Annexe I. Matériel et Méthodes

I

Annexe I. Matériel et Méthodes

1. Manipulations d’ADN

1.1. Préparation, Purification et analyse des ADN plasmidiques

Les expériences de restriction ainsi que de ligation d’ADN, d’extraction phénol/chloroforme, de précipitation, d’électrophorèse sur gel d’agarose ou de polyacrylamide, de transformation de bactéries par choc électrique et de PCR (Polymerase Chain Reaction) ont été réalisées selon les méthodes décrites précédemment (Sambrook et al., 1989). Les extractions d’ADN à partir de gels d’agarose et les minipréparations d’ADN plasmidiques ont été réalisés en utilisant le kit DNA extraction from Agarose et le kit DNA minipreperation (QIAGEN & SIGMA), respectivement.

Les séquençages ont été réalisés et analysés par la firme Genome Express. Toutes les constructions plasmidiques ont été générées en sous-clonant des fragments d’ADN obtenus par restriction de plasmides ou par amplification PCR à partir de plasmides contenant la séquence d’intérêt.

1.2. Plasmides utilisés

Différents plasmides ont été utilisés afin de transcrire, in vitro, des sondes ARN antisens. Ces plasmides «sondes» sont repris dans le tableau 1 présenté en pages I-II. Afin de transcrire des ARNm destinés à être injectés dans les embryons de xénope, nous avons utilisé plusieurs constructions préexistantes qui nous ont été gracieusement fournies par les laboratoires qui les ont générées. De plus, nous avons généré différentes constructions destinées à servir de modèles lors de la transcription in vitro d’ARNm. Ces plasmides d’expression sont repris dans le tableau 2 présenté en pages II-IV.

Plasmide sonde Espèce Vecteur Linéarisation ARN polymérase Rangement Origine BMP4 X.laevis pSPRT PstI T7 ish n° 17 Bang et al., 1997

Delta1 X.laevis XhoI T7 ish n° 82 Chitnis et al., 1995

Delta2 X.laevis pGEM T ApaI SP6 ish n° 4 Jen et al., 1997 Epi. Keratin X.laevis pGEM 81 EcoRI SP6 ish n° 36 Bellefroid et al., 1998 FoxD3 X.laevis pCS2 BamHI T7 ish n° 311 Sasai et al., 2001 Hairy2 X.laevis pBKS SalI T7 ish n° 112 Taelman et al., 2003

HoxB9 X.laevis pBKS BamHI T7 ish n° 270 Sharpe, 1991

Id3 X.laevis pCS2 HinDIII T7 ish n° 339 Liu et al., 2003

Msx1 X.laevis pCTS XhoI T7 ish n° 39 Suzuki et al., 1997

MyoD X.laevis BamHI SP6 ish n° 78 Rupp et al., 1991

II

Myt1 X.laevis pBKS BamHI T7 ish n° 79 Bellefroid et al., 1998 NeuroD X.laevis pBKS XbaI T7 ish n° 69 Bellefroid et al., 1998 Notch1 X.laevis ClaI SP6 ish n° 85 Chitnis et al., 1995 Nrp1 X.laevis BamHI T3 ish n° 367 Bellefroid et al., 1998 N-Tubulin X.laevis pBKS BamHI T3 ish n° 40 Chitnis et al., 1995

Otx2 X.laevis NotI T7 ish n° 126 Blitz et al., 1995

Pax3 X.laevis pBKS SalI T7 ish n° 60 Bang et al., 1997

Pax8 X.laevis pBKS EcoRI T7 ish n° 98 Carroll and Vize, 1999 Serrate1 X.laevis pBKS HinDIII T7 ish n° 278 Sato et al., 2000 Six1 X.laevis pBKS NotI T7 ish n° 303 Pandur et al., 2000 Six3 X.laevis pCS2 ClaI T7 ish n° 404 Zhou et al., 2000 Snail2 X.laevis pSP72 BglII SP6 ish n° 82 Mayor et al., 1995 Sox10 X.laevis pBKS EcoRI T3 ish n° 308 Aoki et al., 2003 Sox2 X.laevis pBKS EcoRI T7 ish n° 50 Bellefroid et al., 1998 Sox3 X.laevis pBKS EcoRI T7 ish n° 276 Penzel et al., 1996 Sox9 X.laevis pGEM T NcoI SP6 ish n° 304 Spokoni et al., 2002 SoxD X.laevis pBKS NotI T7 ish n° 47 Mizuseki et al., 1998 Trp2 X.laevis pGEM T NcoI SP6 ish n° 353 Aoki et al., 2003 Xag1 X.laevis pBKS NotI T7 ish n° 377 Wardle et al., 2002 Xbra X.laevis pSP73 BglII T7 ish n° 152 Smith et al., 1991 Zic1 X.laevis pBKS EcoRI T7 ish n° 49 Sato et al., 2005

Tableau 1. Plasmides utilisés comme modèles pour la transcription in vitro de sondes ARN

Plasmide injection Espèce Vecteur Linéarisation ARN polymérase Rangement Origine dnBMPR (tBr) X.laevis p64T EcoRI SP6 inj n° 4 Graff et al., 1994

BMP4 X.laevis XbaI SP6 inj n° 6 Schmidt et al., 1995

Noggin X.laevis EcoRI SP6 inj n° 15 Wettstein et al., 1997

Lac Z pCS2 NotI SP6 inj n° 44 Turner D

ICD X.laevis pCS2-Myc NotI SP6 inj n° 50 Wettstein et al., 1997

Delta1 X.laevis pCS2 NotI SP6 inj n° 53 Chitnis et al., 1995

Wnt8 X.laevis pCS2 NotI SP6 inj n° 58 Christian et al., 1991

Su(H)ank X.laevis pCS2-Myc-GR NotI SP6 inj n° 75 Chitnis et al., 1995 Delta^stu X.laevis pCS2 NotI SP6 inj n° 123 Chitnis et al., 1995 Su(H) X.laevis pCS2-Flag ApaI SP6 inj n° 124 Wettstein et al., 1997 Hairy1 X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 131 Taelman et al., 2004 Hairy2b X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 132 Taelman et al., 2004 Hes6 X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 154 Koyano-Nakagawa et al., 2000 ESR10 X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 155 Li et al., 2003

ICD X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 170 Lahaye et al., 2002

dnGSK3β X.laevis pCS2-Myc NotI SP6 inj n° 179 Dominguez et al., 1995 GSK3β X.laevis pCS2 NotI SP6 inj n° 180 Dominguez et al., 1995

GFP pCS2 NotI SP6 inj n° 190 Bronchain et al., 1999

Hes2 X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 225 Sölter et al., 2006 HRT1 X.laevis pCS2-Myc-GR NotI SP6 inj n° 270 Taelman et al., 2004 ESR10 X.laevis pCS2-Flag-GR NotI SP6 inj n° 278 Sölter et al., 2006

III

Hairy2b X.laevis pCS2-Myc-GR NotI SP6 inj n° 282 Taelman et al., 2004

Nrarp X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 296 Lahaye et al., 2002

Hes2 X.laevis pCS2-GR NotI SP6 inj n° 300 Sölter et al., 2006

eFGF X.laevis pCS2 NotI SP6 inj n° 302 Slack et al., 1989

caBMPR (Ca-Alk3) X.laevis pCS2 NotI SP6 inj n° 306 Graff et al., 1994 Su(H)dbm X.laevis pCS2-GR NotI SP6 inj n° 314 Chitnis et al., 1995 dnFGFR1 (XFD1) X.laevis pCS2 EcoRI SP6 inj n° 345 Amaya et al., 2001 dnFGFR4 (ΔR4) X.laevis pSP64T SalI SP6 inj n° 346 Hongo et al., 1999

