Conclusions
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Perspectives
Conclusions et perspectives
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Au cours de cette thèse, diverses stratégies ont été élaborées pour tester la validité du modèle décrit par Vanhamme et al. (Vanhamme et al., 2000). Pour rappel, les transcrits Pol I issus de l’ES actif subissent une maturation de type Pol II impliquant un contact physique et/ou fonctionnel entre la machinerie Pol I et Pol II. Le modèle postule que l’association d’une machinerie d’élongation/maturation de l’ARN de type Pol II avec le complexe Pol I du trypanosome existerait uniquement au niveau de l’ES actif (dans l’ES body) et donc constituerait l’élément clé de la variation antigénique.
4 stratégies ont été envisagées : nous avons poussé dans ses derniers retranchements la technique utilisée auparavant (1) ; nous avons analysé quelques caractéristiques de la chromatine connues pour être impliquées dans la régulation transcriptionnelle dans d’autres systèmes (2, 3) ; nous avons recherché les composants moléculaires pouvant être impliqués dans la régulation soit par analogie avec d’autres systèmes soit de proche en proche en s’insinuant dans le système de notre parasite (4, 5).
1) Nous avons comparé la maturation des transcrits selon qu’ils provenaient d’un ES actif ou d’un ES inactif. Les résultats obtenus n’ont pas permis de mettre sur pied un modèle explicatif. Cependant, ils ont appuyé l’idée que les transcrits ayant subi une maturation correcte provenaient préférentiellement de l’ES actif. Nous pouvons ajouter à cela qu’il semblerait que l’ajout du SL RNA soit crucial pour l’activité de l’ES. Il reste maintenant à identifier le ou les facteurs appartenant à cette « RNA factory », ne permettant cette maturation qu’au niveau de l’ES actif. C’est la caractérisation du complexe Pol I du trypanosome qui devrait nous permettre d’atteindre ce but.
2) Nous nous sommes intéressés à la chromatine des ESs. Nous voulions dans un premier temps comparer le taux d’acétylation de l’histone H4 entre un ES actif et un ES inactif. Cette analyse nous a paru intéressante vu la corrélation existant entre l’acétylation des histones et l’activité transcriptionnelle dans d’autres systèmes.
Cependant, l’analyse par IP de chromatine de ce taux d’acétylation pour l’ES actif s’est révélée impossible en raison de la sensibilité élevée de l’ES actif au traitement à la nucléase de microcoque. Néanmoins, lors de ces expériences nous avons constaté une différence d’acétylation des unités de transcription Pol II par rapport aux unités de transcription Pol I. Un enrichissement élevé en ADN immunoprécipité par les anticorps dirigés contre Tb-H4-Ac a été uniquement observé au niveau d’unités de transcription Pol I. Etant donné que seules les unités de transcription Pol I semblent être régulées au niveau transcriptionnel, ce résultat nous a paru très intéressant. L’acétylation de l’histone H4 pourrait donc être impliquée dans la régulation de la transcription des unités Pol I chez le trypanosome.
Nous avons envisagé de confirmer ces résultats au niveau cellulaire par colocalisation, en combinant FISH et IF, sur fibre de chromatine étirée. Des résultats n’ont été obtenus que sur faisceaux de fibres de chromatine. Pour pallier ce manque de sensibilité, une purification des anticorps dirigés contre l’histone H4 du trypanosome a été entreprise. Il est donc envisagé de reproduire ces expériences en utilisant les sérums purifiés. Nous pourrons également augmenter la sensibilité en amplifiant le signal obtenu en IF.
3) Dans le cadre de l’analyse de la chromatine des ESs, nous avons également étudié la possibilité d’un attachement différentiel à la matrice nucléaire des ESs en fonction de leur activité. Il s’avère qu’un attachement différentiel à la matrice nucléaire est également associé à l’activité transcriptionnelle dans d’autres systèmes.
Une technique d’isolement de complexes ADN-matrice nucléaire a permis d’obtenir des résultats préliminaires intéressants. A l’issu de l’isolement, l’ADN issu d’une fraction culot (matrice) et d’une fraction surnageant a été récolté. Des réactions PCR réalisées sur cet ADN ont semblé indiquer que l’ES actif était préférentiellement localisé dans la fraction matrice. En d’autres termes, pour être actif l’ES devait être associé à la matrice nucléaire. Aucune localisation préférentielle n’a cependant été observée concernant les unités de transcription Pol II et ribosomiques. Afin de quantifier et confirmer ces résultats, nous avons envisagé de réaliser des Southern blots. Cela a malheureusement été rendu difficile par le faible rendement et le manque de reproductibilité de la méthode. Afin d’améliorer la méthode, on pourrait dans un premier temps marquer l’ADN au tritium pour le suivre au cours de l’expérience et ainsi pointer l’étape ou les étapes favorisant la perte de l’ADN. La PCR quantitative constitue une alternative qui pourrait être envisagée.
