Nouveaux développements en chromatographie rapide dans le domaine pharmaceutique

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Nouveaux développements en chromatographie rapide dans le domaine pharmaceutique

GUILLARME, Davy, RUDAZ, Serge, VEUTHEY, Jean-Luc

Abstract

Ces dernières années, de nombreux supports et technologies innovants ont été développés en chromatographie liquide pour augmenter le débit d'analyse, tout en maintenant des performances similaires aux méthodes conventionnelles. Parmi ces approches, on peut notamment citer l'utilisation de supports monolithiques, de hautes températures de phase mobile, de colonnes remplies de particules de taille inférieure à 2 μm ou de particules de moins de 3 μm superficiellement poreuses. Les instruments ont également subi des améliorations telles que la réduction du volume extra-colonne et du volume de délai, l'augmentation des fréquences d'acquisition des détecteurs, l'élévation de la perte de charge et de la température maximale admissibles, afin d'être compatibles avec la chromatographie rapide. Cet article passe en revue l'utilisation de ces diverses approches dans le domaine pharmaceutique, où un besoin croissant de techniques analytiques rapides est nécessaire.

GUILLARME, Davy, RUDAZ, Serge, VEUTHEY, Jean-Luc. Nouveaux développements en chromatographie rapide dans le domaine pharmaceutique. Spectra Analyse , 2009, no. 267, p.

12-17

Available at:

http://archive-ouverte.unige.ch/unige:1632

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DAVY GUILLARME

, SERGE RUDAZ, JEANLUC VEUTHEY

* Pour correspondance

1Laboratoire de Chimie Analytique Pharmaceutique – Section des sciences pharmaceutiques – Université de Genève, Université de Lausanne – Boulevard d’Yvoy 20 1211 Genève 4 – Suisse – Tél. : +41 22 379 34 11 – Fax : +41 22 379 68 08 – E-Mail : davy.guillarme@unige.ch

Evolution otio

R ÉSUMÉ

Ces dernières années, de nombreux supports et technologies innovants ont été développés en chromatographie liquide pour augmenter le débit d’analyse, tout en maintenant des

performances similaires aux méthodes conventionnelles. Parmi ces approches, on peut notamment citer l’utilisation de supports monolithiques, de hautes températures de phase mobile, de

colonnes remplies de particules de taille inférieure à 2 μm ou de particules de moins de 3 μm superficiellement poreuses. Les instruments ont également subi des améliorations telles que la réduction du volume extra-colonne et du volume de délai, l’augmentation des fréquences d’acquisition des détecteurs, l’élévation de la perte de charge et de la température maximale admissibles, afin d’être compatibles avec la chromatographie rapide. Cet article passe en revue l’utilisation de ces diverses approches dans le domaine pharmaceutique, où un besoin croissant de techniques analytiques rapides est nécessaire.

M ^OTS - ^CLÉS

Chromatographie liquide rapide, UHPLC, UPLC, haute température, petites particules, fused-core, hautes pressions, monolithes.

New developments in fast chromatography : application to the pharmaceutical fi eld

SUMMARY

These last years, numerous innovative supports and technologies have been developed in liquid chromatography to increase the analysis throughput, while maintaining comparable performance to conventional methods. Among these approaches, we can mention the use of monolithic supports, of high mobile phase temperatures, of columns packed with sub-2 µm or sub-3 µm superficially porous particles.

The instruments have also been adapted and now possess reduced extra-column and dwell volumes, improved detection acquisition rate, increase of the maximal backpressure and temperature limitations.

These features offer a full compliance with fast chromatography. The present article reviews the use of such methodologies in the pharmaceutical field where high throughput separations are mandator y.

K

Fast-LC, UHPLC, UPLC, high temperature, small particles, fused-core, high pressure, monoliths.

