La biopsie liquide à l'ère de l'immunothérapie : perspectives

Correspondances en Onco-Théranostic - Vol. V - n° 4 - octobre-novembre-décembre 2016 158

La biopsie liquide à l’ère de l’immuno- thérapie : perspectives

Liquid biopsy in the era of immunotherapy: perspectives

P. Hofman * , C. Alix-Panabières **

* Laboratoire de pathologie clinique et expérimentale ; laboratoire des biopsies liquides, hôpital Pasteur, CHU de Nice. Centre IRCAN, Inserm U1081 et CNRS/

UMR 7284, centre de lutte contre le cancer Antoine-

Lacassagne, Nice.

FHU OncoAge, université Côte d’Azur, Nice.

** Laboratoire des cellules circulantes rares humaines (LCCRH), département de biopathologie cellulaire et tissulaire des tumeurs, CHU de Montpellier.

Unité EA2415 – Aide à la décision personnalisée : aspects méthodologiques, institut universitaire de recherche clinique (IURC), université de Montpellier.

R ÉSUM É Summary

» Les régulateurs de points de contrôle immunitaires, comme PD-L1, sont devenus de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de longues rémissions chez des patients atteints de cancers avancés.

Cependant, au vu du coût très élevé et de la relative toxicité de ces thérapies, il est crucial et urgent de trouver des biomarqueurs capables de discriminer patients répondeurs et non-répondeurs.

PD-L1 semble être fréquemment exprimé par les cellules tumorales circulantes (CTC), en particulier chez les patientes atteintes d’un cancer du sein métastatique ou chez les patients ayant un cancer du poumon. De plus, l’analyse en parallèle du microenvironnement immunitaire circulant fournirait des informations complémentaires sur l’état du système immunitaire du patient en interaction avec les cellules tumorales. Ainsi, les CTC, en tant que biopsie liquide, devraient être utilisées dans les diff érentes études cliniques en cours et à venir pour défi nir quels patients doivent recevoir une immunothérapie anti- PD-L1/PD-1 et pour suivre ces patients au cours de leur traitement.

Une telle médecine de précision est très attendue dans cette nouvelle ère de la cancérologie qu’est l’immunothérapie.

Mots-clés : Cellules tumorales circulantes - Cytologie - Immuno- thérapie - PD-L1 - PD-1 - Thérapie ciblée.

Immune checkpoint regulators, such as PD-L1, have become exciting new therapeutic targets leading to long- lasting remissions in patients with advanced malignancies.

However, in view of the remarkable costs and the toxicity profiles of these therapies, predictive biomarkers able to discriminate responders from non-responders are urgently needed. PD-L1 seems to be frequently expressed on circulating tumor cells (CTCs) in the blood of patients with metastatic breast cancer or lung cancer. Moreover, the analysis of the circulating immune microenvironment would allow getting complementary information on the immune system of the patient in interaction with tumor cells. CTCs as liquid biopsy should be used in current and future clinical trials for stratification and monitoring of cancer patients undergoing immune-checkpoint blockade.

Such a personalized medicine is needed in this new era immunotherapy in cancer.

Keywords: Circulating tumour cells - Cytology - Immuno- therapy - PD-L1 - PD-1 - Targeted therapy.

L a protéine PD-L1 exprimée dans les tumeurs a reçu une attention très particulière ces dernières années, car elle fonctionne comme une protéine clé dans l’immunité du cancer, empêchant le système immunitaire de détruire les cellules cancéreuses (1) . Le récepteur PD-1 (CD279) est exprimé à la surface des cellules T activées, et ses ligands, PD-L1 (B7-H1 ; CD274) et PD-L2 (B7-DC ; CD273), sont exprimés à la surface des cellules présentatrices d’antigènes comme les macrophages ou des cellules dendritiques, mais aussi par certaines cellules tumorales. Quand PD-L1 se lie à PD-1, un signal fort d’inhibition est transmis à la cellule T qui induit une réduction de la production de cytokines et la suppression de la prolifération des cellules T (2-4) : le système immunitaire est déjoué par les cellules tumorales environnantes qui expriment PD-L1 et ne les détruit plus. Les nouvelles immunothé- rapies ciblant la voie PD-L1/PD-1 ayant un coût élevé

et, potentiellement, des eff ets indésirables, il est urgent de pouvoir discriminer quels patients doivent recevoir ce traitement et, parmi ces derniers, lesquels y répon- dront bien. Qu’en est-il de l’information obtenue par des biopsies de la tumeur primaire ou des métastases et par la biopsie liquide ?

