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de la méthode PICT sur du périphyton de rivière

L. Herouin

To cite this version:

L. Herouin. Développements méthodologiques en vue de l’application de la méthode PICT sur du périphyton de rivière. Sciences de l’environnement. 2007. �hal-02592656�

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IBEA

Institut de Biologie et d’Écologie Appliquées

44 rue Rabelais

49008 Angers cedex 01

Développements méthodologiques en vue de l'application de la méthode PICT sur du

périphyton de rivière

Soutenu par

HEROUIN Lucie

Rapport

Licence professionnelle option Gestion et traitement des sols et des eaux

Avril-Aout 2007

Nom du commanditaire : Mme Emmanuelle Kuhn

Nom du tuteur : Mme Hanane PERREIN

CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

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Je souhaite dans un premier temps remercier Cécile Loumagne, chef de l'unité de recherche Hydrosystèmes et Bioprocédés du Cemagref d'Antony pour m'avoir accueillie dans son département.

Je remercie tout particulièrement ma maitre de stage, Emmanuelle Kuhn, ingénieur d'étude de l'équipe EXPER, pour son aide, sa grande disponibilité ainsi que pour ses judicieux conseils tout au long de ce stage.

Je tiens aussi à remercier Françoise Vincent-Hubert, chercheur au Cemagref, pour m'avoir fait découvrir la biologie moléculaire ainsi que pour tous ses conseils.

Je remercie également Marie-Hélène Tusseau-Vuillemin, chargé de recherche et chef de l'équipe EXPER, pour m'avoir accueillie au sein du laboratoire d'écotoxicologie.

Mes remerciements vont aussi à Lauriane Juzan pour son aide lors des expériences de biologie moléculaire.

Enfin je remercie très chaleureusement Mathieu Guerdin, Isabelle Chardon, Bastien Pellet, Thomas Kermoal, Luc Fiat ainsi que Frédéric Nicolle pour la qualité de l'ambiance de travail au sein de l'équipe EXPER.

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INTRODUCTION 1

1. PRESENTATION DE L'ENTREPRISE ET CONTEXTE DE L'ETUDE 2

1.1. Le Cemagref 2

1.1.1. Au niveau national 2

1.1.2. Le Cemagref d'Antony 3

1.2. Contexte de l'étude 4

1.2.1. La méthode PICT 4

1.2.2. Les écosystèmes aquatiques sous pression urbaine 5

1.2.3. Résultats des études précédentes 5

2. MISE AU POINT METHODOLOGIQUE D'UN TEST DE TOXICITE ALGALE 6

2.1. Mise au point à partir d'une solution d'algues de laboratoire 6

2.1.1. Matériels et Méthodes 6

2.1.2. Adaptation de la méthode au laboratoire d'écotoxicologie 9

2.1.3. Utilisation de la méthode pour les tests de toxicité 12

2.2. Mise au point à partir d'une solution de biofilm 15

2.2.1. Matériels et Méthodes 15

2.2.2. Mise au point des conditions du test de toxicité : 16

2.2.3. Réalisation du test de toxicité à partir du biofilm 20

3. MISE EN ŒUVRE DU TEST DE TOXICITE BACTERIEN SUR UN SITE NON

URBANISE 23

3.1. Matériels et Méthodes 23

3.1.1. Prospection et collecte de biofilm 23

3.1.2. Mesure de l'activité β-Glucosidase 24

3.1.3. Calculs de EC50 25

3.2. Résultats 25

3.2.1. Inhibition de l'activité bactérienne par les ions métalliques 25

4. CARACTERISATION DES COMMUNAUTES BACTERIENNES ET ALGALES

ISSUES DE BIOFILM 30

4.1. Matériels et Méthodes 31

4.1.1. Extraction de l'ADN de biofilms 31

4.1.2. Réalisation de la PCR 31

4.1.3. Réalisation de la DGGE 34

4.2. Résultats et discussion 35

4.2.1. Extraction de l'ADN 35

4.2.2. PCR 36

4.2.3. Résultat de la DGGE 37

(6)

périphyton de rivière

- 7 -

BIBLIOGRAPHIE 41

ANNEXES 42

ANNEXE 1 : TABLE PERMETTANT LA DETERMINATION DU COEFFICIENT D'ABSORPTION DEFINIE SUIVANT LA TEMPERATURE 43

ANNEXE 2 : PROTOCOLES DES DIFFERENTES ANALYSES POUR LE SUIVI DU

BIOFILM 44

ANNEXE 3 : SUIVI DE L'EVOLUTION DE COLONISATION DES MEMBRANES 45

(7)

Introduction

Le Cemagref, laboratoire de recherche en environnement, concentre une partie de ses travaux sur l'étude des milieux aquatiques et leurs réponses aux différents polluants. En effet, l'étude des milieux aquatiques est devenue une priorité. D'après la directive cadre européenne de décembre 2002, complétée par la loi sur l'eau et les milieux aquatiques de décembre 2006, les états membres de l'union européenne ont pour objectif d'atteindre un bon état écologique de leurs écosystèmes aquatiques d'ici 2015. Pour cela, des méthodes pour évaluer les impacts écotoxicologiques sont mises en œuvre.

L'objectif de mon stage est de développer différentes méthodologies en vue de l'application de la méthode PICT, Pollution-Induced Community Tolerance, sur du périphyton de rivière. Cette méthode a pour but de caractériser la tolérance à un toxique acquise par une communauté exposée.

Pour présenter les différents travaux de mon stage, je décrirai dans un premier temps, le Cemagref ainsi que le contexte de mon étude. Par la suite, je détaillerai la mise au point d'un test de toxicité sur la partie algale du périphyton ainsi que l'application d'un test de toxicité bactérien. Pour finir, une partie sur la caractérisation génétique des communautés algales et bactériennes du périphyton sera exposée.

(8)

- 2 -

1. Présentation de l'entreprise et Contexte de l'étude

1.1. Le Cemagref

1.1.1. Au niveau national

Créé en 1981, le Cemagref, Centre national du machinisme agricole, du génie rural, des eaux et des forêts, est un institut de recherche pour l'ingénierie de l'agriculture et de l'environnement. Cet institut de recherche a le statut d'établissement public à caractère scientifique et technologique.