Nouveaux développements en chromatographie rapide

dans le domaine pharmaceutique

I - Introduction

Dans le domaine pharmaceutique, les techni- ques séparatives sont très utilisées et la chro- matographie en phase liquide (HPLC) joue un rôle important lors de toutes les phases du cycle de vie d’un nouveau médicament (découverte,

développement et mise sur le marché). La pro- ductivité accrue voulue par les industriels de la pharmacie impacte le laboratoire d’analyse et entraîne le développement de nouvelles méthodes rapides. Afin de pouvoir augmen- ter le débit d’analyse tout en maintenant des performances identiques, l’HPLC a connu des

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évolutions majeures ces dernières années. Parmi celles-ci, on note la mise sur le marché de sup- ports innovants tels que les monolithes organi- ques ou inorganiques, les colonnes particulaires poreuses de granulométrie réduite proposées par de nombreux fabricants (taille inférieure à 2 μm) et les colonnes remplies de particules de silice superfi ciellement poreuses de diamètre < 3 μm.

Simultanément à cette évolution des supports chro- matographiques, l’instrumentation a également été améliorée afi n d’off rir une compatibilité optimale avec les analyses rapides, tout en restant à la fois ro- buste et précise pour les analyses quantitatives. Les nouveaux systèmes chromatographiques sont ainsi susceptibles de travailler avec des pressions maxi- males de l’ordre de 600 voire 1000 bars, afi n d’être compatibles avec les colonnes remplies de petites particules. De plus, la plupart des systèmes analyti- ques sont actuellement équipés de dispositif de ther- morégulation pouvant atteindre des températures proches de 100 °C, car l’utilisation de hautes tempé- ratures permet de réduire les temps d’analyse par le biais de la diminution de la viscosité de la phase mo- bile (voir III - Intérêt de la chromatographie liquide à haute température (HTLC)). Enfi n, l’électronique du détecteur a été nettement améliorée (fréquence d’acquisition UV pouvant aller jusqu’à 200 Hz chez certains fabricants), les volumes des cellules UV ont

été réduits (V_cell<1μL) alors que les volumes extra colonne et de délai ont été minimisés.

Le propos de cet article est d’évaluer l’apport de ces avancées technologiques sur des analyses habituel- lement eff ectuées dans le domaine pharmaceutique, c’est à dire le contrôle qualité, le profi lage d’impure- tés ou encore la détermination de médicament et de ses métabolites dans les fl uides biologiques. A côté des seules performances chromatographiques, chacune des approches innovantes décrites ici est également caractérisée par d’autres paramètres (disponibilité, coût, compatibilité avec les systèmes chromatographiques existants,…), ces avantages et/ou inconvénients se trouvent synthétisés dans le Tableau I.

II - Intérêt des monolithes

Il existe deux grandes familles de monolithes : les monolithes organiques (à base de métha- crylate, polystyrène-divinylbenzène) et les inor- ganiques (silice, zircone, carbone). Actuellement, seuls les monolithes inorganiques à base de si- lice présentent des performances acceptables en chromatographie liquide pour la séparation de mo- lécules d’intérêt pharmaceutique (1). Ce type de matériau a été développé il y a presque vingt ans (2)

Approche Avantages Inconvénients

MONOLITHES

• Très faible perte de charge - Possibilité de maximiser l’effi cacité avec L_col > 1 mètre

• Approche compatible avec un système HPLC conventionnel

• Colonnes narrow bore (2,1mm D.I.) disponibles depuis peu

• Manque de chimies (seulement C18, C18 endcapped, C8) et de fournisseurs pour les monolithes de silice

• Transfert de méthode direct impossible depuis l’HPLC classique

• Résistance limitée en termes de perte de charge (< 200 bars) et de pH (2 < pH < 8)

HTLC

• Chimie verte : diminution de la quantité de modifi cateur organique à haute température

• Amélioration de la forme des pics des composés basiques et macromolécules

• Possibilité de coupler la haute température avec les autres approches rapides

• Stabilité des solutés et phases stationnaires à base de silice à évaluer

• Nécessité d’utiliser un système dédié (avec préchauff age et refroidissement inclus)