PD-L1 et son analyse au sein des tumeurs primaires

La réponse thérapeutique aux molécules ciblant l’axe PD-L1/PD-1 est, du moins en grande partie, associée au niveau d’expression de PD-L1 dans les tumeurs.

À ce jour, cette évaluation tissulaire se base sur une

approche immunohistochimique (5, 6) . La réponse à

l’immunothérapie est d’autant plus effi cace que PD-L1

est fortement exprimé sur les cellules tumorales et que,

Correspondances en Onco-Théranostic - Vol. V - n° 4 - octobre-novembre-décembre 2016 159 à une immunothérapie ciblant l’axe PD-L1/ PD-1. Bien

que largement déployé dans les essais thérapeutiques et bientôt en pratique quotidienne, ce biomarqueur ne semble pas totalement satisfaisant, et sa robustesse est incertaine (5, 6) .

Plusieurs raisons sont ainsi énoncées . PD-L1 est exprimé de façon hétérogène dans une même tumeur, ce qui, selon le cas, peut entraîner une sous-évaluation de son expression sur des prélèvements tissulaires de petite taille, non représentatifs de l’ensemble du statut PD-L1 au sein de la tumeur (7) .

L’expression de PD-L1 est également diff érente dans la tumeur primitive et dans les métastases. De plus, le niveau d’expression varie au cours de l’évolution de la maladie et selon les traitements administrés (radio- thérapie, chimiothérapie, thérapies ciblées et certaine- ment immunothérapie, voire corticothérapie).

L’interprétation des résultats doit aussi prendre en compte le caractère analytique ou préanalytique de l’approche. Comme pour tous les tests immunohisto- chimiques, la qualité de la fi xation, le fi xateur utilisé et la durée de la fi xation peuvent infl uencer l’intensité du marquage obtenu avec les diff érents anticorps anti- PD-L1 (5) . Plusieurs clones anti-PD-L1 (SP142, SP263, 28-8, 22C3) sont actuellement utilisés dans les essais cliniques, chacun étant développé pour être associé à l’administration d’une molécule thérapeutique spéci- fi que. Diff érents niveaux d’expression (de 1 à 50 % de cellules tumorales marquées) sont aussi défi nis selon l’anticorps anti-PD-L1 utilisé, ce qui rend complexe l’uti- lisation de ce biomarqueur. Un anticorps (clone SP142) nécessite une évaluation combinée de l’expression de PD-L1 sur les cellules tumorales et sur les cellules de l’im- munité présentes au sein du microenvironnement tumo- ral ( 5, 6) . Des études comparatives sont en cours pour savoir si certains anticorps développés par l’industrie peuvent être utilisés sur l’ensemble des plateformes immunohistochimiques.

Biopsie liquide dans les cancers solides

C’est dans ce cadre complexe et très partiellement satis- faisant que la biopsie liquide, grâce surtout à l’analyse des cellules tumorales circulantes (CTC) [8] , peut donner des informations complémentaires, voire constituer une alternative à l’analyse tissulaire de PD-L1.

En effet, la différence d’expression, chez un même

récemment que les sites métastatiques exprimaient davantage PD-L1 que la tumeur primaire (9) , et, par ailleurs, H.R. Ali et al. ont rapporté que les tumeurs primaires de patientes atteintes d’un cancer du sein exprimaient rarement PD-L1 (10) .

Cellules tumorales circulantes et PD-L1

Plusieurs techniques, directes et indirectes, permettent de détecter puis de caractériser les CTC (8, 11) , mais seul le système CellSearch ® a été approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) aux États-Unis. Ces analyses peuvent être réalisées de manière répétée et pourraient permettre le suivi en temps réel des traitements anti- cancer à l’échelle individuelle (12) .

Des études récentes ont montré que les CTC fournis- saient des informations complémentaires sur les cibles thérapeutiques et les mécanismes de résistance aux trai- tements chez certains patients atteints de cancer (8, 13) . L’intérêt majeur des CTC isolées du sang périphérique est qu’elles sont représentatives des cellules dérivées de la tumeur primaire et des diff érents sites métastatiques et peuvent, de ce fait, donner une image en temps réel de la croissance et de la progression tumorales chez chaque patient (14) .

