Investigation phytochimique de plantes alpines

Thesis

Reference

Investigation phytochimique de plantes alpines

MUNARI, Caroline

Abstract

As a part of our ongoing investigations of alpine plants from the Valley of Aoste (Italy), the methanol and dichloromethane extracts of 45 plants have been studied from a phytochemical view point. These species grow at altitudes from 2200 to 2700 meters in extreme habitat.

Thus, 100 extracts were investigated for their free radical scavenging activity against DPPH and antifungal activities with different tests: against the plant pathogenic fungus Cladosporium cucumerinum by direct bioautography, the commensal yeast Candida albicans by bioautography « agar overlay » and Pyrenophora teres by mycelial growth tests in artificial media. Some extracts showed significant activities and were studied by measuring the inhibition of the fractions against the growth of the pathogenic fungi. About twenty compounds have been isolated and the structures of these compounds were determined by means of spectrometric methods, including 1D and 2D NMR experiments and MS analysis.

MUNARI, Caroline. Investigation phytochimique de plantes alpines. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2006, no. Sc. 3785

URN : urn:nbn:ch:unige-33548

DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:3354

Available at:

http://archive-ouverte.unige.ch/unige:3354

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Laboratoire de Pharmacognosie et de Phytochimie Prof. Kurt Hostettmann

Investigation phytochimique de plantes alpines: Etude d’espèces du genre Oxytropis (Fabaceae) et isolement de composés antifongiques et antiradicalaires à partir d’Oxytropis

fetida (Vill.) DC., Potentilla grandiflora L. (Rosaceae) et Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm.

(Ericaceae).

THÈSE

présentée à la Faculté des sciences de l’Université de Genève

pour obtenir le grade de Docteur ès sciences, mention sciences pharmaceutiques

par

Caroline MUNARI

de Mosogno (TI)

Thèse N°

Genève

REMERCIEMENTS

Ce travail de thèse a été réalisé entre l’Institut de Pharmacognosie et Phytochimie de l’Université de Lausanne (Mars 2002 - Septembre 2004) et le Laboratoire de Pharmacognosie et Phytochimie de l’Université de Genève (Septembre 2004 – Septembre 2006), sous la direction du Professeur Kurt Hostettmann.

Je tiens tout d’abord à remercier chaleureusement mon directeur de thèse, Monsieur le Professeur Kurt Hostettmann, pour m’avoir accueilli au sein de son institut et permis de faire mon travail de thèse dans l’environnement stimulant d’un groupe de recherche de renommée mondiale. J’ai ainsi eu l’occasion de présenter quelques uns de mes résultats scientifiques lors de différents congrès internationaux tels qu’à Barcelone (Espagne), Florence (Italie) ou encore Funchal (Madère) et ces expériences m’ont tout particulièrement marqué. Je suis également reconnaissante de la confiance qu’il m’a accordée dans mes tâches d’assistanat, dans l’organisation d’un congrès international à Leysin, ainsi qu’en me nommant responsable informatique de son institut durant de nombreuses années.

Mes remerciements vont aussi aux autres membres de mon jury de thèse : Madame la Docteur Anne-Emmanuelle Haye-de-Bettignies – de l’Université de Genève, Monsieur le Professeur Pascal Richomme – de l’Université d’Angers et Monsieur le Docteur Bertrand Ducrey – de Debio Recherche Pharmaceutique S.A. J’ai beaucoup apprécié notre interaction lors de mon examen de thèse, ainsi que les corrections pertinentes et fouillées de mon manuscrit.

Ma profonde reconnaissance va à Monsieur le Docteur David Guilet, Maître de Conférences à l’Université de Lyon, pour m’avoir guidé et soutenu lors des 12 premiers mois de ma thèse, qui ont été pour moi les plus décisifs. un superviseur technique très compétent, disponible, et un ami.

Un très grand merci à M. Anchisi pour la récolte et l’identification de toutes les plantes alpines de ce travail et dont les compétences botaniques m’ont été d’un grand secours.

Pendant ces quelques quatre années de thèse, j’ai eu beaucoup de plaisir à me consacrer aux diverses tâches d’enseignement qui m’étaient confiées. Je remercie chaleureusement les étudiants que j’ai suivis lors de divers travaux pratiques, ainsi que mes collègues assistants des autres instituts. Je remercie tout particulièrement Carolina Amman et Julie Golleret pour leur contribution à ma thèse dans le cadre de leurs travaux de Diplôme.

Je remercie également tous mes collègues passés et présents du Laboratoire de Pharmacognosie et Phytochimie pour tous les bons moments passés ensemble :

A Karine, Jean-Luc, André, Jean-Robert, Philippe et Emerson pour leurs conseils expérimentés et

humaine, nos fou rires informatiques et pour son soutien de tous les instants.

A Manouche pour sa joie de vivre, son dynamisme, son franc-parler et surtout pour son immense et précieuse aide lors de ma rédaction.

A Fred pour ses incroyables connaissances scientifiques, informatiques et culturels, son très stimulant esprit de contradiction (!), son calme et notre complicité.

A Julie pour sa contribution à ma thèse dans le cadre de son travail de Diplôme, sa vitalité, nos délires nocturnes et surtout sa couverture (!).

A Anne-Laure pour ces dix années inoubliables de « Pharma » passé ensemble et pour son amitié indéfectible.

A Catherine pour notre cohabitation mouvementée (!) dans notre bureau de Lausanne, sa motivation sportive et sa vision enrichissante de la vie.

Aux « Anciens » Boris, Alain, Julien, Anne-Laure, Milena, Patrice, Johanne, Jonathan pour votre accueil et vos encouragements et aux « petits Nouveaux » Daphnée, Sandra, Claudia, Sylvian, Elia, Gaëtan, Aline, Aurélie pour la bonne ambiance au bureau et tous les bons souvenirs.

Merci aussi à tous les autres que j’ai côtoyés et qui ont su rendre agréable la réalisation de cette thèse.

Finalement, un grand merci à mes parents et mon frère Philippe – qui m’ont soutenu à toutes les étapes de ma vie.

COMMUNICATIONS SCIENTIFIQUES

Ce travail de thèse a été réalisé de mars 2002 à juillet 2006 à l’Institut de Pharmacognosie et Phytochimie (IPP) de l’Université de Lausanne (mars 2002 à septembre 2004) et au Laboratoire de Pharmacognosie et Phytochimie (LPP) de l’Université de Genève (septembre 2004 à juillet 2006), sous la direction de Monsieur le Professeur Kurt Hostettmann. Certains aspects de la présente recherche ont été partiellement publiés ou présentés lors de congrès internationaux sous forme de posters.

Publications

C. Munari, D. Guilet, C. Ammann, and K. Hostettmann. An antifungal and radical scavenger acylphloroglucinol from Potentilla grandiflora. (En préparation).

C. Munari, D. Guilet, A.-E. Hay, and K. Hostettmann. Antifungal and antioxidant compounds from the roots of Oxytropis fetida (Vill.) DC. (Fabaceae). (En préparation).

Posters

C. Munari, D. Guilet and K. Hostettmann (2004). Isolation and on-line identification of active compounds of Oxytropis spp. and Astragalus frigidus A. Gray. 15th International Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Analysis (PBA), Florence, Italy, May 2-6, 2004.

C. Munari, D. Guilet, E.-F. Queiroz, C. Amman and K. Hostettmann (2005). Isolation of antifungal compounds of alpine plants. Phytotherapy: The role of an ancient tradition in modern times, Madeira, Portugal, November 1-5, 2005.

C. Munari, D. Guilet, E.-F. Queiroz, C. Amman and K. Hostettmann (2006). Isolation of antifungal compounds of alpine plants. 4^th International congress on natural products: Natural products: a chance for the future of mankind, Leysin, Switzerland, May 28-31, 2006.