• Transfert de méthode diffi cile à cause des changements de sélectivité

UHPLC

• Transfert de méthode aisé entre l’HPLC et l’UHPLC

• Diminution importante du temps d’analyse (jusqu’à un facteur 20)

• Grande variété des colonnes sub-2 μm (plus de dix fabricants)

• Coût de l’instrumentation et des colonnes supérieur à l’HPLC conventionnelle

• Compressibilité des solvants et échauff ement par friction peuvent exister à 1000 bars

• Nécessité d’utiliser un système dédié (volume extra colonne faible, fréquence d’acquisition élevée, injecteur rapide)

FUSED-CORE

• Technologie compatible avec un système HPLC conventionnel

• Excellentes performances : 80 % de l’effi cacité des sub-2μm, ΔP plus faible

• Approche intéressante pour limiter la diff usion des macromolécules dans les pores

• Manque de chimies (seulement C18, C8, HILIC) et de fournisseurs

• Rétention et capacité de chargement plus faibles (cœur de la particule non poreuse)

• Résistance encore limitée en termes de perte de charge (< 600 bars) et pH (2 < pH < 8)

Tableau I Comparaison de diff érentes méthodes chromatographiques

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nées 2000. Les avantages des monolithes sont dus à leur structure bimodale, constituée de macropores et de mésopores, permettant de générer des perfor- mances équivalentes à une colonne remplie de par- ticules de 3-3,5 μm pour une perte de charge cor- respondant à une colonne remplie de particules de 11 μm (voir fi gure 1) (3). Un des problèmes majeurs associés à ce type de support demeure leur diversité restreintes en termes de géométrie des colonnes, de chimie de phase et leur manque de robustesse vis- à-vis de la pression et du pH de la phase mobile.

Toutefois, en complément du diamètre traditionnel de 4,6 mm D.I., des colonnes de 3 et 2,1 mm D.I. ont récemment été introduites, celles-ci permettent à ce type de support d’être plus compétitif, au niveau de la consommation de solvant et du couplage avec la spectrométrie de masse, vis-à-vis des autres ap- proches de chromatographie rapide.

Néanmoins, le manque de diversité de chimie de phase demeure un obstacle majeur pour l’industrie pharmaceutique et explique que seulement 1 % des spécialistes de la chromatographie utilisent en rou- tine ce type de supports (1).

Parmi les applications les plus intéressantes dans le domaine pharmaceutique, on peut citer la possibi- lité de réaliser des séparations d’une ou plusieurs substances actives et leurs métabolites dans une matrice biologique, à l’aide d’une détection de type spectrométrie de masse avec des temps d’analyse inférieurs à une minute (4, 5). D’autres auteurs ont mis en évidence la possibilité d’obtenir le profi l d’im- puretés d’un principe actif avec des temps d’analyse variant de 1 à 3 minutes avec des colonnes de 4,6 mm D.I. et des débits de phase mobile de 9 mL/min, ce qui pourrait poser d’évidents problèmes de ro- bustesse et de répétabilité avec un système HPLC classique (6).

Le lecteur intéressé pourra consulter une excellente revue récemment publiée afi n de disposer d’une synthèse/discussion exhaustive sur les diff érentes voies d’obtention, les propriétés physico-chimi- ques, les performances chromatographiques et les domaines d’applications des monolithes (7).

