in the future. I also want to thank Stéphanie Robert, Thierry Desprez, Sandra Pelletier, Samantha Vernhettes and Martine Gonneau, for all the great discussions and helpfulness.

I thank also all the people of The Plant Biochemistry Laboratory at The Royal Veterinary and Agricultural University where I have not only found a hardworking team but also some of the greatest colleagues you could expect to work with, it was really convivial time, day by day. Thank you Henrik for welcoming me, and giving me the opportunity of defending now this European pH D. Thank you Susanne for supervising me during these three months on the Pichia work and together with Jesper, Jan and Jacob for the open discussion of pectin glycosyltransferases.

At the university of Rouen I want to thank people of the CCME : Azeddine and Christine for her help with the microscopy work on dgl mutant, also Eric and Maïté with whom I have had the pleasure to work with. My thanks also go to people of the Véronique Gomord’s group, Marie-Christine Kiefer-Meyer, Sophie, Anne-Catherine, Claude and Véronique for helpful discussions and technical advice.

their assistance and kindness. I obviously thank Muriel and Marion for their coaching during my master thesis, and Muriel again for giving me the motivation to start this pH D.

Corinne Loutelier-Bourhis (UMR 6014) is thanked for help, advices and explanation about spectroscopic instruments. I also wish to thank the people of Jean-Paul Lassalles’ group : Jean-Paul Lassalles for all his help on statistic data analysis and Gaëlle. I thank also Nadine Paris for our discussion, it was nice to meet you.

I thank Sylvie, Bruno C and Jean for their helpful contribution to our research activity.

I would like to thank my pH D student colleagues : Eric, Thomas from Paris, David from Darnétal, Aurelia, Pravina from Neuville-les-Dieppe, Suha from Amman, Olivia from Gisors, Bruno from Pau, Christophe from Pamiers, Frédéric from Breteuil/iton, Martial from St Etienne du Rouvray, Emilie from Surville (Thank you Emily for your help on the printing stuff and your sunshine beam smiles). I was very happy to work with you, and I hope you will success as you deserve.

Martial, Frédéric, it was a pleasure to see you each morning, thanks for all the discussions about high level plant biology, nuclear physics, fluid mechanics, quanta chemistry, brain surgery, history of florentin arts during the pre-Leonardo da Vinci period, macro-economics modelisation of the stock-option fluidity in south Mozamby and others. I am just sorry that sports and girls issues have missed. You will remain an unsubstitutable colleague and friend of life.

All this research would have been unbalanced without the teaching on plant biology and genetics that I have done. I would, however, not have been able to do it without the kind help of people from the department of biology, Arlette Thoiron, Philippe Bruyant, Guillaume Hermier and Marie-Laure Follet-Gueye : thanks again for your help, for including me in your teaching team and having taught me so much.

My last thought goes to my family little mother, Audrey, Thierry, Nicolas, Alice, Aurélie, Gabriel, René, Rolande, Déborah, Nicole, Pierrot, Corinne, David, Sophie, Florence, Claire, Pascal, Gladys, Yaël, Simone, Emmanuel, Yannou, Paulette, Marc, Alexia, Pierre, Pierre-Olivier, Carole, Claire, Didier, Cyril, Cedric, Liliane, Patrice, Patrice, Luc and Nathalie.

Stages

Juillet-décembre 2002 : Caractérisation génétique de mutants d’insertion d’ADN-T. INRA de Versailles, Laboratoire de biologie cellulaire, France.

Janvier-Avril 2004 : Clonage et expression hétérologue de glycosyltransférases potentielles chez Pichia pastoris. Laboratoire de biochimie des plantes, Université vétérinaire et d’agriculture royale de Copenhague, Danemark.

Publications

KOBITO 1 encodes a novel plasma membrane necessary for normal synthesis of cellulose during cell expansion in Arabidopsis.

Silvère Pagant, Adeline Bichet, Keiko Sugimoto, Olivier Lerouxel, Estelle Aletti, Thierry Desprez, Maureen Mc Cann, Patrice Lerouge, Samantha Vernhettes and Herman Höfte. Plant Cell 14 (9) : 2001-13.

AtBXL1, a novel beta-xylosidase gene from Arabidopsis thaliana : involved in secondary cell wall metabolism.

Thomas Goujon, Abdelhak ElAmrani, Estelle Aletti, Isabelle Mila, Catherine Lapierre, Olivier Lerouxel, Jean-Paul Josseleau and Lise Jouanin. Plant Journal 33 (4) : 677-90. Rapid structural phenotyping of plant cell wall mutants by enzymatic oligosaccharide fingerprinting.

Olivier Lerouxel *, Tze Siang Choo *, Martial Séveno, Björn Usadel, Loïc Faye, Patrice Lerouge and Markus Pauly. Plant Physiology 130 (4) : 1754-63.

*

The two authors have equal contribution to this work.

Composition and dessication-induced alteration of the cell wall in the resurrection plant Craterostigma wilmsii.

Maïté Vicré, Olivier Lerouxel, Jill Farrant, Patrice Lerouge, Azeddine Driouich. Physiologia Plantarum 120 (2) : 229-239.

Mutants in DEFECTIVE GLYCOSYLATION, an Arabidopsis homolog of an oligosaccharyltransférase complex subunit, show protein underglycosylation, and defects in cell differenciation and growth.

Olivier Lerouxel, Grégory Mouille, Christine Andéme-Onzhigi, Marie-Pierre Bruyant, Martial Séveno, Corinne Loutelier-Bourhis, Azeddine Driouich, Herman Höfte and Patrice Lerouge. Plant Journal 42 (4) : 455-468.

Communications orales

Korrigan : involving of an endoglucanase in cellulose biosynthesis

Olivier Lerouxel, Patrice Lerouge et Loïc Faye. XXIIemes days of the french group of polymers. University of Rouen, Mt St Aignan, 7th and 8th of june 2001.

Functional genomics and the synthesis of cellulose

Herman Höfte, Olivier Lerouxel, Grégory Mouille, Remco Viëtor, Silvère Pagant, Samantha Vernhettes et Patrice Lerouge. Génoplante meeting, Poitiers, 1-3rd october 2001.

Cellulose biosynthesis: biochemistry and A.thaliana cell wall mutants.

Olivier Lerouxel. UMR 6037 seminar, University of Rouen, Mt St Aignan, 14th of february 2002.

Screening of A.thaliana cell wall mutants harbouring xyloglucan defects.

Olivier Lerouxel , Martial Séveno, Loïc Faye, Patrice Lerouge. French cell wall network, Reims, 29th and 30th of may 2002.

AtBXL1, a novel beta-xylosidase gene from Arabidopsis thaliana : involved in secondary cell wall metabolism.

Thomas Goujon, Abdelhak ElAmrani, Estelle Aletti, Isabelle Mila, Catherine Lapierre, Olivier Lerouxel, Jean-Paul Josseleau and Lise Jouanin. French cell wall network, INRA of Reims, France 29th and 30th of may 2002.

Phenotyping Arabidopsis cell wall mutants by enzymatic fingerprinting.

Olivier Lerouxel , Martial Séveno, Loïc Faye, Patrice Lerouge. Young researchers annual meeting, Dijon, 1st and 5th of july 2002.

Enzymatic fingerprinting for plant cell wall oligosaccharides profiling using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Tze Siang Choo, Olivier Lerouxel, Martial Séveno, Björn Usadel, Loïc Faye, Patrice Lerouge and Markus Pauly. Plant polysaccharides workshop, Cairns, Australia, june 2002. Methods for the analysis of the “polysaccharidome” of Arabidopsis.

Grégory Mouille, Herman Höfte, Stéphane Robin, Marc Lahaye, Christine Andeme-onzighi, Olivier Lerouxel, Azeddine Driouich and Patrice Lerouge. Génoplante meeting, Poitiers, France, march 2001.

Setting up screening tools for Arabidopsis cell wall mutant, and characterization of the defective glycosylation mutant altered for the N-glycan oligosaccharyltransferase complex function.

Olivier Lerouxel. KVL University seminar, Copenhagen, Denmark, 7th of july 2004.

dgl1 Arabidopsis mutant altered in the oligosaccharyltransferase complex shows protein underglycosylation and severe growth defects.