Ses recherches sont principalement orientées vers la production des connaissances nouvelles et d'innovations techniques liées au développement durable.

Il collabore avec de multiples partenaires comme par exemple les collectivités, les universités ou encore les bureaux d'études…

Le Cemagref privilégie, par ailleurs, une coopération scientifique avec des partenaires de l'Union Européenne. Il s'implique notamment dans l'animation de réseaux thématiques et participe à de nombreux projets de recherche. Cet institut est aussi présent au niveau international principalement dans le domaine de l'eau.

Ses orientations scientifiques sont au cœur des enjeux du développement durable. Elles s'organisent en 9 thématiques :

- La gestion de l'eau et des services publics associés - Les risques liés à l'eau

- Les technologies et procédés de l'eau et des déchets - La qualité des systèmes écologiques aquatiques - Les systèmes écologiques terrestres

- L'agriculture multifonctionnelle et les nouvelles ruralités - Les technologies pour des systèmes agricoles durables

- Les méthodes pour la recherche sur les systèmes environnementaux

(9)

- Les technologies et procédés physiques pour la sureté des aliments

Le Cemagref est présent sur 9 sites principaux répartis dans toutes la France. Il emploie environ 900 permanents dont la moitié est constituée de chercheurs et d'ingénieurs. Il accueille aussi plus de 200 doctorants, ainsi que des post-doctorants et des chercheurs étrangers.

Son budget 2007 est de 88.9 millions d'euros et les recettes provenant des contrats s'élèvent à 18.2 millions d'euros. La majeure partie du budget correspond à la rémunération du personnel.

Les recherches et les activités conduites au Cemagref donnent lieu à des produits variés. En effet, une moyenne de 800 publications par an, une participation à de nombreux colloques, des expertises et des conseils aux services publics, le dépôt de brevet et de logiciel sont réalisés chaque année.

1.1.2. Le Cemagref d'Antony

Le Centre d'Antony est l'une des 9 implantations métropolitaines du Cemagref.

Le centre d'Antony, c'est :

- 3 unités de recherche dans les domaines de l'eau (HBAN), du froid (GPAN) et des agroéquipements (TSAN).

- Il emploie 130 agents permanents dont 97 chercheurs, ingénieurs et techniciens.

- 20 doctorants en permanence et un accueil de 70 stagiaires de l'enseignement supérieur par an.

- Un budget de 3,5 millions d'euros, hors rémunération du personnel permanent, dont 70% environ couverts par des recettes sur contrats et prestations.

La thématique de mon stage fait parti de l'unité de recherche Hydrosystèmes et Bioprocédés.

Cette unité relève des départements scientifiques "Ressources en eau, usages et risques" et

"Milieu, qualité et rejets". Elle travaille sur 6 thèmes de recherche : - EPURE : Génie des procédés épuratoires

(10)

- 4 -

- PHYLEAU : Transfert dans les agro-hydrosystèmes

- SOWASTE : Hydraulique, géochimie et microbiologie des installations de stockage de déchets.

- TRANSFEAU : Hydrologie des bassins versants

.

J'ai donc été accueilli au sein de l'équipe EXPER. Cette équipe travaille dans le domaine de l'écotoxicologie et plus précisément sur l'exposition des écosystèmes aquatiques aux substances chimiques liées aux activités urbaines.

1.2. Contexte de l'étude

Comme dit précédemment, pour caractériser l'état d'un écosystème, il faut mettre en place des méthodes d'évaluation des impacts écotoxicologiques.

1.2.1. La méthode PICT

La méthode PICT, Pollution-Induced Community Tolerance, développée par Blanck et al (1986) est un outil puissant pour détecter les effets d'un toxique sur une communauté.

Cette méthode est fondée sur l'hypothèse qu'une communauté biologique naturelle est constituée de différents composants ayant des sensibilités variables vis-à-vis d'un toxique donné. Ainsi, suite à une exposition à un toxique, les organismes les plus sensibles ne sont plus concurrentiels et sont remplacés par des organismes plus tolérants. La communauté résultante présente alors une tolérance vis-à-vis d'un toxique, supérieure à celle observée pour une communauté semblable mais n'ayant pas connu de pression de sélection par ce toxique.

C'est donc cette différence de réponse qui peut donner une indication sur l'état de pollution des milieux dans lesquels ont été échantillonnées différentes communautés.

Cette méthode se décline en deux phases : une phase de sélection au cours de laquelle la communauté est exposée au toxique, et une phase de détection, au cours de laquelle la communauté est prélevée et sa tolérance au toxique évaluée par un test de toxicité aiguë.

(11)

1.2.2. Les écosystèmes aquatiques sous pression urbaine

Un cours d'eau sous pression urbaine est susceptible d'être contaminé par un certain nombre de substances comme par exemple les métaux. Ces derniers suivant leurs formes chimiques peuvent avoir un impact sur la vie biologique du milieu.

Pour pouvoir déterminer l'impact de ces polluants sur un cours d'eau, on utilise de plus en plus le périphyton, encore appelé biofilm. Le périphyton correspond à l'ensemble des organismes, algues, bactéries, protozoaires et aux plantes et invertébrés associés, attachés sur des surfaces aussi diverses que les pierres, détritus, contenus dans un cours d'eau.

Le périphyton occupe une position clé dans la chaine trophique des écosystèmes aquatiques. Il est une source de nourriture pour le second niveau trophique. Une altération de sa composition provoque un dysfonctionnement dans les niveaux trophiques supérieurs.

Le périphyton peut être collecté facilement sur des supports artificiels comme des lames de verre ou encore des membranes en plastiques.

Toutes ces caractéristiques lui permettent d'être un outil intéressant pour l'évaluation des écosystèmes aquatiques.

1.2.3. Résultats des études précédentes

Lors du stage de Lise FECHNER (2007) [2], une première partie du biofilm a déjà été étudiée : les communautés bactériennes.

