Annexes
Annexe I : Matériel et Méthodes
Manipulations d’ADN
Les expériences de restriction et de ligation d’ADN, d’extraction phénol/chloroforme, de précipitation, d’électrophorèse sur gel d’agarose et de polyacrylamide, de transformation de bactéries par choc électrique et de PCR (Réaction de Polymérisation en Chaîne) ont été réalisées selon les protocoles décrits dans Molecular Cloning, A Laboratory manual, Maniatis.
Les expériences d’extraction d’ADN à partir de gels d’agarose ont été réalisées en utilisant le Kit DNA Extraction from Agarose (QIAGEN).
Toutes les constructions plasmidiques ont été générées en sous-clonant des fragments d’ADN obtenus par restriction de plasmides ou par amplification PCR à partir de plasmides contenant la séquence d’intérêt.
Tableau récapitulatif des plasmides utilisés :
Noms : Utilisation : Rangement : Origine :
pCSII vecteur de clonage Gen #7 Dave Turner*
pCSII MT vecteur de clonage Gen #8 Dave Turner* pCSII NLS MT vecteur de clonage Gen #9 Dave Turner* pCSII Flag vecteur de clonage Gen #29 Dave Turner* pBluescript KS vecteur de clonage Gen #2 Stratagene
EF1α synthèse sonde RPA RPA #3 (Kintner and Melton, 1987) FGFr synthèse sonde RPA RPA # 15 (Lemaire et al., 1995) XHRT1 synthèse sonde RPA RPA #21 (Pichon et al., 2002)
BOIP synthèse sonde RPA RPA #63 (Van Wayenbergh R. et al., 2003) ESR1 synthèse sonde RPA RPA #68 (Wettstein et al., 1997)
XHRT1 synthèse sonde in situ in situ #48 (Pichon et al., 2002) chordin synthèse sonde in situ in situ #7 (Sasai et al., 1994) Epidermal keratin synthèse sonde in situ in situ #34 (Bellefroid et al., 1998) esr10 synthèse sonde in situ in situ #86 (Li et al., 2003) ESR-4 synthèse sonde in situ in situ #254 (Jen et al., 1999) ESR-5 synthèse sonde in situ in situ #255 (Jen et al., 1999) ESR-6e synthèse sonde in situ in situ #253 (Deblandre et al., 1999) esr9 synthèse sonde in situ in situ #87 (Li et al., 2003)
F-spondin synthèse sonde in situ in situ #65 (ruiz I Altaba et al., 1993)
Hes6 synthèse sonde in situ in situ #244 (Koyano-Nakagawa et al., 2000) Kielin synthèse sonde in situ in situ #64 (Matsui et al., 2000)
N-tubulin synthèse sonde in situ in situ #40 (Chitnis et al., 1995) Sox2 synthèse sonde in situ in situ #50 (Bellefroid et al., 1998) Xbra synthèse sonde in situ in situ #152 (Smith et al., 1991) xCLC-k synthèse sonde in situ in situ #175 (Vize, 2003) X-Delta-1 synthèse sonde in situ in situ #82 (Chitnis et al., 1995)
xEvi1 synthèse sonde in situ in situ #101 (Van Campenhout et al., en révision) Xhairy1 synthèse sonde in situ in situ #113 (Taelman et al., 2004)
Xhairy2b synthèse sonde in situ in situ #112 (Taelman et al., 2004) XHes2 synthèse sonde in situ in situ #320 (Sölter et al., en révision) Xmyt1 synthèse sonde in situ in situ #70 (Bellefroid et al., 1998) X-ngnr-1 synthèse sonde in situ in situ #88 (Ma et al., 1996)
Xnot synthèse sonde in situ in situ #104 (von Dassow G. et al., 1993) xPDZ1 synthèse sonde in situ in situ #237 (Van Campenhout et al., en révision) xSat1 synthèse sonde in situ in situ #189 (Van Campenhout et al., en révision) X-Serrate-1 synthèse sonde in situ in situ #278 (Sato et al., 2000)
X-Serrate-2 synthèse sonde in situ in situ #310 (Taelman et al., en révision) XSMP-30 synthèse sonde in situ in situ #96 (Sato et al., 2000)
xWT1 synthèse sonde in situ in situ #174 (Carroll and Vize, 1996) b-galactosidase synthèse ARNm inj #44 Dave Turner*
Notch ICD synthèse ARNm inj #50 (Wettstein et al., 1997) XSu(H)Ank synthèse ARNm inj #56 (Wettstein et al., 1997) XSu(H)DBM synthèse ARNm inj #54 (Wettstein et al., 1997) noggin synthèse ARNm inj #15 (Wettstein et al., 1997) X-ngnr-1 synthèse ARNm inj #52 (Ma et al., 1996) XSu(H)-Flag synthèse ARNm inj #124 (Wettstein et al., 1997) ESR9-Myc synthèse ARNm inj #57 (Taelman et al., 2004)
XHRT1-O-Myc synthèse ARNm inj #145 (Van Wayenbergh R. et al., 2003) XHRT1-bHO-Myc synthèse ARNm inj #157 (Taelman et al., 2004)
XBOIP-Flag synthèse ARNm inj #146 (Van Wayenbergh R. et al., 2003) XHRT1-Myc synthèse ARNm inj #159 (Taelman et al., 2004)
Xhairy2b-Flag synthèse ARNm inj #132 (Taelman et al., 2004) Xhairy1-Flag synthèse ARNm inj #131 (Taelman et al., 2004)
XBOIP N-ter-Flag synthèse ARNm inj #186 (Van Wayenbergh R. et al., 2003) XBOIP I-Flag synthèse ARNm inj #187 (Van Wayenbergh R. et al., 2003) XBOIP C-ter-Flag synthèse ARNm inj #188 (Van Wayenbergh R. et al., 2003) XHRT1-MT-hGR synthèse ARNm inj #270 (Taelman et al., 2004)
hGR-esr9 synthèse ARNm inj #267 (Sölter M., non publié) hGR-esr10 synthèse ARNm inj #278 (Sölter M., non publié) Xhairy2b-MT-hGR synthèse ARNm inj #282 (Taelman et al., 2004) XHRT1-bH-Myc synthèse ARNm inj #202 (Taelman et al., 2004) XHRT1-Flag synthèse ARNm inj #152 (Taelman et al., 2004) Xesr8-Flag synthèse ARNm inj #222 (Gawantka et al., 1998) Xesr9-Flag synthèse ARNm inj #127 (Li et al., 2003) Xesr10-Flag synthèse ARNm inj #155 (Li et al., 2003)
XHes6r-Flag synthèse ARNm inj #154 (Koyano-Nakagawa et al., 2000) XHes2-Myc synthèse ARNm inj #229 (Sölter et al., en révision) XATH3-Myc synthèse ARNm inj #226 (Perron et al., 1999) XneuroD-Myc synthèse ARNm inj #51 (Lee et al., 1995) XHRT1 synthèse ARNm inj #80 (Taelman et al., 2004) XHRT1-bHO synthèse ARNm inj #141 (Taelman et al., 2004)
