Mieux comprendre les fluorochromes pour la microscopie confocale

Mieux comprendre les fluorochromes pour la microscopie confocale

¾ Processus physique et ses implications : spectres

¾ Autres propriétés des fluorochromes

¾ L’environnement

¾ Montage de l’échantillon

¾ Recouvrement des spectres d’émission

¾ Choix d’une sonde fluorescente

¾ Chargement, quantification, chromatisme,

¾ Techniques ratiométriques

¾Les protéines fluorescentes Susanne Bolte

Spencer BROWN,

Dynamique de la compartimentation cellulaire, Béatrice SATIAT-JEUNEMAITRE, Olivier CATRICE,Institut des Sciences du Végétal, CNRS UPR2355, Gif-sur-Yvette

et Susanne BOLTE, Marie-Noëlle SOLER IFR87 "La Plante et son environnement “ et Christel TALBOT^,Plate-forme d'Imagerie Cellulaire de l'Institut de Neurosciences, Université de Bordeaux II

Brown, S., Bolte, S., Satiat-Jeunemaître B. (2007) Tracking Gene Expression in Plant Cells: Microscopy and associated bio-imaging techniques. Chapter 13 in: Functional Genomics: From Sequence to Function in Plants, JF Morot-Gaudry, P Lea et JF Briat (eds) Science Publishers, UK, pp 245-275

AF-actin

lissamine-rhodamine-dextran bisbenzimide Hoechst 33342

DiIC1(5) DeBiasio et al. 1987

endosomes LY

Un marqueur pour chaque compartiment, ou pour chaque fonction ?

fluoro-chromasia Acridine Orange

intensité, spectre, durée de vie de la fluorescence, anisotropie d’émission…

Aniline Blue : ß 1-3 glucanes insolubles

Calcofluor White sur

algues avec phycobiliprotéines

Nuclear membrane Tonoplast Endoplasmic

reticulum (ER+RER) Golgi stacks Plasma

membrane

Chloroplastes

Mitochondria Cell Wall

N

Vac

Peroxisomes

+ cytoskeleton : actin, tubulin, etc.

Ian Small, INRA Evry GFP

cible plastes

GFP cible mitochondria

DsRed cible mitochondria autofluorescence

de

chlorophylle

Cytoskeletal organisation in Medicago T. Hanh Trinh

LUMINESCENCE

© ª

PHOTO-LUMINESCENCE CHIMI-LUMINESCENCE

© ª BIO-LUMINESCENCE

Fluorescence Phosphorescence THERMO-LUMINESCENCE

court tau

τ

_f long

ELECTRO-LUMINESCENCE

singulet triplet

etc…

Bernard VALEUR (2002, 2004) ; Cachan & CNAM

Niveaux d’énergie

S

₀

T

₁

transfert d’énergie 10^-12 à 10^-4 s

S

₀

S

₁

T

₁

cis

phosphorescence 10-8 à10-2 s

Raman Stokes & anti-Stokes (inélastique, sans absorption)

S

₁

S

₂

cis

phosphorescence quenchingde fluorescence 10-9 à10-7 s

fluorescence

ci

absorption

Diagramme simplifié des niveaux d’énergie d’une molécule polyatomique Jablonski energy diagram

~fs ~ns

~ps

triplet singulet

niveau virtuel

vi v0

TPA : two-photon absorption

… l’absorption quasi-simultanée (fs) de deux photons de faible énergie.

Les spectres d’excitation biphotonique ressemblent à peu près aux spectres

conventionnels d’absorption décalés d’un facteur 2x sur l’axe λ ( nm)

déplacement de Stokes

Longueur d’onde (nm) iso-thiocyanate

de fluorescéine

Absorbance (DO, )Intensité(UA, )

0 0

1 1

489 521

émission excitation

Chlorella vulgaris

200 300 400 500 600 700 800

Intensité(UA, )Intensité(UA, )

Spectre d’absorption et d’émission

de l’iso-thiocyanate de fluorescéine et de la chlorophylle in situ

OH O

O

COOH

N C S

fluorescèine ITC PM 389 dalton

acide faible pKa ~6,4

Q ≈ 0,85

ε ≈ 80.000 M^-1. cm^-1

Figure 2.