Olivier Lerouxel, Grégory Mouille, Christine Andéme-Onzighi, Marie-Pierre Bruyant, Azeddine Driouich, Herman Höfte and Patrice Lerouge. Xeme Cell Wall Meeting, Sorrento, Italy, 29th of August -2nd September of 2004.

Korrigan, a membrane-bound endo-β-glucanase required for normal cellulose synthesis in Arabidopsis : subcellular localisation and characterisation of mutant cell wall

Mouille G., Bichet A., Lerouxel O., Goubet F., Satiat-jeunemaître B., Pagant S., Vernhettes S., Mc Cann M., Bardor M. , Lerouge P. and Höfte H. Plant Polysaccharides 2000, Wageningen, The Netherlands, august 2000.

Cellulose biosynthesis and cell elongation

Herman Höfte, Mathilde Fagard, Silvère Pagant, Grégory Mouille, Guislaine Réfrégier, Adeline Bichet, Ageeth Van Tuinen, Stéphanie Robert, Thierry Desprez, Olivier Lerouxel, Patrice Lerouge and Samantha Vernhettes. Annual meeting of ASPPB, Madison, USA, june 1998.

Elucidation of the role of KORRIGAN, an endo 1,4-β-glucanase in cellulose biosynthesis Stéphanie Robert, Silvère Pagant, Grégory Mouille, Guislaine Réfrégier, Herman Höfte, Olivier Lerouxel, Remco Viëtor, Patrice Lerouge and Samantha Vernhettes. Cell Wall Meeting, Toulouse, France, 2-7th of september 2001.

Fast xyloglucan analysis tools for A. Thaliana mutants by enzymatic fingerprinting.

Olivier Lerouxel, Martial Séveno, Loïc Faye, Patrice Lerouge. Annual meeting of the biology and chemistry doctoral school, University of Rouen, France, 21th of march 2002.

Arabidopsis cell wall mutants screening by enzymatic fingerprinting.

Olivier Lerouxel , Martial Séveno, Loïc Faye, Patrice Lerouge. 8th IFRMP meeting, University of Rouen, France 1st and 5th of july 2002.

Kosedia Arabidopsis mutant, altered in the oligosaccharyltransferase complex, shows a restricted N-glycan transfer and dramatical growth defects.

Olivier Lerouxel, Grégory Mouille, Christine Adémé-onzighi, Azeddine Driouich, Loïc Faye, Herman Höfte and Patrice Lerouge. 10th IFRMP meeting, University of Rouen, France, june 2004.

Abréviations

ABREVIATIONS

α1,3-FucT α1,3-fucosyltransférase β1,2-XylT β1,2-xylosyltransférase

Ace Acide acérique

ADN-T Etiquette ADN

AGP Arabinogalactane protéine

ANTS 8-aminonaphtalène 1,3,6 trisulfonate

Api Apiose

BCP Bromocrésol pourpre

BSA Bovine serum albumin

Albumine sérique bovine

CAZy Carbohydrate Active enZyme

CDG Congenital disorders of glycosylation

CESA Cellulose-synthase

CNX Calnexine

CPG Chromatographie en phase gazeuse

CPG-SM Chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse en impact électronique

Col-O Ecotype Columbia

Con A Concanavaline A

CRT Calréticuline

CTAB Bromure d’hexadécyltriméthylammonium

DAD Defender of apoptotic cell dealth

DCB 2,6-dichlorobenzonitrile

Dha Acide 3-désoxy-D-lyxo-heptulosarique

DHB Acide 2,5-dihydroxybenzoïque

DMSO Diméthylsulfoxyde

ECL Electrochimioluminescence

EDEM ER-enhancing 1,2-mannosidase-like protein

EGase Endo-β-1,4-glucanase

ERAD Dégradation associée au RE (ER-associated degradation) FACE Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis

Electrophorèse d’oligosaccharides couplés à un fluorophore

FDA Fluorescéine diacétate

Fuc/F Fucose

GI/α-GlcI α-Glucosidase I GII/α-GlcII α-Glucosidase II

Gal/L Galactose

GalA Acide galacturonique

GALAT1 Acide glucuronyltransférase 1

GDP Guanidine diphosphate

Glc/G Glucose

GlcA Acide glucuronique

GlcNAc N-acétylglucosamine

GNT I N-acétylglucosaminyltransférase I GPI Ancre glycosylphosphatidylinositol GRP Protéines riches en glycine

HG Homogalacturonane

Chromatographie liquide haute performance

HPAEC-PAD High pH Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection

HRP Horse radish peroxidase

HyP Hydroxyproline

Kdo Acide 3-désoxy-D-manno-octulosonique

Lys Lysine

MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation - Time of Flight

Man Mannose

MFTIR Microspectroscopie infrarouge à transformée de Fourier NASC Nottingham Arabidopsis stock center

OST Oligosaccharyltransférase

PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis

PCR Polymerase chain reaction

PDI Protein disulfide isomerase

PME Pectine méthylestérase

PNGase F Peptide N-glycosidase F

PP-Dol Dolicholpyrophosphate

RE Réticulum endoplasmique

RG I Rhamnogalacturonane I

RG II Rhamnogalacturonane II

Rha Rhamnose

RT-PCR Reverse transcription - polymerase chain reaction

SDS Sodium dodecyl sulfate

SEM Système endomembranaire de sécrétion

Ser Sérine

STT Staurosporine and temperature-sensitive

Pro Proline

PRP Protéines riches en proline

TBS Tris buffer salt

TBE Tampon tris-borate EDTA

TCA Acide trichloroacétique

TFA Acide trifluoroacétique

Tris Tris(hydroxyméthyl)aminométhane

Tyr Tyrosine

UDP Uridine diphosphate

UGGT UDP-glucose:glycoprotèine glucosyltransférase

Val Valine

Wbp Wheat binding protein

WS Ecotype Wassilewskija

XG Xyloglucane

XTH Xyloglucane endo-transglucosylase/hydrolase Xyl/X Xylose

Abréviations

PRINCIPAUX MUTANTS CITES DANS LE MEMOIRE

mutants phénotypes catégorie gènes protéines références

rsw1-1 gonflement racinaire à

31°C At4g32410 AtCESA1 Arioli et al., 1998

procuste1-1 phénotype court At5g64740 AtCESA6 Fagard et al., 2000

eli1 lignine ectopique At5g05170 AtCESA 3 Caño-Delgado et

al., 2000 et 2003 irx5

Défaut de structure du

xylème At5g44030 AtCESA4 Taylor et al., 2003

irx3 Défaut de structure du

xylème At5g17420 AtCESA7 Taylor et al., 1999

irx1

Défaut de structure du

xylème At4g18780 AtCESA8 Taylor et al., 2000

fra5 Fragilité des tiges At5g17420 AtCESA7 Zhong et al., 2003

kobito1-1 nain At3g08550 nouvelle famille Pagant et al., 2002

tbr défaut de cellulose des trichomes

Non

disponible nouvelle famille

Pothika et Delmer, 1995 Nita et al., 2004

ixr1 résistance à l’isoxaben At5g05170 AtCESA 3 Scheible et al., 2001

ixr2 résistance à l’isoxaben At5g64740 AtCESA6 Desprez et al., 2002

korrigan1-1 nain At5g49720 KOR

endo-β-(1,4)-glucanase Nicol et al., 1998

acw1 défauts de paroi At5g49720 KOR

endo-β-(1,4)-glucanase Sato et al., 2002 rsw2-1 gonflement racinaire à

31°C At5g49720

KOR

endo-β-(1,4)-glucanase Lane et al., 2001 irx2 Défaut de structure du

xylème

cellulose

At5g49720 KOR endo-β-(1,4)-glucanase

Szyjanowicz et al., 2004 mur2-1 diminution du fucose

pariétale At2g03220 XG-fucosyltransférase Vanzin et al., 2002 mur3-1 diminution du fucose

pariétale

hémicellulose

At2g20370 XG-galactosyltransférase Madison et al., 2003 nolac-H18 défaut de cohésion

intercellulaire NpGUT1

glucuronyltransférase

potentielle Iwai et al., 2002 qua1-1 nain, défaut de cohésion

intercellulaire

pectines

At3g25140 GT potentielle Bouton et al., 2002 mur1-1 diminution du fucose

pariétale At3g51160 GDP-D-Mannose 4,6-déshydratase Reiter et al., 1993 Bonin et al., 1997 reb1, rhd1 gonflement des trichobastes, absence de poils absorbants At1g64440 UDP-D-glucose 4-épimérase Andème-Onzighi et al., 2002 mur4-1 diminution de

l’arabinose pariétale At1g30620

UDP-D-xylose 4-épimérase Burget et Reiter, 1999 mum4-1 rhm2-1 voies d’interconversion des sucres absence de sécrétion de mucilage At1g53500 NDP-L-Rhamnose synthase Usadel et al., 2004 Western et al., 2004

gcs1-1 embryon létale At1g67490 α-glucosidase I Boisson et al., 2001

knf embryon létale At1g67490 α-glucosidase I Gillmor et al., 2002 rsw3 gonflement racinaire à