FGFR4 X.laevis pSP64T AvaI SP6 inj n° 348 Delaune et al., 2005

Hairy2ΔWRPW X.laevis pCS2-GR NotI SP6 inj n° 411 Nichane et al., 2008b Hairy2dbm X.laevis pCS2-NLS-GR NotI SP6 inj n° 412 Nichane et al., 2008b

Id3 X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 427 Nichane et al., 2008a

Bax X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 437 Finkielstein et al., 2001

Bcl2 X.laevis pCS2-Myc NotI SP6 inj n° 438 Finkielstein et al., 2001 Hairy2b-GFP X.laevis pCS2-GFP NotI SP6 inj n° 439 Nichane et al., 2008a Hairy2a-GFP X.laevis pCS2-GFP NotI SP6 inj n° 440 Nichane et al., 2008a

Hairy2a X.laevis pCS2 NotI SP6 inj n° 441 Nichane et al., 2008a

Hairy2a X.laevis pCS2-GR NotI SP6 inj n° 442 Nichane et al., 2008a FGF8a X.laevis pCS107 AscI SP6 inj n° 463 Fletcher et al., 2006 Hairy2ΔIWRPW X.laevis pCS2-GR NotI SP6 inj n° 471 Nichane et al., 2008b Hairy2ΔOIWRPW X.laevis pCS2-GR NotI SP6 inj n° 472 Nichane et al., 2008b Hairy2-I X.laevis pCS2-NLS-GR NotI SP6 inj n° 473 Nichane et al., 2008b Hairy2-O X.laevis pCS2-NLS-GR NotI SP6 inj n° 474 Nichane et al., 2008b Hairy2-OI X.laevis pCS2-NLS-GR NotI SP6 inj n° 475 Nichane et al., 2008b Hairy2-HLHO X.laevis pCS2-NLS-GR NotI SP6 inj n° 476 Nichane et al., 2008b Hairy2-HLH X.laevis pCS2-NLS-GR NotI SP6 inj n° 477 Nichane et al., 2008b Stat3 X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 485 Nichane et al., 2009 Stat3 X.laevis pCS2-GR NotI SP6 inj n° 489 Nichane et al., 2008b

Id3 X.laevis pCS2-Flag-GR NotI SP6 inj n° 492 Nichane et al., 2008a

Hairy2-Nterm X.laevis pCS2-NLS-GR NotI SP6 inj n° 497 Nichane et al., 2008b Hairy2ΔWRPW X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 498 Nichane et al., 2008a Hairy2dbm X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 499 Nichane et al., 2008a Hairy2ΔIWRPW X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 500 Nichane et al., 2008a Hairy2ΔOIWRPW X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 501 Nichane et al., 2008a Hairy2-I X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 502 Nichane et al., 2008a Hairy2-OI X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 504 Nichane et al., 2008a Id3-Nterm X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 508 Nichane et al., 2008a Id3-Cterm X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 509 Nichane et al., 2008a Id3-HLH X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 511 Nichane et al., 2008a Stat3CTC X.laevis pCS2-GR NotI SP6 inj n° 527 Nichane et al., 2009 Stat3YF X.laevis pCS2-GR NotI SP6 inj n° 529 Nichane et al., 2009 Hairy2ΔNterm X.laevis pCS2-NLS-GR NotI SP6 inj n° 533 Nichane et al., 2008b Hairy2ΔNterm X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 534 Nichane et al., 2008b HRT1-Nterm^Hairy2 X.laevis pCS2-GR NotI SP6 inj n° 537 Nichane et al., 2008b

Hes1 Mouse pCS2-GR NotI SP6 inj n° 538 Nichane et al., 2008a

mRFP pCS2 NotI SP6 inj n° 540 Luyten et al., 2008

bFGF X.laevis p64T EcoRI SP6 inj n° 557 Slack et al., 1989

IV

FGF3 X.laevis pCS2 NotI SP6 inj n° 558 Slack et al., 1989

caFGFR1 (torsoR1) X.laevis pSP64T-Myc SacI SP6 inj n° 564 Umbhauer et al., 2000 Wnt7b X.laevis pCS107 AscI SP6 inj n° 565 Monsoro-Burq et al., 2005 caFGFR4 (torsoR4) X.laevis pSP64T-Myc XbaI SP6 inj n° 566 Umbhauer et al., 2000 Hairy2 X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 570 Nichane et al., 2009

Stat3 X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 571 Nichane et al., 2009

FGFR1-IC X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 613 Nichane et al., 2009 FGFR2-IC X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 614 Nichane et al., 2009 FGFR3-IC X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 615 Nichane et al., 2009 FGFR4-IC X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 616 Nichane et al., 2009 Stat3 X.laevis pCS2-GFP NotI SP6 inj n° 629 Nichane et al., 2009 Hairy2 X.laevis pCS2-GFP NotI SP6 inj n° 630 Nichane et al., 2009 Hairy2ΔNterm X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 643 Nichane et al., 2009 Hairy2dbm X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 644 Nichane et al., 2009 Hairy2ΔIWRPW X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 645 Nichane et al., 2009 Hairy2-I X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 646 Nichane et al., 2009 Hairy2-OI X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 647 Nichane et al., 2009

Id3 X.laevis pCS2-Flag-GFP NotI SP6 inj n° 648 Nichane et al., 2009

Pax3 X.laevis pCS107 AscI SP6 inj n° 655 Monsoro-Burq et al., 2005

Zic1 X.laevis pCS2 KpnI SP6 inj n° 656 Sato et al., 2005

Msx1 X.laevis pSP64T EcoRI SP6 inj n° 657 Monsoro-Burq et al., 2005 Stat3CTC X.laevis pCS2-GFP NotI SP6 inj n° 687 Nichane et al., 2009 Stat3YF X.laevis pCS2-GFP NotI SP6 inj n° 689 Nichane et al., 2009

Tableau 2. Plasmides utilisés comme modèles pour la transcription in vitro d’ARNm

2. Transcription et traduction in vitro

Les plasmides servant de modèles pour la transcription in vitro sont préalablement digérés par une enzyme de restriction reconnaissant un site unique en aval de la séquence à transcrire. Le produit de digestion est analysé sur gel et l’ADN linéarisé est ensuite purifié par une extraction au phénol/chloroforme, une extraction au chloroforme et est précipité à l’éthanol. Il est ensuite resuspendu dans de l’H²O traitée au DEPC (diéthyl pyrocarbonate, Sigma) à une concentration d’environ 1µg/µl.

2.1. Transcription des sondes ARN antisens marquées non radioactivement

La réaction de transcription des sondes ARN antisens est réalisée à l’aide du kit MEGAscript®

(Ambion) en utilisant l’ARN polymérase adaptée (T3, T7 ou SP6) en présence de digoxigénine- 11-UTP (Roche) ou de fluoréscéine-11-UTP (Roche). Le mélange réactionnel est incubé à 37°C pendant 4 heures. L’ADN plasmidique est ensuite digéré par l’ajout de DNAse I et incubation de

V 15 minutes à 37°C. La sonde ribonucléotidique antisens est ensuite purifiée par chromatographie d’exclusion sur billes Sephadex G50 Medium (Amersham Biosciences) équilibrées dans une solution de Tris10mM-EDTA 1mM et 0,1% SDS. La sonde ribonucléotidique antisens est précipitée à l’éthanol et le culot est resupendu dans 20µl d’H2O traitée au DEPC. La qualité de l’ARN est vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose. La sonde est ensuite diluée dans du tampon d’hybridation à 1µg/µl et conservée à -20°C.