Lors de ce stage, une méthode d'un test d'activité bactérienne a été mise au point. Les résultats montrent une inhibition de l'activité bactérienne en présence de polluants. Cette étude a été réalisée sur un site fortement urbanisé.

De plus, de nombreux résultats ont été démontrés, nous les utiliserons et détaillerons au cours de ce rapport.

Mon stage est donc la continuation de cette étude. Il a pour objectif la mise au point d'un test de toxicité algale sur du biofilm de rivière, ainsi que l'application du test de toxicité bactérien sur un site non impacté par les rejets urbains.

Une autre partie concernant la caractérisation des communautés algales et bactériennes

(12)

- 6 -

2. Mise au point méthodologique d'un test de toxicité algale

Pour observer d'éventuels effets de toxicité sur une communauté algale, nous avons choisi de mesurer comme paramètre la production de dioxygène

Pour mettre au point ce test, nous nous sommes tout d'abord basées sur une communauté moins complexe que du biofilm, c'est-à-dire des algues cultivées en laboratoire.

2.1. Mise au point à partir d'une solution d'algues de laboratoire

2.1.1. Matériels et Méthodes Culture d'algues :

Les algues, cultivées en laboratoire, sont des micro-algues Pseudokirchniella subcapitata.

Ces algues poussent dans un milieu riche en oligoéléments. Elles sont mises à agiter dans une étuve à 23°C. On fait barboter de l'air en permanence pour oxygéner le milieu.

Avant chaque test, les algues sont transférées dans de l'eau minérale Mont Dore. Pour cela les algues sont centrifugées pendant 15 minutes à 3000 rpm. Le surnageant est vidé et le culot est mélangé à l'eau minérale.

Mesure de la production nette de dioxygène :

La production nette de dioxygène correspond à la production de dioxygène des algues.

Pour pouvoir la calculer 2 mesures simultanées sont nécessaires : - Mesure de la production brute de dioxygène : PO_{2 brute} - Mesure de la respiration : R

La production brute de dioxygène correspond à la production de dioxygène générée par les algues lors de la photosynthèse à laquelle se superpose la consommation de dioxygène par les algues et autres organismes présents (ex : bactéries…).

(13)

La respiration correspond à la consommation du dioxygène par les algues et les autres organismes présents.

Lors de la mesure de la photosynthèse, deux cas se présentent (figure 1) : .

Dans ces deux cas, la production nette d'O₂( PO₂nette) est calculée suivant :

PO_{2 nette} = PO₂_brute- Respiration

avec PO2brute = [O2]f lumière

– [O2]ilumière

et Respiration = [O2]f nuit

– [O2]inuit

Les expériences sont réalisées dans des bouteilles BOD (Bouteilles Oxygène Dissous) de 50mL, ce qui permet de mesurer la quantité d'oxygène présente dans un volume donné.

Pour mesurer la concentration en dioxygène, on utilise un oxymètre. Celui que nous utilisons est une microélectrode MI-730 (Microelectrodes.inc). Les valeurs affichées sont exprimées en pourcentage de dioxygène.

L'étalonnage de la sonde se fait en 2 étapes : tout d'abord en réglant le zéro à partir d'une solution dépourvue d'O₂, par exemple une solution saturée en sulfite. Puis dans une eau saturée en O₂(on fait barboter de l'eau sous agitation magnétique pendant au moins 1/2h) pour régler la calibration à 21 %. Les mesures peuvent ensuite commencer.

Cas n°1 : PO2 brute > 0

-8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10

delta [O]2 1

Photosynthèse Respiration PO2

nette Cas n°1 : PO2 brute > 0

-8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10

delta [O]2 1

Photosynthèse Respiration PO2

nette

Cas n°2 : PO2 brute < 0

-8 -6 -4 -2 0 2

1

delta [O2]

Photosynthèse Respiration

PO2 nette

Figure 1 : Méthode de la mesure de la PO2 nette

(14)

- 8 -

Une formule de conversion est fournie par le fabricant pour convertir la concentration d'oxygène en mole par litre, puis en mg/L.

S = (a/22.414) x ((760-p)/760) x (r%/100)

S : concentration en oxygène en mole par litre

a : coefficient d'absorption définie suivant la température (annexe 1) p : pression de la vapeur d'eau définie suivant la température

r% : valeur obtenue après mesure

[O₂] en mg/L = Sx3,2.10³

Mode opératoire pour la mesure de la production brute et de la respiration :

Mesure de la production brute :

- Faire barboter du diazote dans une partie de la solution algale pendant quelques minutes afin de faire chuter la [O₂] jusqu'à une valeur voisine de 2 %

- Relever la valeur initiale sous agitation

- Répartir cette solution dans les différentes bouteilles BOD

- Mettre les bouteilles BOD à incuber dans l'enceinte thermostatée sous agitation, à éclairage contrôlé

- Après incubation, mesurer la valeur finale sous la même agitation que la mesure initiale

Mesure de la respiration :

- Relever la valeur initiale de la solution algale

- Répartir cette solution dans les différentes bouteilles BOD

- Les recouvrir de papier aluminium pour qu'elles soient plongées dans le noir - Mettre les bouteilles à incuber dans l'enceinte thermostatée sous agitation - Après incubation, mesurer la valeur finale comme précédemment

(15)

C'est à partir de cette technique que nous allons développer une méthodologie pour réaliser un test de toxicité algale.

2.1.2. Adaptation de la méthode au laboratoire d'écotoxicologie

Afin de pouvoir tester la capacité de la sonde et de s'habituer à celle-ci, nous avons réalisé différentes expériences. Ces dernières vont permettre de déterminer différents facteurs pour les tests de toxicité futurs comme par exemple la durée de l'expérience ou encore la concentration d'algues optimales.

Mesure de la production nette de dioxygène en fonction du temps

On cherche ici à connaître le temps nécessaire d'incubation pour obtenir une concentration significative en O2. Pour cela, au cours de cette expérience, nous faisons varier la durée d'incubation.

Cette durée varie de 1 à 6h.

Pour chaque temps, 2 réplicats sont réalisés

Les mesures sont effectuées comme décrites précédemment.