REMERCIEMENTS...I

COMMUNICATIONS SCIENTIFIQUES...III

TABLEDESMATIÈRES...^IV ABRÉVIATIONS,SYMBOLESETCONVENTIONS ...VIII

1. BUTS DU TRAVAIL ... 1

2. INTRODUCTION... 5

2.1LES ALPES, CLIMAT ET VÉGÉTATION...7

2.1.1 Historique et situation des Alpes ...7

2.1.2 Adaptation au climat et à l’altitude des plantes alpines ...8

2.1.2.1 Pression atmosphérique ... 9

2.1.2.2 Température... 9

2.1.2.3 Rayonnement solaire ... 9

2.1.2.4 Précipitation et humidité ... 10

2.1.2.5 Conditions d’enneigement... 10

2.1.2.6 Vent... 10

2.1.2.7 Adaptation des plantes alpines ... 11

2.1.3 Végétation et étage de végétation dans la chaîne alpine. ...11

2.1.4 Intérêts des plantes alpines ...12

2.2MALADIES FONGIQUES HUMAINES ET VÉGÉTALES ET LEURS TRAITEMENTS...15

2.2.1 Introduction...15

2.2.2 Maladies fongiques humaines...16

2.2.3 Traitement des mycoses au jour d’aujourd’hui...17

2.2.4 Maladies fongiques des végétaux ...19

2.2.5 Traitement des cultures au jour d’aujourd’hui...20

2.2.6 Organismes étudiés ...21

2.2.6.1 Candida albicans... 22

2.2.6.2 Cladosporium cucumerinum... 22

2.2.6.3 Pyrenophora teres... 22

2.3LA FAMILLE DES FABACEAE...24

2.3.1 Introduction...24

2.3.2 Classification systématique et aspects botaniques ...24

2.3.3 Intérêts économiques et médicaux de la sous-famille des Faboideae ...26

2.3.4 Présentation du genre Oxytropis...28

2.3.5 Toxicité du genre Oxytropis...29

2.3.6 Travaux scientifiques antérieurs sur le genre Oxytropis...30

2.3.6.1 Alcaloïdes et autres métabolites azotés naturels... 30

2.3.6.2 Flavonoïdes... 34

2.3.6.3 Triterpènes et stéroïdes... 35

2.3.7 Utilisations médicinales et traditionnelles des Oxytropis...38

2.3.8 Présentation des différentes espèces d’Oxytropis sélectionnées...38

2.3.8.1 Oxytropis fetida (Vill.) DC... 39

2.3.8.2 Oxytropis campestris (L.) DC. ... 40

2.3.8.3 Oxytropis jacquinii Bunge... 41

2.3.8.4 Oxytropis helvetica Scheele ... 42

2.4LA FAMILLE DES ROSACEAE...44

2.4.1 Introduction...44

2.4.2 Classification systématique et aspects botaniques ...44

2.4.3 Intérêts économiques et médicaux ...46

2.4.4 Présentation du genre Potentilla...49

2.4.5 Travaux scientifiques antérieurs sur le genre Potentilla...49

2.4.5.1 Tanins... 50

2.4.5.2 Flavonoïdes... 51

2.4.5.3 Triterpènes et stéroïdes... 51

2.4.5.4 Coumarines ... 53

2.4.5.5 Polyprénols ... 54

2.4.5.6 Ionones... 54

2.4.6 Utilisations médicinales et traditionnelles des Potentilla...55

2.4.7 Présentation de Potentilla grandiflora L. ...57

2.5LA FAMILLE DES ERICACEAE...58

2.5.1 Introduction...58

2.5.2 Classification systématique et aspects botaniques ...58

2.5.3 Intérêts économiques et médicaux ...60

2.5.4 Présentation du genre Vaccinium...61

2.5.5 Travaux scientifiques antérieurs sur le genre Vaccinium...62

2.5.5.1 Anthocyanosides... 63

2.5.5.2 Flavonoïdes... 63

2.5.5.3 Tanins... 63

2.5.5.4 Terpènes et stéroïdes ... 64

2.5.5.5 Acides phénols et phénols simples... 65

2.5.5.6 Travaux scientifiques antérieurs sur l’espèce Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. ... 67

2.5.6 Utilisations médicinales et traditionnelles des Vaccinium...68

2.5.7 Présentation de Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm...69

3. RÉSULTATS... 71

3.1RECOLTE DES PLANTES ALPINES ET PREPARATION DES EXTRAITS BRUTS...73

3.2CRIBLAGES BIOLOGIQUE ET BIOCHIMIQUE DES PLANTES ALPINES...76

3.2.1 Introduction...76

3.2.2 Résultats et discussion ...76

3.3FRACTIONNEMENT BIOGUIDE DE L’EXTRAIT DICHLOROMETHANIQUE DES RACINES D’OXYTROPIS FETIDA (VILL.)DC...82

3.3.1 Analyse LC/DAD-UV préliminaire...82

3.3.2 Fractionnement bioguidé de l’extrait dichlorométhanique des racines...84

3.3.2.1 Activités de l’extrait ... 84

3.3.2.2 Fractionnement et isolement des composés A à J ... 85

3.3.3 Déterminations structurales des composés A à J ...88

3.3.3.1 Composés A, B et H ... 88

3.3.3.2 Composé H ... 89

3.3.3.3 Composé B... 91

3.3.3.4 Composé A ... 93

3 .3.3.5 Composé G ... 94

3.3.3.6 Composé I ... 99

3.3.3.7 Composé F ... 100

3.3.3.8 Composé J... 102

3.3.3.9 Composés C, D et E... 104

3.3.3.10 Composé C... 107

3.3.3.11 Composé D ... 109

3.3.3.12 Composé E... 111

3.3.4 Considérations phytochimiques ...112

3.4FRACTIONNEMENT BIOGUIDE DE L’EXTRAIT METHANOLIQUE DES RACINES D’OXYTROPIS FETIDA (VILL.)DC...115

3.4.3.1 Etudes préliminaires des composés K à R ... 121

3.4.3.2 Composé P ... 123

3.4.3.3 Composé Q ... 128

3.4.3.4 Composés M, L, K et O... 130

3.4.3.5 Composés N et R ... 131

3.4.4 Considérations phytochimiques ...132

3.5OXYTROPIS FETIDA (VILL.)DC. :BIOSYNTHESE, ACTIVITES BIOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES. ...134

3.5.1 De la biosynthèse des isoflavonoïdes ...134

3.5.2 Activités biologique et biochimique des composés A à R...137

3.5.2.1 Activité antifongique contre C. cucumerinum des composés isolés. ... 137

3.5.2.5 Activité antiradicalaire sur le DPPH des composés isolés ... 140

3.6ETUDE D’ESPECES DU GENRE OXYTROPIS :O. CAMPESTRIS (L.)DC.,O. HELVETICA SCHEELE,O. JACQUINII BUNGE ET O. FETIDA (VILL.)DC. ...142

3.6.1 Comparaison des différents extraits d’O. fetida (Vill.) DC. ...142

3.6.2 Analyses LC/UV/ESI-MSⁿ de quatre espèces du genre Oxytropis...145

3.7FRACTIONNEMENT BIOGUIDE DE L’EXTRAIT DICHLOROMETHANIQUE DE POTENTILLA GRANDIFLORA L. ...146

3.7.1 Analyses LC/DAD-UV et LC/UV/APCI-MSⁿ préliminaires ...146

3.7.2 Fractionnement bioguidé de l’extrait dichlorométhanique ...151

3.7.2.1 Activités de l’extrait ... 151

3.7.2.2 Fractionnement et isolement des composés A à D ... 151

3.7.3 Détermination de structure des composés A et B ...154

3.7.3.1 Composé A ... 154

3.7.3.2 Composé B... 159

3.7.4 Activités biologique et biochimique des composés ...164

3.7.4.1 Activités biologique et biochimique du composé A... 164

3.7.5 Discussion...165

3.8FRACTIONNEMENT BIOGUIDE DE L’EXTRAIT METHANOLIQUE DES FEUILLES DE VACCINIUM ULIGINOSUM SSP. MICROPHYLLUM (L^ANGE)T^OLM. ...166