XHRT1-bHOI synthèse ARNm inj #140 (Taelman et al., 2004) XHRT1-ΔOYT synthèse ARNm inj #150 (Taelman et al., 2004) XHRT1-bH synthèse ARNm inj #142 (Taelman et al., 2004) XHRT1-DBM synthèse ARNm inj #148 (Taelman et al., 2004) XHRT1-ΔH synthèse ARNm inj #137 (Taelman et al., 2004) XHRT1-ΔY synthèse ARNm inj #149 (Taelman et al., 2004) XHRT1-bHOIY synthèse ARNm inj #139 (Taelman et al., 2004) XHRT1-bH synthèse ARNm inj #142 (Taelman et al., 2004) XHRT1-ΔOI synthèse ARNm inj #151 (Taelman et al., 2004) XHRT1-ΔO synthèse ARNm inj #143 (Taelman et al., 2004) XHRT1/ESR9(OIW)-Myc synthèse ARNm inj #204 (Taelman et al., 2004) ESR9/XHRT1(OIYT)-Myc synthèse ARNm inj #206 (Taelman et al., 2004) XHRT1/ESR9(O)-Myc synthèse ARNm inj #210 (Taelman et al., 2004) ESR9/XHRT1(O)-Myc synthèse ARNm inj #212 (Taelman et al., 2004) ESR9/XHRT1(IYT)-Myc synthèse ARNm inj #233 (Taelman et al., 2004) hGR/Su(H)/Ank synthèse ARNm inj #75 (Chitnis et al., 1995) MT-XHes2-hGR synthèse ARNm inj #375 (Taelman et al., en révision) eGFP synthèse ARNm inj #190 (Bronchain et al., 1999) XHRT1-eGFP synthèse ARNm inj #126 (Taelman et al., en révision) XHRT1-mut-MT-hGR synthèse ARNm inj #307 (Taelman et al., en révision) XHRT1(bHO)-XHes2(IW)-MT synthèse ARNm inj #239 (Taelman et al., en révision) XHRT1(bHO)-XHes2(IW)-MT-hGR synthèse ARNm inj #377 (Taelman et al., en révision) XHes2(bHO)-XHRT1(IYT)-MT synthèse ARNm inj #335 (Taelman et al., en révision) XHes2(bHO)-XHRT1(IYT)-MT-hGR synthèse ARNm inj #379 (Taelman et al., en révision) XHRT1b synthèse ARNm Gen #246 (Taelman et al., en révision) pRL-TK transfection Gen #135 (Taelman et al., 2004) pRL-SV40 transfection Gen #136 (Pichon et al., 2004) (UAS)5-pSV40-Luc+ transfection Gen #55 (Taelman et al., 2004) (XHRT1RE)5-pTK-Luc+ transfection XXX (Pichon et al., 2004)
XBOIP-VP16 transfection XXX (Van Wayenbergh R. et al., 2003) GAL4-XHRT1 transfection Gen #41 (Taelman et al., 2004)
GAL4-XSIP1 transfection Gen #160 (van Grunsven et al., 2003) CtBP-VP16 transfection Gen #155 (van Grunsven et al., 2003) Xhairy1-VP16 transfection Gen #179 (Taelman V., non publié) GAL4 transfection Gen #39 (Taelman et al., 2004) Gal4-XHRT1-O transfection Gen #45 (Taelman et al., 2004) GAL4- XHRT1-H transfection Gen #173 (Taelman et al., 2004) GAL4-XHRT1-OIYT transfection Gen #46 (Taelman et al., 2004) GAL4- XHRT1-OI transfection Gen #66 (Taelman et al., 2004) GAL4-XHRT1-I transfection Gen #61 (Taelman et al., 2004) XHRT1 transfection Gen #38 (Pichon et al., 2004) XHRT1bHOI transfection XXX (Pichon et al., 2004) XHRT1ΔY transfection XXX (Pichon et al., 2004) XHRT1bHO transfection XXX (Pichon et al., 2004) XHRT1ΔO transfection XXX (Pichon et al., 2004) XHRT1ΔH transfection XXX (Pichon et al., 2004) XHRT1/HES1(OIW) transfection XXX (Pichon et al., 2004) XHRT1/HES1(OI) transfection XXX (Pichon et al., 2004)
* (http://sitemaker.med.umich.edu/dlturner.vectors)
Transcription et traduction in vitro
Les plasmides comprenant les séquences à transcrire sont linéarisés par restriction et purifiés avant de pouvoir servir de modèle pour la transcription. Le mélange de restriction contient 20U de l’enzyme de restriction appropriée, 10µl de tampon 10X correspondant à l’enzyme utilisée, 20μg d' ADN plasmidique, et 68µl de ddH2O. La restriction se fait pendant 1 heure à 37°C. La réaction est arrêtée en ajoutant 2µl de protéinase K (25mg/ml) et 5µl de SDS 10%, et en incubant à 37°C pendant 15 min. Après extraction au phénol/chloroforme, l’ADN est précipité à l’éthanol. Après centrifugation, le culot est lavé à l’éthanol 80%, séché à l’air et resuspendu dans 20µl d’H2O DEPC. La concentration finale en ADN linéarisé est de
~1µg/µl.
Les transcriptions in vitro sont réalisées à l’aide d’un kit MEGA Script (Ambion), SP6, T7 ou T3 selon la construction utilisée. Pour les injections, la transcription est réalisée en présence de 7mGpppG (rapport 7mGpppG:GTP de 9:10) qui stabilise l’ARNm. Pour les sondes ARN antisens, la transcription est réalisée soit en présence d’UTPs marqués à la fluorescéine ou à la digoxygénine, soit en présence d’α-32P UTP (800 Ci/mmole). Après transcription, les ARNs sont traités à l’ ADNase pendant 20 min. à 37°C, puis purifiés par centrifugation sur colonne G50 et précipitation à l’éthanol. Le culot d’ARN est resuspendu dans 20µl de ddH20 DEPC de façon à avoir une concentration de ~1µg/µl.
Les réactions de transcription-traduction in vitro ont été réalisées à l’aide d’un lysat de réticulocytes de lapin fournis par le kit TNT SP6 Coupled Transcription-Translation System (Promega) en suivant les instructions de la firme.
Oligos Morpholinos antisens
Un oligo Morpholino antisens (XHRT1-MO) destiné à bloquer la traduction de l'ARNm de XHRT1 endogène, de séquence 5’-TAGTCGTGTCCCCGCTTCATGGCTG-3’
(la séquence complémentaire au codon initiateur est soulignée), et un oligo contrôle standard (cont-MO) ont été synthétisés par la firme Gene Tools LLC. Une recherche dans Genebank pour trouver une séquence complémentaire au morpholino XHRT1-MO a confirmé que seule la séquence correspondant au gène XHRT1 est capable de s’apparier avec plus de 16 bases chez Xenopus Laevis. Les Morpholinos ont été resuspendus dans de l’eau stérile à une
concentration stock de 750mM et ont été microinjectés à une concentration de 15ng par blastomère.