Résultats :

Figure 2: Evolution de la PO2 brute, de la respiration et de la PO2 nette en mg/L d'O2 en fonction du temps

PO₂ nette en fonction du temps

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

0 2 4 6 8

Temps en heure [O2] en mg.L-1

Réplicat 1 Réplicat 2

PO2 brute et Respiration en fonction du temps

-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

1 2 4 5 6

Temps en heure PO2 en mg/L

Respiration Photosynthèse

(16)

- 10 -

D'après la figure 2 ci-dessus, on observe une production brute de dioxygène mesurable à toutes les durées. En ce qui concerne la respiration, celle-ci est trop faible pour être mesurée significativement.

A partir de t=6, on observe un écart à la linéarité, cela laisse donc penser à une saturation en oxygène du milieu.

Nous avons donc choisi d'après ces observations un temps d'incubation de 4h.

Mesure de la production nette de dioxygène en fonction de la concentration algale

Nous allons dans cette expérience essayer de définir la concentration algale optimale, c'est- à-dire une concentration pour laquelle la mesure d'O₂ est significative.

Dans cette expérience le facteur qui varie est la concentration algale.

A partir d'une solution algale à 3,85.10⁶Cellules/mL, on réalise 4 dilutions pour obtenir des solutions à 2,21.10⁶; 1,96.10⁶ ; 8,10.10⁵ et 4,45.10⁵ Cell/mL.

Le temps d'incubation choisi est de 4h.

Résultats :

Figure 3 : Evolution de la production brute, de la respiration et de la production de O2 nette en fonction de la concentration algale

D'après la figure 3, on observe tout d'abord une forte augmentation de la production d'O₂ puis un palier apparait.

PO2 brute et respiration en fonction de la [algale]

0 2 4 6 8 10 12 14 16

4,45E+05 8,10E+05 1,96E+06 2,21E+06 Qté algale en Cell/mL

O2 en mg/L

Photosynthèse Respiration

PO2 nette en fonction de la [algale]

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0,00E+00 1,00E+06 2,00E+06 3,00E+06 4,00E+06 5,00E+06 Qté algale en Cell/mL

O2 en mg/L

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On décide donc de se placer juste avant la saturation, c'est à dire aux alentours de 10⁶ Cellules/mL. Cela permet en effet d'avoir une amplitude de signal significative pour les biotests.

Test de performance de la sonde

Test de répétabilité dans de l'eau minérale

Afin de connaître la sensibilité de l'oxymètre et de définir un écart-type, nous avons réalisé un test de répétabilité avec l'eau minérale Mont-Dore.

Ce test va aussi permettre de définir une limite de détection et une limite de quantification par rapport à la mesure de la production d'O2.

Ce test de répétabilité tient compte de la mesure de l'appareil et non de la photosynthèse ou de la respiration.

La limite de détection d'une méthode est la plus basse concentration qui produit un signal détectable. Elle correspond à 3 écart-type.

La limite de quantification est la concentration à partir de laquelle on va pouvoir fournir un résultat avec une incertitude raisonable. Elle correspond à 10 écart-type.

Pour cela, le protocole est le même que précédemment mis à part que la solution d'algues est remplacée par l'eau minérale.

La durée d'incubation est fixée à 4h.

Un total de 10 mesures est effectué.

Test de répétabilité de la mesure de dioxygène dans les conditions optimales

Un autre test de répétabilité a été effectué pour définir un écart-type ainsi qu'un coefficient de variation dans les conditions optimales, c'est-à-dire avec une durée d'incubation de 4h et une concentration algale de10⁶Cell/mL.

(18)

- 12 -

Ce coefficient de variation correspond à l'écart type des mesures sur la moyenne exprimée en pourcentage. Cela permet de connaître à partir d'une valeur moyenne, le pourcentage de variation de la mesure. Plus celui-ci est élevé et plus la mesure est dispersée.

Un total de 10 mesures est aussi réalisé.

Résultats :

Le tableau 1 ci-dessous récapitule les résultats du test de répétabilité dans les 2 milieux.

Valeur mesurée après expérience

de l' : Ecart-type Limite de détection en mg/L

Limite de quantification

en mg/L

Photosynthèse 0.32 0.96 3.2

Eau minérale

Respiration 0.099 0.29 0.9

Valeur mesurée après expérience

des : Ecart-type Valeur moyenne de la [O2] correspondante

Coefficient de variation

Photosynthèse 0.819 10.67 7.7 %

Algues

Respiration 0.070 10.24 0.67 %

Tableau 1 : Résultats du test de répétabilité

On peut donc en conclure qu'une valeur mesurée est fiable lorsque celle-ci est supérieure à 0.3 mg/L. En dessous de celle-ci, la valeur n'a pas de signification.

En ce qui concerne le coefficient de variation pour la solution d'algues, celui-ci est inférieur à 10 %. Ce qui est tout à fait acceptable.

Nous allons, à partir de ces différents paramètres, essayer de mesurer l'inhibition de la production nette de dioxygène des algues par rapport à un toxique.

2.1.3. Utilisation de la méthode pour les tests de toxicité

Préparation de la solution mère Le toxique choisi est le Cadmium.

(19)

La solution de Cadmium est préparée à partir de nitrate de Cadmium (CdN₂O₆, H₂O) que l'on dissout dans de l'eau ultra-pure.

Des solutions mères de 1 et 10g/L sont utilisées.

Gamme de toxique

Les concentrations d'exposition au cadmium sont indiquées dans le tableau 2 ci-dessous :

Métaux Concentrations en mg/L Cd 0.25 ; 0.75 ; 1 ; 1.15 ; 9 ; 23 Tableau 2 : Gamme de toxique pour test sur algues

Protocole

La solution d'algues à environ 10⁶ Cell/mL est répartie dans 6 fioles de 250mL, dont une fiole correspondant au témoin.

On mesure la concentration de dioxygène initiale comme décrit précédemment.

On introduit ensuite le toxique suivant la concentration voulue. Le volume devant être inférieur à 2.5mL pour obtenir une erreur de dilution inférieure à 1%.

