Extrait de Bruxelles-Médical, 38" a n né e , n" 34, d u 31 août 1958, pp. 1373 à 1379-
La microscopie électronique
Nouvelle méthode d'investigation en pathologie humaine par P. DUSTIN Jr..
Chargé de Cours d'Anatomie pathologique.
Faculté de Médecine, Université Libre de Bruxelles.
D e p u i s que Marton, d a n s u n travail mé m o r a b l e réalisé e n 1934 à l'Université de Bruxelles, à l ' a u b e d e la microscopie électronique, m o n t r a qu'elle permettait l'observation d e tissus provenant d ' ê t r e s vivants, il s'est écoulé u n e période relativement courte où ce qui n'était alors q u e t â t o n n e m e n t s et espoirs, s'est t r a n s f o r m é en réalités concrètes. L e micro
scope électronique est d e v e n u u n instrument répandu à des c e n t a i n e s d ' e x e m p l a i r e s d a n s le m o n d e , et il a permis aux biologistes de voir a v e c facilité des structures plus de c e n t fois plus petites que celles qui sont à la limite d u pouvoir séparateur d u microscope optique.
D a n s le m o n d e entier, des d é p a r t e m e n t s de pathologie de plus e n plus n o m b r e u x s'intéressent a u x possibilités immenses d'étudier des struc
tures d e plus en plus fines, et d e p u i s p e u les résultats obtenus m o n t r e n t q u e l ' é t u d e de la cellule et des tissus m a l a d e s bénéficiera largement des nouvelles possibilités techniques.
Nous voudrions rapporter ici quelques acquisitions récentes, à titre d ' e x e m p l e , après avoir insisté sur les conditions techniques p r é a l a b l e s qui doivent être c o n n u e s pour q u e le m é d e c i n sache q u a n d et c o m m e n t il peut espérer bénéficier de l ' é t u d e électronique des structures vivantes.
1. — Remarques techniques.
L e s progrès récents ont été rendus possibles par le perfectionnement des microscopes, dont de n o m b r e u x modèles sont actuellement fabriqués d a n s le m o n d e entier. Nous passerons sous silence leurs caractéristiques t e c h n i q u e s , et ne ferons que mentionner les très g r a n d s progrès réalisés d e p u i s quelques a n n é e s d a n s la m a n i p u l a t i o n de ces instruments néces- s a i r e m e n t à la fois compliqués aux points d e vue électronique et méca- nique. E n effet, ces progrès de l'instrumentation auraient été sans utilité si en m ê m e t e m p s des m é t h o d e s nouvelles de préparation des objets bio- logiques n ' a v a i e n t été mises au point. A l o r s q u ' a u début on devait se contenter de l'observation des cellules étalées en couches très fines (cultures de tissus), ou d ' o m b r a g e s métalliques qui ne d o n n a i e n t q u ' u n aspect d e la f o r m e générale et de la surface des objets, la microscopie électronique n'est entrée d a n s le d o m a i n e de l'histologiste et d u patho- logiste q u e depuis l'invention de nouvelles m é t h o d e s de fixation et d'in- clusion permettant de réaliser des coupes ultrafines examinées ensuite par t r a n s p a r e n c e sans aucun o m b r a g e . L a fixation la plus courante est a c t u e l l e m e n t assurée par le liquide de P a l a d e , c'est-à-dire u n e solution de tétroxyde d ' o s m i u m à p H 7,4. D ' a u t r e s fixateurs ont été essayés, mais m a l g r é leur prix élevé, les solutions osmiées sont à l'heure actuelle les meilleures. L a fixation qui est très brève (une ou deux heures), est suivie d ' u n e inclusion d a n s u n matériel qui doit être très dur pour permettre la réalisation de coupes très fines, dont l'épaisseur se situe aux environs du 50' de micron. Cette inclusion est faite par la polymérisation de méthacry- late d e m é t h y l e et de butyle, qui en quelques heures forment u n e m a s s e dure a n a l o g u e au (( plexiglass ». Ce t e m p s d'inclusion est délicat et peut c o n d u i r e à des altérations cellulaires. Les pièces ainsi enrobées sont cou- pées a u microtome, et étant d o n n é la d u r e t é du milieu de m o n t a g e , il est nécessaire de se servir de couteaux en verre, que l'on obtient en brisant des l a m e s de glace épaisses de 4 à 5 m m . Ces couteaux sont b o n m a r - ché, m a i s