Pour vérifier la spécificité et l’efficacité du morpholino XHRT1-MO, nous avons réalisé plusieurs constructions : une construction contenant la région codante de XHRT1 étiquetée Myc en 3’ ainsi que 18 bases de la région 5’UTR comprenant la séquence cible du morpholino (XHRT1a-MT) ; une construction comprenant la séquence codante de XHRT1 fusionnée en 3’ à la région codante de l’eGFP (XHRT1-eGFP) ; une construction comprenant la séquence codante de XHRT1 mutée au niveau de la région cible du morpholino (5’- ATGAAaaGaGGcCAtGAtTA-3’, le codon initiateur est souligné et les bases mutées apparaissent en caractère minuscule) ; une construction contenant l’ADNc correspondant à l’autre copie du gène XHRT1 (XHRT1b-MT).
Obtention et manipulation d’embryons de xénope
A. Induction de la ponte :
L’ovulation est déclenchée artificiellement par l’injection d’hormone gonadotropine chorionique humaine (hCG) dans le sac lymphatique dorsal d’une femelle Xenope (500 U/femelle). La ponte a lieu 8 à 10 heures après l’induction de l’ovulation et dure environ 8 heures. Lorsque la ponte débute, les femelles sont transférées dans un milieu salin à concentration élevée en sels dans lequel les oeufs restent pendant plusieurs heures fécondables.
Solution de ponte: NaCl 120mM, KCl 1mM, NaHCO3 4mM, MgSO4 1.66mM, Tris 30mM, Ca(NO3)2 4H2O 0.3mM, CaCl2 2H2O 0.4mM.
NB: Avant d’ajouter les sels de Ca, le pH de la solution est amené à 7.8.
B. Isolement des testicules :
Les mâles sont anesthésiés dans une solution de 0.1% 3-aminobenzoic acid ethyl ester (Sigma) pendant 15 min, puis décapités. Pour isoler les testicules, une incision est réalisée au niveau de la peau et des muscles de l’abdomen de façon à exposer les viscères. Les testicules
débarrassés du tissu adipeux sont récupérés et peuvent être conservés à 4°C pendant plusieurs jours.
Solution de stockage des testicules: NaCl 124mM, KCl 3.75mM, Na2HPO4 1.5mM, HEPES 7.5mM, CaCl2 1.5mM, NaOH 5.7mM.
NB: Avant d’ajouter le CaCl2, le pH est ajusté à 7.8.
C. Récolte des oeufs, fertilisation in vitro, et culture des embryons :
Les oeufs dans la solution de ponte sont récoltés à l’aide d’une pipette et transférés dans une boîte de pétri. Lorsque les oeufs sont prêts à être fertilisés, un maximum de solution de ponte est retiré de manière à les concentrer. Ceux-ci sont fertilisés en appliquant directement un morceau de testicule et/ou en les incubant pendant 3 min. dans un volume minimum de solution de testicule dans lequel a été préalablement écrasé un morceau de testicule. Après fertilisation, les oeufs sont cultivés dans du milieu MBS (Modified Barth’s medium) 0.1X. La première division cellulaire apparaît 1 heure après la fécondation lorsque les oeufs sont maintenus à température ambiante. Ceux-ci sont cultivés dans des boîtes de pétri dans du MBS 0.1X et maintenus à 14°C, 18°C ou température ambiante. A partir du stade 40, ceux-ci sont transférés dans de l’eau et maintenus en aquarium.
Milieu MBS 10X: NaCl 88mM, KCl 1mM, NaHCO3 2.4mM, MgSO4 7H2O 0.82mM, Ca(NO3)2 4H2O 0.33mM, CaCl2 6H2O 0.41mM.
NB: Avant d’ajouter les sels de Ca et de Mg, le pH de la solution est amené a 7.5.
D. Microinjection :
Les microinjections sont réalisées sous binoculaire à l’aide d’un micromanipulateur MM3 (Märhauser Wetzlar) et d’un microinjecteur (PicoSpritzer II). Les capillaires en verre (Clark Electromedical Instrument, ref. GC100TF-10) sont étirés à l’aide d’une étireuse horizontale (Sutter Instrument). Le temps d’injection et la pression utilisée sont réglés de manière à injecter un volume de 5-10 nl. La concentration des solutions d’ARN injectées varie entre 0.1µg/µl et 0.2µg/µl.
Avant l’injection, les oeufs sont traités pendant 7 minutes dans une solution de cystéine 2% dans du MBS 0.1% (pH 8.0) afin d’enlever la gangue gélatineuse qui entoure l’embryon. Après traitement à la cystéine, les embryons sont transférés dans du milieu MBS 0.5X + Ficol 1%. Les oeufs sont injectés dans ce milieu au stade deux cellules dans un seul des blastomères au niveau du pôle animal. Environ une heure après l’injection, les embryons sont transférés dans du MBS 0.1X + Ficol 1%, avant d’être placés dans du MBS 0.1X pour continuer leur développement.
E. Manipulation d’embryons :
Les embryons destinés à une hybridation in situ ou à un immunomarquage sont collectés au stade approprié après avoir été coloré au Nile blue (0.01% dans 50 mM tampon phosphate PH7.8) afin de faciliter l’identification de leur stade de développement. Afin de pouvoir observer la région injectée, ceux-ci ont été coinjectés avec de l’ARNm codant pour une forme nucléaire de la β-galactosidase. Après fixation dans du MEMFA (0.1M Mops pH 7.4, 2mM EGTA, 1mM MgSO4) pendant une heure, ceux-ci sont placés dans un tampon phosphate 0,1M pH 6.3 contenant 10mM de K3Fe(CN)6, 10mM de K4Fe(CN)6, et du 5-bromo 4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside 0.15% (X-Gal, Bioline) pour faire apparaître un marquage turquoise ou du 6-Chloro-3-indolyl-β-D-galactoside 0.15% (Red-Gal, Research Organics) pour faire apparaître un marquage rouge. Ensuite, les embryons sont stockés dans de l’éthanol 100% à -20°C.
Nous avons réalisé des constructions codant pour des protéines inductibles en ajoutant à la région codante de la protéine une séquence codant pour le domaine de liaison du récepteur à l’hormone glucocorticoïde humaine (hGR). Les embryons microinjectés avec de l’ARNm codant pour ces protéines sont induits au stade désiré en étant placés dans du milieu de culture MBS 0,1X + 10 μM dexamethasone (analogue à l’hormone glucocorticoïde) (Sigma).
Les explants de calotte animale sont disséqués au stade blastula et cultivés dans du milieu de culture MBS 1X + 0,1% BSA jusqu’au stade désiré.