2.2. Transcription d’ARNm synthétiques

La réaction de transcription d’ARNm synthétique est réalisée à l’aide du kit mMESSAGE mMACHINE® (Ambion) en utilisant l’ARN polymérase adaptée (T3, T7 ou SP6). Le mélange réactionnel est incubé à 37°C pendant 2 heures. L’ADN plasmidique est ensuite digéré et éliminé par l’ajout de DNAse I et incubation de 15 minutes à 37°C. L’ARNm synthétique est extrait au phénol/chloroforme et est purifié par chromatographie d’exclusion sur billes Sephadex G50 Medium (Amersham Biosciences) équilibrées dans une solution aqueuse de TE (10mM Tris, 1mM EDTA) et 0,1% SDS. L’ARNm synthétique est ensuite précipité à l’éthanol. Le culot est resupendu dans 20µl d’H²O traitée au DEPC et conservé à -80°C. La qualité de l’ARNm est vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose.

2.3. Transcription – traduction couplées in vitro

Les réactions de transcription et traduction couplées in vitro sont réalisées en présence de méthionine [³⁵S] (15µCi/mmol ; Amersham Life Science) à l’aide du kit "TNT SP6 Coupled Transcription-Translation System®" (Promega) en suivant les instructions de la firme. Les produits de réaction sont analysés par électrophorèse sur gel 10% SDS – PAGE. Après migration, le gel est fixé 20 minutes dans une solution aqueuse contenant 10% d’acide acétique et 10% de méthanol. Le gel est séché 1 heure et placé dans une cassette au contact d’un film autoradiographique. Le film est développé après une nuit à température ambiante.

3. Oligos morpholinos antisens

Les morpholinos (Gene Tools) sont des oligomères analogues synthétiques de l’ADN capable de bloquer spécifiquement l’épissage ou la traduction d’un ARNm cible. Afin d’inhiber la traduction, les séquences des morpholinos sont choisies au niveau du site d’initiation de la

VI traduction ou dans la région 5’ non traduite située immédiatement en amont du site d’initiation de la traduction de l’ARNm. Les morpholinos, d’une longueur de 25 résidus, sont resupendus dans de l’H²O à une concentration d’environ 1mM. L’absorbance de 5µl de la solution de morpholinos est lue à 265nm dans 995µl d’une solution 0,1M d’HCl. La concentration de la solution de morpholinos est calculée selon la formule suivante : A265 x 200/

ε

. Où

ε

est l’absorbance d’une mole de morpholinos. Les stocks de morpholinos dilués sont aliquotés et conservés à -80°C. Juste avant l’injection, les morpholinos sont dégelés et incubés 5 minutes à 65°C afin de permettre leur complète mise en solution. Après décongélation, les morpholinos peuvent être gardés à 4°C durant 2 semaines. Les séquences des différents morpholinos utilisés sont reprises dans le tableau 3 présenté en page VI.

Morpholino Espèce Séquence Rangement Origine

Hairy2a MO X.Laevis 5’-ATGGTATCTGCGGGCATGTTCAGTT-3’ MO n°5 Nichane et al., 2008a Hairy2b MO X.Laevis 5'-GGCATGTTCAGATGTTGTATCCGGA-3’ MO n°6 Nichane et al., 2008a Hairy2b MO5mis X.Laevis 5’-GGCTCGTTCATAGTCGTATCCTGA-3’ MO n°7 Nichane et al., 2008a Id3 MO X.Laevis 5'-ACCGCACTGGGCTGATGGCTTTCAT-3' MO n°29 Light et al., 2005 FGF8 MO X.Laevis 5'-GGAGGTGATGTAGTTCATGTTGCTC-3' - Fletcher et al., 2006 Pax3 MO X.Laevis 5'-TCTCAGTTCCCTTGCCAAGTATTAA-3' MO n°69 Monsoro-Burq et al., 2005 Msx1 MO X.Laevis 5'-GCCATACAGAGAGATCCGAGCTGAG-3' MO n°68 Monsoro-Burq et al., 2005 Zic1 MO X.Laevis 5'-AAGTCTTCCAACAATGGGCAGCGAA-3' - Sato et al., 2005 Delta1 MO X.Laevis 5'-CGCTGCTGTCCCATGTTGTCTGATA-3’ MO n°30 Nichane et al., 2008b Stat3 MO X.Laevis 5'-GGTTCCACTGCGCCATTGTGTGGGC-3' MO n°28 Ohkawara et al., 2004 Stat3 MO7mis X.Laevis 5'-GACTCCAATGGGCCTTTGTGTCCGA-3' MO n°49 Nichane et al., 2008b FGFR1a MO X.Laevis 5’-AGGGACCTTCCGGAGAACATCCCAA-3’ MO n°74 Nichane et al., 2009 FGFR1b MO X.Laevis 5’-AGGGACATTCCGGAGAACATCCCAA-3’ MO n°75 Nichane et al., 2009 FGFR4a MO X.Laevis 5'-GATCCAGACATGACTGGTGCGTATG-3’ MO n°72 Nichane et al., 2009 FGFR4b MO X.Laevis 5’-GATCCAGACATGGCTGGCGCGTATG-3’ MO n°73 Nichane et al., 2009 Control MO - 5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3' MO n°17 Gene Tools

Tableau 3. Morpholinos oligonucléotides utlisés pour les expériences de perte de fonction

4. Obtention et manipulation d’embryons

4.1. Obtention des embryons de Xenopus laevis 4.1.1. Induction de la ponte

Les xénopes de l’espèce X. laevis adultes (Nasco) sont élevés dans des aquariums dont l’eau, à une température de 16°C, est renouvelée une fois par jour. L’ovulation est induite par l’injection,

VII dans le sac lymphatique dorsal d’une femelle pigmentée ou albinos d’hCG (hormone gonadotropine chorionique humaine; Sigma). Les femelles X. laevis reçoivent 500U d’hCG la veille du jour désiré de la ponte. La ponte dure de 8 à 16 heures. Au début de la ponte, les femelles X. laevis sont transférées dans la solution de ponte (120mM NaCl, 1mM KCl, 4mM NaHCO³, 1,7mM MgSO⁴, 30mM Tris, 0,3mM Ca(NO³)².4H²O, 0,06mM CaCl².2H²O, pH 7,8 à ajuster avant d’ajouter les sels de Ca). Cette solution à concentration élevée en sels, permet aux oeufs de rester fécondables durant plusieurs heures.

4.1.2. Dissection des testicules

Les mâles sont anesthésiés dans une solution de 0,1% de 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS 222; Sigma) avant d’être décapité. Afin d’isoler les testicules, une incision est pratiquée au niveau de l’abdomen à travers la peau et les muscles de façon à exposer les viscères. Les testicules sont débarrassés des corps adipeux. Les testicules de X. laevis sont récupérés dans 5ml d’une solution de stockage (125mM NaCl, 3,75mM KCl, 1,5mM NaH²PO⁴, 7,5mM HEPES, 1,5mM MgCl².6H²O, 1,5mM CaCl², 5,7mM NaOH, pH 7,8 à ajuster avant d’ajouter les sels de Ca). Dans cette solution, les spermatozoïdes restent en vie plusieurs jours à 4°C.