La suite du protocole est le même que précédemment.

La durée d'incubation est fixée à 4h.

Mesure du toxique dissous

Une fois le test de toxicité réalisé, 5mL de chaque solution de biofilm est filtré à 0,45µm. Les échantillons sont ensuite acidifiés à 1% pour maintenir le cadmium en solution.

L'analyse de ces échantillons est faite par spectrométrie d'absorption atomique flamme (SAAF).

Détermination de la EC50

La EC₅₀ correspond à la concentration à laquelle on observe un effet négatif de la substance sur 50 % des organismes tests. Pour ce test de toxicité, cela correspond à l'inhibition de 50 % de la production nette de dioxygène.

Cette EC50 est déterminé à l'aide la macro Excel REGTOX 6 (développée par Eric Vindimian

(20)

- 14 -

optimales par régression non linéaire et sur le modèle de Hill. Les intervalles de confiance à 95 et 99% sur les paramètres sont estimés par des simulations numériques.

Résultats :

Test de toxicité au Cadmium

0 2 4 6 8 10 12

0 5 10 15 20 25 30

[Cd] en mg/L [O2] en mg/L

Figure 4 : Courbe d'inhibition de la production nette de 02

Le graphique 4 montre une inhibition de la production nette de [O₂] en présence de cadmium.

On peut ainsi déterminer une EC50.

Résultats des différents tests réalisés :

Les tests n°1 et 2 ont été réalisés avec des bouteilles de 125 mL, les deux autres avec des 50mL. Ce qui ne doit normalement pas changer les résultats.

Tests EC₅₀en mg/L EC₅₀ en mg/L

En cadmium nominal En cadmium dissous mesuré

1 1.54 ± 1.24 1.51 ± 1.12

2 0.72 ± 0.18 0.71 ± 0.1

3 0.64 ± 0.14 0.54 ± 0.12

4 3.72 ± 1.44 3.37 ± 1.22

Tableau 3 : Résultats des différentes EC50 sur des algues de laboratoire. Résultats exprimés en cd nominal et mesuré. L'intervalle de confiance est de 95 %

(21)

D'après les résultats du tableau 3, on observe en prenant en compte les intervalles de confiance, que les EC₅₀des 3 premiers tests se recoupent.

Si on compare les résultats du cadmium mesuré au cadmium nominal, on observe qu'ils ne varient que très légèrement. La majeure partie du cadmium introduit se trouve donc sous forme dissoute pour les algues.

Conclusion :

D'après les résultats obtenus, on peut donc en conclure que la méthode mise au point sur des algues de laboratoire est adaptée aux tests de toxicité.

En effet, on observe bien une inhibition de la production nette de dioxygène en présence de toxique et on peut donc à partir de cela déterminer une EC₅₀.

Nous allons donc dans la suite de notre étude essayer d'adapter ce test à du biofilm récolté en rivière.

2.2. Mise au point à partir d'une solution de biofilm

2.2.1. Matériels et Méthodes

Récolte du biofilm

Nous avons décidé de récolter du biofilm dans la Marne à l'écluse de Saint-Maurice. Saint Maurice se trouve dans la banlieue est de Paris. Ce site a été choisi pour sa proximité du Cemagref ainsi que sa facilité d'accessibilité.

Pour récolter du biofilm, nous avons mis en place un système de boite composé de membranes en plastique pour que le biofilm s'y accroche (figure 5).

(22)

- 16 -

Figure 5 : Avant et après colonisation du biofilm

Un suivi de la colonisation du biofilm est effectué chaque semaine.

Pour cela, on récupère un nombre de membranes pouvant varier de 1 à 20 suivant les tests envisagés. Au retour au laboratoire, les membranes sont grattées et mises en solution dans de l'eau minérale Mont Dore. Le biofilm est conservé à 5°C.

Différents tests pour suivre l'évolution de la colonisation des membranes sont effectués : Les MES (matières en suspension), la chlorophylle a qui permet de quantifier la présence d'algues, ainsi que les COT (carbone organique total) pour connaitre la nature du biofilm.

2.2.2. Mise au point des conditions du test de toxicité :

Comme dans la méthodologie précédente, différents tests ont été réalisés pour caractériser le biofilm.

Lors d'une première expérience pour déterminer la concentration d'O2, nous nous sommes rendu compte que la mesure de la production d'O2 brute n'était pas réalisable suivant le protocole initial.

En effet, la production brute d'O2 s'avère négative dans certaines situations (figure 1).

Cela entraine donc qu'au lieu de mettre la solution de biofilm voisine de 0 mg/L, nous avons décidé de la laisser à sa concentration initiale. Ce qui permet de pouvoir observer soit une augmentation soit une diminution de sa concentration.

Le reste du protocole est identique.

(23)

Mesure de la production nette de 0₂ en fonction du temps d'incubation

Nous cherchons comme dans la partie 2.1.1 à déterminer le temps d'incubation optimal.

Les différents temps testés vont de 30min à 6h.

3 réplicats sont aussi réalisés pour chaque temps.

Résultats :

PO₂nette en fonction du temps

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

0 2 4 6 8

temps en heure

[O2] en mg/L

Figure 6 : Evolution de la production d'O2 nette en fonction du temps. Les barres d'erreur correspondent à ± 1/2 écarts type

D’après le graphique 6 et comme pour l’expérience similaire réalisée avec les algues, on observe une production nette à toutes les durées.

Néanmoins à partir de 6 h, la respiration n’est plus mesurable, en effet la solution est à saturation et la mesure est très imprécise.

On se placera donc comme dans l’expérience précédente à 4h d’incubation.

Mesure de la production nette en fonction des MES

A travers cette expérience, nous cherchons à déterminer la quantité de MES optimale pour observer une production de O₂ significative sans que la solution soit saturée.

A partir d’une solution mère, différentes dilutions ont été réalisées.

Les concentrations en MES varient entre 1 et 12 g/L.

Le temps d'incubation est de 4h

3 réplicats sont réalisés pour chaque quantité de MES.