Hybridations in situ
Les hybridations in situ “whole-mount” ont été réalisées sur des embryons albinos selon la technique décrite par Harland (Harland, 1991) et détaillée dans "Early Development of Xenopus Laevis" (Course Manuel , Cold Spring Harbor , Second Edition , 1994). Selon cette technique, des sondes ARN antisens synthétisées in vitro et marquées à la digoxygénine sont hybridées à des embryons entiers et révélées avec des anticorps anti- digoxygénine couplés à l’enzyme phosphatase alcaline. La révélation des sondes est généralement réalisée dans du tampon AP (100mM Tris pH 9.5, 50mM MgCl2, 100mMNaCl, 0.1% Tween-20) contenant du NBT (Nitro Blue Tetrazolium) 338mg/ml et du BCIP (5-bromo-4-chloro-3- indolylphosphate) 175mg/ml (Roche), ce qui donne un précipité de couleur bleue après réaction avec la phosphatase alcaline. Pour les doubles hybridations in situ, deux sondes, l’une marquée à la digoxygénine et l’autre à la fluorescéine ont été hybridées simultanément et visualisées séquentiellement à l’aide des anticorps correspondants couplés à la phosphatase alcaline. La première sonde marquée à la fluorescéine a été révélée en utilisant le réactif de coloration Fast Red (Sigma) qui donne une coloration rouge. L’inactivation de la phosphatase de la première sonde a été réalisée par incubation dans du Tris 100mM pH 7.5 , NaCl 150mM, 10mM de EDTA à 65°C pendant 30 minutes. La seconde sonde, marquée à la digoxygénine a été révélée au NBT-BCIP. Les expériences d’hybridation in situ sur section on été réalisées telles que décrit par Lemaire et Gurdon, 1994.
Les images ont été obtenues à l’aide d’une camera vidéo Sony DXC9100P adaptée sur un binoculaire Leica MZFLIII.
Sections
Les embryons hybridés en “whole-mount” ont été sectionnés au vibratome (752/M vibroslice tissue cutter, Campden Instruments Limited ). Pour ce faire, ceux-ci ont été transférés dans une solution contenant de la gélatine (4.9 mg/ml), de la BSA (0.3 mg/ml) et du sucrose (0.2 g/ml). Les embryons ont été fixés dans ce milieu après polymérisation de ce dernier lors du rajout de glutaraldéhyde. Des sections de 30 μm d’épaisseur ont été montées sur lamelles.
Les images ont été obtenues à l’aide d’une camera vidéo Sony DXC9100P adaptée sur un microscope Zeiss Axioskop 2.
Culture cellulaire et transfection
Des cellules HeLa ont été cultivées stérilement dans un incubateur à 37°C dans une atmosphère saturée en humidité contenant 5% de CO2. Le milieu de culture utilisé se compose de DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) comprenant 5% de sérum (Fetal Bovine Serum, Invitrogen), 50U/ml de pénicilline (Gibco) et 50U/ml de streptomycine (Gibco).
Lorsque la densité des cellules atteint la confluence, celles-ci sont traitées à la trypsine-EDTA 1X (Invitrogen) pendant 5 minutes à 37°C. Elles sont alors rincées avec du PBS 1X, resuspendues dans du milieu de culture et comptées.
Les transfections ont toutes été réalisées en suivant le même protocole. 2,5.105 cellules sont distribuées dans des boîtes de 35mm de diamètre 24 heures avant la transfection. La quantité totale d’ADN transfecté est amenée à 1,2-1,5μg par ajout de plasmide pBluescript KS+ (Stratagene). On incube l’ADN avec du réactif FuGENE6 (Roche) selon les proportions indiquées par la firme pendant 15 minutes à température ambiante. Le mélange est alors distribué de manière homogène sur les cellules.
PBS 1X : 137mM NaCl, 2.68mM KCl, 100mM Na2HPO4, 1.76mM KH2PO4, pH 7.4
Mise en évidence de l’activité du gène rapporteur luciférase
Des cellules HeLa sont co-transfectées avec 100-500ng de plasmide comprenant la séquence du gène rapporteur luciférase Firefly ((XHRT1RE)5-pTK-luc+, pTK-luc+, (UAS)5- pSV40-luc+, ou pSV40-luc+), 100-200ng de plasmide d’expression de la protéine d’intérêt, et 100ng de plasmide pRL-TK (Promega, codant pour la luciférase Renilla), utilisé comme contrôle interne d’efficacité de transfection. L’activité des luciférases Firefly et Renilla est mesurée 48 heures après la transfection en utilisant le kit Dual-luciferase Reporter Assay System avec un luminomètre TD-20/20.
Immunochimie et immunodétection par Western Blot
Immunomarquage sur embryons :
Après avoir été graduellement réhydratés, les embryons sont lavés 2 fois 5 minutes dans du PBS 1X, 1 fois 10 minutes dans du PBT (PBS 1X + 0.2% Tween20), et 4 heures dans du PBT comprenant 10% de sérum de chèvre. L’anticorps primaire (α-Myc ou α-Flag monoclonaux, Sigma) est alors dilué dans du PBT + 10% Sérum (1 :200-1 :500) et mis en contact avec les embryons toute la nuit à 4°C. Les embryons sont ensuite lavés 5 fois 1 heure dans du PBT et mis en contact toute la nuit à 4°C avec un anticorps secondaire dirigé contre les immunoglobulines de souris (α-souris couplé à la peroxydase, Sigma) dilué dans du PBT + 10% Sérum (1 :500-1 :1000). Les embryons sont finalement lavés 5 fois ½ heure avec du PBT et traités avec une solution contenant du DAB (0,7mg/ml) et de l’H2O2 (2mg/ml) afin de révéler l’activité de la peroxydase.
Immunomarquage sur cellules :
Les cellules HeLa préalablement transfectées sont fixées dans du MEMFA pendant 15 minutes et ensuite traitées avec du PBS 1X + 0,1% Triton pendant 10 minutes. Après 3 lavages de 5 minutes dans du PBS 1X à température ambiante, les cellules sont incubées pendant 30 minutes dans une solution de PBS 1X contenant 5% de sérum de chèvre. Les cellules sont alors lavées 3 fois 5 minutes dans du PBS 1X, et incubées 1 heure avec l’anticorps primaire (α-Myc ou α-Flag) dilué dans du PBS 1X (1 :500-1 :1000). Après 2 lavages de 10 minutes dans du PBS 1X et 1 lavage de 10 minutes dans du PBS 1X + 5% de sérum de chèvre, les cellules sont incubées 1 heure avec un anticorps secondaire dirigé contre les immunoglobulines de souris (α-souris conjugué à la fluorescéine isothiocyanate ou à la rhodamine) dilué dans du PBS 1X (1-5μg/ml). Enfin, les cellules sont lavées 3 fois dans du PBS 1X, 2-3 minutes dans du PBS 1X + Hoechst (0.0005%) afin de révéler les noyaux, et rincés une dernière fois dans du PBS 1X avant d’être montées sous lame et lamelle.