3.8.1 Analyse LC/DAD-UV préliminaire...166

3.8.2 Fractionnement de l’extrait méthanolique des feuilles ...168

3.8.2.1 Activités de l’extrait ... 168

3.8.2.2 Fractionnement et isolement des composés... 169

3.8.3 Considérations phytochimiques ...172

4. CONCLUSIONS ... 174

5. PARTIE EXPERIMENTALE ... 180

5.1MATERIEL VEGETAL ET EXTRACTION...182

5.2TECHNIQUES DE SEPARATION ANALYTIQUE...185

5.2.1 Chromatographie sur couche mince (CCM) ...185

5.2.2 Chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrophotométrie ultraviolet/visible (HPLC/DAD-UV)...185

5.2.3 Chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (HPLC/UV/MS)...186

5.3TECHNIQUES DE SEPARATIONS PREPARATIVES...188

5.3.1 Chromatographie de partage centrifuge (CPC)...188

5.3.2 Chromatographie liquide à moyenne pression (MPLC) ...188

5.3.3 Chromatographie liquide semi-préparative à haute pression ...189

5.4METHODES PHYSICO-CHIMIQUES...190

5.4.1 Polarimétrie ([α]D) ...190

5.4.2 Spectrophotométrie UV/Visible...190

5.4.3 Spectrométrie de masse (MS) ...190

5.4.4 Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) ...191

5.5METHODES CHIMIQUE ET BIOCHIMIQUE DE CRIBLAGE...193

5.5.1 Réactifs de révélation chimique sur CCM ...193

5.5.2 Mise en évidence de l’activité antiradicalaire sur le DPPH...193

5.5.3 Mise en évidence de l’activité inhibitrice de l’acétylcholinestérase ...194

5.6METHODES BIOLOGIQUES DE CRIBLAGE...196

5.6.1 Mise en évidence de l’activité antifongique sur Cladosporium cucumerinum par bioautographie directe ...196

5.6.2 Mise en évidence de l’activité antifongique sur Pyrenophora teres par test de croissance du mycélium sur milieu artificiel...196

5.6.3 Mise en évidence de l’activité antifongique sur Candida albicans par bioautographie « agar overlay » ...196

5.7CONSTANTES PHYSIQUES ET DONNEES SPECTRALES DES COMPOSES ISOLES...198

5.7.1 Composés isolés de l’extrait dichlorométhanique des racines d’Oxytropis fetida (Vill.) DC. ...198

5.7.2 Composés isolés de l’extrait méthanolique des racines d’Oxytropis fetida (Vill.) DC...211

5.7.3 Composés isolés de l’extrait dichlorométhanique de Potentilla grandiflora L. ...222

6. RÉFÉRENCES... 226

7. RÉSUMÉ... 244

8. ABSTRACT... 248

[α]D Pouvoir rotatoire à la longueur d’onde de la raie D du sodium (589,3 nm)

δ Déplacement chimique

ε Coefficient d’extinction molaire

A, B, C,… Désignation des composés naturels isolés dans le présent travail

APCI Ionisation chimique à pression atmosphérique (Atmospheric Pressure Chemical Ionization)

CCM Chromatographie sur Couche Mince

CHCl3 Chloroforme

CHCl3-d1 Chloroforme Deutérié

CH2Cl2 Dichlorométhane

CH2Cl2-d2 Dichlorométhane diDeutérié d Doublet

Da Dalton (unité de masse moléculaire)

DAD Détecteur à barrettes de diodes (Diode Array Detector) DCM DiChloroMéthane

dd Double Doublet

DEPT Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer

DMSO-d6 DiMéthylSulfOxyde hexaDeutérié

DPPH Radical 1,1-DiPhényl-2-PicrylHydrazyle

EI Ionisation par impact électronique (Electron Impact ionization) ESI Ionisation par électrospray (ElectroSpray Ionization)

EtOH Ethanol

gDQF-COSY Double Quantum Filtered COrrelation SpectroscopY gHMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence

gHSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

HPLC Chromatographie liquide à haute performance (High Performance LC)

HR Haute Résolution (High Resolution)

i.d. Diamètre interne

int. rel. Intensité relative

IT Analyseur à piège d’ions (Ion Trap analyzer)

J Constante de couplage

LC Chromatographie liquide (Liquid Chromatography) m Multiplet

MeCN Acétonitrile MeOH Méthanol

MeOH-d4 Méthanol tétraDeutérié

Mp Point de fusion (Melting Point)

MPLC Chromatographie liquide à moyenne pression (Medium Pressure LC) Mr Poids moléculaire (Molecular weight)

MS Spectrométrie de masse (Mass Spectrometry)

MSⁿ Spectrométrie de masse tandem à plusieurs étapes (multiple stage tandem MS) m/z Rapport entre la masse et le nombre de charges élémentaires d’ions

RMN Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy)

NOESY Nuclear Overhauser Enhancement SpectroscopY ppm Unité de δ (Parties Par Million, Parts per Million = 10^-6) Rf Facteur de rétention (Retention Factor)

Rt Temps de rétention (Retention Time)

RP Phase inverse (Reversed Phase)

s Singulet

sh. Epaulement (shoulder)

spp. Plusieurs espèces du même genre botanique t Triplet

THF TétraHydroFuranne TMS TétraMéthylSilane

UV Spectrophotométrie/rayonnement dans le domaine de l’Ultra-Violet

1. BUTS DU TRAVAIL

Depuis quelques années, la chimie combinatoire suivie d’un criblage à haut débit, est considérée comme la solution à l’obtention de nouveaux composés de tête (« Lead compound »). Néanmoins cette approche débouche de moins en moins sur la découverte de nouvelles molécules actives et un certain retour en arrière est en train d’être observé. Ainsi, l’utilisation des produits naturels comme sources de nouvelles structures actives, combinée à des techniques de synthèse combinatoire, plutôt que comme entité finale du médicament (« natural product mimic ») est à nouveau d’actualité [Newman et al., 2003]. Les métabolites secondaires issus de produits naturels végétaux, animaux ou encore de mycètes apparaissent alors à nouveau comme une source inexhaustible de nouveaux médicaments potentiels.

Actuellement, au cœur de la recherche de nouvelles substances à activité pharmacologique, deux problématiques sont toujours d’actualité : les maladies infectieuses et le stress oxydatif.

Dans le cadre des diverses maladies infectieuses, une forte augmentation durant la dernière décennie de la prévalence des infections fongiques systémiques et topiques a été constatée. Les facteurs principaux de cette augmentation incluent entre autres, l’utilisation intensive d’antifongiques à large spectre d’où l’apparition de résistance, l’augmentation du nombre de personnes immunodéprimées (SIDA, thérapies immunosuppressives), le vieillissement de la population, ou encore l’utilisation de méthodes invasives [Vicente et al., 2003].

Un intérêt grandissant concerne également le stress oxydatif en biologie et en médecine et s’explique par les mises en évidence de son implication dans de très nombreux mécanismes pathologiques, notamment ceux dus au vieillissement, tels que l’athérosclérose, le cancer, les maladies auto-immunes ou encore les maladie de Parkinson et d’Alzheimer [Salvi, 1998; Salvi et al., 2002].

C’est dans ce cadre qu’une investigation de diverses plantes alpines a été entreprise ici.

L’intérêt des plantes alpines pour la médecine et pour la recherche de nouvelles molécules actives s’explique par leur environnement naturel singulier qui leur confère des caractéristiques très particulières. Elles sont, en effet, exposées à des conditions climatiques extrêmes qui ne se trouvent nulle part ailleurs. Différents paramètres obligent ainsi les plantes à développer des mécanismes de protection efficaces, contre à la fois les attaques par les micro-organismes, les champignons et les insectes, mais aussi contre un stress oxydatif important en haute altitude.

Des espèces hautement réactives, source de composés potentiellement actifs, sont ainsi synthétisées par la plante pour sa survie et sa lutte contre ses prédateurs. Elles peuvent donc être la source de nouveaux composés intéressants et actifs.

Dans ce travail, une sélection de 45 plantes alpines de diverses familles a été récoltée. Toutes les plantes ont été cueillies en août 2001 dans les Alpes centrales dans les étages suprasubalpin et alpin à des altitudes allant de 2200 à 2700 mètres. Elles ont ensuite été soumises à un criblage comprenant un test antiradicalaire sur le DPPH et plusieurs tests antifongiques, tels que la mise en évidence de l’activité sur Candida albicans par bioautographie « agar overlay », sur Cladosporium cucumerinum par bioautographie directe ou encore sur Pyrenophora teres par test de croissance du mycélium sur milieu artificiel.