31°C At5g63840 α-glucosidase II Burn et al., 2003

cyt1-1 embryon létale At2g39770 GDP-D-Mannose

pyrophosphorylase

Nickle et Meinke, 1998 Lukowitz et al.,

2001

vtc1 déficient en vitamine C At2g39770 GDP-D-Mannose

pyrophosphorylase Conklin et al., 1999 stt3a-1

altération de la racine en condition de stress

salin

At5g19690 STT3a (complexe OST)

stt3b-1 aucun

N-glycosylation

At1g34130 STT3b (complexe OST)

SOMMAIRE

SOMMAIRE 10 INTRODUCTION 13

1. La paroi 15

1.1 La paroi primaire : composition et biosynthèse 16

Les monosaccharides 16 Les polysaccharides 17 1.1.2.1 La cellulose 17 1.1.2.2 Les hémicelluloses 19 1.1.2.3 Les pectines 22 Les homogalacturonanes Le rhamnogalacturonane I (RG I) Le rhamnogalacturonane II (RG II)

Les protéines pariétales 24

1.1.3.1 Les extensines (HRGPs) 25

1.1.3.2 Les arabinogalactanes protéines 25

1.1.3.3 Les expansines 26

1.1.3.4 Les endo-β-1,4-glucanases (EGases) 26

1.1.3.5 Les xyloglucane-endo-transglucosylase/hydrolases (XTHs) 27

1.1.3.6 Les pectines méthylestérases (PMEs) 28

1.2 La paroi primaire : architecture 28

1.3 La paroi secondaire 31

2.Criblages et apports des mutants à l’étude de la biosynthèse pariétale 32

2.1 Genèse de collections de mutants d’Arabidopsis 32

2.2 Méthodes de criblage de mutants 33

2.2.1 Criblages phénotypiques 33

2.2.1.1 Approche macroscopique 33

2.2.1.1 Approche par microscopie 34

2.2.2 Criblages biochimiques 36

2.2.2.1 Composition en monosaccharides de la paroi 36

Sommaire

2.3 Apports des mutants à la compréhension des processus de biosynthèse de la paroi 38

2.3.1 Les voies d’interconversions entre monosaccharides 38

2.3.2 La biosynthèse de la cellulose 40

2.3.3 La biosynthèse du xyloglucane 42

2.3.4 La biosynthèse des polysaccharides pectiques 43

3. N-glycosylation et biosynthèse de la paroi 44

3.1 Généralités sur la N-glycosylation 44

3.1.1 Le réticulum endoplasmique, portail du système endomembranaire de sécrétion 44

3.1.2 Le translocon 44

3.1.3 Biosynthèse du N-glycanne précurseur 45

3.1.4 Le complexe oligosaccharyltransférase 45

3.1.4.1 Les partenaires du complexe oligosaccharyltransférase 46

3.1.4.2 Organisation du complexe oligosaccharyltransférase 47

3.1.4.3 Mutants d’Arabidopsis altérés dans des sous-unités du complexe

oligosaccharyltransférase 48

3.1.5 Le contrôle qualité des protéines 49

3.1.5.1 Le contrôle qualité des glycoprotéines : le cycle calnexine/calréticuline 49

3.1.5.2 Le contrôle qualité des glycoprotéines : activité endo-α-mannosidase 50

3.1.5.3 Le contrôle qualité des protéines : le système ERAD 51

3.1.5.4 Les Congenital Disorder of Glycosylation (CDGs) 52

3.1.6 Maturation des N-glycannes, particularités chez les végétaux 52 3.2 Interaction entre la N-glycosylation et la synthèse de polysaccharides pariétaux 53

3.2.1 L’exemple de la β-(1,6)-glucan synthase de Saccharomyces cerevisiae 53 3.2.2 Mutants d’Arabidopsis thaliana altérés dans la voie de N-glycosylation 54

4. OBJECTIFS DE LA THESE 56

CHAPITRE 1 58

Cribles biochimiques de mutants de paroi : détermination de la composition pariétale

1- Introduction : contexte de l’étude 59

2- Le matériel végétal 60

3- Composition en monosaccharides de la paroi 60

4- Marquage au 14C-glucose 61

5- Applications 62

5.1- Analyse de mutants d’Arabidopsis thaliana 62 5.2- Analyse de variants d’Arabidopsis thaliana 62

6- Conclusions 63

CHAPITRE 2 65

Cribles biochimiques de mutants de paroi : Rapid structural phenotyping of plant cell wall mutants by enzymatic oligosaccharide fingerprinting. Lerouxel O, Choo TS, Séveno M, Usadel B, Faye L, Lerouge P and Pauly M. Plant Physiology (2002) 130 : 1754-1763.

CHAPITRE 3 78

Sélection et caractérisation du mutant dgl1-1 : Mutants in DEFECTIVE

GLYCOSYLATION, an Arabidopsis homolog of an oligosaccharyltransferase complex subunit, show protein underglycosylation, and defects in cell differentation and growth. Lerouxel O, Mouille G, Andémé-Onzhigi C, Bruyant M-P, Séveno M, Loutelier-Bourhis C, Driouich A, Höfte H and Lerouge P.

CHAPITRE 4 109 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES CHAPITRE 5 114 MATERIELS ET METHODES CHAPITRE 6 146 BIBLIOGRAPHIE CHAPITRE7 165 ANNEXES ANNEXE I 166 ANNEXE II 178 ANNEXE III 193

Introduction

INTRODUCTION

INTRODUCTION

A ce jour, de nombreuses données sont disponibles sur la paroi végétale, particulièrement sur sa composition en polysaccharides, en protéines et en lignine. Cependant, l’organisation in muro de tous ces polymères, permettant la formation d’une matrice rigide et évolutive, demeure mal connue. De même, les processus de biosynthèse des polysaccharides, composant majoritairement les parois, sont pour la plupart inconnus. Depuis quelques années, l’étude d’une plante modèle de la famille des brassicacées, Arabidopsis thaliana, a permis de nombreuses avancées vers la compréhension de l’édification in planta de cette paroi. Durant l’année 2000, l’aboutissement du séquençage systématique de l’ensemble du génome d’Arabidopsis thaliana a offert un outil génétique important, ouvrant de nouveaux horizons pour l’étude de la paroi (Arabidopsis Genome Initiative, 2000). De façon concomitante au séquençage de ce génome, deux outils sont venus renforcer les capacités de la communauté scientifique à étudier les enzymes impliquées dans la biosynthèse et la mise en place des polysaccharides pariétaux : 1- l’identification et la classification des glycosyltransférases potentielles impliquées dans la synthèse de ces polysaccharides, sur la base d’homologies de séquences avec des gènes caractérisés dans d’autres organismes modèles (Henrissat & Bairoch, 1996 ; CAZy : Carbohydrate Active enZyme, http://afmb.cnrs-mrs.fr) et 2- la création de banques de mutants. A ce jour, quelques enzymes de la voie de biosynthèse des polysaccharides pariétaux ont pu être mises en évidence par analyse de mutants altérés dans des gènes codant potentiellement pour des glycosyltransférases répertoriées dans la classification CAZy. Parallèlement, la recherche de candidats potentiels dans des banques de mutants s’est également avérée fructueuse. Ces travaux sont basés sur la sélection de mutants arborant des défauts pouvant être reliés à des altérations de la paroi (problème de croissance, organes altérés…), via des cribles adaptés. L’analyse génétique de ces mutants a conduit à l’identification de gènes impliqués dans le métabolisme pariétal, menant ainsi à la compréhension de l’impact de la déficience de ces gènes sur le développement de la plante.