Propriétés:

absorptivité moyenne

bon rendement quantique peu encombrante

divers analogues disponible

Niveaux d’énergie

S

₀

T

₁

transfert d’énergie 10^-12 à 10^-4 s

S

₀

S

₁

T

₁

cis

phosphorescence 10-8 à10-2 s

Raman Stokes & anti-Stokes

S

₁

S

₂

cis

phosphorescence quenchingde fluorescence 10-9 à10-7 s

fluorescence

ci

absorption

Diagramme simplifié des niveaux d’énergie d’une molécule polyatomique Jablonski energy diagram

~fs ~ns

~ps

NH₂ NH₂

N⁺

(CH₂ )₃ -⁺N CH₃ C₂ H₅ C₂ H₃

0 1

Longueur d’onde (nm) propidium

200 300 400 500 600 700 800

Intensité(UA, )

Intensité(UA, )

0 1

Intensité(UA, )

émission excitation

Intensité(UA, )

iso-thiocyanate de fluorescéine

Spectre d’absorption et d’émission

de l’iso-thiocyanate de fluorescéine et du propidium

OH O

O

COOH

N C S

Spectres et « déplacement de Stokes »

Longueur d’onde λ du maximum d’excitation < λ du maximum d’émission

Exemple: pour la fluorescéine, respectivement 495 nm et 521 nm, déplacement de Stokes = 26 nm.

Des complexes offrent un déplacement de Stokes important

vis. chlorophylle, iodure de propidium, ECD, Red670, Tricolor, Cychrome et les Nano-particules colloïdales Quantum Dots

et les particules à émission anti-Stokes “upconverted luminescence nanocrystals”

Wu S, Han G, Milliron DJ, Aloni S, Altoe V, Talapin DV, Cohen BE, Schuck PJ. (2009) Non-blinking and photostable upconverted luminescence from single lanthanide-doped nanocrystals. PNAS Early Edition, July 2009

Déplacement de Stokes = la distance entre les maxima d'excitation et d'émission

Rendement quantique φ _f

= rapport du nombre total de photons émis dans tout le spectre d'émission de fluorescence au nombre de photons reçus et absorbés dans la zone spectrale d'excitation

I

_f

et I

_a

= nombre de quanta par unité de temps et de surface recevant (a) et émettant (f) la lumière

( φ

_f

^≈ 0,85 pour la fluorescéine )

rendement quantique, I _f = φ _f ∗ I _a

phi

C, concentration du fluorophore I

_f

, intensité d'émission

Coefficient d'extinction, ε ^,

ou absorbance spécifique = absorbtivité molaire

Sa valeur peut constituer un critère pour le choix des colorants ; plus ε ^{est grand,}

plus la fluorescence sera élevée à intensité lumineuse incidente égale.

( Pour la fluorescéine à 488 nm, ε ^{= 8 x 10}

⁴

^M

^-1

^{. cm}

^-1

⁾

Avec une absorbance spécifique très réduite ( ε.C.l < 0,02 ), on peut linéariser la fonction exponentielle, avec Log10 ≈ 2,3

I

_f

≈ 2,3 φ

_f

. I

_o

. ε.C.l

La "brillance" est proportionnelle à ε et φ

ε φ « brillance »

( M^-1. cm^-1 ) ( unités arbitraires )

Fluorescéine 80 000 0,9 72 000

Cyanine5.18 250 000 0,35 70 000

EYFP 84 000 0,61 51 000

B-phycoérythrine 2 410 000 0,98 2 360 000

Tryptophan 6 000 0,1 600

Quantum Dot 605 1 000 000 0,55 550 000

Quantum Dot 655 3 000 000 0,60 1 800 000

(à 490 nm)

" Brillance "

Pour Non Linear Optics:

Action cross section = absorption cross section (spécifique de NLO) multipliépar le rendement quantique

1 Göppert-Mayer = 10^-50 . cm⁴ . s

Durée de vie du singulet excité le plus bas

= la constante de temps de déclin de fluorescence, τ

_f

τ _f = φ _f . τ _N

τ _N , constante de temps intrinsèque de l'état excité (en considérant seulement la fluorescence).

( τ

_f

^≈ 4 ns pour la fluorescéine dans l'eau)

φ _F , rendement quantique

Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM

tau

phi

k

_ET , constante de cinétique pour resonant energy transfer, RET

τ

_D , durée de vie du donneur

R_o , constante de la distance critique (en nm) pour un couple donneur – accepteur

R , distance moyenne effective (en nm) entre les centres des dipôles donneur – accepteur.