leur valeur est inégale et leur usure assez rapide. R é c e m m e n t , F e r n a n d e z - M o r a n , au V e n e z u e l a , a mis a u point u n e m é t h o d e particu- lière d e polissage de d i a m a n t s industriels qui conduit à des couteaux très supérieurs aux couteaux en verre. Les coupes sont recueillies sous le con- trôle d ' u n e puissante loupe binoculaire, et montées sur de petites grilles en cuivre qui seront introduites d a n s le microscope, la préparation étant s o u t e n u e le plus souvent par un film d e formvar et par u n film de car- b o n e o b t e n u par évaporation sous vide. C e dernier film renforce considé- r a b l e m e n t la solidité de la préparation, tout en étant transparent aux électrons. Les coupes sont e x a m i n é e s a p r è s projection des électrons sur u n e s u r f a c e fluorescente. L a p h o t o g r a p h i e fixera les i m a g e s les plus dignes d'intérêt.
A u point de v u e pratique, il convient de retenir de ces techniques, qui e n fait ne sont q u e des modifications des m é t h o d e s classiques de fixa-
tion et d e coupe utilisées en microscopie optique, la nécessité d ' u n soin rigoureux et surtout celle d ' u n e fixation parfaite. Si le microscope ordi- naire p e r m e t d'utiliser des fixateurs aussi énergiques q u e l'acide acétique ou le formol, il n ' e n est rien lorsqu'on e x a m i n e des structures sub-micro- scopiques. Il est aussi impérieux de fixer les tissus immédiatement a p r è s leur p r é l è v e m e n t ; l'acide osmique doit coaguler les structures des cellules encore vivantes. L ' é t u d e d e matériel prélevé sur des cadavres paraît d o n c exclue. Mais l ' a n a t o m o - p a t h o l o g i s t e n e s'intéresse pas u n i q u e m e n t aux d o c u m e n t s recueillis post mortem, et la salle d ' o p é r a t i o n et les techni- ques m o d e r n e s d e prélèvement par ponction de tissus variés — foie, rein, thyroïde, sang, organes hématopoïétiques, t u m e u r s —• vont fournir à la microscopie électronique u n matériel très a b o n d a n t que l'on c o m m e n c e à étudier d a n s plusieurs laboratoires. A j o u t o n s q u e bien des p r o b l è m e s d ' a n a t o m i e pathologique s'éclaireront par l'expérimentation animale, plus c o m m o d e pour réaliser u n e fixation parfaite. U n e des difficultés actuelles n est pas d e trouver u n sujet d ' é t u d e , m a i s plutôt de limiter la recherche à des p r o b l è m e s où le microscope électronique apporte des d o c u m e n t s qu a u c u n e autre m é t h o d e ne pourrait fournir. E n voici quelques exemples.
2. — Quelques acquisitions récentes en anatomie pathologique.
Plus u n e molécule a u n poids atomique élevé, plus elle a b s o r b e r a le r a y o n n e m e n t électronique, et plus elle a p p a r a î t r a noire sur la p l a q u e p h o t o g r a p h i q u e . L e fer en est u n des meilleurs exemples, et il nous suf- fira de rappeler ici les b e a u x t r a v a u x de Bessis, qui ont été exposés r é c e m m e n t d a n s ces colonnes. L ' é t u d e de l ' h é m o c h r o m a t o s e paraît parti- culièrement intéressante, par suite de la possibilité de suivre, par des biopsies h é p a t i q u e s qui pourront être étudiées au microscope électronique, la répartition d u fer d a n s les cellules p a r e n c h y m a t e u s e s . C e fer se trouve sous u n e f o r m e granulaire qui est celle d e la ferritine. Sa localisation d a n s l ' h é m o c h r o m a t o s e est particulièrement intéressante, car elle paraît être intramitochondriale. C'est u n e observation qui était impossible a u microscope optique. O n connaît le rôle f o n d a m e n t a l des mitochondries d a n s la respiration cellulaire, et l ' o n c o m p r e n d sans doute mieux pour- quoi l ' a c c u m u l a t i o n d e fer, qui d a n s l ' h é m o c h r o m a t o s e paraît la consé- q u e n c e d ' u n trouble d e la barrière intestinale et d ' u n e résorption exces- sive, lèse les fonctions et, ensuite, les structures cellulaires. D ' a u t r e s atomes lourds ont été étudiés r é c e m m e n t : c'est le cas p a r exemple de l'argent.