4.1.3. Fécondation in vitro et culture des embryons

Les oeufs de X. laevis sont récoltés dans la solution de ponte à l’aide d’une pipette et transférés dans une boîte de Pétri. La solution de ponte est éliminée et les oeufs sont fécondés en les incubant 3 minutes dans quelques gouttes de solution de stockage dans laquelle un morceau de testicule a été broyé. Les spermatozoïdes sont activés par la dilution de la solution de stockage de testicule, diminuant ainsi la concentration en sels dans la solution. Pour ce faire, la boîte de Pétri contenant les oeufs est remplie de milieu de 0,1X MBS (Modified Barth Saline ; MBS 10X 88mM NaCl, 1mM KCl, 2,4mM NaHCO³, 0,82mM MgSO⁴.7H²O, 0,33mM Ca(NO³)².4H²O, 0,41mM CaCl².6H²O, pH 7,5 à ajuster avant d’ajouter les sels de Ca et de Mg). La première division cellulaire apparaît 1 heure après la fécondation lorsque les embryons sont maintenus à température ambiante. Les embryons sont cultivés dans du milieu 0,1X MBS et s’y développeront plus ou moins rapidement suivant la température d’incubation (14°C, 18°C ou température ambiante). Les embryons sont récoltés au stade désiré défini selon les tables de Nieuwkoop and Faber (Nieuwkoop and Faber, 1967).

VIII 4.2. Micro-injection

Afin de les débarrasser de leur gangue, les embryons de X. laevis sont traités 8-10 minutes dans une solution 2% de cystéine (Sigma; 2% cystéine dans du MBS 0,1X, pH 8,0). Ils sont ensuite rincés dans du milieu 0,1X MBS et sont placés dans la solution d’injection contenant du Ficoll (Sigma; 1% Ficoll dans du 0,5X MBS). Les micro-injections sont réalisées sous une loupe binoculaire à l’aide d’un micromanipulateur MM3 (Märhauser Wetzlar) et d’un microinjecteur (PicoSpritzer II). Les aiguilles en verre sont obtenues en étirant des capillaires en verre (Harvard Apparatus) à l’aide d’une étireuse P87 (Sutter Instrument). Un volume de 5nl de solutions d’ARNm synthétiques ou de morpholinos est injecté dans les embryons. Les concentrations des ARNm synthétiques utilisées varient de 0,2ng/µl à 200ng/µl, permettant d’injecter respectivement de 1pg à 1ng dans un volume de 5nl. Les stocks de morpholinos à une concentration de 40ng/5nl (environ 1mM) sont dilués de manière à injecter 20 à 5ng de morpholinos dans un volume de 5nl.

Les volumes injectés sont calibrés sous la loupe binoculaire, à l’aide d’un réticule, en ajustant le diamètre de la goutte injectée par variation du temps d’injection. Environ deux heures après l’injection, les embryons de X. laevis sont transférés dans du milieu 0,1X MBS afin qu’ils puissent continuer leur développement.

4.3. Manipulation des embryons et dissection de calottes animales

Afin de sélectionner les embryons albinos vivants de X. laevis et de déterminer leur stade de développement, ceux-ci sont colorés dans une solution contenant un colorant vital bleu : le Nile blue (0,01% Nile blue, 45mM K²HPO⁴, 5mM KH²PO⁴, pH 7,8).

Dans le cas d’injections d’ARNm codant pour des protéines de fusion inductibles aux glucocorticoïdes, de la dexaméthasone (Sigma), un analogue de glucocorticoïde a été ajoutée au milieu de croissance des embryons (0,1X MBS) au stade désiré à une concentration finale de 10µM. Un stock de dexaméthasone est préparé dans de l’éthanol à une concentration de 10mM et est conservé à -20°C.

Les explants de calottes animales sont disséqués au stade blastula tardive (stade 9) et sont cultivés dans du milieu 1x Steinberg (58mM NaCl, 0,67mM KCl, 0,34mM Ca(NO³)², 0,83 MgSO⁴, 3mM HEPES, 100mg/l de sulfate de kanamycine, pH 7,8) contenant 0,1% de BSA. Les embryons sont débarrassés de leurs membranes vitellines à l’aide de forceps et les calottes animales sont disséquées avec un cil collé sur une pipette Pasteur.

IX 4.4. Fixation et révélation de l’activité enzymatique de la β-galactosidase

Les embryons sont placés dans des tubes en verre de 5ml et sont fixés une heure dans du MEMFA (0,1M MOPS, 2mM EGTA, 1mM MgSO⁴, 3,7% formaldéhyde, pH 7,4). Ils sont ensuite transférés dans de l’éthanol et conservés à -20°C. Les embryons injectés avec de l’ARNm codant pour la β-galactosidase sont fixés 40 minutes dans du MEMFA et lavés dans du tampon phosphate (23mM K2HPO4, 77mM KH2PO4, pH 6,3) pendant 15 minutes. Ils ont ensuite incubés à température ambiante dans du tampon de coloration (23mM K²HPO⁴, 77mM K²HPO⁴, 10mM K³Fe(CN)⁶, 10mM K⁴Fe(CN)⁶) contenant 0,15% de X-Gal (5-bromo 4-chloro-3indolyl-β- galactopyranoside ; Bioline) ou 0,15% de Red-Gal (6-chloro 3-indolyl-β-D-galactoside ; Research Organics) faisant apparaître un marquage respectivement bleu ou rouge. Les embryons sont ensuite fixés de nouveau 20 minutes dans du MEMFA et transférés dans de l’éthanol, dans lequel ils sont conservés à -20°C.

5. Hybridations in situ sur embryons entiers

Les expériences d’hybridation in situ sont réalisées sur des embryons entiers selon une méthode de détection non radioactive. Les embryons de xénope, conservés dans de l’éthanol à -20°C, sont progressivement réhydratés à température ambiante. Pour ce faire, ils sont successivement lavés pendant 5 minutes dans des solutions contenant 75% 50% puis 25% d’éthanol dans du PTw et finalement dans du PTw 100% (0,1% Tween-20 dans du 1x PBS). Les embryons sont lavés 3 x 5 minutes dans la solution de PTw. Un traitement de 5-10 minutes dans 2ml de PTw contenant 10mg/ml de protéinase K (Roche) permet de perméabiliser les embryons. Ils sont ensuite incubés 2 x 5 minutes dans une solution de triéthanolamine (0,1M Triéthanolamine, pH 7,5). Après la fin du 2^èmelavage dans la solution de triéthanolamine, la solution est additionnée de 12,5µl d’acide acétique anhydre et les embryons sont incubés 5 minutes dans cette solution sous agitation. Le même volume d’acide acétique anhydre est à nouveau ajouté pour le même temps d’incubation.