(24)

- 18 -

Résultats :

PO2 nette en fonction des MES

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00

M ES e n g/L [O2] en mg/L

Figure 7 : Evolution de la production de O2 nette en fonction des MES pendant 4 h. Les barres d'erreur correspondent à ± 1/2 écart type.

D’après le graphique 7, on observe que malgré la forte variation des MES, il y a toujours une production nette de O2. Néanmoins, on constate qu'à partir de 8 g/L, la production nette de dioxygène se stabilise. La solution arrive donc à saturation. On essaiera donc au maximum de se placer entre 2 et 8g/L.

Suivi sur 4 jours de l'état du biofilm

Nous avons décidé de suivre l'évolution du biofilm sur une durée de 4 jours. Cela va permettre d'évaluer l'évolution de sa composition, de son comportement et sa durée de conservation une fois prélevé du milieu naturel.

Pour cela, nous allons suivre : - les MES

- la chlorophylle a

- Le carbone organique particulaire - la production nette de dioxygène

- l'activité β-glucosidase (le protocole est décrit dans la partie 3.1.2 de ce dossier)

Les protocoles de ces différentes analyses sont fournis en annexe 1.

(25)

périphyton de rivière Résultats :

Figure 8 : Suivi de l'évolution du biofilm sur 4 jours. Pour la PO_2nette et l'activité bactérienne, les écarts type sont de ± ½

D'après ces différents graphiques (figure 8), on observe que pendant ces 4 jours, le biofilm évolue fortement.

En effet, on observe en ce qui concerne les MES qu'il y a notamment un pic au deuxième jour pour les deux plus fortes concentrations. Cela est surement du à une mauvaise répartition du mélange dans les différentes bouteilles. Il faudra donc pour les futurs tests faire attention à la bonne homogénéisation du milieu.

En ce qui concerne l'activité bactérienne, tout d'abord on observe un pic au 2^ème jour, puis une forte diminution le 3^ème et 4^ème jour.

Ces observations pourraient donc expliquer la forte diminution de la PO₂ nette le deuxième jour. En effet, la PO₂nette est étroitement liée avec la respiration. (PO₂ nette = PO₂brute – Respiration).

Suivi de la chlorophylle sur 4 jours

0 5 10 15 20 25

0 1 2 3 4 5

jours

Chla en mg/L d=1

d=0,5 d=0,2

Suivi de l'activité bactérienne sur 4 jours

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0 1 2 3 4 5

jours

Fluorescence en EMI

d=1 d=0,5 d=0,2 PO₂ nette sur 4 jours

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 1 2 3 4 5

jours [O2] en mg/L

d=1 d=0,5 d=0,2 Suivi des MES sur 4 jours

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

0 1 2 3 4 5

jours

MES en g/L

d=0,2 d=0,5 d=1

(26)

- 20 -

Pour ce qui est de la présence des communautés algues, celles-ci diminuent légèrement au fil du temps.

Il est donc conseillé de réaliser les diverses expériences le 1^èr et 2^ème jours suivant la récolte du biofilm.

Test de répétabilité

Un test de répétabilité est aussi effectué dans les conditions optimales pour connaitre la précision des mesures.

Un total de 10 mesures est effectué.

Résultats : (tableau 4)

Valeur mesurée à la

fin du test de : Ecart-type Valeur moyenne de la [O2] correspondante

Coefficient de variation

Photosynthèse 1,84 17.9 10.2 %

Respiration 0,36 7.05 5.1 %

Tableau 4 : Résultats du test de répétabilité

La limite de détection obtenue précédemment ne peut pas nous servir dans nos expériences avec le biofilm. En effet, la mesure n'étant pas effectuée dans les mêmes conditions (pas de mise à 0 % pour le biofilm), la comparaison n'est donc pas possible.

2.2.3. Réalisation du test de toxicité à partir du biofilm

Gamme de toxique (tableau 5)

Métaux Gamme des concentrations en mg/L Cd 0, 50, 100, 200, 300, 400

Tableau 5 : Concentrations d'exposition aux ions cadmium

Le protocole utilisé est le même que celui décrit pour le test de toxicité avec la solution d'algues.

(27)

La détermination de la EC50 est la même que précédemment ainsi que la détermination du cadmium dissous.

Résultats :

Figure 9 : Courbes d'inhibition de fluorescence lors d'une exposition au cadmium de deux biofilms prélevés à 1 semaine d'intervalle

Les EC50 respectives des tests de toxicité n°1 et n°2 sont de 78.69 ± 58.8 et 83.53 ± 63.54 mg/L.

Ces résultats sont du même ordre de grandeur et se recoupent en prenant en compte les intervalles de confiance. (Les intervalles de confiance sont de 95 %).

Pour se conformer à la méthode PICT, il faut pouvoir comparer les EC50 obtenues pour deux sites différents. Or celles-ci sont susceptibles de varier suivant la quantité de biomasse utilisée pour la solution de biofilm. En effet, la quantité de matière organique présente est susceptible de jouer sur la biodisponibilité des métaux et donc de leur toxicité. Cette quantité de biofilm est susceptible de varier fortement. En effet, la vitesse de colonisation du biofilm est variable suivant le lieu mais aussi de la période de récolte.

Lors de l'étude de Lise FECHNER, celle-ci a montré la pertinence d'utiliser les MES pour normaliser les résultats et donc de s'affranchir du facteur de dilution des différentes solutions.

EC50 "normalisées" = EC50 (en g/L) / MES (g/L)

Test de toxicité au Cadmium n°2

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

0 100 200 300 400 500 600

[Cd] en mg/L Test de toxicité au Cadmium n°1

-2 0 2 4 6 8

0 50 100 150 200 250 300 350 400

[Cd] en mg/L

(28)

- 22 -

EC₅₀ Test En cadmium nominal

en mg/L

En cadmium dissous

mesuré en mg/L "normalisée"

1 78.6 ± 58.8 51.91 ± 135.2 0.0055 ± 0.0042

2 83.53 ± 63.54 59.03 ± 29.15 0.0053 ± 0.0041

Tableau 6 : Récapitulatif des EC50 en cadmium nominal, cadmium dissous mesuré et normalisée. L'intervalle de confiance est de 95 %

Si on compare les EC50 en cadmium introduit avec le cadmium mesuré (tableau 6), on observe que celles-ci varient d'avantage que lors du test avec les algues de laboratoire.