Le succès d’un crible de mutants de paroi dépend de la pertinence de celui-ci. Un « bon » crible se doit d’être rapide afin d’être appliqué à un grand nombre de mutants potentiels. Il se doit aussi d’être informatif : des données précises aiguilleront d’autant plus facilement vers la fonction du gène altéré. Mon travail de thèse s’inscrit dans ce contexte scientifique. La première partie de mes travaux a consisté à explorer la faisabilité et la pertinence de différentes méthodes biochimiques de criblage de mutants d’Arabidopsis présentant des défauts de paroi. Dans un second temps, ces stratégies ont été appliquées au

Introduction

criblage de mutants de la collection de Versailles présentant des défauts d’élongation cellulaire. Ce travail a conduit à l’isolement d’un mutant dont la caractérisation génétique a révélé l’altération d’une des protéines du complexe oligosaccharyltransférase impliqué dans la voie de N-glycosylation.

En introduction des travaux réalisés lors de ma thèse, je rappellerai les principales données actuelles sur la structure et l’organisation de la paroi végétale. Puis, je ferai une présentation générale de quelques stratégies de criblage développées ces dernières années dans l’optique de la sélection de nouveaux mutants altérés dans les processus de biosynthèse et de mise en place des polysaccharides de la paroi. Le dernier chapitre de l’introduction est consacré à la description du processus de N-glycosylation et de l’impact de défauts de celui-ci dans la biosynthèse pariétale.

1 - LA PAROI

La paroi cellulaire a longtemps été considérée uniquement comme une structure physique séparant la cellule végétale de l’environnement extérieur. Aujourd’hui, cette vision d’une paroi possédant un rôle unique de soutien a laissé place à celle d’une structure hautement complexe réalisant une grande diversité de fonctions au cours de la vie de la plante. La paroi cellulaire possède des propriétés mécaniques de rigidité et de résistance aux contraintes de pressions générées par la cellule, mais au-delà de ce rôle d’armature rigide, cette structure s’avère régulée afin de permettre l’élongation cellulaire requise pour la croissance de chaque organe. En effet, il est maintenant admis que l’élongation cellulaire est dirigée principalement par un relâchement, finement contrôlé, de certaines zones de la paroi. Lorsque la pression de turgescence de la cellule serait trop importante, ces zones où la paroi serait plus relâchée permettraient l’allongement de la cellule, dans une ou plusieurs directions, sans perte de sa structure globale, conservant alors ses propriétés mécaniques. La paroi est donc un acteur important du développement des végétaux, puisque son remaniement va permettre à la plante d’assurer sa croissance, mais qu’elle sera aussi le siège de modifications qualitatives (accumulation de cellulose, lignification, cutinisation…) qui assureront la différenciation de chaque tissu. Enfin, un aspect fonctionnel important de la paroi cellulaire est l’obstacle qu’elle oppose aux mouvements des macromolécules de tailles importantes et des organismes pathogènes. En effet, la paroi constitue un réseau dense et hautement organisé de macromolécules chargées négativement qui va protéger la cellule en limitant la progression des agents pathogènes. C’est pourquoi, au-delà de fournir une armature rigide à

l’ensemble de la plante, la paroi cellulaire est une structure dynamique impliquée dans le développement des végétaux, la différenciation tissulaire et la protection vis à vis des attaques pathogènes.

La composition des parois végétales, étudiée depuis plus de cinquante ans, est maintenant bien documentée, surtout dans un sous embranchement majeur du règne végétal : celui des angiospermes. Ce groupe immense, composé d’environ 250 000 espèces à morphologie variable, s’avère quasiment partout dominant à l’échelle du globe. L’analyse de la composition pariétale des deux sous-embranchements de ce groupe, les monocotylédones et les dicotylédones, a conduit les scientifiques à proposer des modèles d’organisation entre les polysaccharides, les glycoprotéines de structure et les composés phénoliques au sein de ces parois. On y retrouve également des ions tels que le bore et le calcium qui interviennent pour complexer des polysaccharides pectiques spécifiques, ainsi que des activités enzymatiques responsables de la dégradation ou du réarrangement des polymères pariétaux (endoglucanases, expansines, xylosyl-endo-transglycosidases). Les polysaccharides constitutifs de cette paroi sont regroupés en trois classes définies par leurs degrés d’extractibilité hors de la paroi et par leurs compositions respectives en monosaccharides. Ainsi, les polymères les plus extractibles sont regroupés sous le terme de pectines, ensuite une deuxième catégorie est formée par la classe des hémicelluloses, enfin la dernière classe est composée par la cellulose, dont la structure cristalline la rend insoluble. Ces composés diffèrent également par leur lieu et mode de synthèse. La cellulose est synthétisée au niveau de la membrane plasmique, les autres polymères sont synthétisés dans l’appareil de Golgi puis exportés, déposés et remaniés dans la paroi.

1.1 La paroi primaire : composition et biosynthèse

1.1.1 Les monosaccharides

Les composés polysaccharidiques que l’on retrouve au niveau de la matrice pariétale sont issus de la polymérisation de nucléotide-sucres par des glycosyltransférases. Les monosaccharides constitutifs des parois sont principalement l’arabinose, le rhamnose, le xylose, le mannose, le galactose et le glucose, ainsi que les acides glucuronique et galacturonique. Les plantes sont généralement des êtres vivants autotrophes et les monosaccharides utilisés pour la biosynthèse de leurs parois dérivent tous du fructose-6-phosphate produit lors de la photosynthèse via le cycle de Calvin. Le fructose-6-fructose-6-phosphate est

Figure 1: Voies d’interconversion des nucléotides sucres chez les plantes. l’ensemble des monosaccharides dérive du fructose-6-P produit lors de la photosynthèse grâce à l’action de 26 enzymes impliquées dans les mécanismes d’interconversion (Reiter & Vanzin, 2001).

GDP-L-Fuc 4-céto-6-désoxy-GDP-D-Man

GDP-D-Man 4,6-déshydratase NAD(P)+ _NAD(P)H 3,5-épimerase-4-réductase (GER1) PPi GTP GDP-D-Man D-Man-1-P GDP-D-Man pyrophosphorylase Phosphomannomutase D-Man-6-P Phosphomannose isomérase D-Fructose-6-P Phosphoglucose isomérase D-Glc-6-P Phosphoglucomutase D-Glc-1-P UDP-D-Glc pyrophosphorylase UTP PPi UDP-D-Glc

saccharose UDP-L-Rha

UDP-D-Gal D-Gal-1-P D-Gal UDP-D-GlcA D-GlcA-1-P D-GlcA myo-inositol UDP-D-GalA

UDP-D-Xyl UDP-L-Ara

PPi UTP PPi UTP PPi UTP ADP ATP H2O O2 ADP ATP CO2 GDP-L-Gal GDP-D-Man 3,5-épimérase L-ascorbate NAD(P)H NAD(P)+ UDP-D-Gal pyrophosphorylase D-Galactokinase (AGK1) L-Ara-1-P L-Ara L-Arabinose kinase UDP-L-Ara pyrophosphorylase UDP-D-Glc 4-épimerase (UGE1) UDP-D-Xyl 4-épimérase UDP-D-GlcA 4-épimérase UDP-D-GlcA décarboxylase UDP-D-GlcA pyrophosphorylase D-Glucuronokinase Inositol oxygénase UDP-D-Api + UDP-D-Xyl UDP-D-Glc déshydrogénase (UGD)

UDP-D-Api/UDP-D-Xyl synthase

4,6-déshydratase 3,5-épimérase 4-réductase

UDP Fructose

2NAD(P)+ _{2 NAD(P)H}

ATP ADP

Photosynthèse

converti au niveau du cytosol en pentoses, hexoses et acides uroniques par les voies métaboliques d’interconversion des nucléotide-sucres dont les aspects biochimiques sont aujourd’hui relativement bien connus (figure 1). Cependant, à un niveau moléculaire, la caractérisation des gènes codant les enzymes qui permettent l’interconversion de ces nucléotide-sucres en est à ses débuts, bien que l’étude de mutants d’Arabidopsis présentant des altérations du contenu en monosaccharides de leur paroi a récemment permis quelques avancées significatives (Reiter & Vanzin, 2001 ; voir chapitre 2.3.1).