Les embryons sont refixés pendant 20 minutes dans une solution contenant 4% de formaldéhyde dans du PTw et sont rincés par 5 lavages de 5 minutes dans du PTw. Ils sont ensuite préhybridés 4 heures à 65°C dans du tampon d’hybridation pour embryons de xénope (SSC 5x pH 7,0, 50%

formamide, 100µg/ml héparine, 1mg/ml torula RNA, 1x Denhart’s, 0,1% Tween-20, 0,1%

CHAPS, 10mM EDTA). Après la préhybridation, les embryons sont incubés dans 1ml de tampon d’hybridation contenant la sonde ARN antisens marquée à la digoxigénine (1µg/ml) pendant une

X nuit à 65°C. La sonde non hybridée est éliminée par 3 lavages de 20 minutes dans du SSC 2x à 65°C puis par traitement à la RNase A (Sigma; 20µg/ml) et RNase T1 (Sigma; 10u/ml) pendant 30 minutes à 37°C. Les embryons sont ensuite lavés 2 x 30 minutes dans du SSC 0,2x. La sonde est détectée à l’aide d’un anticorps dirigé contre la digoxigénine. Pour cela, les embryons sont lavés 2 x 15 minutes à température ambiante dans du tampon MAB (100mM acide maléique, 0,8% NaOH, 150mM NaCl, pH 7,5). Les embryons sont incubés 1 heure à température ambiante dans une solution de MAB contenant 2% de BMB (Boeringher Mannheim Blocking; Roche) et 20% de sérum d’agneau (Invitrogen) et ensuite 4 heures dans la même solution additionnée de l’anticorps anti-digoxigénine couplé à la phosphatase alcaline (Roche) dilué à 1/2000. Les embryons sont lavés dans du tampon MAB 4 x 10 minutes, sous agitation, à température ambiante, ainsi qu’un lavage supplémentaire durant la nuit à 4°C, de manière à éliminer l’excès d’anticorps. Les embryons sont lavés 2 x 5 minutes à température ambiante dans du tampon AP (Alkaline Phosphatase buffer; 100mM Tris-HCl pH 9,5, 50mM MgCl², 100mM NaCl, 0,1%

Tween-20). La réaction chromogénique est réalisée en présence de 4,5 µl de NBT (Roche; Nitro Blue Tetrazolium, 75mg/ml dans une solution aqueuse de diméthylformamide 70% concentrée) et de 3,5µl de BCIP (Roche; 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl Phosphate, 50mg/ml dans du diméthylformamide 100%) pour 1ml de tampon AP. Ces réactifs génèrent un précipité de couleur bleue foncée, après réaction avec la phosphatase alcaline. La réaction est arrêtée par incubation des embryons dans une solution de MEMFA. Le marquage non spécifique est éliminé par plusieurs lavages dans l’éthanol. Les embryons sont ensuite conservés dans du MEMFA.

Pour les doubles hybridations in situ, les deux sondes, l’une marquée à la digoxigénine et l’autre à la fluorescéine sont hybridées simultanément et visualisées séquentiellement à l’aide des anticorps correspondants couplés à la phosphatase alcaline (Roche). La première sonde marquée à la fluorescéine est révélée par une réaction chromogénique à l’aide de BCIP, générant un précipité de couleur turquoise. La réaction est arrêtée par deux lavages de 30 minutes dans du méthanol 100%. Les embryons sont ensuite lavés 5 x 10 minutes dans du tampon MAB et incubés en présence de l’anticorps dirigé contre la digoxigénine comme décrit précédemment.

Après lavage des embryons dans du tampon MAB, la seconde sonde est révélée au NBT et BCIP comme décrit plus haut.

Les images ont été obtenues à l’aide d’une caméra vidéo Sony DXC9100P adaptée sur une loupe binoculaire Leica MZFLIII.

XI

6. Immunohistochimie et test TUNEL sur embryons entiers

6.1. Analyse de la prolifération : Immunohistochimie sur embryons entiers

Afin de visualiser les cellules en cours de prolifération dans des embryons entiers, des expériences d’immunohistochimie ont été réalisées à partir d’embryons injectés avec différents ARNm et/ou morpholinos. La rhodamine dextran (RLDx, Invitrogen), qui est un composé fluorescent émettant dans le rouge (lumière visible), a été utilisée comme traceur au lieu de l’activité de la β-galactosidase, afin de ne pas confondre la coloration X-gal et le marquage de l’immunohistochimie. Après injection, les embryons sont divisés en 2 groupes selon que la partie gauche ou droite de l’embryon est injectée, ils sont ensuite fixés 1 heure dans du MEMFA et sont stockés dans l’ethanol à -20°C. Les embryons sont progressivement réhydratés à température ambiante par des incubations de 5 minutes dans des solutions contenant 75%, 50% et 25%

d’éthanol dans du 1x PBS. Un traitement de 3 minutes dans du 1x PBS contenant 10mg/ml de protéinase K (Roche) permet de perméabiliser les embryons, suivi de 3 lavages de 5 minutes dans du 1x PBS. Ils sont ensuite lavés 2 x 10 minutes dans du PBT (0,5% Triton-X100, 2mg/ml BSA dans du 1x PBS). Afin d’éviter les liaisons aspécifiques d’anticorps, les embryons sont incubés 4 heures à température ambiante, sous agitation, dans une solution de PBT contenant 20% de sérum de chèvre. Les embryons sont ensuite incubés en présence de l’anticorps primaire anti-phospho- Histone 3 (Rabbit anti-pH3, UPSTATE) qui permet de détecter les cellules en phase M (mitose) dilué 1/250, dans du PBT contenant 20% de sérum de chèvre, une nuit à 4°C sous agitation.

L’excès d’anticorps est éliminé par 5 lavages d’une heure à température ambiante et sous agitation dans du PBT. L’anticorps primaire est ensuite détecté par un anticorps secondaire anti- IgG de lapin couplé à la phosphatase alcaline (Goat anti-rabbit IgG-AP, CHEMICON) dilué 1/500, dans du PBT contenant 20% de sérum de chèvre, une nuit à 4°C sous agitation. L’excès d’anticorps secondaire est éliminé par 5 lavages d’une heure à température ambiante et sous agitation dans du PBT. Les embryons sont ensuite lavés 2 x 10 minutes dans du tampon AP. La réaction chromogénique est réalisée en présence de 4,5µl de NBT et de 3,5µl de BCIP pour 1ml de tampon AP. La réaction est arrêtée par incubation des embryons dans une solution de MEMFA durant 20 minutes. Le marquage non spécifique est éliminé par plusieurs lavages dans l’éthanol. Les embryons sont ensuite conservés dans du MEMFA.

XII 6.2. Analyse de l’apoptose : test TUNEL sur embryons entiers

Afin de visualiser les cellules apoptotiques dans des embryons entiers, des expériences de test TUNEL ont été réalisées à partir d’embryons injectés avec différents ARNm et/ou morpholinos.

La rhodamine dextran a été utilisée comme décrit précédemment et les embryons ont été stockés à -20°C dans de l’éthanol après fixation. Les embryons sont progressivement réhydratés à température ambiante par des incubations de 5 minutes dans des solutions contenant 75%, 50% et 25% d’éthanol dans du 1x PBS. Ils sont lavés 2 x 10 minutes dans du 1x PBS. Ensuite, les embryons sont successivement lavés 3 x 5 minutes dans une solution de PTw (0,1% Tween-20 dans du PBS 1x), 1x 15 minutes dans une solution de PTw 0,2% Tween-20 et 1x 30 minutes dans une solution de PTw 0,5% Tween-20 pour perméabiliser les embryons. Après, les embryons sont rincés 3x 10 minutes dans du 1x PBS afin d’éliminer les détergents (Tween-20) qui pourraient inhiber la réaction enzymatique. Ils sont préincubés 1 heure à température ambiante dans du tampon TDT (200µl de 1x PBS + 50µl de tampon 5x TDT, Invitrogen). Après préincubation, les embryons sont soumis à une réaction enzymatique à température ambiante durant la nuit et sous agitation. Pour ce faire, de la digoxigénine-11-dUTP est ajoutée par une terminal désoxynucléotide transférase (TDT, Invitrogen) aux extrémités terminales de l’ADN génomique (2,5µl de TDT + 2µl de dig-11-dUTP + 50µl de tampon 5x TDT + 200µl de 1x PBS par réaction). Les cellules en apoptose ou en nécrose incorporeront une quantité plus importante de dig-11-dUTP en raison de la fragmentation de leur ADN génomique. La réaction enzymatique est bloquée par 2 lavages de 30 minutes dans une solution de 1x PBS + 2mM EDTA à 65°C, suivi de 3x 10 minutes dans du 1x PBS à température ambiante. Les fragments d’ADN génomique marqués avec la digoxigénine-11-dUTP sont détectés à l’aide d’un anticorps dirigé contre la digoxigénine couplé à la phosphatase alcaline. La suite de la procédure est identique au protocole d’hybridation in situ sur embryons entiers.