Immunoprécipitations
Pour les études d’interaction entre protéines, des embryons ont été injectés dans chaque blastomère au stade 4 cellules avec 250pg d’ARNm codant pour les protéines d’intérêt. Au stade blastula, des explants de calotte animale sont disséqués et cultivés jusqu’au début de la gastrulation. 20 calottes animales par échantillon sont homogénéisées dans 200μl de tampon de lyse froid (50mM Tris pH7.5, 150mM NaCl, 0.5% NP40) avec de l’inhibiteur de protéase (Complete Mini EDTA-free, Roche). Les lysats sont centrifugés afin d’éliminer les substances insolubles. 20μl de la solution est ajoutée à du tampon dénaturant Laemmli (1X au final) et sera utilisé comme contrôle de présence des protéines étudiées. Le reste du surnageant est préadsorbé en ajoutant 20μl de billes de sepharose couplées à la protein A (50%, Pharmacia) qui ont été préalablement bloquées par une incubation dans du tampon de lyse + BSA (0.1% au final). Les lysats sont alors centrifugés afin d’éliminer les billes.
L’immunoprécipitation est réalisée en ajoutant 1μg d’anticorps primaire (α-Myc ou α-Flag monoclonaux, Sigma) aux surnageants qui sont alors mis sous agitation pendant à 4°C, auxquels on ajoute après 1 heure 20μl de billes 50%. Après 1 heure en présence des billes, les lysats sont centrifugés et les culots sont lavés 3 fois avec du tampon de lyse avant d’être resuspendus dans du tampon Laemmli (1X au final). Les protéines des extraits et des immunoprécipitations sont conservées dans le tampon Laemmli à -20°C jusqu’au moment de l’immunodétection par Western Blot.
Western Blot
Les extraits protéiques resuspendus dans le tampon Laemmli sont mis à 100°C pendant 5 minutes avant d’être déposés et séparés par SDS PAGE (polyacrylamid gel electrophoresis, 10-12.5%). Les extraits sont ensuite transférés sur membrane PVDF (Bio- Rad) pendant 1-2 heures à 100V à 4°C. La membrane est incubée dans du TBST (TBS 1X + 0.1% Tween20) + 3% lait en poudre pendant 1 heure, lavée plusieurs fois dans du TBST, incubée pendant 1 heure avec l’anticorps primaire dilué dans du TBST (1 :10000-1 :20000, α- Myc ou α-Flag monoclonaux, Sigma), lavée plusieurs fois dans du TBST, et incubée pendant 1 heure avec l’anticorps secondaire dirigé contre les immunoglobulines de souris (α-souris couplé à la peroxydase, Sigma) dilué dans du TBST. Après plusieurs lavages dans du TBST,
les protéines sont détectées sur les membranes en utilisant le kit ECL Western Blotting Detection System (Amersham Biosciences).
Protection à l' ARNase
La technique de protection à l' ARNase permet de détecter de manière quantitative la présence d' ARNm spécifiques au sein d’une population d’ARN donnée. L’ARN à tester est mis en présence d’une sonde ARN antisens marquée à l’ α-32P dUTP. Si de l’ARNm complémentaire à la sonde utilisée est présent, celle-ci va s’hybrider. Après traitement à l’ARNase (A et T1), les ARNm non hybridés sont dégradés et le fragment d’ARN antisens protégé est visualisé sur gel d' acrylamide par autoradiographie.
L’extraction d’ARN d’embryons entiers ou d’explants de calotte animale a été réalisée suivant la méthode phénol/NETS (NaCl 0.3M, EDTA 1mM, Tris 50mM pH7.5, SDS 1%) sans traitement à la protéinase K (Sambrook et al., 1989). L’extraction d’ARN à partir de tissu a été réalisée en suivant la méthode d’extraction au thyocyanate de guanidine suivie d’une centrifugation sur coussin de Chlorure de Césium (Sambrook et al., 1989). La technique de protection à l' ARNase a été réalisée tel que décrit par Krieg (Krieg, 1991).
Expérience de retard sur gel (EMSA)
Pour les expériences d’EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays), les protéines étudiées ont été traduites in vitro en utilisant le Kit TNT SP6 Coupled Transcription- Translation System (Promega). La sonde correspondant à la séquence E-Box de classe B
« ggCACGTGcc » a été déterminée comme constituant la séquence cible optimale de la protéine XHRT1 par le Dr. Bruno Pichon (laboratoire du Dr. Daniel Christophe, IRIBHM, ULB). Les oligonucléotides hybridés sont marqués à une extrémité par traitement à l’enzyme Klenow en présence d’α-32P dATP. Les complexes protéine-ADN sont formés par incubation des protéines avec 50 000CPM (+/- 0.1ng) de sonde radioactive pendant 20 minutes à température ambiante. La réaction se fait dans du tampon de liaison 1X au final (10mM Tris pH7.5, 150mM KCl, 1mM DTT, 10% glycerol, 0.1% NP40, 0.2mg/ml BSA, 0.5μg/ml poly(dI-dC)). Les réactions sont déposées sur gel de polyacrylamide 4% et l’électrophorèse est réalisée dans du tampon 0.5X TBE (45mM Tris-Borate, 1mM EDTA, pH 8) pendant 3 heures à 120Volts.
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Annexe II : Publications
En parallèle à mon travail sur la caractérisation du gène XHRT1, j’ai contribué à plusieurs autres travaux du laboratoire. Certains de ces travaux ont été intégrés dans des articles qui sont publiés ou soumis pour publication.
Durant ma première année de thèse, j’ai continué les travaux débutés lors de mon mémoire dont l’objectif était la caractérisation du gène codant pour le facteur de transcription à domaine bHLH XATH2, exprimé spécifiquement dans le télencéphale dorsal. Les résultats obtenus concernant l’étude du gène XATH2 ont été repris dans l’article : « Xath2, a bHLH gene expressed during a late transition stage of neurogenesis in the forebrain of Xenopus embryos » accepté pour publication dans le journal Mechanisms of Development.
D’autre part, j’ai participé à l’étude du gène codant pour le facteur de transcription de type bHLH-O XHes2, exprimé fortement dans la rétine. Dans ce travail, j’ai étudié les propriétés de dimérisation de ce facteur via des expériences de coimmunoprécipitation. Les résultats obtenus ont été inclus dans l’article : « The bHLH-O protein XHes2 inhibits neurogenesis and promotes gliogenesis in Xenopus retina » actuellement soumis pour publication dans le journal Development.