1.1.2 Les polysaccharides

1.1.2.1 La cellulose

La cellulose est, en terme de biomasse, le polymère le plus abondant à l’échelle de la planète. Elle est synthétisée par des organismes aussi différents que les bactéries (Agrobacterium tumefasciens, Acetobacter xylinum), les champignons et les plantes. La cellulose est un β-(1,4)-glucane linéaire (figure 2A). Chez les plantes, on estime que 36 molécules de ce β-(1,4)-glucane s’assembleraient en une microfibrille paracristalline via des interactions hydrogène intrachaînes et interchaînes entre groupements hydroxyles (Delmer, 1999). Dans la paroi primaire, on estime qu’un polymère de cellulose serait composé d’environ 6000 résidus glucose et que ce nombre serait porté jusqu’à 16000 résidus dans la paroi secondaire. On distingue deux types d’organisation de la cellulose. La cellulose I correspond à la molécule synthétisée par les êtres vivants. Les chaînes de cellulose s’organisent alors parallèlement, c’est-à-dire avec toutes les extrémités réductrices des molécules composant la microfibrille dirigées dans le même sens. La cellulose II correspond à une réorganisation des chaînes, après des traitements alcalins, dans un état antiparallèle plus stable que l’on retrouve par exemple dans le papier. L’analyse de la cellulose native par RMN du solide a permis de montrer qu’elle pouvait encore être divisée en deux sous-domaines Iα et Iβ correspondant à des niveaux d’organisation différents des molécules de cellulose les unes par rapport aux autres dans la microfibrille (Atalla & VanderHart, 1984). Le type Iα correspond à une organisation cristalline triclinique où les chaînes qui constituent la microfibrille possèdent toutes le même décalage diagonal, tandis que le type Iβ correspond à une organisation où les chaînes parallèles s’organisent par deux afin de réaliser un cristal monoclinique à l’échelle de la microfibrille (figure 2B ; Baker et al, 1997). Ces deux types de

cellobiose

monoclinique

Iβ

67°/ 63°

triclinique

Iα

Figure 2 : (A) Structure de la cellulose, β-(1,4)-glucane de la paroi des végétaux. (B) Organisation des molécules de cellulose entre-elles, selon les types Iα et Iβ (d’après Baker et al., 1997).

A

cellulose I sont naturellement présents dans la cellulose cristalline native des êtres vivants mais dans des rapports variables : le type Iα est majoritaire chez les bactéries et les algues, tandis que le type Iβ prédomine chez les végétaux. Par ailleurs, on caractérise la cellulose des parois végétales comme étant cristalline (Iα ou Iβ) ou paracristalline, en fonction de la qualité des liaisons hydrogène établies entre les molécules. Dans les zones cristallines, le réseau tridimensionnel de ces liaisons est le plus élevé possible, tandis que ce haut degré d’organisation n’est pas atteint dans les zones paracristallines.

Grâce à son organisation particulière, la cellulose apporte majoritairement les caractéristiques mécaniques structurantes de la matrice pariétale. D’autre part, la synthèse de la cellulose en anneau, perpendiculairement à l’axe d’élongation de la cellule, définirait l’anisotropie de croissance de la cellule végétale. Jusqu’en 1995, aucune glycosyltransférase impliquée dans la biosynthèse des polysaccharides pariétaux n’avait été purifiée à homogénéité et aucun gène codant une telle activité n’avait été identifié et cloné. La caractérisation de mutants bactériens produisant des quantités réduites de cellulose chez Acetobacter xylinum (Saxena et al., 1990 et 1991) et Agrobacterium tumefasciens (Mathysse et al., 1995a et 1995b) a permis l’identification d’opérons bactériens impliqués dans le mécanisme de biosynthèse de la cellulose, aboutissant à la détermination d’un motif peptidique caractéristique des Cellulose-Synthases (CESA) : DDDQXXRW (Saxena et al., 1995). Sur la base d’homologie avec ces séquences bactériennes, deux cellulose-synthases potentielles : CELA-1 et CELA-2 (rebaptisées GhCESA1 et GhCESA2 en 1999) ont été identifiées dans une banque d’EST (expressed sequence tag) de coton, établie durant la synthèse de la paroi secondaire, très riche en cellulose (Pear et al., 1996). Par la suite, une approche analogue menée sur le génome d’Arabidopsis thaliana a permis l’identification de 10 isoformes de sous-unités catalytiques de synthèse de la cellulose nommées AtCESA1 à AtCESA10, dont des orthologues sont détectés chez de nombreuses plantes: maïs, coton, riz (Holland et al., 2000 ; Desprez et al., 2002). Ces gènes ne présentent qu’une faible identité globale (environ 30%) avec leurs homologues bactériens, cependant la « signature » contenant les acides aminés « DDDQXXRW » (Saxena et al., 1995) apparaît très conservée.

Le siège de la synthèse de la cellulose chez les plantes est une structure hexagonale, incluse dans la membrane plasmique, dénommée rosette. Cependant, le mode d’extrusion de la cellulose reste purement hypothétique (Brown and Saxena, 2000). Trois différents types de données permettent de corréler la synthèse de la cellulose à ces rosettes. Premièrement, le mutant d’Arabidopsis thaliana rsw1, muté dans un gène codant une cellulose synthase (CESA

Figure 3 : Modèle d’organisation des cellulose-synthases (CESA), en « rosette » (d’après Doblin et al., 2002). (A) Six CESA s’associeraient pour former une rosette et 6 rosettes se regrouperaient afin de polymériser 36 molécules de cellulose de façon synchronisée. (B) La dissection génétique de la synthèse de la cellulose montre que trois type de CESA (α1, α2, β) seraient présentes pour former une rosette fonctionnelle. Les CESA α1 n’interagissent qu’avec les CESA β, au sein d’une même rosette. Les CESA α2 interagissent entre-elles, mais entre des rosettes différentes. Les CESA β n’interagissent qu’avec les CESA α, uniquement au sein d’une rosette. L’étude de mutants a montré que du maintien de cette organisation dépend la synthèse correcte de la cellulose (Doblin et al., 2002).

1) et présentant à la température restrictive une diminution de la quantité de cellulose, montre à cette température restrictive un désassemblage de ces rosettes, alors que leur assemblage est correct à la température permissive (Arioli et al., 1998). Deuxièmement, le mutant d’orge brittle culm, déficient en cellulose présente aussi une forte diminution du nombre de rosette (20% de la quantité du sauvage) (Kimura et al., 1999a). Enfin, troisièmement, un anticorps polyclonal obtenus contre un polypeptide de CESA de coton permet de détecter spécifiquement ces structures (Kimura et al., 1999b). Chaque rosette serait composée de 6 sous-unités, et chacune de ces sous-unités contiendrait plusieurs cellulose-synthases (possiblement six). Cette organisation permettrait donc la synthèse de 6 chaînes glucaniques par sous-unités, et finalement la polymérisation de 36 chaînes en une microfibrille, à l’échelle de la rosette (figure 3A). Plusieurs mutants d’Arabidopsis pour ces gènes de cellulose- synthases ont été identifiés et analysés, permettant d’affiner la compréhension de l’organisation de la rosette qui synthétise la cellulose (voir chapitre 2.3.2). D’après Scheible et al. (2001), au moins deux types de CESA (α et β), seraient nécessaires pour l’assemblage en rosette. De plus, parmi ces sous-unités α on distinguerait deux isoformes : α1 qui interagirait avec des sous-unités β, et α2 qui interagirait avec 2 types des sous-unités β et α2 (figure 3B).

1.1.2.2 Les hémicelluloses

Les hémicelluloses sont des polysaccharides apparentés à la cellulose de part leurs squelettes formés de résidus de D-hexoses liés en β-(1,4). Deux types d’hémicelluloses sont fréquemment rencontrés, le xyloglucane pour les dicotylédones et l’arabinoxylane pour les monocotylédones. Les polymères hémicellulosiques peuvent se lier à la cellulose de manière non-covalente et ainsi recouvrir et/ou relier les microfibrilles de cellulose entre elles (Mc Cann et al., 1990), afin de constituer un réseau, nommé réseau cellulose/hémicellulose. Ce réseau confère à la paroi végétale ses propriétés mécaniques, notamment sa résistance à la pression de turgescence de la cellule.