O n savait d e p u i s longtemps q u e d a n s l'argyrose, ce métal s'accumulait chez l ' h o m m e d a n s les m e m b r a n e » b a s a l e s de certaines glandes, n o t a m - m e n t des glandes sudoripares. L e microscope électronique a permis d ' i d e n - tifier avec plus d e précision le substrat qui fixe l'argent, et qui s e m b l e le m ê m e q u e celui qui se colore p a r la m é t h o d e d e P A S au microscope optique. C'est ainsi que la m e m b r a n e hyaline P A S positive qui f o r m e la partie filtrante des glomérules r é n a u x fixe électivement les a t o m e s
d ' a r g e n t . Il est intéressant de se rappeler q u e cette m ê m e m e m b r a n e se colore électivement par la m é t h o d e de G o m o r i au nitrate d ' a r g e n t réduit p a r l'urotropine (hexamine).
L e poids a t o m i q u e du calcium lui confère u n contraste très net en électronique, et divers problèmes de calcification normale ou hétéroto- p i q u e (par exemple, la néphrocalcinose sous l'influence d'extraits para- thyroïdiens) ont été r é c e m m e n t abordés. L e microscope électronique per- met de saisir la f o r m e cristalline de l'apatite sous la f o r m e duquel le calcium se dépose le plus souvent.
Mais des substances sans contraste particulier, de nature protidique, ont p u être étudiées avec fruit en pathologie. R a p p e l o n s les très impor- tants travaux qui ont été consacrés au collagène et aux fibres élastiques, et qui ont permis d e préciser la structure moléculaire d u premier, et l'origine p r o b a b l e de l'élastine par dénaturation du collagène (*). L a plupart d e ces travaux ont été réalisés par des m é t h o d e s d ' o m b r a g e , ou d e (( coloration » p a r l'acide phosphotungstique. O n peut en effet ima- giner des « colorations » électroniques, c'est-à-dire des imprégnations électives par des substances a b s o r b a n t particulièrement les électrons.
A côté d u collagène, existe u n g r a n d groupe de substances m a l connues, désignées sous les termes anciens d ' « hycline » ou de (( jibrindide »,
et qui jouent u n rôle très important d a n s la pathologie d e n o m b r e u s e s affections, en particulier d a n s celles désignées par le terme malencon- treux d e « m a l a d i e s du collagène ». Q u e sont ces substances h y a l i n e s ? S'agit-il de produits d e destruction locale des protéines tissulaires, ou d ' u n e imprégnation par des protéines (ou mucoprotéines), d'origine san- guine ? Ces substances ont-elles u n rapport quelconque avec la fibrine c o m m e le pensaient les anciens anatomo-pathologistes ? L a microscopie électronique, c o n f i r m a n t les m é t h o d e s immuno-histochimiques de colora- tion par des anticorps fluorescents (Coons), résout ce vieux problème. E n effet, elle a p u montrer q u e d a n s diverses circonstances, des dépôts (( fibrinoïdes », qu'il s'agisse d ' a m a s formés d a n s la lumière des capil- laires glomérulaires du rein d a n s le p h é n o m è n e d e S c h w a r t z m a n n géné- ralisé ou de la <( m e m b r a n e hyaline » qui revêt les cavités pulmonaires d e tant de nourrissons morts d a n s les premiers jours ex utero, avaient les m ê m e s caractères q u e la fibrine. Celle-ci présente, en effet, u n e striation transversale, différente de celle d u collagène, et qui a p u être vue dans la m e m b r a n e hyaline p u l m o n a i r e et d a n s les thrombi hyalins du rein.