III - Intérêt de la chromatographie liquide à haute température (HTLC)

L’impact de la température a souvent été négligé en HPLC alors que ce paramètre joue un rôle pri- mordial dans les séparations par chromatographie en phase gazeuse (GC). En fait, il est important de noter que la température est un paramètre qui in- fl uence directement les rétentions et sélectivités en chromatographie (8). De plus, puisque la viscosité de la phase mobile et les coeffi cients de diff usion des solutés dépendent également de la température, il est possible d’augmenter le débit de phase mobile à température élevée, tout en maintenant des per- tes de charge acceptables et des effi cacités pouvant être identiques (9). A titre d’exemple, la Figure 2

compare les performances chromatographiques obtenues pour l’analyse de parabènes entre 25 et 120 °C, au moyen de courbes de Van Deemter. Il est important de noter que d’autres bénéfi ces peuvent également être tirés de l’élévation de température en HPLC. On observe par exemple une diminu- tion de la quantité de solvant organique nécessaire dans la phase mobile, voire des expériences réali- sées en eau pure (liée à la diminution de la cons- tante diélectrique de l’eau) (8), l’amélioration de la forme des pics de composés basiques (diminution du pKa et des interactions secondaires avec le sup- port (10, 11)) ou de macromolécules, telles que pro- téines et peptides (les cœffi cients de diff usion très faibles de ces molécules augmentent fortement).

Cependant, afi n de travailler avec des températu- res de phase mobile élevées (jusqu’à 200 °C), il est nécessaire de s’assurer de la stabilité thermique de la colonne et des solutés. De plus, il est important de disposer d’un système chromatographique adapté, permettant le préchauff age de la phase mobile avant

monolithes en chromatographie liquide et comparaison avec une colonne HPLC classique remplie de particules 5 μm. A) Impact sur les performances chromatographiques.

C : coeffi cient de résistance au transfert de masse, u : vitesse de la phase mobile uopt : vitesse linéaire optimale. B) Impact sur la perte de charge dans le système chromatographique.

Figure 2

Intérêt de l’élévation de température en HPLC. Courbes de Van Deemter pour une colonne Zorbax Stable Bond 150x4,6mm, 5μm utilisée avec des températures comprises entre 30 et 120°C. Inspiré de la fi gure 2 contenue dans la référence (15).

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l’entrée dans la colonne et son refroidissement préa- lablement à la détection UV. Quelques revues récem- ment publiées off rent une discussion approfondie sur ces diff érents points (12, 13).

Dans le domaine pharmaceutique les possibilités associées à cette approche font l’objet d’évaluations particulières, l’application en routine semble plus diffi cile. Les réticences vis-à-vis de l’HTLC sont prin- cipalement liées au risque de dégradation thermique des solutés rencontré particulièrement à très haute température

Quelques applications, telles que la séparation de di- vers substrats et métabolites ou le contrôle qualité de formulation pharmaceutique ont cependant été pu- bliées avec des températures pouvant atteindre 200 °C (14, 15). En outre, il a été démontré à l’aide d’une pro- cédure de validation, que les performances quantitati- ves restaient équivalentes entre 30 et 90 °C (16), ce qui indique que la stabilité des analytes ne constitue pas réellement un facteur critique dans une gamme de températures raisonnables et avec des temps d’ana- lyse très courts (17).

IV - Intérêt des petites particules et hautes pressions (UHPLC)

L’approche qui s’est développée le plus rapidement ces dernières années dans l’industrie pharmaceutique consiste à utiliser des colonnes remplies de particu- les poreuses de diamètres inférieurs à 2 μm. En eff et, l’utilisation de ces particules sub-2 μm correspond à la progression logique de la diminution de la gra- nulométrie opérée à partir des années 1970 avec des particules de 10 μm puis 5 μm dans les années 1980 et ensuite 3-3,5 μm vers la fi n des années 1990 (18).

Ainsi, des colonnes à base de silice, remplies de par- ticules poreuses de 1,7 μm ont été commercialisées dès l’année 2004 (fi gure 3A) (19). La réduction de la granulométrie des particules et de la longueur des colonnes permet d’obtenir des effi cacités équivalen- tes à celles obtenues sur des supports conventionnels, mais avec des temps d’analyse beaucoup plus courts.