Le xyloglucane est le type principal d’hémicellulose des dicotylédones. Il est composé d’un squelette de D-glucoses liés en β-(1,4) et partiellement substitué par des résidus α-(1,6)-xyloses. Ces derniers pourront être successivement substitués à leur tour par d’autres résidus monosaccharidiques (galactose et éventuellement fucose). Une nomenclature permet de désigner les structures des unités répétitives des xyloglucanes en fonction de leur type de ramification (Fry et al., 1993 ; figure 4). Ainsi, cette nomenclature attribue à chaque résidu

(A)

(B)

(C)

Figure 4 : Principaux types du xyloglucane, dont le motif répétitif (A) de type XXXG est caractéristique des dicotylédones. (B) Le motif XXGG, se retrouve chez les Solonacées. (C) Nomenclature abrégée des structures des chaînes latérales rencontrées dans le xyloglucane (Fry et al., 1993).

glucose du squelette de la molécule une lettre correspondant au dernier résidu d’ose de la chaîne latérale : la lettre « G » renvoie à un β-D-Glc non branché, la lettre « X » à une séquence α-D-Xyl-(1,6)-β-D-Glc, la lettre « L » à une séquence β-Gal-(1,2)-α-D-Xyl-(1,6)-β-D-Glc et la lettre « F » à une séquence α-L-Fuc-(1,6)-β-Gal-(1,2)-α-D-Xyl-(1,6)-β-β-Gal-(1,2)-α-D-Xyl-(1,6)-β-D-Glc, pour les substitutions les plus courantes. D’autres chaînes latérales sont représentées dans la figure 4. Deux grands types d’organisation des xyloglucanes ont à ce jour été décrits dans le règne végétal (Vincken et al., 1997 ; figure 4):

- le type XXXG, présent chez les gymnospermes et majoritaire chez les angiospermes, est constitué de la répétition d’un core minimal heptasaccharidique composé de l’enchaînement de 4 résidus glucose substitués par 3 résidus xylose,

- le type XXGG, caractéristique des Solonacées et du riz, possède un core minimal hexasaccharidique, dont le troisième résidu glucose n’est plus substitué par un résidu xylose.

La fonction du xyloglucane est de relier, via son squelette osidique de type « cellulose », les microfibrilles de cellulose entre-elles dans la paroi (Carpita & Gibeaut, 1993). La longueur des molécules de xyloglucane in-muro, entre 30 à 400 nm, est supérieure à la distance séparant deux couches successives de cellulose dans la paroi (30 nm), ce qui suggère que ces polysaccharides relient plus de deux microfibrilles entre-elles (Mc Cann et al., 1992). Par son interaction avec les microfibrilles de cellulose et donc son rôle dans la formation du réseau cellulose/hémicellulose, le xyloglucane s’avère être un polymère clé dans la régulation de la croissance pariétale. De fait, de nombreuses activités protéiques présentes au niveau de la paroi (endoglucanase, xyloglucane endo-transglucosylase/hydrolase, expansine) interagissent spécifiquement dans la paroi avec le xyloglucane, afin de relâcher le réseau cellulose/hémicellulose et permettre l’élongation cellulaire.

Chez Arabidopsis thaliana, quatre classes de glycosyltransférases sont impliquées dans l’élaboration de ce polysaccharide : les α-fucosyltransférases, les β-galactosyltransférases, les α-xylosyltransférases et les glucane-synthases. Il est admis que la XG β-(1,4)-glucane-synthase et les α-(1,6)-xylosyltransférases agiraient en coopération dans les mêmes membranes golgiennes afin de synthétiser le squelette du xyloglucane. En effet, des fractions membranaires golgiennes ont pu être caractérisées comme ayant cette activité in-vitro en présence d’UDP-Glc et d’UDP-Xyl (Brummell et al., 1990). L’étude de la biosynthèse du

Figure 5 : Structure des glucuronoarabinoxylanes, hémicelluloses majoritaires des parois (type II) de monocotylédones. Le squelette de β-(1,4)-xylose est substitué principalement par de l’arabinose et éventuellement par de l’acide glucuronique.

xyloglucane a récemment connu un certain succès puisque seule la XG-β-(1,4)-glucane synthase n’est pas identifiée au niveau moléculaire à ce jour. La XG fucosyltransférase AtFUT1 fut la première enzyme clonée et caractérisée (Perrin et al., 1999), par homologie avec une protéine d’épicotyle de pois possédant une activité fucosyltransférase. Plus récemment, la première α-(1,6)-xylosyltransférase d’Arabidopsis a pu être identifiée, par homologie de séquence avec l’α-(1,6)-galactosyltransférase impliquée dans la biosynthèse d’un galactomannane (Edwards et al., 1999), et l’activité α-(1,6)-xylosyltransférase du produit de ce gène a été démontrée, après expression dans le système hétérologue Pichia pastoris (Faik et al., 2002). Enfin, la caractérisation du mutant mur3 a permis l’identification de la XG galactosyltransférase (Madson et al., 2003 ; chapitre 2.3.3)

Hormis le xyloglucane, on rencontre d’autres types d’hémicelluloses dans le règne végétal, tels que les xylanes, les arabinoxylanes et glucuronoarabinoxylanes, les mannanes, les glucomannanes et les galactomannanes. Les arabinoxylanes sont des hémicelluloses très répandus, constitutifs des parois des monocotylédones telles que les plantes céréalières (paroi de type II ; Carpita & Gibeaut, 1993). Les arabinoxylanes et glucuronoarabinoxylanes se composent d’un squelette de β-(1,4)-xylopyranose auquel peuvent se lier des unités L-arabinofuranose en α-(1,3) et/ou α-(1,2) et des acides α-D-(1,2) glucuroniques (parfois 4-O-méthylés) dont la distribution varie en fonction des différentes plantes (figure 5). Les glucomannanes sont constitués par l’enchaînement de résidus glucose et de résidus mannose liés en β-(1,4) qui ne sont généralement pas substitués, et les galactomannanes sont formés d’un squelette de résidus mannose liés en β-(1,4) avec des substitutions α-D-galactosyl en O-6. Une α-(1,6)-galactosyltransférase impliquée dans la synthèse de cette ramification fut une des premières glycosyltransférases caractérisées dans le règne végétal (Edwards et al., 1999). Par ailleurs, une mannane synthase vient d’être récemment caractérisée (Dhugga et al., 2004).

1.1.2.3 Les pectines

Les pectines forment une catégorie complexe de polysaccharides qui contiennent tous des acides galacturoniques liés en α-(1,4). A ce jour, 3 classes de polysaccharides pectiques ont été caractérisés : les homogalacturonanes (HG), le rhamnogalacturonane I (RG I) et un homogalacturonane hautement substitué, appelé rhamnogalacturonane II (RG II). Les pectines sont un des composants majeurs des parois primaires et on estime généralement qu’elles représentent un tiers des macromolécules des parois primaires. Elles sont en partie présentes

Arabinane

Galactane

Galactane de type I

Figure 6 : Structures de l’homogalacturonane (A) et du xylogalacturonane (B). Structure du rhamnogalacturonane I (C,D,E) et de quelques unes de ses substitutions de type arabinane (C), galactane (D) ou galactane de type I (E).

Homogalacturonane

Xylogalacturonane

au niveau de la lamelle moyenne où elles permettent et régulent l’adhésion intercellulaire. Elles sont, par contre, rares dans les parois secondaires. Finalement, les pectines peuvent être décrites comme une classe majeure de polysaccharides des plantes, essentielle dans la paroi primaire. La matrice pectique constitue un réseau hydraté, adapté à l’extension du réseau cellulose/hémicellulose, qui d’une part contrôle la porosité cellulaire et qui d’autre part est un acteur majeur de l’adhésion entre les cellules.