Donc, le transfert d'énergie par résonance non radiatif est proportionnel à R

^-6

. Transfert d'énergie par résonance (loi de Förster)

Förster (Fluorescence) Resonant Energy Transfer = FRET

Chevauchement du spectre d'émission d’un donneur d'énergie et du spectre d’absorption d’un accepteur d'énergie :

Excitation du donneur et émission de l'accepteur

k

_ET

= 1 / τ

_D

. ( R

_o

/ R )

⁶

Notons que des transferts d'énergie sont importants dans des complexes chlorophylliens.

L’occurrence de FRET réduit le durée de vie apparente du donneur,

τ

_D ^.

Knapp et al. Cytometry (2003) Part A 51A: 68-78 Aurora Company, Roger Tsien

Intra-molecular FRET

Violet or UV excited green to blue B-lactamase

substrate

Mesure de calcium avec le Biosenseur CAMELEON:

CFP

YFP

CFP

YFP

+4Ca

²⁺

440 nm 480 nm

FRET

440 nm

530 nm

4Ca

²⁺

Calmodulin

M13

Changement conformationnel

-Ca

²⁺

Allen et al., 1999

Les applications de la microscopie confocale en biologie végétale/Susanne Bolte IFR87

Mark JEPSON & Darran CLEMENTS, Bristol Univ. The Biochemist, June 2004, 30-34

caspase3 indicator CFP CFP-DEVD-YFP YFP in staurosporine-treated HeLa cells

ex 430 nm, em 465-485 nm ex 430 nm, em 520-540 nm DAPI ex 357 nm, em 420-490 nm

YFP/CFP

1.46

0.83

Intra-molecular FRET

CFP-DEVD- CFP YFP YFP

caspase3

X

Resonant Energy Transfer RET Förster (Fluorescence) Resonant Energy Transfer FRET

• Sonde permeante fluorescente bleu/verte pour l’activité β–lactamase.

• sondes calciques Cameleon, typiquement CFP-YFP

• Biosensors e.g. protéines périplasmiques fusionnées avec CFP/YFP Fehr (2004)

• PCR quantitative, un fluorophore et un quencher sont placés à proximité l'un de l'autre sur un même oligonucléotide

• Molecular Beacons ( balises moléculaires )

L'oligonucléotide libre forme par auto-hybridation une épingle à cheveux qui amène le fluorophore à proximité du quencher.

Lors de l'hybridation avec un autre fragment d'ADN, cette compétition amène une linéarisation de l'oligonucléotide, et le fluorophore est alors éloigné du quencher.

• « sondes FRET d'hybridation »

• homo-FRET est dépolarisant GFP/GFP (Grandjean, Versailles)

• FRET inter-moléculaire FITC/TRITC ; CFP/YFP ; GFP/mCHERRY ; GFP/Cy3.18

Bioluminescence Resonant Energy Transfer BRET et CRET BRET2 utilise Renilla luciferase sur coelentérazine (DeepBlueC) qui transfert à GFP2.

Black Hole Quenchers, Dabcyl et TAMRA (Qiagen Operon Product Guide 2002, www.operon.com).

Autres propriétés

Température : généralement l’intensité augmente quand la température baisse Polarisation : absorption favorable si

champs électromagnétique du photon // dipôle d’absorption ; ensuite…

émission isotrope ou anisotrope, d’après les cinétiques de rotation.

par exemple, un fluorophore cylindrique dans un membrane

Photostabilité :

Perte de fluorescence (fading):

fluorescéine versus rhodamine ; Alexas ; QuantumDots FRAP (Fluorescence Recovery/Redistribution After Photobleaching) FMI-43, FM4-64 styryl dyes, membranaires

Rouge Neutre (Neutral Red; abs max 533, pKa 6.7) Photo-activable PA-GFP inductible par 413 nm

Photo-convertible Kaede, Eos, Dendra ; ou DRONPA réversible

L’importance donc du milieu de montage

L’environnement

Un déplacement d’absorption vers des longueurs d’onde courte se dit hypsochromique.