En eff et, la vitesse linéaire optimale est déplacée vers des valeurs plus élevées puisque u est proportionnel à 1/dp. Le problème reste cependant la perte de charge générée par ce type de support puisque, selon la loi de Darcy (voir équation 1) ΔP est proportionnelle à 1/dp³ au débit optimal de travail.

• Equation I

avec Ф : résistance à l’écoulement, η : viscosité dy- namique, u : vitesse linéaire moyenne de la phase mobile et dp : diamètre des particules de la phase stationnaire.

Pour cette raison, des instruments permettant l’utilisation de pressions jusqu’à 1000 bars ont été commercialisés (19) et aujourd’hui de nombreux fabricants ont mis sur le marché des colonnes et

systèmes analytiques dédiés à l’UHPLC. Des pu- blications d’études comparatives entre certains instruments (20), d’une part, et des colonnes sub- 2 μm (21, 22), d’autre part, constituent des sources d’informations intéressantes susceptibles de gui- der l’analyste dans le choix d’un appareil approprié au sein de l’off re aujourd’hui proposée.

Comme l’illustre la Figure 4, avec des colonnes courtes (L=50 mm) remplies de particules sub-2 μm, il est possible d’obtenir une efficacité identi- que à celle obtenue sur une colonne convention- nelle (150 mm, 5 μm) avec un temps d’analyse réduit d’un facteur 9. En privilégiant la résolu- tion, il est également possible d’augmenter l’effi- cacité d’un facteur 9 pour une colonne trois fois plus longue et une granulométrie passant de 5 à 1,7 μm (N proportionnel à 1/dp et à L), alors que le temps d’analyse reste identique.

Un des avantages majeurs de l’UHPLC par rap- port aux méthodes chromatographiques rapides précédemment décrites réside dans la possibilité de transférer directement les conditions analyti- ques de l’HPLC conventionnelle, à l’aide d’équa- tions de base de la chromatographie en modes isocratique (23) et gradient d’élution (24). Cet argument est extrêmement important pour l’in- dustrie pharmaceutique. En effet, dans le cadre d’un transfert de méthode, une validation par- tielle peut alors être considérée (25). De nom- breuses applications ont déjà été publiées sur le

Figure 3 Comparaison d’une particule de silice poreuse 1,7μm et d’une particule de silice superfi ciellement poreuse de 2,7μm (dite fused-core).

Inspiré de la brochure Supelco Ascentis Express.

Figure 4

Concept d’utilisation des colonnes remplies de particules sub-2μm pour des analyses rapides ou à haute résolution.

dp P Lu

2

φ η

=

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d’analyse divisé par un facteur 5 à 20 par rapport à l’HPLC conventionnelle avec maintien des performances séparatives. Les principales uti- lisations de l’UHPLC dans le domaine pharma- ceutique portent sur l’obtention de profils d’im- puretés (26), le contrôle qualité de formulations pharmaceutiques (27) ou encore la détermina- tion de médicaments dans des matrices biolo- giques complexes (28). Plus récemment, des colonnes ultra-courtes de 10 mm et remplies de particules 1,9 μm ont été utilisées pour l’analyse en moins de 10 secondes de diverses formula- tions (29). Ces méthodes ont été validées et les résultats obtenus restent comparables à ceux obtenus au moyen de l’HPLC conventionnelle, mais avec des durées d’analyse jusqu’à 60 fois plus courtes. Il est important de noter que ces géométries de colonnes extrêmes nécessitent un système chromatographique adapté incluant entre autres un processus d’injection rapide.

Rappelons en effet, que la plupart des disposi- tifs présentent des séquences d’injection de 30- 45 sec., qui sont actuellement peu compatibles avec des analyses ultra-courtes.

Actuellement, une des seules limitations de l’ap- proche UHPLC concerne l’investissement que représente l’achat de l’instrument et le coût des colonnes sub-2 μm, en moyenne 20 à 30 % plus onéreuses que les colonnes traditionnelles. Tou- tefois, ces coûts seront très certainement amenés à baisser à l’avenir et, par ailleurs, la consomma- tion de solvant organique par analyse se trouve fortement réduite avec ce type de technologie.