Quatre extraits de plantes alpines ont ainsi été sélectionnés pour un fractionnement bioguidé selon leurs potentialités antifongique et antiradicalaire. Un genre a particulièrement retenu notre attention, pour l’uniformité de son activité antifongique. En effet, tous les extraits apolaires des espèces du genre Oxytropis se sont révélés plus ou moins actifs, alors que deux extraits polaires de ce même genre ont montré une activité significative. De plus l’extrait dichlorométhanique des racines d’Oxytropis fetida (Vill.) DC. est le seul extrait apolaire montrant une bonne activité antiradicalaire. Les extraits méthanolique et dichlorométhanique d’Oxytropis fetida (Vill.) DC. ont donc été choisis pour une étude phytochimique plus approfondie, tandis que les autres extraits de ce genre ont été analysés par LC/DAD-UV et LC/UV/ESI-MSⁿ. L’extrait dichlorométhanique de Potentilla grandiflora L. et l’extrait méthanolique des feuilles de Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. ont quant à eux fait également l’objet d’un fractionnement bioguidé selon leur activité antifongique.

2. INTRODUCTION

2.1 Les Alpes, climat et végétation

2.1.1 Historique et situation des Alpes

Les Alpes sont une chaîne de montagnes relativement jeunes d’environ 40 millions d’années et situées à l’ouest de l’Europe. Elles recouvrent la frontière nord de l'Italie, le sud-est de la France, la Suisse, le Liechtenstein, l'Autriche, le sud de l'Allemagne et la Slovénie centrale (Figure II-1).

Figure II-1 : Les Alpes vue depuis l’espace (NASA, 2002).

Les Alpes peuvent être subdivisées en trois parties :

ƒ les Alpes occidentales (de la Méditerranée au Mont-Blanc)

ƒ les Alpes centrales (du Val-d’Aoste au Brenner)

ƒ les Alpes orientales (du Brenner à la Slovénie)

Parmi les grands systèmes montagneux d’Europe, c’est la chaîne la plus puissante en longueur, largeur et altitude moyenne. En effet, l’arc alpin mesure 1’200 kilomètres de long et s’étend sur environ 200’000 km². De nombreux massifs culminent à plus de 4’000 mètres ; le sommet du Mont-Blanc, sur la frontière franco-italienne, en est le point culminant à 4 808 mètres. Comme nous pouvons le voir sur la figure II-2, la largeur maximale de la chaîne est de 250 kilomètres au centre des Alpes orientales (au niveau du Tyrol et des Dolomites) et sa largeur la plus faible, 140 kilomètres environ, se situe dans les alpes nord-occidentales [Ozenda, 1985; Landolt et

Figure II-2 : Situation, dimensions et limites des Alpes d’après Landolt (2005).

En Europe, les grandes glaciations de l’ère quaternaire ont recouvert complètement les Alpes d’une énorme calotte glacière. Durant 100’000 années, ces glaciations successives ont modelé un paysage montagneux bien particulier, caractérisé par de profondes vallées longitudinales et par l’existence, à la périphérie de la chaîne, de grands lacs tels que les lacs Léman, de Constance, de Chiem, Majeur, de Lugano, de Côme, d’Isée et de Garde [Ozenda, 1985; Landolt et Aeschimann, 2005].

2.1.2 Adaptation au climat et à l’altitude des plantes alpines

Les Alpes sont principalement situées dans la zone némorale de l’Europe, au climat tempéré et aux forêts caducifoliées. Dans cette zone, le climat des Alpes est subocéanique (hivers relativement doux et courts, étés modérément chauds et plutôt humides). Seul le sud-ouest des Alpes montre déjà une nette influence méditerranéenne. Le climat de la chaîne alpine est la résultante de deux groupes de composantes [Ozenda, 1985] :

ƒ les caractères généraux du climat de montagne, liés à l’altitude (augmentation de l’insolation, diminution des températures, accroissement des précipitations et de la couverture nivale) ou au modelé topographique (influence de l’exposition).

ƒ les caractères propres aux Alpes, liés à la complexité de la chaîne et notamment à son épaisseur, à sa situation en limite de plusieurs grandes provinces climatiques, aux modifications qu’elle crée elle-même dans les climats généraux de l’Europe centro-méridionale.

Les différences de climat ont une influence profonde sur la végétation. La diversité et les caractéristiques de la végétation alpine ne peuvent être saisies que grâce à une certaine

connaissance des facteurs climatiques. Les plus importants sont brièvement présentés ici [Ozenda, 1985; Landolt et Aeschimann, 2005].

2.1.2.1 Pression atmosphérique

La pression atmosphérique décroît avec l’altitude suivant une loi exponentielle. Elle n’exerce qu’une action indirecte sur les plantes, dans la mesure où l’air des altitudes supérieures contient moins de vapeur d’eau et de gaz carbonique pour un volume donné. Ainsi, la plante se déshydrate plus rapidement en ouvrant ses stomates. D’autre part, de manière à assimiler autant de gaz carbonique pour une synthèse équivalente de sucre, la plante doit ouvrir ses stomates plus longtemps. Ainsi, son bilan hydrique en cas de sécheresse peut devenir précaire.

2.1.2.2 Température

La température de l’air diminue de la moyenne annuelle de 0.55 °C pour une augmentation de 100 mètres d’altitude. Cette valeur est une moyenne et est étonnamment valable pour les régions les plus diverses. Etant donné que de nombreux processus vitaux sont dépendants de la température, ce facteur joue un rôle déterminant dans la vie des plantes. En général, la vitesse des processus vitaux (donc aussi la croissance) augmente proportionnellement à la température (jusqu’à une limite propre à chaque plante). C’est pourquoi la croissance des plantes d’altitude est en général moins intensive que celle des plantes de plaine. De plus, en montagne, l’intense rayonnement terrestre nocturne entraîne un risque de gel pour les plantes proches de la surface du sol, durant presque toute l’année. Ainsi, les plantes doivent être résistantes au gel, même pendant la période de croissance.

2.1.2.3 Rayonnement solaire

A nébulosité égale, la luminosité augmente avec l’altitude. En effet, le rayonnement solaire est plus élevé du fait que celui-ci a traversé une épaisseur d’atmosphère plus faible qu’en plaine.

La composition spectrale de la lumière se modifie aussi avec l’altitude croissante. En haute montagne, elle est plus riche en rayons de faible longueur d’onde et notamment en ultraviolet.

La forte intensité lumineuse favorise l’assimilation chez les plantes et permet l’élaboration de sucre en quantité suffisante, malgré les basses températures. Mais la plante doit pouvoir se protéger face à une trop forte intensité de rayonnement ultraviolet, grâce à des pigments rouges, un duvet de poils ou une cuticule épaisse. L’intense rayonnement solaire permet de compenser en partie la faible température de l’air (cf. 2.1.2.2) et ceci principalement sur les versants exposés au sud. C’est pourquoi la végétation y prospère à des altitudes plus élevées que sur les

2.1.2.4 Précipitation et humidité

Les précipitations annuelles augmentent avec l’altitude et la proximité des Alpes. Un refroidissement de l’air humide provoque des précipitations (sous forme de pluie, neige ou grêle). Lorsque l’air arrive à proximité des montagnes, il s’élève et par conséquent se refroidit.

C’est la raison pour laquelle les précipitations sont plus abondantes au voisinage des Alpes qu’en plaine. Les Alpes internes sont donc aussi plus sèches que les chaînes externes, mais ceci s’égalise avec l’altitude ; de ce fait, pour les plantes des étages alpin et subnival (au-dessus des forêts), les différences de précipitations ne jouent presque plus aucun rôle. Par contre, l’humidité de l’air diminue en moyenne avec l’altitude. En raison de cet air plus sec, les plantes perdent davantage d’eau par transpiration en montagne qu’en plaine. Il en résulte un danger accru de dessèchement, car l’eau trop fraîche du sol ne peut être mise à disposition suffisamment vite pour compenser les pertes.