Les CTC sont actuellement en cours d’étude en tant que biomarqueur prédictif de l’effi cacité des thérapies ciblant HER2 (15) , et une stratégie similaire pourrait être utilisée pour les thérapies ciblant les points de contrôle du système immunitaire, comme PD-L1.

CTC

et technique CellSearch ®

Pour la première fois en 2015, l’analyse des CTC positives

pour l’expression de PD-L1 a pu être réalisée, au CHU

de Montpellier, sur une petite cohorte de 16 patientes

ayant un cancer du sein métastatique (16, 17) [fi gure 1,

p. 160] . Pour ce faire, la technique CellSearch ® a été opti-

misée pour la détection de l’expression de PD-L1 dans le

quatrième canal de l’automate. Très simplement, nous

avons pu mettre en évidence une sous-population de

CTC qui exprimaient PD-L1 chez la majorité (70 %) des

16 patientes de cette étude préliminaire (16) . Nous en

avons conclu que cette sous-population spécifi que de

CTC représentait des cellules métastatiques fortement

susceptibles d’échapper à la lyse induite par les lympho-

cytes T et que, par conséquent, ces CTC constituaient

de véritables cibles pour l’immunothérapie anti-PD-L1.

Correspondances en Onco-Théranostic - Vol. V - n° 4 - octobre-novembre-décembre 2016 160

Figure 1. Détection de cellules tumorales circulantes (CTC) chez une patiente atteinte d’un cancer du sein par la technique CellSearch®.

Trois CTC exprimant PD-L1 sont indiquées par des fl èches orange, en bas à droite. Les autres CTC, sous forme de microemboles (événements 3 et 40) ou de cellules uniques (événements 20 et 82), n’expriment pas PD-L1 chez cette même patiente.

Ces résultats, qui sont en contradiction avec ceux de H.R. Ali et al. , peuvent s’expliquer de 2 façons : d’une part, les cellules tumorales positives pour l’expression de PD-L1 préexistaient dans la tumeur primaire, mais n’ont pas été repérées lors des biopsies parce qu’elles n’étaient représentées qu’en petit nombre au sein de la tumeur, et, d’autre part, l’acquisition de l’expression de PD-L1 pourrait s’être faite lors de la dissémination des cellules tumorales de la tumeur primaire ou des métastases dans le sang périphérique. Ces résultats montrent à nouveau l’intérêt crucial d’analyser les CTC en complément de celle de la tumeur primaire et des sites métastatiques ( 18 ) .

CTC

et technique ISET ®

Une autre technique de détection des CTC est la méthode d’isolement par la taille des cellules épithéliales tumorales (ou méthode ISET ®) , qui consiste en l’analyse des cellules circulantes non hématologiques (CCNH) isolées à la surface d’un fi ltre de polycarbonate après une fi ltration sanguine et sur des critères de taille (11) . Ainsi, les CCNH sont classées en 3 catégories : cellules présentant des critères cytologiques de malignité, cellules sans critères cytologiques de malignité et cellules

dont les critères cytologiques de malignité sont incer- tains (19, 20) [fi gure 2] . L’avantage de cette technologie est de pouvoir combiner une analyse morphologique et une analyse immunocytochimique. Plusieurs études ont ainsi démontré la mise en évidence sur des CCNH isolées sur des filtres ISET ® de différentes protéines intracytoplasmiques, membranaires ou nucléaires par une approche immunocytochimique (7, 20-22) . Ainsi, l’évaluation immunocytochimique du statut PD-L1 est réalisable sur des CCNH isolées à la surface des fi ltres de polycarbonate (fi gure 2) . On peut ainsi distinguer des CCNH exprimant PD-L1 à diff érents niveaux d’intensité : élevé, moyen, faible ou nul. PD-L1 peut être exprimé au niveau membranaire, cytoplasmique ou nucléaire (5, 23) . Cette approche ne permet que plus diffi cilement de préciser le statut PD-L1 des cellules immunitaires cir- culantes, car la plupart de ces cellules passent à travers les pores du fi ltre et sont éliminées lors de la fi ltration.