Les homogalacturonanes

Les homogalacturonanes sont des polymères linéaires composés de 100 à 200 résidus d’acide α-D-(1,4)-galacturonique (GalA) (Thibault et al., 1993). Ce sont des polysaccharides pectiques abondants et synthétisés dans l’appareil de Golgi, puis déposés dans la paroi, généralement sous forme d’ester de méthyle (figure 6A). La désestérification de ces groupements carboxyliques sous l’action de pectines méthylestérases pariétales permet la formation in muro de gels par formation de ponts calciques entre les fonctions carboxylates de plusieurs chaînes homogalacturonanes. Plus rarement, ces polymères peuvent être acétylés en C-3 ou en C-2 (Ishii, 1997 ; Pauly & Scheller, 2000) ou substitués en C-3 par un résidu xylose, conduisant ainsi à la formation d’un domaine xylogalacturonane (Schols et al., 1995) (figure 6B). Enfin, la substitution par un résidu apiose en C-2 ou C-3 du GalA a été décrite chez Lemna minor et Spirodela polyrrhiza (Ridley et al., 2001). Ces modifications de la structure des homogalacturonanes seraient reliées à une évolution des propriétés des domaines homogalacturonanes, sans qu’il n’y ait actuellement de données précises confortant cette hypothèse.

La biosynthèse de l’homogalacturonane serait effectuée par une « acide galacturonyltransférase » nommée GALAT1, qui a pu être partiellement purifiée à partir de membranes de cellules de tabac. Cette enzyme montre une activité non-processive sur des acides polygalacturoniques ayant un degré de polymérisation supérieur à 9 (Doong & Mohnen, 1998). Par la suite, le même groupe a mis en évidence que la biosynthèse de l’homogalacturonane est le résultat de l’addition de résidus GalA à l’extrémité non-réductrice du polymère en élongation (Scheller et al., 1999 ; Sterling et al., 2001).

-

4GalAα1-Chaîne A

2-O-MeαXylp

αGalpA

βGalpA

2

βApif

Rhap

αFucp

βGlcpA

α-L-Galp

αRhap

Chaîne C

3

αKdo

Chaîne D

βAraf

3

βDha

2

αRhap

αArap

βGalp

βRhap

Chaîne B

αAcef

βApif

2-O-MeαFucp

Bore

Figure 7: Structure du rhamnogalacturonane II dont la chaîne A porte le site de dimérisation par le bore ( Api: apiose; Dha: acide 3-désoxy-D-lyxo-heptulosarique; Kdo: acide 3-désoxy-D-manno-octulosonique, Ace: acide acérique).

Le rhamnogalacturonane I (RG I)

Le rhamnogalacturonane I est un polysaccharide pectique formé dont le squelette est composé de la répétition du disaccharide [ 4)-α-D-GalA-(1,2)-α-L-Rha-(1 ] (figures 6C, 6D, 6E). Les résidus GalA du squelette du RG I peuvent être O-acétylés en C2 ou en C3 (Lerouge et al., 1993 ; Rihouey et al., 1995 ; Pauly & Scheller, 2000). Les résidus GalA du RG I ne sont pas substitués par des chaînes latérales osidiques (mono- ou oligosaccharidiques) bien qu’une étude récente ait montré qu’environ 2% des résidus GalA du RG I de la betterave sucrière présentaient un résidu de β-D-GlcA lié en C-3 (Renard et al., 1999). Inversement, 20-80% des résidus rhamnose du RG I (selon les plantes et les méthodes d’extraction), sont substitués en C-4 par des chaînes oligosaccharidiques latérales (O’Neill et al., 1990). Ces chaînes latérales sont constituées d’arabinanes composées de résidus α-(1,5)-L-arabinofuranosyl ramifiés en C-2 ou C-3, de galactanes composés de résidus β-(1,4)-D-galactose liés de façon linéaire ou branchée ou d’arabinogalactanes de type I composés d’un squelette de β-(1,4)-galactane ramifié par des résidus α-(1,3)-L-arabinofuranosyl et de courtes chaînes d’arabinanes.

Les activités enzymatiques permettant d’assurer la biosynthèse du squelette du RG I sont inconnues et aucun mutant de RG I n’a été identifié à ce jour. Cependant, les activités galactosyltransférases permettant la synthèse des chaînes latérales de ce polymère ont pu être mesurées, notamment chez le lin et le soja (Peugnet et al., 2001 ; Konishi et al., 2004).

Le rhamnogalacturonane II (RG II)

Le rhamnogalacturonane II n’est pas structurellement relié au RG I car son armature polysaccharidique est uniquement composée d’acides galacturoniques liés en α-(1,4). Dans le RG II, ces résidus GalA sont substitués par 4 chaînes latérales nommées A, B, C, D. Les deux chaînes latérales A et B sont les principales : la chaîne A est formée par un octasaccharide et la chaîne B par un heptasaccharide, l’une et l’autre étant attachées au C-2 du GalA de l’armature (figure 7). Deux disaccharides de structure α-Rha-(1,5)-Kdo et β-Ara-(1,5)-Dha forment respectivement les chaînes C et D. Le paradoxe du RG II se résume par sa complexité structurale qui tranche avec son caractère ubiquiste. En effet, le RG II est un polysaccharide hautement complexe nécessitant l’intervention de 21 glycosyltransférases pour son élaboration. Il est composé de résidus osidiques rares comme l’apiose, le 2-O-méthyl-L-

o o o o Homogalacturonane Diester de borate B

A

B

C

D

A

D

C

B

-Figure 8 : Schématisation de la dimérisation in muro du rhamnogalacturonane II via un di-ester de borate dans la paroi. L’étude du mutant mur1 a démontré l’importance physiologique de ces dimères chez Arabidopsis thaliana (O’Neill et al., 2001).

fucose, le 2-O-méthyl-D-xylose, le Dha, le Kdo et l’acide acérique et de monomères de séries L ou D (Gal) ou de formes pyranose ou furanose (Ara) (Pérez et al., 2003). Malgré cette complexité, ce polymère est très conservé et ne présente que quelques variantes au niveau des décorations des chaînes A et B. On le retrouve au niveau des parois primaires de tous les végétaux supérieurs (O’Neill et al., 1990). Par ailleurs, des polymères pariétaux structurellement très proches du RG II des plantes supérieures ont été mis en évidence chez les ptéridophytes (végétaux vasculaires inférieurs). Par contre, ce polymère n’existe qu’en très faibles quantités chez les bryophytes (végétaux non vasculaires), suggérant une corrélation entre l’apparition du RG II dans l’évolution et la capacité des plantes vasculaires à assurer un port dressé et former des parois secondaires lignifiées (Matsunaga et al., 2004).

Dans les parois primaires, le RG II existe sous la forme de dimères reliés par un atome de bore (Kobayashi et al., 1996). La formation de ces liaisons diesters de borate, entre les résidus apiosyl des chaînes A de chaque molécule, permet d’associer in muro des chaînes pectiques proches et ainsi d’accroître la cohésion de la matrice pariétale (O’Neill et al., 2001 ; figure 8).

1.1.3 Les protéines pariétales

Les parois cellulaires forment un environnement complexe, à la fois par les différentes fonctions qu’elles assurent dans le développement de la plante et par la diversité des familles de molécules qui les composent. Des protéines rentrent dans la composition et l’organisation de cette paroi et l’on peut les séparer, globalement, en deux catégories : les protéines ayant un rôle structural ou fonctionnel : extensines, protéines riches en proline ou glycine, arabinogalactanes protéines, et les protéines ayant des activités sur les polysaccharides: expansines, endoglucanases, xyloglucane-endo-transglucosylases/ hydrolases, permettant de remodeler les polysaccharides et ainsi d’assurer un contrôle moléculaire de l’extensibilité pariétale.