6.3. Détection de protéines phosphorylées endogènes : Immunohistochimie sur embryons entiers

Afin de visualiser les cellules exprimant de manière endogène la protéine Stat3 phosphorylée dans des embryons entiers, des expériences d’immunohistochimie ont été réalisées à partir d’embryons de stades différents. Les embryons ont d’abord été coupés en deux parties égales pour permettre une meilleure pénétration de l’anticorps. Les embryons sont progressivement

XIII déshydratés à température ambiante par des incubations de 5 minutes dans des solutions contenant 25%, 50% et 75% de DENT’s fix (80% méthanol, 20% DMSO) dans du 1x PBS et sont stockés dans le DENT’s fix à -20°C durant une nuit minimum. Ensuite, les embryons sont progressivement réhydratés à température ambiante par des incubations de 5 minutes dans des solutions contenant 75%, 50% et 25% de DENT’s fix. Ils sont ensuite lavés 3 x 10 minutes dans du TBST (0,1% Tween-20, 50mM Tris pH7,5, 150mM NaCl). Afin d’éviter les liaisons aspécifiques d’anticorps, les embryons sont incubés 4 heures à température ambiante, sous agitation, dans une solution de TBST contenant 5% de BSA. Les embryons sont ensuite incubés en présence de l’anticorps primaire anti-phospho-Tyrosine705-Stat3 (Rabbit anti-pTyr705-Stat3, Cell Signaling) dilué 1/300, dans du TBST contenant 5% de BSA, une nuit à 4°C sous agitation.

L’excès d’anticorps est éliminé par 5 lavages d’une heure à température ambiante et sous agitation dans du TBST contenant 0,2% de BSA. Les embryons sont incubés 2 heures à température ambiante, sous agitation, dans une solution de TBST contenant 5% de BSA.

L’anticorps primaire est ensuite détecté par un anticorps secondaire anti-IgG lapin couplé à la phosphatase alcaline (Goat anti-rabbit IgG-AP, CHEMICON) dilué 1/500, dans du TBST contenant 5% de BSA, une nuit à 4°C sous agitation. L’excès d’anticorps secondaire est éliminé par 5 lavages d’une heure à température ambiante et 1 lavage durant la nuit à 4°C et sous agitation dans du TBST contenant 0,2% de BSA. La réaction chromogénique est réalisée comme pour le protocole d’immunohistochimie décrit ci-dessus. Les embryons sont ensuite conservés dans du MEMFA.

7. Sections d’embryons

Une première couche de gélatine-albumine est coulée dans un moule à partir de 2 ml de solution de gélatine - albumine (4mg/ml gélatine, 0,27g/ml de BSA, 0,18mg/ml sucrose dans du 1x PBS) et de 140 µl de glutaraldéhyde 25%. Le mélange se fait sur glace pour diminuer la vitesse de polymérisation provoquée par la glutaraldéhyde. Ensuite, l'embryon analysé en hybridation in situ et préalablement équilibré dans la solution de gélatine - albumine est déposé sur la couche solidifiée. Une seconde couche est coulée au-dessus de la première. Une fois la solution solidifiée, un cube est découpé dans la gélatine autour de l’embryon et collé sur le support du vibratome (752/M vibroslice tissue cutter, Campden Instruments Limited) selon l’orientation désirée. Les sections réalisées présentent une épaisseur comprise entre 30 et 45µm. Elles sont

XIV montées entre lames et lamelles dans une solution de 90% glycérol dans du 1x PBS et sont conservées à 4°C. Les images ont été obtenues à l’aide d’une caméra vidéo Sony DXC9100P adaptée sur un microscope Zeiss Axioskop 2.

8. Coloration du cartilage au Bleu d’Alcian

Les embryons contrôles ou injectés avec des ARNm ou morpholinos expérimentaux sont récoltés aux stades têtard (42-45) et sont fixés 1 heure dans du MEMFA à température ambiante. Ils sont ensuite déshydratés dans de l’éthanol 100% 5 x 5 minutes avant d’être incubés dans une solution de Bleu d’Alcian (15ml d’acide acétique, 35ml d’éthanol 100%, 20mg de Bleu d’Alcian, Sigma) durant 3 jours sous agitation et à température ambiante. Après, la solution de Bleu d’Alcian est enlevée par 3 lavages de 15 minutes dans de l’éthanol 95%. Les embryons sont progressivement réhydratés à température ambiante dans une solution contenant 2% de KOH. Pour ce faire, ils sont successivement lavés pendant 10 minutes dans des solutions contenant 75% 50% puis 25%

d’éthanol dans la solution de 2% KOH et 3 x dans la solution de 2% KOH. Ensuite, les embryons sont lavés successivement avec des solutions contenant 20%, 40% puis 60% de glycérol dans la solution de 2% KOH durant 1 heure sous agitation. Finalement, les embryons sont lavés avec une solution contenant 80% de glycérol dans la solution de 2% KOH durant une nuit sous agitation.

Les embryons sont ensuite conservés dans du 80% de glycérol/2% KOH à 4°C.

9. Analyse de protéines

9.1. Extraction des protéines totales

Les explants de calottes animales (30 par échantillon analysé) sont lysés 10 minutes sur glace dans 150µl de tampon de lyse (50mM Tris-HCl pH 7,5, 150mM NaCl, 0,5% NP40, 20µM PMSF). Une pastille d’inhibiteurs de protéases (Complete Mini EDTA-free, Roche) est ajoutée pour 10ml de tampon de lyse. Les échantillons sont centrifugés à 14000rpm pendant 5 minutes à 4°C et les surnageants sont récupérés. Un volume de 100µl est prélevé à partir de chaque échantillon, auquel est ajouté 25µl de tampon Laemmli 5x (tampon Laemmli 5x : 0.5M Tris-HCl pH 6.8, 5% β-Mercaptoethanol, 0.1% Bromophenol Blue, 20% Glycerol). Ces échantillons sont conservés à -70°C en prévision de l’analyse par western blot.

XV 9.2. Immunoprécipitations

Afin d’étudier les interactions biochimiques entre protéines, celles-ci ont été produites par surexpression dans des embryons injectés dans chaque blastomère au stade 4 cellules avec leur ARNm correspondant. Les embryons injectés sont récoltés aux stades gastrula et stockés à -70°C.