2.1.2.5 Conditions d’enneigement

Les plantes à fleurs ne peuvent prospérer qu’aux endroits dépourvus de neige pendant au moins deux mois par an ; sous la neige, la température et l’intensité lumineuse sont en effet trop faibles pour assurer une croissance continue. Dans les Alpes, la durée d’enneigement augmente avec l’altitude (environ 10 jours pour 100 mètres) et la limite climatique des neiges (limite à laquelle la neige fond, en été, sur les plans horizontaux) est située entre 2400 et 3200 mètres selon que l’on se trouve dans les Alpes septentrionales, internes ou méridionales. La couche de neige est néanmoins un isolant thermique et nécessaire car en dessous de celle-ci, le sol n’est jamais vraiment gelé. De plus, la couche hivernale de neige est un réservoir d’eau important (surtout pendant la période végétative), qui maintient le sol humide jusque dans ses profondeurs. Une épaisse couche de neige protège donc les plantes à la fois contre le froid et le dessèchement. En période hivernale et de grand froid, la neige est utile afin que les pousses aériennes de beaucoup de plantes ne soient pas détruites, alors qu’il est essentiel d’avoir une assez longue période sans couverture nivale le reste de l’année.

2.1.2.6 Vent

Le vent peut exercer sur les plantes des effets variés, parfois très néfastes. La vitesse moyenne des vents augmente avec l’altitude. Près du sol, la vitesse du vent est considérablement ralentie par le frottement. L’action des vents violents se fait dès lors, surtout sentir sur les sommets isolés et les crêtes. Dans les Alpes, les végétaux qui croissent dans les lieux exposés doivent être bien enracinés et résistants aux dommages mécaniques ; ils doivent en outre posséder une protection efficace contre l’évapotranspiration, celle-ci étant augmentée par l’effet du vent.

Tous ces paramètres sont considérés dans un cadre très théorique, mais il faut aussi bien entendu prendre en considération que les Alpes sont des montagnes de formes quelconques, faisant partie d’un système ou d’une chaîne complexe. Des facteurs tels que l’exposition, le modelé des pentes, les microclimats ou encore les faits bioclimatiques propre à la chaîne alpine (au moins cinq divisions climatiques peuvent être distinguées) doivent être pris en compte [Ozenda, 1985; Landolt et Aeschimann, 2005].

2.1.2.7 Adaptation des plantes alpines

Les conditions extrêmes abordées précédemment provoquent un certain nombre d’adaptations chez les plantes, telles que [Ozenda, 1985; Landolt et Aeschimann, 2005] :

ƒ Le nanisme qui permet une meilleure utilisation de la chaleur du sol et offre une protection contre les vents desséchants et l’évapotranspiration. D’autre part, en hiver, les plantes basses sont beaucoup mieux protégées par la couche de neige. De plus, la forte intensité lumineuse et les basses températures nocturnes freinent leur croissance.

ƒ Un système radiculaire important et des organes souterrains bien développés qui leur permettent d’absorber de plus grandes quantités d’eau et de substances nutritives tirées du sol, ainsi qu’une meilleure assise.

ƒ Une longue durée de vie pouvant atteindre plusieurs dizaines d’années

ƒ Diverses stratégies contre l’évapotranspiration, telles que les stomates sur la face inférieure, de petites feuilles larges et coriaces, souvent enroulées ou succulentes, une pilosité dense ou encore un revêtement cireux.

ƒ Une courte période de végétation et des stratégies de pollinisation élaborées.

2.1.3 Végétation et étage de végétation dans la chaîne alpine.

La végétation est l’ensemble des plantes qui croissent à un endroit déterminé. L’aspect et la composition de la végétation dépendent en grande partie des conditions extérieures de vie (climat, sol, concurrence) et de la situation géographique. La végétation peut être divisée selon des coupures altitudinales, déterminées essentiellement par le gradient de température, qui sont dites « étage de végétation » [Ozenda, 1985; Landolt et Aeschimann, 2005]. Dans la chaîne alpine, la végétation est divisée en cinq étages principaux, de bas en haut :

ƒ L’étage collinéen : au pied des montagnes

ƒ L’étage montagnard : correspondant à la partie centrale

ƒ L’étage subalpin : transition entre les forêts et les étage à pelouses

Les limites des étages ne sont pas tranchées, car de larges zones intermédiaires et une imbrication intime des diverses formations végétales les estompent. La figure II-3 présente les principaux étages de végétations ainsi que certaines sous-divisions caractéristiques des Alpes helvétiques.

Figure II-3 : Etages de végétation dans les Alpes helvétiques d’après Landolt (2005).

1 : étage collinéen (étage du chêne et du hêtre). 1a : variante septentrionale à chênes pédonculé et sessile (Quercus robur, Q. petraea), ainsi que beaucoup de hêtre (Fagus sylvatica). 1b : variante interne à chêne pubescent (Quercus pubescens), mais sans hêtre. 1c : variante méridionale à chêne pubescent et hêtre.

2 : étage montagnard, à hêtre (Fagus sylvatica) et sapin blanc (Abies alba)

3 : étage subalpin, à épicéa (Picea abies). 3a : variante interne avec l’apparition du pin sylvestre

4 : étage montagnard continental, à pin sylvestre (Pinus sylvestris) 5 : étage suprasubalpin, à arolle (Pinus cembra)

6 : étage alpin (étage des pelouses)

7 : étage subnival (étage des plantes en coussinets)

8 : étage nival (étage des neiges éternelles, sans plantes à fleurs, sauf en certains emplacements favorables)

2.1.4 Intérêts des plantes alpines

L’intérêt des plantes alpines pour la médecine et pour la recherche de nouvelles molécules actives s’explique par leur environnement naturel singulier qui leur confère des caractéristiques très particulières. Comme nous avons pu le voir précédemment, les plantes des Alpes sont exposées à des conditions climatiques extrêmes qui ne se trouvent nulle part ailleurs [Baltisberger, 1997].

Un facteur qui retiendra plus particulièrement notre attention est le rayonnement solaire, celui- ci est nettement plus intense et donc potentiellement nocif en haute altitude. En effet, il favorise la formation d’espèces réactives, appelées radicaux libres, hautement toxiques pour les constituants cellulaires tels que les lipides, les protéines, les sucres ou l’ADN. L’ensemble de ces dégâts est regroupé sous le terme de stress oxydatif. L’intérêt grandissant concernant le stress oxydatif en biologie et en médecine s’explique par les mises en évidence de son implication dans des mécanismes pathologiques, notamment ceux dus au vieillissement, tels que l’athérosclérose, le cancer, les maladies auto-immunes ou encore la maladie de Parkinson ou d’Alzheimer [Salvi, 1998; Salvi et al., 2002]. En altitude, pour se protéger du rayonnement solaire, les plantes synthétisent des substances de défense aux propriétés antioxydantes et antiradicalaires [Hostettmann, 2001]. Ces molécules sont alors une cible pour la recherche pharmaceutique, car elles sont susceptibles de neutraliser les radicaux libres, d’inhiber l’oxydation des Low Density Lipoproteins (LDL) ou lipoprotéines de basse densité in vitro ou encore démontrent des propriétés antiagrégantes, hépatoprotectrices ou chimiopréventives [Salvi, 1998].

Divers autres facteurs, tels que la température de l’air, du sol, les conditions d’enneigement ou encore le rayonnement terrestre nocturne impliquent une période de végétation nettement raccourcie des plantes alpines par rapport à celles de plaine. Ces différents paramètres obligent les plantes à développer des mécanismes de protection efficaces contre les attaques par les micro-organismes, les champignons et les insectes, non seulement pour pouvoir se reproduire en un minimum de temps lors de la belle saison, mais aussi pour optimiser leur croissance dans le court temps qui leur est imparti [Baltisberger, 1997]. Des espèces réactives hautement toxiques sont ainsi synthétisées par la plante pour sa lutte contre ses prédateurs.

Comme nous allons le voir dans le point 2.2 : Maladies fongiques humaines et végétales et leurs traitements, les substances antifongiques sont actuellement une cible de recherche très importante. La prévalence des infections fongiques systémiques et topiques ayant très significativement augmenté durant la dernière décennie.