Un déplacement d’absorption vers des longueurs d’onde longue se dit bathochromique.

effet Solvant

Nile Red (Rouge de Nil) : jaune triglycérides neutres ; rouge phospholipides polaires Nile Blue : jaunes lipides ; rouge protéines

NBD (nitrobenzoxadiazole)…

Q est 10 fois moins dans un environnement aqueux : insertion membranaire critique

pH

_{- FITC pKa ≈ 6,4}

- BCECF-AM pKa 6,98

- EGFP pKa 5,5

- EYFP pKa 6,9

Ions métalliques

mithramycine et chromomycine → Mg²⁺ essentiel

Hoechst 33342 → bromure quench

sondes chélatrices de calcium

→

Mn²⁺ quench

YFP

→

chlore quench

Concentration ou agrégation

carboxy-fluorescéine : non fluorescent à 100 mM

JC-1 formation de J-agrégats, alors I_rouge /I_vert reflète l’hyperpolarisation

Fluorescence moléculaire

polarité potentiel

électrique

quenchers

pH

pression

viscosité température

ions

liaison hydrogène

Fluorescence moléculaire

polarité potentiel

électrique

quenchers

pH

pression

viscosité température

ions

liaison hydrogène

Bernard VALEUR (2002), CNAM

Figure 3.

Amphiphilic amino-styrene dye FM4-64 : emission spectrum

Protoplast from suspension cells of Arabidopsis

Transmission DIC

Fluorescence

spectrofluorométrie

in CHAPS micelles in protoplasts & cells

imagerie

Bolte S, Talbot C, Boutte Y, Catrice O, Read ND, Satiat-Jeunemaitre B (2004)

FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. J. Microscopy, 214, 159-173

bathochrome

base de

données

hypsochrome

Quenching

Quenching dynamique Quenching statique

RET : transfert d’énergie à distance

… et bien sûr la photo-destruction

How many Photons?

• Consider 1 mW of power at 488 nm focused to a Gaussian spot whose radius at 1/e

²

intensity is 0.25 μm via a 1.25 NA objective

• The peak intensity at the center will be 10

^-3

W [π.(0.25 x 10

^-4

cm)

²

] = 5.1 x 10

⁵

W/cm

²

or 1.25 x 10

²⁴

photons/(cm

²

sec

^-1

)

• At this power, FITC FITC would have 63% of its molecules in an excited state and 37% in ground state at any one time

J. Paul Robinson, Purdue University Cytometry Laboratories www.cyto.purdue.edu/flowcyt/educate/pptslide.htm

Photobleaching example

• • FITC : FITC : At 4.4 x 10

²³

photons cm

^-2

sec

^-1

FITC FITC bleaches with a quantum efficiency Q

_b

of 3 x 10

^-5

• Therefore FITC FITC would be bleaching with a rate constant of 4.2 x 10

³

sec

^-1

so 37% of the molecules would remain after 240 µsec of irradiation.

• In a single plane, 16 scans would cause 6-50% bleaching

J. Paul Robinson, Purdue University Cytometry Laboratories www.cyto.purdue.edu/flowcyt/educate/pptslide.htm

Milieu de montage

• transparence

• indexe de réfraction

• stabilité

• respect des structures et volumes

• viscosité

• osmolarité

• pH (pKa)

• ions

• antioxydant(s)

• pièges à radicaux libres (DABCO, etc.) et aux composés phénoliques (PVP)

• permanence

On stocke ses préparations fixées à 4°C.

Pour cellules vivantes :

quencheurs de radicaux libres tel

caroténoïdes (50 mM crocétine ou etretinate) ; ascorbate, imidazole, histidine, cystéamine, glutathion réduite, Trolox (analogue de vitamine E)

J. Paul Robinson, Purdue University Cytometry Laboratories

www.cyto.purdue.edu/flowcyt/educate/pptslide.htm

voire notre base : Milieu de montage

Maîtriser les Indices de Réfraction

Objectifs

n=1.52 n = 1.52 n = 1.52

Specimen Lamelle Huile

n= 1.33 n = 1.52 n = 1.0

n = 1.5

Eau n=1.52

Air

Eau ^{n= 1.33} perdu

Quel choix de fluorochromes ?!

Le marquage des cellules par des fluorochromes permet d'accéder à des informations arbitrairement classées en deux catégories

- les paramètres structuraux - les paramètres fonctionnels

M-H Ratinaud

nodule de Medicago : Fugier et Crespi (1994) hybridation in situ : réflectance sur l’argent

avec autofluorescence tissulaire

Glucuronidase report assessed by confocal microscopy

develop the GUS reaction only weakly ; chlorhydrate ; fix ; gomme arabique Epi-reflectance confocal image (blue) superposed upon DIC transmission image

A tissue-specific promotor of the vegetative apical meristem in Arabidopsis (200 images with z = 0.2 µm)