D’abord, des billes de sépharose couplées à la protéine A (ProteinA Sepharose Fast flow, GE Healthcare) 50% sont préparées. 500µl de ces billes sont prélevées du stock auquel 10ml de tampon de lyse (50mM Tris-HCl pH 7,5, 150mM NaCl, 0,2% NP40, 20µM PMSF) est ajouté afin de laver les billes. Les billes sont centrifugées 2 minutes à 2000rpm et le surnageant est enlevé. L’opération est répétée 2 x et les billes sont ensuite incubées dans du tampon de lyse plus 0,1% BSA durant 1 heure sous agitation à 4°C. Les billes sont de nouveau lavées et centrifugées 3x. Le surnageant est enlevé et 500µl de tampon de lyse est ajouté aux billes de manière à obtenir des billes 50%. 50 embryons par échantillon analysé sont lysés 10 minutes sur glace dans 400µl de tampon de lyse froid plus inhibiteurs de protéases. Les échantillons sont centrifugés à 14000rpm pendant 5 minutes à 4°C, les surnageants sont récupérés et un volume égal (400µl) de 1,1,2-Trichloro-Trifluoroethan (Merck) est ajouté. Les échantillons sont vortexés 1 minute et une nouvelle centrifugation est effectuée à 14000rpm pendant 5 minutes de manière à éliminer les lipides et les débris cellulaires. Les surnageants sont de nouveau récupérés et sont préadsorbés avec 25µl de billes de sépharose couplées à la protéine A durant 1 heure, sous agitation à 4°C.

Les échantillons sont centrifugés à 14000rpm pendant 2 minutes à 4°C, les surnageants sont récupérés et un volume de 30µl est prélevé à partir de chaque échantillon, auquel est ajouté 6µl de tampon Laemmli 5x. Ces échantillons sont conservés à -70°C en prévision de l’analyse par western blot. 1 à 2µl d’anticorps primaire (Anti-Flag, M2, Sigma ; anti-Myc, clone 9E10, Sigma ; anti-HA, clone HA-7, Sigma) sont ajoutés au reste du surnageant. Les échantillons sont mis sous agitation durant 1 heure à 4°C. Après, 30µl de billes sont ajoutées et les échantillons sont de nouveau mis sous agitation, 1 heure à 4°C. Ensuite, les échantillons sont centrifugés 2 minutes à 2000rpm, le surnageant est éliminé et 1ml de tampon de lyse est ajouté pour laver les billes auxquelles l’anticorps et les protéines d’intérêts sont fixés. L’opération est répétée 2 x. Le surnageant est éliminé et 15µl de tampon Laemmli 2x est ajouté. Les échantillons sont conservés à -70°C en prévision de l’analyse par western blot.

XVI 9.3. Western blot

Les échantillons sont bouillis 5 minutes afin de dénaturer les protéines. Les échantillons sont séparés et analysés par électrophorèse sur gel SDS-PAGE dans du tampon de migration (12g de Tris, 57,6g de Glycine, 40ml de SDS 10% , 4 litres d’eau milli Q). Ils sont ensuite transférés sur une membrane PVDF (PolyVinylidine DiFluoride, Biorad), préalablement incubée 2 minutes dans du méthanol 100%, dans du tampon de transfert (23,24g de Tris, 11,6g de Glycine, 20ml de SDS 10%, 3 litres d’eau milli Q, 1 litre de méthanol 100%) 2 heures à 100V à 4°C. Les membranes sont rincées dans du TBST (50mM Tris-HCl pH 7,5, 150mM NaCl, 0,1% Tween-20) et sont incubées, 1 heure à température ambiante sous agitation, dans une solution de saturation (3-5% lait en poudre écrémé dans du TBST). Elles sont ensuite incubées en présence de l’anticorps primaire à la concentration appropriée (Anti-Myc, à 1/10000; Anti-Flag, à 1/1000;

Anti-HA, à 1/1000; Anti-Stat3, clone C-20, Santa Cruz, à 1/1000; Anti-GAPDH, Abcam, à 1/5000; Anti-GFAP, DAKO, à 1/1000) dilué dans du TBST + 3-5% de lait en poudre, pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation. La membrane est ensuite lavée 5 x 5 minutes dans du TBST à température ambiante et incubée avec l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase (Anti-souris, Jackson immunosource, à 1/30000; Anti-lapin (Protéine A-peroxydase), Sigma, à 1/10000) dilué dans du TBST + 3-5% lait en poudre, pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation. La membrane est lavée 5 x 5 minutes dans du TBST à température ambiante. Les protéines sont détectées par chémiluminescence à l’aide du kit ECL™ Western Blotting ou ECL plus™ Western Blotting (GE Healthcare) sur film autoradiographique (Super Rx, Fujimedical).

Après révélation des protéines, les membranes PVDF peuvent être réutilisées 1 à 2 x afin de détecter d’autres protéines sur la même membrane. Pour ce faire, les anticorps primaires et secondaires utilisés lors de la première détection sont éliminés de la membrane sans pour autant affecter les protéines transférées préalablement sur la membrane. La membrane est d’abord lavée 10 minutes dans du TBST et incubée 30 minutes à 55°C dans une solution de stripping (3,8g de Tris, 10g de SDS, 500ml d’eau milli Q, pH 6,7) à laquelle 750µl de β-Mercaptoethanol est ajouté par 50ml de solution de stripping. Ensuite, la membrane est lavée 3 x 10 minutes dans du TBST.

La suite de la procédure est identique à celle décrite ci-dessus à partir de l’étape de saturation (1 heure dans du TBST + 3-5% de lait en poudre) jusqu’à la détection chemiluminescente des protéines.

XVII 9.4. Western blot sur des échantillons contenant des phospho-protéines

Pour la détection de la protéine Stat3 phosphorylée (pTyr705-Stat3), les explants de calottes animales (30 par échantillon analysé) sont lysés 15 minutes sur glace dans 90µl de solution phospho ready (tampon RIPA (0,1% NP40, 20mM Tris-HCl, pH 8, 10% glycérol, 1mM EDTA) plus une pastille d’inhibiteurs de protéases par ml de tampon RIPA auquel on ajoute 900µl de phospho stay solution (Novagen) pour 100µl de tampon RIPA). Les échantillons sont centrifugés à 14000rpm pendant 5 minutes à 4°C et les surnageants sont récupérés. Un volume de 60µl est prélevé à partir de chaque échantillon, auquel est ajouté 15µl de tampon Laemmli 5x. Ces échantillons sont conservés à -70°C en prévision de l’analyse par western blot. La détection des phospho-protéines est identique à la procédure décrite ci-dessus à l’exception que du TBST contenant 3% de BSA au lieu de 3-5% de lait en poudre est utilisé lors des étapes de saturation et d’incubation avec les anticorps primaires et secondaires. L’incubation en présence de l’anticorps primaire (Anti-pTyr705-Stat3, Cell Signaling, à 1/1000) dilué dans du TBST + 3% BSA est réalisée durant la nuit à 4°C sous agitation. Après lavages, la membrane est incubée avec l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase (Protéine A-peroxydase, à 1/10000) dilué dans du TBST + 3% BSA, pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation. La membrane est de nouveau lavée et les protéines sont détectées à l’aide du kit ECL plus™ Western Blotting.

10. PCR quantitatives (qPCR)

Les embryons ont été injectés dans chaque blastomère au stade 4 cellules avec différents ARNm ou morpholinos expérimentaux. Les explants de calottes animales (20 par échantillon analysé) sont disséqués au stade blastula et sont récoltés à l’équivalent des stades neurula ou bourgeon caudal. Les ARN totaux sont extraits en utilisant le kit RNeasy mini (Qiagen). La qualité des ARN totaux est vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose. Ensuite, une PCR est réalisée avec les amorces Histone 4 (H4) afin de vérifier que les ARN totaux ne contiennent pas d’ADN génomique. Après vérification, l’ADN complémentaire (ADNc) est synthétisé avec le kit iScript cDNA synthesis (Biorad). 500ng d’ARN total sont utilisés pour la transcription inverse par reaction. Chaque réaction est diluée 2,5 x pour être utilisée dans la reaction de PCR quantitative (qPCR). La réaction de qPCR a été réalisée en utilisant le kit qPCR core kit for SYBR Green I (Eurogentec) suivant le protocole recommandé par la firme. Brièvement, une courbe d’étalonnage a été réalisée en diluant 4 x un plasmide contenant la séquence d’intérêt (de 10⁷ à 10⁴ copies)

XVIII pour chaque paire d’amorce utilisée. La quantité de fragments PCR amplifiés à partir des ADNc synthétisés provenant des ARNm des gènes d’intérêts produits par la réaction de qPCR a été détectée grâce à un lecteur Gene Amp TM PCR system 9600 (Perkin Elmer Biosystem) et analysés avec le programme Gene Amp 5700 SDS. La valeur obtenue de chaque échantillon a été normalisée avec la valeur de GAPDH, un gène ubiquitaire. Les paires d’amorces utilisées sont reprises dans le tableau 4 présenté en pages XVIII-XIX.