E n f i n , on ne peut m e n t i o n n e r cette nouvelle orientation de l ' a n a - tomie pathologique sans parler des Virus. On sait assez, par les travaux m o d e r n e s sur le b a c t é r i o p h a g e , ce q u e la microscopie électronique a révélé d a n s ce d o m a i n e . C'est elle qui, la première (dès 1942), a rendu justice
(•) Ces travaux ont également montré que les fibres dites de « réticuline » n'étaient autres que des fibres collagénes particulièrement grêles, plongées dans une substance fondamentale qui leur confère peut-être leur argyrophilie et leur colorabilité par le PAS.
à tous ceux qui avec d ' H e r e l l e a v a i e n t a f f i r m é que le bactériophage était u n virus. Et depuis, elle a a p p o r t é des d o c u m e n t s f o n d a m e n t a u x sur le m o d e de fixation de ce virus à la surface des bactéries réceptives, la transmission du contenu désoxyribonucléique du parasite à l'hôte, et la synthèse, en quelques minutes, d e n o u v e a u x virus à l'intérieur de l ' h ô t e , à l'intervention p r o b a b l e de l'acide désoxyribonucléique.
E n morphologie, le microscope électronique a permis de r é s o u d r e clairement la n a t u r e des corps d'inclusion observés d a n s tant de viroses, et d e montrer qu'il s'agissait d ' a m a s d e virus et n o n d ' u n e q u e l c o n q u e (( réaction cellulaire ». Elle c o m m e n c e à révéler le m o d e de s y n t h è s e intracellulaire de ces virus à partir d ' u n « viroplasme » vers lequel se tourne tout l'intérêt actuellement, et qui est formé d e molécules de petite taille à partir desquelles se f o r m e n t les nouvelles particules virales.
C ' e s t é v i d e m m e n t d a n s le d o m a i n e d u cancer que les espoirs d e m e u r e n t les plus grands, car le microscope électronique pourrait apporter u n e d o c u m e n t a t i o n décisive à la théorie virale d u cancer. Déjà les s a r c o m e s et les leucémies des oiseaux, le c a r c i n o m e mcunmaire de la souris, le c a r c i n o m e d ' E h r l i c h , et u n e l e u c é m i e transmissible par filtrat c h e z la souris, étudiée par C. Friend et E . d e H a r v e n , ont prouvé la p r é s e n c e de n o m b r e u s e s particules virales d a n s les cellules malignes et d a n s les filtrats permettant la transmission d e l'affection. Il est trop tôt p o u r e n tirer des conclusions générales et le p r o b l è m e qui retient m a i n t e n a n t toute 1 attention est l'effet des c o r p s cancérigènes sur la structure s u b - microscopique des cellules.
Ceci paraît nous éloigner d e la pathologie h u m a i n e , m a i s d a n s plu- sieurs laboratoires on e x a m i n e m i n u t i e u s e m e n t des tumeurs prélevées chez l ' h o m m e d a n s l'espoir d ' y trouver des virus. U n e telle découverte ne ferait d'ailleurs que poser u n p r o b l è m e nouveau, particulièrement dif- ficile à résoudre chez l ' h o m m e qui p e u t héberger tant d e virus non p a t h o - gènes : c o m m e n t démontrer q u ' u n virus trouvé d a n s u n e tumeur h u m a i n e est la cause de la prolifératon m a l i g n e ? L'expérimentation h u m a i n e q u ' o n ne saurait assez c o n d a m n e r ( m ê m e lorsqu'elle utilise c o m m e c o b a y e s des prisonniers) et qui n ' e s t a c c e p t a b l e q u e si l'expérimentateur l u i - m ê m e s ' o f f r e c o m m e matériel d ' e x p é r i e n c e , est p r o b a b l e m e n t vouée à u n é c h e c à c a u s e des différences génétiques individuelles. Les méthodes de cultures d e tissus, qui pourraient utiliser d e s cellules provenant de l'individu c a n - céreux, et d o n c g é n é t i q u e m e n t identiques, pourraient résoudre le pro- b l è m e , à la condition q u e l'on puisse établir d ' a b o r d q u e les cellules cultivées n'étaient p a s parasitées d e façon latente.