Nathalie Glab and Séverine Domenichini, IBP, CNRS, UMR8618, Orsay

Autofluorescence chez la betterave et le pois

modifié de Cerovic et al, 1999

NAD(P)H,

acide férulique, coumarines, alcaloïdes

flavines, FAD, FMN

phycobiliprotéines

chlorophylles,

porphyrines (hème), rhodopsine

en IR : matériaux phenylalanine

tyrosine, tryptophan

Excitation UV sur le plan d’une coupe transversale de feuille de Daphniphyllum macropodum

Cerovic et al, 1999 ; Meyer et al. 2004

chlorophylle chlorophylle phé ph énoliques noliques

coumarines coumarines

flavines

flavines (lignine)

Zoran Cerovic

Equipe de Biospectroscopie Végétale, Laboratoire d'Ecologie Systématique et Evolution (UMR 8079), UniversitéParis-Sud 11

… et si on irradie par l’épiderme en UV, vis, IR ?

Chlorophylle comme sonde pour apprécier les polyphénoles d’après leur effet d’écran

Hutzler P, Fischbach R, Heller W, Jungblut TP, Reuber S, SchmitzR, Veit M., Weissenbo G, Schnitzler JP (1998) Tissue localization of phenolic compounds in plants by confocal laser scanning microscopy. J. Exp Bot. , 49, 953–965

broad bean rye

Naturstoffreagenz A spruce

rye NH

₃

Plastids of live mesophyll of Commelina communis , with 1200 nm excitation THG 400 nm SHG 600 Biphoton Overlay

Third Harmonic Second Harmonic autofluorescence Generation Generation

P-C Cheng, National Taiwan University, Taipei.

Figure 36 in Feijo, J.A., Moreno, N. 2004. Imaging plant cells by two-photon excitation. Protoplasma, 22, 1-32

…des éléments contrastants complémentaires

Action cross section = absorption cross section multiplied by the fluorescence quantum yield 1 Göppert-Mayer = 10^-50 . cm⁴ . s

Zipfel WR, Williams RM, Christie R, Yu Nikitin A, Hyman BT, WebbWW (2003) Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. PNAS, 100, 7075-7080

Fig. 1. Two-photon action cross sections and emission spectrafrom a basis set of biological molecules that contribute much of the intracellular 2PE intrinsic fluorescence. (a). In buffered (pH 7.2) saline solution, except retinol and cholecalciferol (vit D), which were measured in EtOH. Riboflavin, cholecalciferol, and NADH were measured at 100 µM; retinol, folic acid, phylloquinone, pyridoxine, and nicotinamide were measured at 500 µM. (b) Emission spectra of the compounds shown in a .

Andrey S. Klymchenko A S, Duportail G, Mély Y,Demchenko A P (2003) Ultrasensitive two-color fluorescence probes for dipole potential in phospholipid membranes. PNAS, 100: 11219–11224

Fig. 5. Response in emission spectra of F8N1S and PPZ8 to variations of the dipole potential in THP-1 cell plasma membrane produced by the addition of 6-KC (5, 10, 15, 20, 30, 40, and 50 µM). ψ_dwas modified by the addition of 6-ketocholestanol 10, 20, and 40 µM. Spectra normalized at the T* band for PPZ8 and at the N* band for F8N1S. Dotted line upper panel: addition of 50 µM cholesterol.

Intensity

Ratio N*/T* 485/585 nm

Aspects

spectraux

Exemples de marqueurs fluorescents utilisés en biologie cellulaire et moléculaire

modifié d'après Kasten dans Mason (1999) Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity.

Academic Press, Londres (2è éd).

Wavelength (nm)

Name Excitation Emission Applications

Immunocytochemical fluorophores, conjugates and lectins

Tracers for various proteins, receptors, mono- and

polysaccharides Alexa Fluor family 350, 430, 488, 532, 546, 568,

594, 633, 647, 660, 680

Allophycocyanin (AP) 620 660

Allophycocyanin cross-linked (AP-XL) 650 660 AMCA (7-amino-4- methylcoumarin-3-acetic acid) 350 450 Bodipy (borondipyromethene difluoride dye) 505 512 CT-120 (coumarin 120 thiolactone) 345 410 CT-339 (coumarin 330 thiolactone) 350 420

Coumarin 138 365 460

Cyanine2 492 510 incompatible avec VectaShield

Cyanine3.18 488, 552 570 ε 150.000 Cy3 de biopuces

Cyanine3.5 588 604 ε 150.000

Cyanine5.18 650 670 ε 250.000 Cy5 de biopuces

Cyanine5.5 675 694 ε 250.000

Cyanine7 743 767 ε 250.000

4’5’ -Dimethylfluorescein 510 535 5-DTAF (5-(4’6-dichloro- triazinyl) aminofluorescein) 495 530

Eosin-5-isothiocyanate 524 548

Erythrosin-5-isothiocyanate 535 558

FITC(fluorescein-5- isothiocyanate) 490 520 Tableau 6.

https://www.omegafilters.com/

= Cy3.18

Faites la différence !