Les plantes alpines synthétisent des molécules qui ont un rôle précis comme les pigments ou des substances de défense contre les stress oxydatif, les insectes ou les champignons pouvant présenter un rôle médical certain. Malheureusement, bon nombre de ces plantes alpines sont aujourd’hui protégées et l’on se trouve souvent confronté aux difficultés de les cultiver dans un environnement qui ne leur est pas propre pour pouvoir les récolter et les étudier [Künzle, 1947].

Dans ce travail, une sélection de 45 plantes alpines de diverses familles a été récoltée. Toutes les plantes ont été cueillies par Monsieur Egidio Anchisi, Jardin Alpin de Champex (Suisse), en août 2001 dans les Alpes centrales :

ƒ dans la région autour du col du Petit-Saint-Bernard (Savoie, France)

ƒ dans la région autour du col du Petit-Saint-Bernard (val d’Aoste, Italie)

ƒ dans le vallon de l’Urtier (val d’Aoste, Italie)

ƒ dans la région du col du Bard (val d’Aoste, Italie)

Ces différentes plantes alpines ont été spécialement récoltées dans les étages suprasubalpin et alpin à des altitudes allant de 2200 à 2700 mètres.

2.2 Maladies fongiques humaines et végétales et leurs traitements

2.2.1 Introduction

Jusqu’aux années 70, les infections fongiques étaient considérées comme largement curables et la demande de nouveaux traitements était relativement faible [Vicente et al., 2003].

Actuellement, dans de nombreux domaines, tels que la médecine, l’agro-alimentaire ou encore l’agriculture, le besoin de nouvelles molécules, de préférence avec de nouveaux modes d’action, se fait sentir. Alors que les phytopathogènes sont responsables d’une diminution de 20

% du rendement mondial des cultures de céréales, et que les gouvernements doivent faire face à la croissance exponentielle de la population, l’augmentation des rendements devient essentielle [Hadacek et Greger, 2000]. De plus, la prévalence des infections fongiques systémiques et topiques a très significativement augmenté durant la dernière décennie. Les facteurs principaux de cette dramatique augmentation, incluent entre autre, l’utilisation intensive d’antibiotiques à large spectre, l’augmentation du nombre de personnes immunodéprimées, le vieillissement de la population, ou encore l’utilisation de méthodes invasives telles que les voies veineuses [Vicente et al., 2003].

Depuis quelques années, la chimie combinatoire de molécules simples (« drugs like »), est considérée comme la solution à l’obtention de très grandes librairies de composés nécessaires aux criblages basés sur les cibles moléculaires. Néanmoins, et contre toute attente, la découverte de nouvelles entités chimiques ne cesse de diminuer depuis quelques années ; 2001, par exemple, a été une des années au plus bas rendement depuis 20 ans. Très récemment, un certain retour en arrière a pu s’observer. Ainsi, l’utilisation des produits naturels comme sources de nouvelles structures actives, combinée à des techniques de synthèse combinatoire, plutôt que comme entité finale du médicament (« natural product mimic ») est à nouveau d’actualité [Newman et al., 2003]. Les métabolites secondaires apparaissent alors à nouveau comme une source inexhaustible de nouveaux composés tels que de nouveaux antimicrobiens, antiviraux, anticancéreux, ou encore agents pour l’agriculture [Vicente et al., 2003]. Ceci est particulièrement évident dans le domaine des maladies infectieuses et de l’oncologie, où respectivement plus de 60 et 70 % des médicaments sont d’origine naturelle [Newman et al., 2003]. Encore récemment, cela concernait peu le cas des antifongiques, mais pour la première fois depuis les années 70, deux produits naturels modifiés ont été enregistrés en 2001 (Cancidas®) et 2002 (Fungard®) pour la thérapie antifongique. Ils sont les premiers d’un type

80, alors que tous les autres antifongiques étaient des azoles ou des inhibiteurs de la squalène époxidase du type terbinafine [Newman et al., 2003].

2.2.2 Maladies fongiques humaines

La grande majorité des 100'000 espèces de champignons actuellement connues sont des saprophytes strictes, vivant de matières organiques en décomposition. Seulement une cinquantaine d’espèces sont pathogènes pour l’homme et provoquent pour la plupart, des maladies superficielles de la peau ou des muqueuses [Agrios, 1988].

Les maladies fongiques chez l’homme peuvent être classées en trois catégories [Barrett, 2002] :

ƒ les réactions allergiques aux protéines fongiques

ƒ les intolérances aux toxines de certains champignons

ƒ les infections ou mycoses

Les deux premières pathologies impliquant principalement des mécanismes immunologiques, nous nous intéresserons uniquement à la dernière catégorie, qui va des infections superficielles (dermatomycoses) aux mycoses systémiques potentiellement mortelles [Vicente et al., 2003].

Les mycoses topiques ou superficielles des cheveux, de la peau, des muqueuses et des ongles sont une source majeure de morbidité à travers le monde. Il a été estimé que ces infections étaient responsables de 5 % des nouvelles consultations chez les dermatologues dans les climats tempérés, alors que dans les climats tropicaux, ce pourcentage atteint 20 %. Les infections fongiques touchant des individus sains, en particulier des enfants du tiers monde, souffrant de conditions sanitaires déficientes, sont en constante augmentation [Rai et Mares, 2003]. Les organismes responsables étant majoritairement des dermatophytes ou des levures, principalement du genre Candida (candidoses cutanéo-muqueuses par ex. buccales ou génitales).

Les infections fongiques systémiques restent des affections graves et sont de plus en plus fréquentes. Les principaux pathogènes responsables étant Candida spp., Cryptococcus neoformans (méningites, broncho-pneumonies), Aspergillus spp., Pneumocystis carinii (pneumonies) et Histoplasma capsulatum (pneumonies, infections opportunistes) [Vicente et al., 2003].

A côté de l’apparition de mycoses d’importation dues à la multiplication des voyages, la cause principale de cette croissance réside très probablement dans l’augmentation considérable des facteurs de risque et plus particulièrement du nombre de patients sévèrement immunodéprimés.

Cette immunodépression peut être d’origine constitutive (déficits immunitaires), mais surtout acquise (infection par le HIV) ou iatrogène et associée aux progrès de la médecine (traitement

anti-rejets). D’autres facteurs prédisposant peuvent encore être pris en compte tels que la thérapie antibactérienne, le traumatisme cutané, le diabète, la grossesse, la chimiothérapie.

Ainsi, des services hospitaliers de spécialités très diverses doivent faire face à un nouveau risque infectieux majeur. En effet, les dermatomycoses peu virulentes, tout comme les mycoses systémiques, peuvent être mortelles chez les immunodéprimés, les prématurés, les cancéreux sous chimiothérapie, les transplantés ou les grands brûlés [Garraffo, 2003; Rai et Mares, 2003].

2.2.3 Traitement des mycoses au jour d’aujourd’hui

Bien qu’en apparence une grande quantité de médicaments pour le traitement des mycoses superficielles et systémiques soient disponibles sur le marché, seuls peu d’entre eux sont des antifongiques réellement efficaces. De nombreux traitements ont des effets secondaires ou sont réellement toxiques (amphotéricine B), sont fongistatiques et non fongicides (azoles), ou sont responsables d’induire le développement de résistances (5-fluorocytosine). Les résistances aux médicaments sur le marché sont en croissante augmentation, et ceci malgré l’avènement de thérapies combinées. Il existe ainsi une réelle demande pour une nouvelle génération d’agents antifongiques plus sûrs et plus efficaces [Rai et Mares, 2003].

O OH

O OH OH

OH

OH OH OH

O

CO₂H

O HO

O

OH NH₂ OH

Figure II-4 : Amphotéricine B (1)

Le tableau II-1 résume les principaux types de composés utilisés en thérapeutique au jour d’aujourd’hui ainsi que leurs champs et modes d’action.

Depuis 2003, de nouvelles formulations lipidiques d’amphotéricine B, diminuant ses effets secondaires et plus particulièrement sa néphrotoxicité , ainsi qu’un certain nombre de triazoles de deuxième génération plus performants sont actuellement sur le marché (Vfend® : voriconazole, posaconazole et ravuconazole : en cours d’accréditation) [Barrett, 2002].

Tableau II-1 : Principaux médicaments antifongiques utilisés actuellement [Rai et Mares, 2003].