3. — Conclusions.
Parallèlement à l'édification d ' u n e nouvelle histologie, à l'échelle électronique, il ne fait p a s de d o u t e q u ' u n e pathologie submicroscopique
se constitue. N o u s ne s o m m e s q u ' à l'aurore d ' u n e période nouvelle, et des découvertes absolument inattendues peuvent être prédites. A côté des organites cytoplasmiques classiques, des inclusions d e petite taille n ' o n t p a s encore dévoilé leur nature. D a n s certaines cellules néoplasiques, des structures bizarres attendent d ' ê t r e expliquées. Les cycles intracellu- laires d e multiplication des virus sont encore m a l compris, et certains s t a d e s paraissent traduire u n e véritable disparition des virus qui se multi- plieraient sous la f o r m e de macromolécules formées sans doute d ' a c i d e désoxyribonucléique (DNA). E n pathologie du système nerveux, des découvertes très importantes ont été rendues possibles par la microscopie é l e c t r o n i q u e ; telles les grains synaptiques, la structure fine de la myéline, la neurosécrétion, les rapports des cellules gliales avec les neurones. L a neuro-pathologie s'enrichit considérablement par l'utilisation des grossis- s e m e n t s élevés.
A v e c l'utilisation de cet outil n o u v e a u , la morphologie entre d a n s u n e période aussi créative q u e la g r a n d e é p o q u e qui suivit l'utilisation d u microscope c o m p o s é et des m é t h o d e s de coupe et de coloration, d a n s le dernier quart d u XIX'' siècle. Cette morphologie nouvelle sera en con- tact étroit avec la chimie, car elle c o m m e n c e à saisir la f o r m e des molé- cules les plus grosses. Mais elle n e p e r d r a pas, au contraire, le contact, i n d i s p e n s a b l e pour le pathologiste, avec le m a l a d e et l'hôpital. Nous a v o n s dit combien les m é t h o d e s d e fixation et d'inclusion nécessitaient le p r é l è v e m e n t d e tissus vivants ; ceci n e pourra très souvent se faire q u ' à la salle d ' o p é r a t i o n , et ainsi le microscope électronique devrait aider à créer u n lien d e plus entre le laboratoire et la clinique. Souhaitons, en cette a n n é e centenaire de la publication de la Pathologie cellulaire de
V i r c h o w , que les m o y e n s d'investigation qui nous sont donnés conduisent à d é c h i f f r e r les lois d e la pathologie cellulaire, à l'échelle mille fois plus petite qui nous est dorénavant accessible.
R é S U M é .
A p r è s avoir rappelé quelques particularités des techniques m o d e r n e s d ' e x a m e n au microscope électronique de coupes ultrafines, l'auteur, en s ' a i d a n t de quelques exemples, m o n t r e l ' i m p o r t a n c e grandissante que p r e n d le microscope électronique d a n s l'étude de la pathologie.
SAMENVATTING.
D e schrijver geeft een kort overzicht v a n enkele bijzonderheden v a n de m o d e r n e techniek om bij middel v a n het electronen microskoop ultra- fijne s n e d e n te onderzoeken ; a a n d e h a n d v a n e n k e l e voorbeelden toont hij het groeiend b e l a n g van het electronen microscoop bij de studie van de pathologie.
SUMMARY.
T h e author, after a brief review of the technical problems involved in the confection of ultrafine sections for électron microscopy, gives a s u m m a r y of some récent a d v a n c e s in pathology w h i c h have been m a d e possible by the n e w instruments. T h e future rôle of électron micro- scopy is shortly outlined.
(Copyright by Pierre Dustin Jr., Bruxelles.)