Quelques fluorochromes utilisés en microscopie confocale

- immunofluorescence :

FITC, TRITC, lissamine rhodamine, Texas Red,

Cy3.5, Cy5.5, Alexa Fluors

488, 568, 647

- ADN :

iodure de propidium, YOYO, YOPRO, SYTO16, chromomycine, mithramycine;

DAPI, Hoechst, DRAQ5, TOTO3, TOPRO3 (oligos Cy3.18, Cy5.18)

- mitochondie :

sensible au potentiel membranaire: nM

Rhodamine 123, DiOC

₆

(3), DiOC

₆

(5), DiOC

₇

(3), JC-1, MitoTracker Red CMXRos

(post-fixation possible) ;

NAO

(peu sensible potentiel)

- membranes :

Styrenes FM1-43, FM4-64, fusions-GFP, divers anticorps de surface

- Viabilité : FDA, exclusion d’iodure de propidium,…

morphologie, avec DIC

- réticulum endoplasmique:

(µM non spécifique) DiOC

₆

(5), GFP-HDEL

- appareil de Golgi : GFP-taggée,

anticorps, NBD-C

₆

-ceramide

(pas pour végétaux)

- dépendance envers le pH : carboxy-SNARF-1, BCECF

- dépendance envers le calcium : Fluo-3 ou -4 (± FF), FuraRed, CalciGreen, Indo-1, Cameleon - divers :

LysoTracker, Acridine Orange, Neutral Red, Lucifer Yellow, chlorophylle,

- Protéines (Auto)fluorescentes

Tableau 3.

*maximum approximatif d’absorption et d’émission

Une famille d’excellents fluorophores pour marquer des protéines, anticorps secondaires, etc

Molecular Probes, Inc

Fluorophore Absorption*

(nm)

Emission*

(nm)

Couleur Coefficient

d’extinction ( M^-1 . cm^-1 )

AlexaFluor 350 346 442 Bleu 19.000

AlexaFluor 405 401 421 Violet 34.000

AlexaFluor 430 433 541 Jaune-vert 16.000

AlexaFluor 488 495 519 Vert 71.000

AlexaFluor 532 532 553 JauneJaune 81.000

AlexaFluor 546 556 573 Orange 104.000

AlexaFluor 555 555 565 Jaune-orange 150.000

AlexaFluor 568 578 603 Orange-rouge 91.300

AlexaFluor 594 590 617 Rouge 73.000

AlexaFluor 610 612 628 Rouge 138.000

AlexaFluor 633 632 647 Rouge 239.000

AlexaFluor 635 633 647 Rouge 140.000

AlexaFluor 647 650 665 Rouge lointain 239.000

AlexaFluor 660 663 690 Rouge lointain 132.000

AlexaFluor 680 679 702 Rouge lointain 184.000

AlexaFluor 700 702 723 Rouge lointain 192.000

AlexaFluor 750 749 775 Infra-rouge proche 240.000

Several laser options for microscopy

Krypton/Argon 60 mW démodé *488 nm (15 mW), 568 nm (15 mW) & 647 nm (15 mW) Argon Ion 100 mW 457 nm (6 mW), 488 nm (40 mW) & 514 nm (40 mW) Argon Ion 5W (UV/Vis) refroidi à eau 351+363 nm (50 mW), etc.

Blue Laser Diode 405 nm (50-100 mW)

Helium Cadmium 442 nm (80 mW)

Helium Néon-Green 543 nm (2 mW)

Diode Pumped Solid State (DPSS561) 561 nm (50 mW)

Helium Néon Orange 595 nm (3 mW)

Helium Néon-Red 633 nm (10 mW)

Laser blanc 470 - 670 nm

Accordable fs for multi-photon 705-980 nm (1 W)

Ytterbium fs with spectral selection 950-1150 nm (45%)

*le rapport entre les différentes raies a tendance à se dégrader avec le temps Tableau 4.