Enfin, j’ai également participé à l’étude du mode d’action du facteur de transcription à doigts à zinc XSIP1 jouant un rôle important dans la formation du tissu neural. Dans un premier temps, nous avons comparé son profil d’expression et ses propriétés d’induction à celui du facteur apparenté XδEF1. Les résultats obtenus ont été repris dans l’article : « δEF1 and SIP1 do not function as antagonists during early Xenopus embryogenesis » actuellement en révision pour le journal Developmental Dynamics. Dans un second temps, nous avons essayé de comprendre comment XSIP1 induit la formation du tissu neural. Nous avons pu montrer qu celui-ci neuralise l’ectoderme en réprimant directement l’expression du gène BMP4 et que le recrutement du corépresseur CtBP joue un rôle essentiel dans son activité de répression. Ces résultats sont actuellement en cours de rédaction pour le journal Developmental Biology.
Gene expression pattern
Xath2, a bHLH gene expressed during a late transition stage of neurogenesis in the forebrain of Xenopus embryos
Vincent Taelmana, Karin Opdecampa, Bernard Avalossea, Kenneth Ryanb, Eric J. Bellefroida,*
aLaboratoire d'Embryologie MoleÂculaire, IBMM, Universite Libre de Bruxelles, Rue des Profs. Jeener et Brachet 12, B-6041 Gosselies, Belgium
bThe Children's Hospital of Philadelphia and the University of Pennsylvania School of Medicine, The Joseph Stokes Jr. Research Institute, Department of Pediatric Cardiology, 3516 Civic Center Blvd., Abramson Research Bldg. Rm. 704D, Philadelphia, PA 19104-4318, USA
Received 13 October 2000; received in revised form 17 November 2000; accepted 17 November 2000
Abstract
We have identi®ed a Xenopus bHLH gene,Xath2, which is the homologue of the murineMATH-2/NEX-1gene, using a functional expression screening approach. Overexpression of this gene in neurula embryos induces the expression of theN-tubulinneuronal marker but does not stimulate the expression of theX-ngnr-1and NeuroDproneural genes. Expression ofXath2begins in stage 32 embryos and is restricted to the dorsal telencephalon. Within the neuroepithelium of the dorsal telencephalon,Xath2expression is detected in postmitotic cells located more laterally than those expressing several other related bHLH neuronal regulators.q2001 Elsevier Science Ireland Ltd. All rights reserved.
Keywords:Xath2; Basic helix±loop±helix gene; Neuronal differentiation; Forebrain;Xenopus laevisembryo
1. Molecular cloning of Xath2
Transcription factors of the basic helix±loop±helix (bHLH) family play a critical role in cell fate decision in a variety of biological systems (Kageyama and Nakanishi, 1997). InXenopus laevis, several gene products related to Drosophilaatonal have been identi®ed, including X-ngnr-1, NeuroD, Xath3 and Xath5. These genes have distinct expression patterns in the developing nervous system and have all been implicated in the determination or differentia- tion of neuronal cells (Lee et al., 1995; Ma et al., 1996;
Takebayashi et al., 1997; Kanekar et al., 1997).
Using a functional expression screening approach, we identi®ed inXenopusa factor that when overexpressed on one side of the embryo, induces the expression of theN- tubulinneuronal marker at a neurula stage (27/32 embryos;
Fig. 1A) but does not stimulate the expression ofX-ngnr-1 (0/42 embryos) orNeuroD(0/65 embryos) (Fig. 1B,C). The original cDNA fragment, which was completed by 50- RACE (GenBank accession number AF306736), contains an open reading frame that encodes a bHLH protein which shows 85% overall amino acid identity to mouse
MATH-2/NEX-1 (BartholomaÈ and Nave, 1994; Shimizu et al., 1995; Schwab et al., 1998, 2000) (Fig 2A). Interest- ingly, theXenopussequence shows also 85% homology to human genomic (GenBank accession number AC006380) and cDNA sequences (EST clone M78507). Within the bHLH domain, the sequences in these three species differ only in two positions. Related members of the bHLH family show less homology in the bHLH domain (e.g. 92% for rat BHF1 andXenopusNeuroD, 87% forXenopusXath3) and exhibit substantial sequence divergence outside of the DNA binding domain (Fig. 2B and data not shown). We therefore refer to the describedXenopusprotein as Xath2.
2.Xath2expression pattern
RNAase protection analysis shows thatXath2expression is ®rst seen in stage 32 tailbud embryos, and it continues to be expressed at least until stage 38. In the adult, strong Xath2 expression is maintained in the brain and a low level of expression is detected in the spinal cord (Fig. 3, top panels). Whole-mount in situ hybridization of tadpole (stage 35) Xenopus embryos shows that the expression is restricted to two symmetric patches in the dorsal telence- phalon. Sections revealed speci®c expression in postmitotic cells located outside the ventricular zone, which has been labeled with BrdU (Fig. 3, bottom panels). A similar expres-
Mechanisms of Development 101 (2001) 199±202
www.elsevier.com/locate/modo
* Corresponding author. Tel.:132-2-650-9732; fax:132-2-650-9770.
E-mail address:ebellef@dbm.ulb.ac.be (E.J. Bellefroid).
sion pattern has been reported for the mouseMATH-2/NEX- 1 gene (BartholomaÈ and Nave, 1994; Shimizu et al., 1995;
Schwab et al., 1998). In double-staining experiments, the expression of Xath2colocalizes with Eomesodermin, a T- box transcription factor encoding gene expressed bilaterally
in the dorsal forebrain from stage 23 onward (Fig. 4A,B;
Ryan et al., 1998). Within the neuroepithelium of the dorsal telencephalon,Xath2transcripts are localized more laterally than those of the other neuronal bHLH genes, Xath3 and NeuroD(Fig. 4C±F).
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Fig. 2. (A) Alignment of the predicted amino acid sequence ofXenopusAth2 to the mouse MATH-2/NEX-1 sequence and to the conceptual translation of a human genomic sequence (database accession number AC006380). Identical amino acids are represented by hyphens, the basic helix±loop±helix domain is boxed. (B) Alignment of the Xath2 bHLH domain with that of other atonal related bHLH proteins. The positions of the basic domain, helix 1, the loop, and helix 2 are shown above the aligned sequences. The percentage of amino acid identity (ID) of Xath2 in comparison with the other sequences is indicated at the Fig. 1. Induction ofN-tubulin, but notX-ngnr-1andNeuroDexpression, by injection ofXath2mRNA.Xenopusembryos were coinjected withXath2andb- galactosidase mRNA (0.5 ng/blastomere) on one side at the two-cell stage. Neural plate stage injected embryos were then stained with X-gal to detectb- galactosidase, followed by whole-mount in situ hybridization with aN-tubulin(A),NeuroD(B) orX-ngnr-1probe (C).
In overexpression experiments, we found that neuro- genin, NeuroD and Xath3 are unable to induce Xath2 expression (data not shown). Further work will be necessary to understand the mechanisms that control Xath2 speci®c expression during Xenopus development.