Antifongiques Type de composés Type d’infection Mode d’action

Amphotéricine B Polyènes Aspergilloses

Blastomycoses Candidoses Cryptococcoses

Complexe avec l’ergostérol dans la membrane plasmique fongique

5-Fluorocytosine Dérivé fluoré de la pyrimidine

Candidoses

Traitements combinés

Inhibition de la synthèse de l’ADN et l’ARN

Terbinafine Naftifine

Allylamines Dermatomycoses Mycoses des muqueuses

Inhibition de la biosynthèse de l’ergostérol par blocage de la squalène époxidase Ketoconazole

Miconazole Itraconazole Fluconazole

Imidazoles

Triazoles

Blastomycoses Coccidioïdomycoses Histoplasmoses Paracoccidioïdomycoses

Inhibition de la biosynthèse de l’ergostérol par blocage de la 14-deméthylation du lanostérol

De même, de nouveaux antifongiques, les inhibiteurs de synthèse des glucanes (Cancidas® : acétate de caspofungine, Fungard® : sodium de micafungine), ont des caractéristiques permettant d’espérer une efficacité contre certains germes résistants.

HO NaO₃SO

NH O O

H₂N

O N

HO

OH HO

NH

O N O

OH

OH HN

O NH

O

N O NH

HO O

HO OH

O(CH₂)₄CH₃

Figure II-5 : Sodium de micafungine (2)

Ces dérivés des échinocandines/pneumocandines sont les premiers inhibiteurs du glucane sur le marché, alors que la structure de base des échinocandines a été pour la première fois reportée en 1974 [Newman et al., 2003]. Les pneumocandines sont des produits naturels dérivés de la fermentation de Glarea lozoyensis [Vicente et al., 2003]

De nouvelles stratégies sont en cours d’exploration, notamment les associations d’antifongiques et l’adjonction de traitements immunostimulants (cytokines) [Granier, 2003]. Bien que ces

diverses voies ouvrent des perspectives intéressantes, elles ne résolvent pas tous les problèmes.

Il est donc impératif de trouver de nouveaux composés ayant des mécanismes d’actions originaux et sélectifs, une activité fongicide plutôt que fongistatique, un large spectre d’action et un minimum d’induction de résistance [Rai et Mares, 2003].

2.2.4 Maladies fongiques des végétaux

Dans les pays industrialisés, les pertes induites par les phytopathogènes entraînent des pertes économiques pour les agriculteurs, l’augmentation des prix de vente, ou encore la destruction des plantes ornementales. Certaines populations du tiers monde vivent de leurs cultures et les pertes dues aux attaques fongiques ou à d’autres phytopathogènes peuvent avoir des conséquences dramatiques telles que la malnutrition, la famine, la migration ou décimer les cheptels. La destruction des ressources alimentaires est à l’origine de graves désastres depuis des siècles et est malheureusement aujourd’hui toujours d’actualité [Agrios, 1988].

De nombreuses espèces de champignons vivent dans le sol. La plupart sont uniquement saprophytes, mais un certain nombre peut se développer aux dépens de plantes vivantes et sont alors à l’origine de graves affections. Plus de 8000 espèces de champignons peuvent ainsi provoquer des maladies fongiques chez les plantes [Agrios, 1988].

L'interaction entre les mycètes pathogènes et leurs plantes hôtes est extrêmement complexe et devrait être regardée des deux points de vue. Les facteurs biologiques importants à prendre en considération chez le mycète pathogène sont entre autres : la façon dont il se reproduit et la nécessité pour sa survie d’un hôte intermédiaire ou d’un hivernage. D'autres facteurs importants incluent les moyens par lesquels le mycète atteint la plante, tels que le vent, les insectes vecteurs comme des coléoptères, ou encore des conditions de stockage inadéquates. De la perspective de la plante hôte, sa physiologie et son métabolisme doivent être pris en compte.

Les effets de l'environnement physique influant sur la croissance, le développement, ou les processus biochimiques, sont également des facteurs importants.

Certains champignons sont des parasites primaires à pouvoir pathogène élevé, d’autres sont des parasites secondaires qui ne peuvent s’installer que sur des plantes affaiblies ou blessées. La colonisation des tissus des plantes par ces parasites peut se limiter aux racines ou au collet dont les parenchymes sont alors partiellement ou complètement détruits par pourriture ou nécrose.

Ceci provoquant des arrêts de développement, des dépérissements, des flétrissements ou la mort des plantes. Cette mort peut être rapide lorsque l’attaque a lieu au stade de plantule. Une

vaisseaux par l’intermédiaire desquels ils colonisent la plante de façon interne, provoquant généralement sa mort [Bailly et al., 1980].

2.2.5 Traitement des cultures au jour d’aujourd’hui

L’infinie variété et la complexité des nombreuses maladies fongiques végétales ont induit le développement d’un grand nombre d’approches pour leur contrôle. Les caractéristiques particulières du cycle de vie de chaque champignon, ses préférences d’habitats et ses performances selon certaines conditions environnementales, sont quelques uns des points les plus importants à considérer lors du contrôle d’une attaque fongique. Bien que, dans certains cas les maladies puissent être traitées par un seul type de moyens, en général une combinaison de mesures doit être entreprise pour un contrôle complet de l’infection. Les mesures les plus courantes incluent : l’utilisation de graines ou de plantules non infectées, la destruction des plantes infectées, la rotation des cultures, l’utilisation de variétés de plantes résistantes, etc. La méthode la plus efficace et parfois la seule disponible est l’application de produits chimiques sur les plantes, leurs semences ou sur les sols de cultures [Agrios, 1988].

L’application de produits chimiques a connu une grande avancée au cours de ce dernier siècle, depuis l’utilisation des premiers antifongiques inorganiques jusqu’aux QoI, ou « Quinone outside Inhibitors », qui représentent le développement le plus important réalisé par l'industrie chimique en termes de protection fongique. Le tableau II-2 résume l’introduction des différents types de fongicides aux cours de ces 100 dernières années, ainsi que l’apparition de traitements de plus en plus sûrs et puissants [Russell, 2005].

Tableau II-2 : Principaux antifongiques depuis le 19ème siècle et relation entre la diminution des dosages et l’augmentation de la sûreté [Russell, 2005].

Antifongiques Année

d’introduction

Dosage usuel Kg a.i. / ha

Oral LD50 mg

a.i. / kg (mammifères)

Sulfures 19ème siècle 10-20 400-500

Sulfates de cuivre 19ème siècle 10-20 472

Chlorures mercurique 1891 Traitement des semences 1-5

Dithiocarbamates 1940-1969 1.5-3.5 > 8’000

Phthalimides 1950-1969 < 2.0 > 5’000 > 22’000

Chlorothalonil 1964 0.75-1.25 > 10’000

Méthyl benzimidazole carbamates (MBC)

Années 60 0.25-1.00 > 15’000

Dicarboximides Années 70 0.750 3500-10’000

Inhibiteurs de la déméthylation (DMI)

Années 70 0.125-0.250 568 >6’200

Strobilurines Années 90 0.125-0.250 > 5’000

Actuellement, trois grandes classes de fongicides sont très populaires. Les azoles, rentrés dans la classe des inhibiteurs de la déméthylation (DMI), sont toujours très utilisés et de nouvelles molécules sont régulièrement mises sur le marché. La dernière en date (2002) est le prothioconazole. Malheureusement, cette classe de composés induit de jour en jour d’avantage de résistance. L’introduction de morpholines (par exemple : fenpropidine), d’inhibiteurs de la biosynthèse des stérols dépourvus d’induction de résistance utilisés conjointement aux DMI, résout partiellement le problème [Russell, 2005].

(4)

(3)

OMe O MeO

O N CF₃

(5)

N (H₃C)₃C

N NH N

Cl S

OH

Cl

Figure II-6 : Exemple de fongicides actuellement utilisés Fenpropidine (3), Prothioconazole (4), Picoxystrobine (5)

Les QoI sont des fongicides qui agissent comme inhibiteurs du site d'oxydation du coenzyme Q situé sur la face externe du cytochrome b. Les QoI résultent de la fusion de trois familles de fongicides, les strobilurines et deux nouvelles familles représentées par la fenamidone et la famoxadone. Les strobilurines dérivent d’un fongicide naturel : l’acide β-méthoxy-acrilique.