En effet, on obtient des EC₅₀ nettement inférieur à celles en cadmium nominal.

On peut donc constater que la part disponible du toxique sur les communautés algales ne correspond pas à la concentration introduite.

Il est donc intéressant de connaître la part de toxique dissous pour obtenir une EC₅₀ plus réaliste.

Conclusion :

D'après les différents résultats obtenus, on peut dans un premier conclure que la méthode utilisée permet d'obtenir une inhibition de la production nette d'O2.

Si on regarde la reproductibilité du test (figure 9), on retrouve des résultats cohérents. En effet, les EC₅₀ sont du même ordre de grandeur.

Cette méthode nécessite des approfondissements. Il serait intéressant de regarder par exemple la répétabilité, ou encore utiliser d'autres métaux pour vérifier la faisabilité de ce test.

De plus, une comparaison avec un biofilm venu d'un milieu non urbanisé pourrait montrer la fiabilité de ce test.

(29)

3. Mise en œuvre du test de toxicité bactérien sur un site non urbanisé

Le biotest choisi est un test d'activité enzymatique bactérienne : l'activité β-Glucosidase. Cette mesure, qui est fréquemment utilisée pour étudier les mécanismes de décomposition d'un sol, a été adaptée dans le cadre d'études écotoxicologiques.

Lors d'une étude précédente, la mise au point méthodologique a été réalisée et des résultats sur un site impacté par les rejets urbains ont été obtenus. Notre étude sera réalisé à partir d'un biofilm provenant d'un milieu rural donc non impacté par les rejets urbains.

3.1. Matériels et Méthodes

3.1.1. Prospection et collecte de biofilm

L'objectif était de rechercher un site non impacté par les rejets urbains et qui avait des conditions optimales pour récolter du biofilm.

Nous nous sommes donc rendus sur le Bassin de l'Orgeval qui se situe au nord est de Paris.

Ce site a tout d'abord été choisi pour sa situation géographique, en effet, il se situe en zone rurale, il n'est donc pas impacté par la pollution urbaine.

De plus, le Cemagref dispose de données hydrologiques, ce qui nous permet de connaitre la qualité de l'eau.

Le biofilm a donc été récolté dans un des ruisseaux de ce bassin.

Trois boites ont été déposées dans ce ruisseau : la première en plein jour dans une eau stagnante, la deuxième toujours en plein jour mais dans une eau circulante et la dernière à l'obscurité (sous un pont). Cela a pour objectif de comparer les comportements des différentes communautés présentes.

La technique de collecte de biofilm est la même que précédemment.

(30)

- 24 -

3.1.2. Mesure de l'activité β-Glucosidase

On peut mesurer une activité enzymatique en introduisant un substrat accroché à une molécule fluorescente comme la 4-méthylumbelliférone (MUF). Lorsque cette molécule est accrochée à une molécule de glucose, autrement dit le MUFGLU, la fluorescence disparait.

Lorsque l'enzyme hydrolyse la liaison qui le sépare de son substrat, le MUF redevient fluorescent (figure10).

Figure 10 : Réapparition de fluorescence sous l'action de l'enzyme

On peut alors mesurer la fluorescence émise à l'aide d'un spectrofluorimètre (figure 11).

Protocole initial :

Dans un tube en plastique de 15 mL : - Introduire 4 mL de biofilm

- 200 µL de solution de MUF-GLU à 2mmol/L - Vortexer

- Incuber 30 min

- Ajout de 400µL de soude à 1 mol/L

- Centrifuger le mélange : 3000 rpm pendant 15 min Figure 11 : Mesure de la fluorescence émise

(31)

L'activité est ensuite mesurer au spectrofluorimètre à une longueur d'onde d'absorption de 348nm.

Protocole avec ajout de toxique :

Toujours dans un tube en plastique de 15 mL, on introduit : - 3.96 mL de biofilm

- 40 µL de toxique

La suite du protocole est le même que précédemment. La durée d'incubation passe cependant à 1 h.

Préparation des solutions d'ions métalliques (tableau 7) :

Métaux Concentrations d'exposition en mg/L Cd 0, 1, 5, 10, 25, 50 / 0, 10, 25, 50, 100 Cu 0, 5, 10, 15, 25, 50 / 0, 10, 50, 75, 200

Zn 0, 5, 10, 20, 30, 50

Tableau 7 : Concentrations d'expositions aux ions métalliques

3.1.3. Calculs de EC₅₀

Quand une inhibition de l'activité β-Glucosidase est observée, il est possible d'en déduire une EC₅₀ pour le toxique testé.

Pour rappel, la EC50 est la concentration pour laquelle on observe une inhibition de 50 % de l'activité bactérienne.

Le logiciel utilisé est le même que celui pour la toxicité algale.

3.2. Résultats

3.2.1. Inhibition de l'activité bactérienne par les ions métalliques

(32)

- 26 -

Les résultats obtenus sont, pour le Cadmium, une EC₅₀ de 74.99 ± 86.75 mg/L, pour le Cuivre de 27.32 ± 7.71 et pour le Zinc de 379.37 ± 310.39 mg/L.

Figure 12 : Courbes d'inhibition de fluorescence par Cd, Cu et Zn en mg/L

Les valeurs des EC₅₀ "normalisées" par les MES figurent dans le tableau ci-dessous :

Solution MES en g/L EC50 "normalisée" = EC50/MES

Cadmium 0.035 ±0.04

Cuivre 0.013 ±0.003

Zinc

2.14

0.177 ± 0.14

Tableau 8 : Résultats des EC50 "normalisées" du Cd, Cu et Zn. L'intervalle de confiance est de 95 %

Cu

0 20 40 60 80 100

0 20 40 60 80 100 120 140

Concentration

Zn

0 20 40 60 80 100

0 50 100 150 200 250 300

Concentration Cd

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0 20 40 60 80 100 120 140

Concentration

Légende :

EC10 EC15 EC20 EC25 EC50 EC10 EC15 EC20 EC25 EC50

(33)

Ces résultats sont toutefois à nuancer. En effet, d'après les graphiques de la figure 12, on observe qu'à partir d'une certaine concentration, pour le cadmium et le cuivre 50mg/L, pour le zinc 100mg/L, un palier apparait.