Spectres normalisés d’absorbance et d’émission

450 500 550 600 650

Absorbance relative

500 550 600 650 700

Emission : Fluorescence relative

FITC PE TX Red

FITC PE TX Red

BP 530

BP 580

BP 630

Longueur d’onde (nm)

FITC = isothiocyanate de fluorescéine PE = PhycoéPE = Phycoérythrinerythrine TX Red = Texas Red

Recouvrement des spectres d’émission !!!

Figure 6.

488 543

UV ou violet 405 nm HOECHST 33258

488 nm

Alexa Fluor 488

Alexa Fluor 568 543, 561, 568 nm

DIC

Paramecium; Anne Fleury, UPS, Orsay

Acquisitions simultanées

Lasers 488 and UV Laser 488 then UV The cross-talk problem

Acquisitions simultanées Acquisitions séquentielles

Radio-fréquences Transducteur

Absorbeur Cristal TeO

₂

lumière incidente

I

₀

raie diffractée ordre -1

AOTF : Acousto Optical Tunable Filter filtre opto-acoustique accordable

Brown et al. (2007) Temps de réponse rapide : 1-2 µs

Modulation continue entre 0 – 95 % Effet bloquant fort : T < 10

^-5

Accordable pour de nouvelles configurations, et multilignes

Robuste

I

₁

raie diffractée

ordre 1

AOBS:

Acousto-Optical Beam Splitter

change in 2 µs

AOBS versus Double Dichroic 488/ 543 543 nm

Transmission %

filtre dichroïc classique

versus

AOBS

± diffusion

exemple, iodure de propidium ne diffuse qu’à travers une membrane dégradée ; exclus par une membrane intacte

lipophilicité

Nile Red, DPH (di-phenyl-hexatriéne) ; DiIC₁₈ (3) sur membranes neuronales

lipophile & polaire

^{= ancrage:} TMA-DPH (tetra-méthyl-DPH), FM1-43, FM4-64 (amino-styryls)

amphiphile

bisbenzimide Hoechst 33342 (perméant) versus Hoechst 33258 (non perméant)

amphiphile avec charge délocalisée

exemples avec charges positives, DiOC₆ (3), JC-1, Rhodamine123. Vers la mitochondrie, leurs formes protonées seront captées à l'intérieur électronégatif de cet organite, d’après l’équation simplifié de Nernst : distribution d’une molécule

perméante de part et d’autre d’une membrane chargée V(mV) V = -61,5 log ( [M⁺]_i / [M⁺]_e )

soit, -61 mV vaut 10x concentration.

base faible

exemple, Rouge neutre ou une alcaloïde s’accumulent dans un compartiment acide comme la vacuole (piégée par protonation), d’après l’équation de Waddel &

Butler : pour une base faible perméante dans un système à deux compartiments:

i, intérieur et e, externe , alors C_i / C_e = 10^{pHe - pHi} soit, Δ1 pH vaut 10x concentration.

acide faible

exemple, Fluorescéine cytosolique s’accumule dans un compartiment alcalin (chloroplaste) par son état dissocié et chargé… Δ1 pH vaut 10x concentration.

dérivés estérifiés

fluorescéine di-acétate, assez lipophiles pour traverser une membrane. On compte ensuite sur des estérases cellulaires pour libérer le composé actif sur place.

Tableau 2.

Quelques exemples des composés dérivés de la fluorescéine (1)

HO O O

COO^-H⁺

N C S

HO O

O

COO^-H⁺

fluorescéine iso-thiocyanate de fluorescéine (FITC)

di-acétate

de fluorescéine (FDA)

- Excitation maximum 492-495 nm - Emission maximum 521 nm - rendement quantique 0,6 à 0,9 - pKa 6,3; acide faible

- largement imperméable à la membrane à pH >7

- Réagit avec les amines, sert donc pour étiqueter des protéines

- quasi non fluorescent - perméant aux membranes - estérases cellulaires libèrent

la fluorescéine acide O O

O

COO^-H⁺

CH₃ -C-O O-C-CH₃

Quelques exemples des composés dérivés de la fluorescéine (2)

di-acétate de

5-carboxyfluorescéine (CFDA)

di-acétate de

2’,7’-dichlorofluorescin (DCFH-DA)

2’,7’-bis(carboxyethyl) -5(6)-carboxyfluorescéine, penta-acétoxyméthyl ester

(BCECF-AM)

- analogue àla FDA - lactone perméante

- et le produit carboxyfluorescéine (pKa 6,4) est mieux retenu dans la cellule

- analogue à la FDA, réduite - les estérases libèrent un produit non fluorescent qui au cours d’une activité cellulaire peroxydasique, devient fluorescent