3. Materials and methods
Expression cloning was performed using a tadpole head cDNA library constructed in the pBluescriptRN3 vector as previously described (Lemaire et al., 1995). Capped synthetic mRNA and antisense mRNA probe were tran- scribed using Megascript kits (Ambion). A full-length cDNA clone was obtained by utilizing the RACE cDNA Ampli®cation kit (Boehringer) on Xenopus adult brain total RNA and subcloned into the pCS21 expression vector. RNAase protection assays were performed as described (Krieg, 1991). AntisenseXath2probe was gener- ated from a cDNA fragment corresponding to nucleotides 1±255 subcloned into a pBluescript vector linearized with EcoRI and transcribed with T3. TheFGFrprobe has been described previously (Ryan et al., 1998). Whole-mount in situ hybridization and vibratome sectioning of stained speci-
mens were performed as described using digoxygenin- or
¯uorescein-labeled antisense probes (Bellefroid et al., 1996). The initialXath2cDNA fragment in pBluescriptRN3 linearized withS®I was used for the synthesis of antisense RNA with T3 polymerase. Probes forEomesodermin(Ryan et al., 1998),NeuroD (Lee et al., 1995) andXath3(Take- bayashi et al., 1997) were synthesized and used as described previously. For BrdU labeling, embryos were injected with 50 nl of a 10 mM BrdU solution. Injected embryos were
®xed 3 h after injection, embedded in paraf®n and sectioned.
Sections were subjected to in situ hybridization as described (Ryan et al., 1996) and then processed for BrdU immuno- detection using the 5-Bromo-deoxy-uridine Labeling and Detection kit1 (Boehringer).
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Fund for Scienti®c Medical Research, the Banque Nationale de Belgique and the International Brachet Stiftung. The expert technical assistance of Sadia Kricha is gratefully acknowl- edged.
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Fig. 3. Expression ofXath2duringXenopusdevelopment. (Top panels) RNAase protection analysis of Xath2 transcripts during embryogenesis and in adult organs. The FGF receptor is used as an internal control. (Bottom panels) Whole-mount in situ hybridization using Xath2 antisense RNA on stage 35 embryos.
(A) Lateral view; (B) dorsal view; (C) parasagittal section; (D) transverse section; (E) horizontal section; (F) double labeling for BrdU incorporation (green) and Xath2 expression (black) on a horizontal section. E, egg.
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Fig. 4. Expression of Xath2 compared with other genes expressed in the dorsal forebrain. (Top panels) Stained double in situ hybridized embryos (st. 35) with Xath2 (black) and Eomesodermin (red) were gelatin-embedded and vibratome-sectioned at 30 mm. (A) Horizontal and (B) parasagittal sections. (Bottom panels) Double in situ hybridization on sections with Xath2 (red) and the bHLH genes Xath3 and NeuroD (black). (C,D) Hori- zontal sections of st. 35 embryos. (E,F) Transverse sections of dissected brains (st. 54) at the level of the telencephalon.
Characterization and function of the bHLH-O protein XHes2:
Insight into the mechanisms controlling retinal cell fate decision
Marion Sölter1, Morgane Locker2, Sébastien Boy2, Vincent Taelman3, Eric J. Bellefroid3, Muriel Perron2, * and Tomas Pieler1, *
1Georg-August-Universität Göttingen, Zentrum Biochemie und Molekulare Zellbiologie, Abteilung Entwicklungsbiochemie, Justus-von-Liebig-Weg 11, 37077 Göttingen, Germany
2Laboratoire Gènes, Développement et Neurogenèse, UMR CNRS 8080, Bâtiment 445, Université Paris XI, 91405 Orsay, France
3Laboratoire d’Embryologie Moléculaire, Université Libre de Bruxelles, Institut de Biologie et de Médecine Moléculaires (IBMM), rue des Profs. Jeener et Brachet 12, 6041 Gosselies, Belgium
*Authors for correspondence (e-mail: tpieler@gwdg.de, muriel.perron@ibaic.u-psud.fr)
Key words: bHLH, Hes2, Gliogenesis, Neurogenesis, Retina, Cell cycle, Xenopus
Short title: Control of retinal cell fate by XHes2
Total word count: 7573
SUMMARY
Neurons and glial cells differentiate from common multipotent precursors in the vertebrate retina. We have identified a novel member of the hairy/Enhancer of split [E(spl)]
gene family in Xenopus, XHes2, as a regulator to bias retinal precursor cells towards a glial fate. XHes2 expression is predominantly restricted to sensory organ territories, including the retina. Using in vivo lipofection in the optic vesicle, we found that XHes2 overexpression dramatically increases gliogenesis at the expense of neurogenesis. The timing of Müller cell generation is affected but does not result from XHes2-dependent perturbation of precursor proliferation. These data suggest that XHes2 deviates early born cell types, that would normally have given rise to neurons, towards a glial fate. Conversely, a significant inhibition of glial differentiation is observed upon XHes2 loss of function. Our results indicate that XHes2 gliogenic activity relies on its ability to inhibit neuronal differentiation by at least two distinct mechanisms. Indeed, XHes2 not only negatively regulates X-Ngnr-1 and NeuroD transcription, but also physically interacts with a subset of proneural bHLH proteins.
INTRODUCTION
The retina has been extensively used as a model system to investigate the molecular mechanisms governing cell fate decisions, as it contains only six types of neurons and one type of glia (Müller glia), properly organized in three nuclear layers. From numerous studies in a variety of organisms, a common model has emerged, where bHLH activators, in combination with homeodomain factors, are responsible for neuronal subtype specification (Wang and Harris, 2005; reviewed in Hatakeyama and Kageyama, 2004). On the other hand, mechanisms allowing the generation of glial versus neuronal cells, remain to be defined in detail.
Retinal Müller glial cells and neurons differentiate from a common, multipotent precursor (Turner and Cepko, 1987; Wetts and Fraser, 1988). Gliogenic activities of Notch signaling have been reported in this context (reviewed in Perron and Harris, 2000; Pujic and Malicki, 2004). Activation of Notch signaling indeed promotes Müller glia differentiation (Bao and Cepko, 1997; Furukawa et al., 2000; Hojo et al., 2000; Scheer et al., 2001).
Conversely, blocking Notch activity forces progenitors to differentiate prematurely, leading to a decrease in late cell types, including Müller glial cells (Austin et al., 1995; Dorsky et al., 1997; Silva et al., 2003). More recently, an instructive role of the Notch pathway in gliogenesis has been proposed, since the inhibition of both Notch and Delta function in the zebrafish retina prevents Müller glia cells to differentiate (Bernardos et al., 2005).