Gène Espèce Séquence des amorces Rangement Origine

BMP4 X.Laevis Fw: 5’-AAGAGGATGAGCTGCACGAT-3’ n°18 Nichane et al., 2008a

Rev: 5’-GCTGCTGAGGTTGAACACAA-3’

Epi. Keratin X.Laevis Fw: 5’-CTCACTTTGCCAGCACTCTG-3’ n°40 Nichane et al., 2008a

Rev: 5’-GTGATAGCAATGGCCTTCGT-3’

ESR6e X.Laevis Fw: 5’-CTGCTTCCAGAAAATGCACA-3’ n°16 Nichane et al., 2008a

Rev: 5'-CAGGGAGGCAAGAATCAGTC-3’

GAPDH X.Laevis Fw: 5’-TAGTTGGCGTGAACCATGAG-3’ n°27 Nichane et al., 2008a

Rev : 5’-GCCAAAGTTGTCGTTGATGA-3’

Hairy2 X.Laevis Fw : 5’-TGACAGTCAAGCACCTACGG-3’ n°17 Nichane et al., 2008a

Rev : 5’-CTGGTCCTCACTTCGGTGTT-3’

Id3 X.Laevis Fw: 5’-AAAGCCATCAGCCCAGTG-3’ n°33 Nichane et al., 2008a

Rev: 5’-AGTGGCAGACGCTGGTGT-3’

N-Tubulin X.Laevis Fw: 5’-CAATACCGAGCCCTGACAGT-3’ Nichane et al., 2008a

Rev: 5’-CTGTGAGGTAGCGTCCATGA-3’

Six1 X.Laevis Fw: 5’-GCGATCACCTCCACAAGAAT-3’ n°64 Nichane et al., 2008a

Rev: 5’-AGTGGTCTCCCCCTCAGTTT-3’

Snail2 X.Laevis Fw: 5’-CACACGTTACCCTGCGTATG-3’ n°15 Nichane et al., 2008a

Rev: 5'-TCTGTCTGCGAATGCTCTGT-3’

Sox3 X.Laevis Fw: 5’-TACCTGTGCTGGATCTGCTG-3’ n°39 Nichane et al., 2008a

Rev: 5’-AGACACTTACGCGCACATGA-3'

Sox9 X.Laevis Fw: 5’-GCAATTTTCAAGGCCCTACA-3’ n°29 Nichane et al., 2008a

Rev: 5’-GCTGCCTACCATTCTCTTGC-3’

Sox10 X.Laevis Fw: 5’-TGCTCACTCCAGTCCAGATG-3’ n°28 Nichane et al., 2008a

Rev: 5’-ACCAATGTCCAGTCGTAGCC-3’

Delta1 X.Laevis Fw: 5’-CAATGTGCACGAGGTTATGG-3’ n°19 Nichane et al., 2008b

Rev: 5’-AGCAATCCATGGGAACTGTC-3’

SoxD X.Laevis Fw: 5’-TATGGGTACCTCCCCTACCC-3’ n°35 Nichane et al., 2008b

Rev: 5’-TCCAGGGTTTGGTACTGGAC-3’

CDK4 X.Laevis Fw: 5’-TGAACCTGTCGCAGAGATTG-3’ n°68 Nichane et al., 2009

Rev: 5’-GACCGTAGAGAGGGGGAGTC-3’

CyclinD1 X.Laevis Fw: 5’-ACCGCAGAGAAACTTTGCAT-3’ n°73 Nichane et al., 2009

Rev: 5’-GCGGATGATCTGCTTGGTAT-3’

HoxB9 X.Laevis Fw: 5’-CTGGGACCCCAACATTACAC-3’ n°74 Nichane et al., 2009

Rev: 5’-TGTTTTGATGAGTCCGGTCA-3’

p27XIC1 X.Laevis Fw: 5’-AAGAAATGATCGCATCC-3’ n°69 Nichane et al., 2009

Rev: 5’-CTCTTCAGCTCCGACCTCAG-3’

XIX

Pax8 X.Laevis Fw: 5’-CTCTCGACCCACCAAGGATA-3’ n°23 Nichane et al., 2009

Rev: 5’-CAGGAAGGTGGGGCTACATA-3’

Sox2 X.Laevis Fw: 5’-TGCGTCCAACAACCAGAATA-3’ n°21 Nichane et al., 2009

Rev: 5’-TTGCTGATCTCCGAGTTGTG-3’

Tableau 4. Amorces utilisées pour les expériences de PCR quantitatives

11. Mesure et mise en évidence de l’activité rapportrice luciférase

Des embryons ont été injectés dans chaque blastomère au stade 4 cellules avec 100pg de plasmide rapporteur pTATA-TK-Luc-4xM67 (Adgene; Besser et al., 1999) contenant 4 sites de liaison au facteur de transcription Stat3 et la séquence codant pour la luciférase firefly ainsi que divers ARNm ou morpholinos expérimentaux. 2pg de plasmide phRL contenant un promoteur ubiquitaire et la séquence codant pour la luciférase rénilla a également été co-injecté pour servir de contrôle de normalisation. Les explants de calottes animales (20 par échantillon analysé) sont disséqués au stade blastula et sont récoltés à l’équivalent du stade gastrula. L’activité des luciférases rénilla et firefly est mesurée en utilisant le kit Dual-luciferase Reporter Assay System (Promega) avec un luminomètre TD-20/20 (Programme DLR, temps d’intégration 10s, temps de délai 2s). Les échantillons sont lysés dans 100µl de tampon PLB (Passive Lysis Buffer) et 20µl du lysat sont prélevés et ajoutés à 100µl de LAR II (Luciférase Assay Reagent II). Les échantillons sont vortexés et l’activité rapportrice de la luciférase firefly est d’abord mesurée.

Ensuite, 100µl de solution Stop & Glo est ajoutée, les échantillons sont vortexés et l’activité rapportrice de la luciférase rénilla est mesurée. Le rapport entre les valeurs obtenues pour la luciférase firefly et la luciférase rénilla (contrôle interne) est calculé par le luminomètre.

12. Microscopie fluo ou confocale

Des explants de calottes animales provenant d’embryons injectés dans chaque blastomere au stade 4 cellules avec des ARNm codant pour des protéines fusions GFP seuls ou avec un ARNm codant pour une RFP membranaire (mRFP) ont été récoltés et fixés 1 heure dans du MEMFA.

Les explants ont ensuite été brièvement lavés dans du PBS 1x et sont incubés 5 minutes dans du PBS 1x contenant du DAPI (1µg/ml, Sigma) avant d’être de nouveau lavé 2 x 5 minutes dans du PBS 1x. Les explants sont montés entre lames et lamelles dans du milieu de montage Vectashield