Le nombre de CCNH exprimant PD-L1 par rapport au

nombre de celles qui ne l’expriment pas peut être éva-

lué avant l’immunothérapie, mais aussi pendant. Il est

probable que la décroissance ou la disparition des CCNH

sous traitement sera corrélée à un meilleur pronostic (22) .

Bien que cela soit parfois controversé et variable selon

Correspondances en Onco-Théranostic - Vol. V - n° 4 - octobre-novembre-décembre 2016 161 Figure 2. Détection des cellules circulantes non hématologiques (CCNH) chez les patients atteints d’un cancer du poumon non

à petites cellules (adénocarcinome) par la méthode ISET®. CCNH n’exprimant pas (A) ou exprimant fortement (B) PD-L1 (SP142, immunoperoxydase, × 400).

le type histologique et la pathologie concernée, des études récentes montrent qu’une forte expression de PD-L1 dans les tissus tumoraux est souvent associée à un plus mauvais pronostic (24) . Ainsi, par analogie, il serait intéressant de rechercher une corrélation, chez des patients ne présentant pas de tumeur métastatique, entre le nombre de CTC exprimant PD-L1 et la probabilité d’une évolution métastatique. Dans ce contexte, il a été montré récemment que l’expression nucléaire de PD-L1 sur les CTC était associée à un plus mauvais pronos- tic (23) . Compte tenu de l’hétérogénéité de l’expression de PD-L1 au niveau d’une tumeur primitive et au niveau des diff érents sites métastatiques, des biopsies tissulaires peuvent faire sous-estimer le statut PD-L1 chez certains patients. Ainsi, ces derniers ne bénéfi cieront pas d’une immunothérapie. Le compartiment des CTC est le refl et de plusieurs sites tumoraux et pourrait donc permettre une meilleure évaluation du statut global de PD-L1.

Microenvironnement immunitaire circulant

Une biopsie liquide permet d’étudier le statut PD-L1 au niveau des CTC, mais aussi d’analyser les cellules immu- nitaires (lymphocytes T régulateurs, cellules dendritiques circulantes, cellules myélosuppressives, polynucléaires, cellules lymphocytotoxiques, etc.). Des études montrent que les CTC peuvent circuler soit de façon isolée, soit de façon groupée sous forme de microemboles ou de

“clusters” , et les interactions avec les cellules du microen- vironnement immunitaire “liquide” diff èrent certaine- ment selon les cas (11, 22) . Dans un avenir proche, il conviendra donc d’étudier ces interactions entre les CTC

et les cellules immunitaires et d’analyser l’expression de diff érents récepteurs et molécules au-delà de l’axe PD-L1/PD-1 (25) . Hormis sur les CTC, PD-L1 peut aussi être étudié et quantifi é au niveau du sérum ou du plasma, mais l’intérêt de ce dosage reste à démontrer en routine et dans le cadre de l’immunothérapie (26) . Il est certain que l’analyse et la manipulation expérimentale des dif- férentes sous-populations immunitaires sanguines, en particulier celle des lymphocytes CD8 exprimant PD-1, laissent entrevoir d’autres champs d’activité dans le cadre de l’immunothérapie antitumorale (27) .

Conclusion

La biopsie liquide permet l’analyse des diff érentes muta- tions somatiques à partir de l’ADN des CTC ou à partir de l’ADN libre circulant (13, 28, 29) . Dans le cadre du déve- loppement de l’immunothérapie, l’analyse des CTC pour l’expression de PD-L1 ainsi que celle de l’ADN tumoral circulant peuvent s’intégrer dans l’optimisation de la stratégie thérapeutique afi n de mieux défi nir la séquence ou la combinaison des traitements par inhibiteurs de l’axe PD-1/PD-L1 ou des thérapies ciblées. L’analyse de la “charge mutationnelle” est possible à partir de cet ADN extrait des CTC ou libre plasmatique, sachant qu’il est de mieux en mieux admis que l’association d’une expres- sion intense de PD-L1 et d’une importante charge muta- tionnelle peut être prédictive d’une meilleure réponse à l’immuno thérapie. Grâce à la biopsie liquide, nous espérons arriver à un traitement de précision dans cette nouvelle ère qu’est l’immunothérapie pour le traitement

des cancers. ■

P. Hofman déclare ne pas avoir de liens d’intérêts en relation avec cet article.

C. Alix-Panabières n’a pas précisé

ses éventuels liens d’intérêts.

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