1.1.3.1 Les extensines et protéines riches en proline ou glycine

Les extensines sont des protéines ubiquistes du règne végétal dont la séquence protéique contient un signal peptidique permettant leur export vers la paroi et une région répétée riche en proline, dont le motif principal est SerPro4 (Sommer-Knudsen et al., 1998). Pour la plupart, les gènes codant des extensines sont régulés lors du développement, induits

Figure 9 : Structure des arabinogalactane protéines, intégrées dans les membranes par une ancre glycosylphosphatidyl inositol (GPI). Les hydoxyproline, thréonine ou sérine du polypeptide peuvent Être O-glycosylées par des chaînes d’arabinogalactanes de type II.

lors de blessures ou par des éliciteurs, ou encore lors d’attaques fongiques (Josè & Puidomènech, 1993). Bien que de nombreux gènes d’extensines aient été clonés, leurs protéines respectives ont rarement été purifiées. Ainsi, peu d’informations sont disponibles sur les modifications post-traductionnelles de ces molécules telles que leur hydroxylation, leur glycosylation, les pontages entre tyrosines ou encore leurs éventuelles interactions avec les polysaccharides pectiques. Une extensine du péricarpe de maïs (Hood et al., 1991) a cependant été analysée en détail : elle comporte un seul motif SerPro4 et est composée pour 27% de glucides constitués de courtes chaînes d’arabinane liées à des hydroxyprolines (Kieliszewski et al., 1994). Cette glycosylation serait nécessaire à la stabilité de la protéine dans la paroi. Enfin, une des caractéristiques des extensines est leur capacité à s’associer entre elles via la formation de ponts isodityrosyles conduisant ainsi à leur réticulation et à la formation de polymères pariétaux insolubles.

Pour leur part, les protéines riches en proline (PRP) contiennent un motif répété Pro-Hyp-Val-Tyr-Lys faiblement glycosylé et les protéines riches en glycine (GRP) contiennent de 30 à 70% de résidus glycine organisés en motifs répétés (Cassab, 1998).

1.1.3.2 Les arabinogalactane protéines

Les arabinogalactane protéines (AGP) sont des protéoglycanes composés de 90 à 95% d’oses parmi lesquels l’arabinose et le galactose sont principalement représentés. Ces oses sont liés à la partie protéique via une O-glycosylation des résidus hydroxyproline, thréonine et sérine de la séquence protéique (Du et al., 1996). Les polysaccharides associés à la partie protéique des AGP sont des galactanes dit de type II (figure 9), formés d’un squelette de (1,3)-β-D-Gal substitués en C6 par de courtes chaînes de α-D-Gal et se terminant par un résidu arabinose. Les AGP ont également la particularité d’être associées à la membrane plasmique via une ancre glycosylphosphatidylinositol (GPI).

De nombreux rôles sont actuellement proposés pour les AGPs : elles contribueraient à l’adhésion du pollen sur le pistil lors de la fécondation, elles seraient une réserve de monosaccharides consommés lors de la croissance du tube pollinique, elles interviendraient dans le contrôle de la balance hydrique de la cellule ou encore contrôleraient des processus de différenciation cellulaire. En effet, il a été démontré, par l’usage d’anticorps monoclonaux, que la présence de ces AGP est régulée au cours du temps, de façon spécifique notamment dans la racine (Knox, 1991) et que la composition des polysaccharides de ces AGPs évoluait au cours du développement (van Hengel et al., 2002). Par ailleurs, les AGPs joueraient un rôle

Introduction

dans le contrôle de l’anisotropie de l’expansion cellulaire, comme le suggère une étude récente du mutant d’Arabidopsis thaliana reb1 (Andème-Onzighi et al., 2002).

1.1.3.3 Les expansines

Les expansines ont été caractérisées en 1989 par Daniel Cosgrove (Université de Pensylvannie, USA), lors d’une étude sur l’extension d’hypocotyles de concombre en croissance (Cosgrove, 1989). Ces protéines induisent un relâchement durable de la paroi et une extension pH-dépendante (Cosgrove, 1997). De nombreuses expansines ont maintenant été clonées majoritairement chez des dicotylédones (Shcherban et al., 1995). Cependant, leur mode d’action dans les processus de relâchement de la paroi reste énigmatique. Des études ont montré que les expansines n’avaient pas d’activités hydrolytiques contre les polysaccharides pariétaux (McQueen-Mason & Cosgrove, 1994 et 1995). L’hypothèse la plus communément admise est que les expansines affaibliraient les interactions hydrogène entre les chaînes de glucanes, notamment entre cellulose et hémicellulose, permettant un glissement des microfibrilles de cellulose vis-à-vis de l’ensemble de la matrice pariétale. Des analyses récentes de la structure des expansines suggèrent qu’elles possèdent 3 domaines fonctionnels. Le premier domaine comporte le signal peptide et porte la portion N-terminale de la protéine mature, le deuxième domaine présente des similarités de séquences avec les endoglucanases et enfin le troisième comporte des caractéristiques de domaines de liaison à la cellulose (Cosgrove, 2000).

1.1.3.4 Les endo-β-1,4-glucanases (EGases)

Les endo-β-1,4-glucanases (EGases) sont des enzymes capables d’hydrolyser les chaînes de β(1,4)-Glc que l’on retrouve chez de nombreux êtres vivants, des bactéries jusqu’aux plantes supérieures. A ce jour, on dénombre un total de 12 familles d’EGases, parmi lesquelles la famille 9 qui regroupe l’ensemble des EGases de plantes (Henrissat et al., 1996 ; http://afmb.cnrs-mrs.fr). Les EGases de plantes possèdent généralement une masse moléculaire de 50-70 kDa et présentent des caractéristiques partagées avec certaines EGases de bactéries. On les retrouve chez une large variété d’espèces, exprimées à des stades de développement différents (élongation, mûrissement, abscission) (Levy et al., 2002). La famille de gènes d’EGases d’Arabidopsis a notamment été largement étudiée et ne présente

pas moins de 12 membres qui varient en structure et en localisation tant au niveau tissulaire que cellulaire (del Campillo, 1999). Le rôle fondamental des EGases serait la régulation de l’élongation des cellules végétales via le clivage des xyloglucanes du réseau cellulose/hémicellulose. Ces enzymes pariétales couperaient le xyloglucane au niveau des résidus glucose non-substitués puis la pression de turgescence présente au niveau du protoplaste repousserait l’ensemble de la paroi, et notamment les microfibrilles de cellulose, assurant ainsi l’expansion cellulaire (Nicol & Höfte, 1998). Certaines EGases retrouvées chez les plantes présentent des caractéristiques de protéines membranaires en terme de séquences peptidiques et de propriétés biochimiques (Nicol et al., 1998). De façon intéressante, ces EGases membranaires semblent ne pas avoir d’activité hydrolytique sur les xyloglucanes comme le montre l’étude de la spécificité enzymatique de la protéine CEL 16, orthologue de Korrigan chez Brassica napus, produite chez Pichia Pastoris (Mølhøj et al., 2001). Cette étude a permis de conclure à une activité hydrolytique de cette EGase membranaire sur de la carboxyméthylcellulose et de la cellulose amorphe, ce qui a conduit à lui conférer un rôle dans la biosynthèse de la cellulose plutôt qu’un rôle dans le ré-arrangement des xyloglucanes (Nicol et al., 1998 ; Sato et al., 2001 ; Peng et al., 2002 ; Mølhøj et al., 2001).

1.1.3.5 Les xyloglucane endo-transglucosylases/hydrolases (XTHs)

Les xyloglucane endo-transglucosylases/hydrolases ont des activités enzymatiques capables de cliver puis de relier les molécules de xyloglucane dans les tissus de plantes en croissance rapide, ce qui permet le relâchement de la paroi de façon réversible (Rose et al., 2002). En effet, le xyloglucane ayant un rôle prépondérant dans la cohésion des microfibrilles de cellulose entre elles, les enzymes impliquées dans son métabolisme in muro sont des agents potentiellement importants pour le contrôle de la rigidité et de l’extensibilité de la paroi. Ces activités enzymatiques sont aujourd’hui regroupées sous le terme de xyloglucane endo-transglucosylase/hydrolase (XTH) et sont référencées sous le code EC 2.4.1.207 (Rose et al., 2002). Les XTH sont principalement des protéines pariétales dont le pH d’activité optimum, entre 5 et 6, est cohérent avec cette localisation. Le site actif de ces XTH estt un motif peptidique de séquence DEIDFEFLG ou DEIDIEFLG (Campbell & Braam, 1998). Deux rôles sont actuellement attribués aux XTH : la restructuration de la paroi en permettant son relâchement nécessaire lors de la croissance cellulaire et la capacité de ces activités à incorporer dans la paroi des xyloglucanes nouvellement synthétisés (Campbell & Braam, 1998).