In mammals, it has also been shown that Notch effectors, like Hes1 and Hes5, promote gliogenesis at the expense of the neuronal fate in the retina (Furukawa et al., 2000; Hojo et al., 2000; Kageyama and Nakanishi, 1997). Conversely, interfering with Hes1 function reduces the number of Müller glial cells (Furukawa et al., 2000; Takatsuka et al., 2004). Hes genes are vertebrate homologs of Drosophila hairy and Enhancer of split [E(spl)] genes, which encode basic helix-loop-helix (bHLH) transcriptional repressors that negatively regulate neuronal
bHLH genes (Akazawa et al., 1992; Chen et al., 1997; Ishibashi et al., 1995; Sasai et al., 1992; Tomita et al., 1996). Gliogenic properties of Hes proteins could result from this anti- neuronal activity. Interestingly, however, some Hes related proteins behave differently in the retina. For instance, while Hes1, Hes5 and Hesr2 bias retinal precursors towards gliogenesis, Hesr1 or Hesr3 do not (Furukawa et al., 2000; Hojo et al., 2000; Satow et al., 2001). The Hes6 protein even promotes neurogenesis (Bae et al., 2000). The reason for these differences and the functional relevance for each Hes related protein in gliogenesis remains to be investigated.
There is accumulating evidences that cell fate determination is also linked to cell proliferation. The timing of cell cycle exit may influence cell fate choice during retinogenesis, since, according to the “competence model”, precursors change their competence over time (Livesey and Cepko, 2001). A gliogenic phenotype could thus be related to defects in cell cycle exit. Indeed, a dramatic increase in Müller cells has been observed in retinas overexpressing cyclin-dependent kinase inhibitors, such as p27Xic1, p16Xic2 and p17Xic3 (Daniels et al., 2004; Ohnuma et al., 1999). Similarly, the orphan nuclear receptor Tlx appears to control the proper generation of Müller glial cells in mice, through the modulation of the cell cycle related activities of cyclin D1 and p27Kip1 (Miyawaki et al., 2004). In addition to the gliogenic phenotype described above, constitutive activation of the Notch pathway leads to an accelerated cell cycle exit of Müller precursor cells in the Xenopus retina (Ohnuma et al., 2002a).
To gain further insight into the mechanisms controlling neuronal versus glial fate choice, we aimed at identifying novel gliogenic genes in the Xenopus retina. We report herein the characterization of one of these, encoding the bHLH-O type protein XHes2. XHes2 is mainly expressed in groups of cells giving rise to sensory organs, including the retina. We show that XHes2 forces gliogenesis by repressing neurogenesis rather than by affecting precursor proliferation. Our data suggest that XHes2 may function both by inhibition of
proneural gene transcription and through its interaction with a subset of bHLH proteins, including NeuroD.
MATERIALS AND METHODS
XHes2 cDNA isolation
Based on five XHairy1-related, partially overlapping EST sequences from Xenopus laevis (GenBank accession numbers: AW639943, AW642120, AW643378, AW644752, BI350304), primers were designed to amplify the complete open reading frame (ORF) of XHes2: 5’-ACC ATG GCT CCC AAT GTA GCG CTC G-3’, forward primer ; 5’-TCA CCA CGG CCT CCA GAT GGA GCT G-3’, reverse primer. XHes2 positive fractions of an oocyte lZap cDNA library (Claussen and Pieler, 2004) were selected for further screening performed with the ECL Labelling and detection system (Amersham), following the manufacturer’s protocol. The sequence of the longest obtained XHes2 cDNA consists of 1075 nucleotides including 5‘- and 3‘- untranslated regions, as well as a poly(A) tail (GenBank accession number: DQ156231) and differs from the above database EST sequences (meanwhile available as the TIGR contig TC209580) in nine nucleotide positions.
Expression constructs
pCS2+XHes2, pCS2+XHes2-DW and pCS2+XHes2-DC , respectively, encode the wild-type XHes2 protein, a shortened XHes2 protein devoid of the WRPW motif, and a C-terminal truncated XHes2 variant missing the WRPW motif and fifty-one additional amino acids, but still containing the Orange domain. These constructs were generated by cloning the PCR products amplified from pBK-CMV XHes2 into the pCS2+ vector (Turner and Weintraub, 1994), using the following primers: 5’-CAG AAT TCT ACC ATG GCT CCC AAT GTA GCG-3’, common XHes2 forward primer; 5’-TGT ACT CGA GTC ACC ACG GCC TCC AGA TGG-3’, XHes2 reverse primer; 5’-TGT ACT CGA GGA TGG AGC TGT TGA GCT GCG-3’, XHes2-DW reverse primer and 5’-TGT ACT CGA GCT CAG GGC TCC TCT GCA GGT-3’, XHes2-DC reverse primer. pCS2+XHes2-DW-VP16 and pCS2+XHes2-DC-
VP16 encode XHes2 variants where the WRPW motif or the carboxylterminal part was replaced by the VP16 transactivation domain (Sadowski et al., 1988). pCS2+XHes2-DBM encodes a DNA-binding mutant of XHes2, in which the basic amino acids 37EKRRRARIN45 within the basic domain were replaced by the acidic amino acids 37KEEEEAEID45 , according to the DNA-binding mutant of ESR6e (Deblandre et al., 1999), and was generated by mutagenesis of pCS2+XHes2 using the QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), the sense primer 5’-TAA AGC CCC TGA TGA AAG AAG AAG AGG AGG CGG AAA TCG ACG AGA GTC TGA AC-3’ and its corresponding antisense primer. To ensure proper nuclear localization of XHes2-DBM, pCS2+NLS-XHes2-DBM was constructed by inserting XHes2-DBM into pCS2+NLS.Finally, pCS2+Flag-XHes2 and pCS2+MT-XHes2 , encoding amino-terminal Flag and myc tagged versions of XHes2, were engineered by subcloning XHes2 ORF from pCS2+XHes2 into pCS2+Flag and pCS2+MT (Turner and Weintraub, 1994). All other expression constructs used in this study have been previously described: nLacZ (Chitnis et al., 1995), NogginD5’ (Smith and Harland, 1992), Notch ICD (Chitnis et al., 1995), MT-X-Ngnr-1 (Ma et al., 1998), MT-NeuroD (Lee et al., 1995), MT-Xath3, Flag-Xhairy1, Flag-Xhairy2b, Flag-ESR9, and Flag-XHes6r (Taelman et al., 2004) and MT-Xath5 (Kanekar et al., 1997).
In situ hybridization!
Digoxigenin (DIG)-labelled antisense RNA probes for in situ hybridization were generated according to the manufacturer instructions (Roche). XHes2 riboprobe was transcribed with T7 RNA polymerase from the EcoRI linearized pBK-CMV-XHes2 vector. All other probes used have been already described: NeuroD (Lee et al., 1995), N-tubulin (Oschwald et al., 1991), Pax2 (Heller and Brandli, 1997), Xhox11L2 (Patterson and Krieg, 1999), Xlim3 (Taira et al., 1993) and X-Ngnr-1 (Ma et al., 1998). Whole-mount in situ hybridization analysis was performed as described in (Hollemann et al., 1999) except for expression on retinal cross-