V - Intérêt des particules de silice superfi ciellement poreuses de 2,7μm (FUSED-CORE)

Depuis l’année 2007, certains fabricants ont intro- duit sur le marché des colonnes remplies de par- ticules de silice superfi ciellement poreuses de 2,7 μm de diamètre, comme représenté sur la Figure 3B. Ce type de technologie a été développé par JJ Kirkland dans les années 1990 (30) pour diminuer la distance de diff usion au sein des particules. Ceci permet d’améliorer les performances chromatogra- phiques des méthodes appliquées aux biomolécu- les, pour lesquelles les coeffi cients de diff usion sont extrêmement faibles. Cette approche est également attractive dans le domaine de la chromatographie rapide et a été adaptée en diminuant la taille des particules de 5 à 2,7 μm. Ainsi, pour une longueur de colonne identique, il apparaît possible d’obtenir, une effi cacité égale à 80 % de celle obtenue avec des particules sub-2 μm alors que la perte de charge est environ deux fois plus faible, ce qui rend ce type de support potentiellement compatible avec des sys- tèmes chromatographiques conventionnels (31).

d’atteindre avec une colonne remplie de particules poreuses de même granulométrie ont été attribuées à l’amélioration du transfert de masse ainsi qu’à la meilleure qualité du remplissage (le terme h de Knox pouvant être inférieur à deux dans certains cas) (32). Les seules limites à l’utilisation de ces colonnes remplies de particules superfi ciellement poreuses concernent le manque de variété dans la chimie de greff age des phases stationnaires dis- ponibles, ainsi que la surface spécifi que limitée de ce type de matériau conduisant à des capacités de chargement et des rétentions inférieures aux tech- niques conventionnelles.

Les applications dans le domaine pharmaceutique sont encore peu nombreuses et se limitent à la réa- lisation d’études comparatives avec colonnes rem- plies de particules sub-2μm (31, 32). Cependant, les avantages indéniables de ce type de matériau devraient conduire à un développement plus large de son utilisation en particulier pour l’analyse de biomolécules.

VI - Conclusion

Quelle que soit l’approche considérée, il est im- portant de mettre l’exergue sur les spécifi cités de l’appareillage chromatographique susceptible de permettre à l’utilisateur de profi ter des perfor- mances espérées en chromatographie rapide et ultra-rapide. En eff et, le système doit nécessaire- ment posséder un détecteur avec une fréquence d’acquisition élevée, un volume extra-colonne réduit pour éviter des élargissements supplé- mentaires de pic ainsi qu’un volume de délai li- mité pour obtenir des performances optimales en mode gradient.

Du point de vue des performances chromatogra- phiques, l’approche de type UHPLC (c’est à dire utilisation de colonnes remplies de particules sub-2 μm avec une limite en pression fi xée à 1000 bars) est actuellement la plus avancée pour géné- rer les effi cacités usuelles de la chromatographie en phase liquide (comprises entre 5 000 et 30 000 plateaux) avec des temps d’analyse très courts (16). Afi n d’améliorer encore le débit d’analyse, les diff érentes approches présentées dans cet ar- ticle peuvent être combinées entre elles, comme par exemple l’UHPLC à haute température (33).

Enfi n, il est à noter que l’industrie pharmaceuti- que est également intéressée par les techniques analytiques permettant de résoudre les probléma- tiques les plus complexes pour lesquelles la con- trainte en terme de temps d’analyse est moindre.

En eff et, certains laboratoires expriment des be- soins vis-à-vis d’effi cacités très supérieures aux 30 000 plateaux précédemment évoqués. Dans ce contexte, l’applicabilité et l’intérêt des approches bidimensionnelles de type 2D-LC-MS ou LC-CE- MS est actuellement en cours d’évaluation (34).

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