Elles possèdent des actions prophylactiques, systémiques, éradiquantes et sont actives contre une grande majorité de champignons pathogènes. En 2000, le picoxystrobine a été commercialisé [Russell, 2005].

2.2.6 Organismes étudiés

Dans ce travail, les différents extraits de plantes alpines sélectionnés ont été soumis à un criblage comprenant plusieurs tests antifongiques : mise en évidence de l’activité sur Candida albicans par bioautographie « agar overlay », sur Cladosporium cucumerinum par bioautographie directe et sur Pyrenofora teres par test de croissance du mycélium sur milieu artificiel. Les deux premiers tests sont effectués en routine au Laboratoire de Pharmacognosie

plantes, de part leur simplicité et leur rapidité [Hostettmann et Marston, 1994]. L’essai sur Pyrenophora teres a été réalisé en collaboration avec le Syngenta ® Jealott's Hill International Research Center, le choix s’étant porté sur cet organisme suite à un criblage général des extraits effectué par leurs soins.

2.2.6.1 Candida albicans

Candida albicans, l’espèce la plus importante du genre, est une levure faisant partie de la flore commensale gastro-intestinale, buccale et vaginale de l’être humain. Ce champignon microscopique unicellulaire peut cependant devenir pathogène chez les personnes qui possèdent des mécanismes de défense naturels déficients. Comme vu précédemment, différents facteurs peuvent induire cette immunodéficience et de nos jours, l’infection la plus grave et potentiellement mortelle est probablement la candidose systémique apparaissant chez les patients atteints du HIV. De même que pour la plupart des mycoses, cliniquement, on distingue les infections superficielles cutanées et muco-cutanées (muguet, candidose vaginale) et les infections profondes locales [Reynolds, 1996]. Actuellement, les candidoses représentent 8 à 9

% de la totalité des infections nosocomiales, ce qui place ce genre au quatrième rang des germes pathogènes responsables de ce type d’infection [Olson et al., 2005].

2.2.6.2 Cladosporium cucumerinum

La moisissure Cladosporium cucumerinum est un champignon microscopique phytopathogène s’attaquant particulièrement aux membres de la famille des Cucurbitaceae. Alors qu’il existe d’autres espèces phytopathogènes proches (p. ex. : C. fulvum pour la tomate, C. herbarum), le genre Cladosporium est aussi impliqué dans des pathologies humaines comme des allergies respiratoires, des infections cutanées ou du système nerveux central (C. cladosporioides, C.

bantianum) [Salaki et al., 1984; Elgart, 1996; Cruz et al., 1997].

2.2.6.3 Pyrenophora teres

La levure Pyrenophora teres Drechs., téléomorphe ou forme sexuée de Drechslera teres Shoem. (anamorphe ou forme asexuée) est un champignon unicellulaire phytopathogène [Scott, 1991]. Les spores de P. teres sont habituellement propagées par le vent, puis la nutrition et la croissance de cet organisme parasite sur la plante hôte, induit la nécrose, la sénescence et la mort de cette dernière.

Il existe deux « formes » de Pyrenophora teres, qui diffèrent selon les symptômes observés : P.

teres f. teres, produisant des nécroses brunes en raies et P. teres f. maculata Smedeg, produisant des lésions circulaires ou elliptique. Dans de nombreux pays, les dommages causés par cette levure impliquent de sérieuses conséquences économiques. En effet, elle provoque dans les

climat humides et tempérés l’helminthosporiose ou rayure réticulée de l’orge (Hordeum spp., Poaceae) et induit de sérieuses diminutions de rendement des cultures [Weiergang et al., 2002].

L’orge, en 2004 selon la banque de donnée FAOSTAT, occupait la quatrième plus importante surface de culture de céréales dans le monde, la pertinence du choix de cet organisme est alors mieux comprise.

2.3 La famille des Fabaceae

2.3.1 Introduction

Les Fabaceae constituent la troisième famille des angiospermes de par le nombre de ses représentants. Elles ont une distribution quasi cosmopolite et se trouvent dans les zones tropicales, subtropicales ou tempérées (Figure II-7). Cette famille s’accommode d’une très large gamme d’habitats, et inclue autant des plantes herbacées, aquatiques ou xérophytes, que des arbustes, des arbres ou des plantes grimpantes à lianes volubiles ou à vrilles. Les Fabaceae sont souvent caractérisées par un métabolisme azoté élevé et des acides aminés inhabituels. Elles présentent souvent des nodosités traduisant une symbiose avec la bactérie fixatrice d'azote Rhizobium, c'est particulièrement le cas chez les Faboideae Elles comptent 600 à 700 genres et plus de 18’000 espèces différentes [Heywood, 1996; Judd et al., 2002; Spichiger et al., 2004].

Figure II-7 : Carte de répartition géographique des Fabaceae d’après Heywood (1996).

2.3.2 Classification systématique et aspects botaniques

Le monophylétisme des Fabaceae est attesté par de nombreux caractères morphologiques et par les données de la séquence rbcl. Trois sous-groupes sont généralement reconnus à l’intérieur des Fabaceae : les Caesalpinioideae, les Mimosoideae et les Faboideae (= Papilionoideae). Les Faboideae sont cosmopolites, alors que les Mimosoideae et les Caesalpinioideae sont plutôt tropicales. Dans la plupart des classifications, ces groupes sont considérés comme des sous- familles, mais ils sont parfois traités en familles indépendantes, comme par exemple dans la classification de Cronquist. Le concept « Leguminosae » est lui utilisé soit à un niveau familial (chez Engler), soit à un niveau ordinal (chez Cronquist). Bien que le terme Fabaceae soit actuellement préféré dans la nouvelle classification systématique de l’Angiosperm Phylogeny Group (APG), le terme Leguminosae est encore couramment utilisé par certaines catégories de scientifiques (spécialistes des légumineuses). Ces deux termes sont considérés comme des

synonymes par l’International Code of Botanical Nomenclature (ICBN). [Judd et al., 2002;

Spichiger et al., 2004]. La position systématique des Fabaceae est présentée dans le tableau II- 3.

Tableau II-3 : Position systématique des Fabaceae selon différentes approches phylogénétique ou morphologique [Engler et Prantl, 1889; Cronquist, 1988; Thorne, 1992; Thorne, 1992b; The

Angiosperm Phylogeny Group, 1998].

Engler (1887-1915) Cronquist (1988) Thorne (1992) APGII (1998)

Règne Plantae Plantae Plantae Plantae

Embranchement Embryophyta Magnoliophyta Spermatophytae Spermatophyta

Sous-

embranchement

Angiospermae - Angiospermae Angiospermae

Classe Dicotyledonae Magnoliopsida Magnoliidae Eudicotyledonae

Sous-classe Archichlamydeae Rosidae Rutanae Rosidae

Ordre Rosales Fabales Rutales Eurosidae I

Sous-ordre Leguminosineae - Fabineae Fabales

Famille Leguminosae Fabaceae (=Papilionaceae) Mimosaceae Caesalpiniaceae

Fabaceae Fabaceae (=Leguminosae)

Sous-famille Faboideae Mimosoideae Caesalpinoideae

Faboideae Mimosoideae

Caesalpinoideae Swartzioideae

Faboideae Mimosoideae Caesalpinoideae

Les Fabaceae étant une famille extrêmement vaste, pour la suite de cette discussion nous allons nous intéresser plus particulièrement à la sous-famille des Faboideae qui comprend 440 à 500 genres, dont Oxytropis, et plus de 12'000 espèces. Les caractères morphologiques principaux des Faboideae sont les suivants [Spichiger et al., 2004]:

ƒ Feuilles : - Généralement alternes, composées pennées, souvent trifoliées, parfois unifoliées.

- Stipules et stipelles, rarement modifiées en épines, en feuilles ou en vrilles.

- Feuilles avec mouvement « veille - sommeil ».

ƒ Inflorescences : racème, panicule ou épi.

ƒ Fleurs : - Bisexuée.

- Zygomorphe papilionacée.

- Sépales plus ou moins soudés en tube bilabié.