- analogue au FDA

- le produit BCECF, avec pKa 6,97 et une charge nette -4 à -5 est bien retenu dans la cellule et la

dépendance de sa fluorescence sur le pH permet son emploi comme sonde de pH cytoplasmique O O

O

COO^-H⁺

CH₃ -C-O O-C-CH₃

O O

Cl H Cl

O O

O

COO^-H⁺

CH₃ -C-O O-C-CH₃

R-O O O-R

R-OOC

O O

COO-R R-OOC

O-C-CH₃ O CH₃ -C-O

O

Membrane cellulaire

Di-acétate de

2’,7’-dichlorofluorescin (DCFH-DA)

+ H

₂

O

₂

(+ peroxydase)

2’,7’-dichlorofluorescin (non fluorescent)

2’,7’-dichlorofluorescein (fluorescent)

O OH

COO^-H⁺ HO

Cl Cl

O O-C-CH₃ O

O

COO^-H⁺ CH₃ -C-O

Cl H Cl

O OH

COO^-H⁺ HO

Cl H Cl

Désacétylation intracellulaire par des estérases

Perméation, libération, activation

O

COO^-H⁺

Cl H Cl

Ozyme

pour SNAP : X-Benzylguanine ; pour CLIP : X-Benzylcytosine 20 kDa SNAP-tag

petit réactif,

éventuellement perméant et fluorescent

SNAP-tag, CLIP-tag

Click-iT™ EdU (Invitrogen)

EdU (5-ethynyl-2

'

-deoxyuridine) analogue de la thymidine

•

Non-radioactive

• No DNA denaturation required

• Simplified protocol

• Small molecule detection

• Multiplex compatible, including

• Other antibodies

• Dyes for cell cycle analysis

AlexaFluor azide

Imaging DNA Synthesis

voir aussi l’utilisation d’anticorps contre bromo-deoxyUridine chloro-deoxyUridine

iodo-deoxyUridine

Altered Quiescent Centre cell properties in ccs52a2 mutant roots of A. thaliana.

Vanstraelen et al. (2009) PNAS

I

_o

, intensité lumineuse incidente I

_t

, intensité lumineuse transmise

C , concentration de la molécule absorbante, en mol.l

^-1

(M) l , trajet optique, en cm

I

_f

, intensité d’émission

Absorption : Loi de Beer-Lambert

I _a = I _o - I _t = I _o ( 1 - 10 ^-ε.C.l ) qui se simplifie à :

I _f ≈ 2,3 φ _f . Io . ε. C. l

La quantification… toute une chaine !

Figure 4 : Spectres d'émission de fluorescence dépendant du pH, de la sonde ratiométrique carboxy-SNARF-1,

pour différentes excitations 488 (A), 514 (B), 534 (C) .

(Molecular Probes, Invitrogen)

iso(s)beste

Spectre d’émission de fluorescence

du FLUO-3 et de Fura-Red microinjectés ensemble

Chen & Smiley J-aggregate-forming dye

JC-1 (un carbocyanine)

Img2 monoméric émission 520 nm

Img1

J-aggregates émission 585 nm

notre perception seuillage,

débruitage, puis ImgRatio

= Img1 / Img2

= une cartographie

de la potentiel Nernst

Michalet, X,Pinaud, F, Bentolila LA, Tsay J M, Doose S, Li J J, Sundaresan G, Wu A M, Gambhir S S, Weiss S (2005) Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science 307:

538–544

Violet

http://probes.invitrogen.com/products/qdot/

http://www.evidenttech.com/

Anatomy of a quantum dot

Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking.

Dahan M., … Triller A. (2003) Science 302: 442

Dynamiques de la molécule unique : Single Particle Imaging or Tracking

quantum dots = boîtes quantiques colloïdales

motif AP, puis biotine lyase : Howarth et al. 2005

… afin de réduire la taille du complexe des boîtes quantiques colloïdales …

On s’imagine d’ordinaire que rien n’est plus aisé que de faire des expériences; et même des Savants du premier ordre (…) ont traité cette occupation de frivole et de puérile. Cependant, j’ose le dire, elle est d’une difficulté infinie ; elle demande beaucoup d’art, beaucoup de

finesse et de sagacité d’esprit. Pierre VAN MUSSENBROEK, 1769 (citédans Valeur 2004)

Marije Scholte, ISV, Gif