On peut interpréter ces résultats en considérant qu'à partir d'une certaine concentration en Cd, Cu et Zn, on observe une mutation de populations bactériennes, avec une population de bactéries plus résistantes. Ce palier avait déjà été remarqué dans l'étude de Lise FECHNER.

Il est donc possible de définir une EC50 par rapport au palier d'inhibition observé. Pour cela, on utilise comme valeur du palier la moyenne des 2 ou 3 derniers points obtenus, et on retranche cette valeur aux valeurs de fluorescence obtenues.

Figure 13 : Courbes d'inhibition de l'activité bactérienne par le Cd, le Cu et le Zn en y incluant les paliers

Cd

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06

[Cd]/MES

Cu

0 10 20 30 40 50 60 70

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06

[Cu]/MES

Zn

0 5 10 15 20 25 30 35 40

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12

[Zn]/MES

Légende :

EC10 EC15 EC20 EC25 EC50 EC10 EC15 EC20 EC25 EC50

(34)

- 28 -

Les nouvelles valeurs de EC₅₀"normalisées" obtenues sont respectivement pour le cadmium de 0.0042 ± 0.0009, pour le cuivre de 0.0053 ±0.0008, et pour le zinc de 0.0090 ± 0.003.

D'après ces résultats, on observe que le zinc est le métal le moins toxique pour les communautés bactériennes. Sa EC50 est la plus élevée. Ce qui semble logique puisque le zinc est un métal essentiel.

Ce serait donc le cadmium et le cuivre qui provoqueraient le plus de mortalité chez les bactéries.

Récapitulatif des résultats des expériences réalisées :

Toxique Lieu de prélèvement

Durée de colonisation

EC50 en mg/L

MES en

g/L EC₅₀ "normalisée"

Jour ; Eaux

Circulantes 21 jours 7.31 ± 1.43 0.40 0.018 ± 0.0035

Nuit ;

E. Stagnantes 21 jours 3.54 ± 1.16 0.45 0.0078 ± 0.0026

Cadmium

E. Circulantes 43 jours 8.99 ± 1.93 2.14 0.0042 ± 0.0009

Nuit ;

Cuivre

Zinc E. Circulantes 43 jours 19.26 ±0.64 2.14 0.0090 ± 0.0030

Tableau 9 : Résultats des différentes EC₅₀ suivant le toxique utilisé et le lieu de prélèvements. L'intervalle de confiance est de 95 %

La première remarque que l'on peut faire est que suivant le lieu de prélèvements, les EC₅₀ varient. En effet, pour le cadmium, la EC₅₀ du biofilm "nuit" est deux fois plus importante que celle de jour. On peut donc supposer que soit les communautés bactériennes présentes de nuit sont plus résistantes que celles présentes le jour, ou soit que les communautés bactériennes sont variables suivant le lieu de colonisation.

(35)

Les mêmes remarques peuvent être faites pour le cuivre. En effet, les EC₅₀ sont très variables d'un lieu à l'autre.

Si on compare les EC50 d'un même toxique sur du biofilm prélevé à un même endroit mais avec des durées de colonisation différentes, on voit que celle-ci sont différentes.

En effet, en ce qui concerne le cuivre, la EC50 est de 0.0053 ± 0.0008 pour une durée de colonisation de 43 jours et de 0.0011 ± 0.00078 pour une durée de 45 jours.

On peut en conclure que la EC50 dépend de nombreux paramètres. En effet, suivant le lieu de prélèvements (obscurité, lumière, eaux stagnantes, eaux circulantes), la durée de colonisation des membranes ou encore la saison de récolte, celle-ci peut varier fortement.

De plus on peut remarquer que la normalisation par rapport aux MES nécessite de valider un domaine d'utilisation. Par exemple, lorsque celles-ci sont inférieures à 1 g/L, cette normalisation ne parait pas adaptée.

(36)

- 30 -

4. Caractérisation des communautés bactériennes et algales issues de biofilm

Comme nous l'avons vu précédemment la méthode PICT comprend deux phases : une phase de sélection des communautés composant le biofilm, suivie d'une phase de détection de la tolérance. La caractérisation génétique, que nous réaliserons dans cette étude, intervient dans la phase de sélection. Elle a pour objectif de connaitre la richesse d'une communauté.

Les techniques de biologie moléculaire apparaissent comme complémentaires aux techniques systématiques classiques (l'observation microscopique pour les algues ou l'isolement–culture de souche pour les bactéries). Depuis l'avènement de la biologie moléculaire, La DGGE, Denaturing gradient gel electrophoresis, est une des méthodes les plus intéressantes pour comparer les différents profils génétiques des communautés.

Notre approche méthodologique a pour objectif d'extraire l'ADN total du biofilm, c'est-à-dire à la fois des communautés eucaryotes et procaryotes. L'intérêt réside en une analyse de deux types de communautés. En effet, jusqu'ici les quelques études menées analysaient essentiellement les communautés bactériennes.

Nous présenterons donc dans cette quatrième partie la mise au point de la méthode de PCR et de DGGE pour chaque communauté. Cette partie est un complément de mon stage, elle sera donc moins développée.

Nous avons cherché à comparer les différentes communautés bactériennes et algales issues de deux sites différents : l'Ecluse de Saint Maurice et le bassin de l'Orgeval.

Enfin, afin de déterminer si la structure de la communauté bactérienne était modifiée au cours de l'exposition à des métaux lourds et donc éventuellement d'expliquer l'apparition d'un palier lors des tests de toxicité bactérien (cf partie 3.2.1), nous comparerons les profils génétiques avant et après un test de toxicité au cuivre et au cadmium.