4) En vue de rechercher les composants moléculaires intervenant dans l’élongation de la transcription des ESs, une première démarche a été de caractériser un facteur particulier nommé TFIIS. Ce facteur général de l’élongation de la transcription de la Pol II permet à cette dernière de redémarrer la transcription lorsqu’elle est bloquée par un site de pause. Ce facteur nous a semblé être un candidat de choix dans la régulation de l’expression du VSG d’autant plus qu’il a été impliqué dans la maturation et le clivage des transcrits ribosomiques chez la souris (Schnapp et al., 1996).
Nous avons identifié deux candidats TFIIS chez T. brucei, cas unique chez les invertébrés. Les facteurs TFIIS disposent d’un domaine C-terminal très conservé qui est également conservé chez TbTFIIS1 et TbTFIIS2. Par contre le domaine N-terminal peu conservé est pratiquement inexistant chez TbTFIIS1 et comprend un domaine supplémentaire appelé PWWP chez TbTFIIS2. Ce domaine PWWP semble être essentiel pour le ciblage de la chromatine par deux ADN
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méthyltransférases (Ge et al., 2004). De plus, il a été identifié chez d’autres protéines impliquées dans divers procédés en rapport avec la chromatine comme la réparation de l’ADN, la modification des histones ou l’activation transcriptionnelle (Ge et al., 2004). Des homologues des deux candidats TFIIS ont été également identifiés chez les kinétoplastidés que sont T. cruzi et L. major. Les gènes de TbTFIIS1 et TbTFIIS2 existent en une copie dans le génome de T. brucei et leur transcription est équivalente dans les formes procyclique et sanguicole.
TbTFIIS1 et TbTFIIS2 ont fait l’objet d’invalidations individuelles par RNAi dans des cellules au stade sanguicole ainsi qu’au stade procyclique. Un phénotype particulier de croissance suite à l’induction du RNAi n’a été observé dans aucun des cas. Nous en avons déduit qu’individuellement aussi bien TbTFIIS1 que TbTFIIS2 n’étaient pas essentiels au trypanosome. L’effet de l’invalidation de ces gènes sur la transcription de diverses unités de transcription (ES (VSG et ESAG7), procycline et TbH2B) a été analysé en Northern blot. Aucun effet significatif n’a été observé.
Dans l’idée qu’un facteur TFIIS puisse complémenter l’invalidation de l’autre facteur, il a été nécessaire d’invalider les deux gènes en même temps dans la même lignée de trypanosomes. Lors des premières courbes de croissance réalisées, un ralentissement de la croissance a été observé chez différents clones. Nous avons ensuite voulu tester sur ces mutants conditionnels l’effet de toxines (acide mycophénolique et 6-azauracile) provoquant la réduction de la concentration en nucléotides et pour lesquelles les mutants TFIIS-∆ de levure présentent une sensibilité. Aucune sensibilité n’a été constatée mais l’effet de la simple induction du RNAi sur la croissance était beaucoup moindre. Suspectant la perte de cellules dotées de la construction menant au RNAi suite à la décongélation, nous envisageons de reproduire les transfections et dans la foulée les diverses expériences sur le double mutant conditionnel. Nous testerons la sensibilité aux toxines et l’impact sur la transcription de l’ES.
L’impact de l’invalidation des deux gènes in vivo, sur la progression de la parasitémie, fera également partie de nos plans. Le RNAi in vivo a été mis au point au laboratoire et les mutants TbTFIIS1 se sont développés tout à fait normalement.
Enfin, la localisation des deux facteurs en IF par l’intermédiaire d’un « tag » fait aussi l’objet de travaux actuellement (Pierrick Uzureau, post-doctorant au laboratoire).
5) La seconde démarche visant à étudier les composants moléculaires intervenant dans l’élongation de la transcription des ESs, a été de caractériser le complexe Pol I de T. brucei. Pour ce faire, nous avons « taggé » la sous-unité TbRPA12 homologue à Rpa12p spécifique du complexe Pol I chez la levure. TbRPA12
est codée par un gène unique dont le niveau de transcription est équivalent en PF et en BF. L’invalidation de TbRPA12 par RNAi en PF et en BF n’a pas donné lieu à un phénotype de croissance particulier. TbRPA12 a donc été considéré comme non essentiel à T. brucei.
TbRPA12 a été fusionné en C-terminal avec le « TAP tag » (Rigaut et al., 1999;
Puig et al., 2001), permettant d’entreprendre deux purifications d’affinité successives.
De cette manière un ensemble de protéines associées à TbRPA12 ont été purifiées. Parmi ces protéines, 4 sous-unités du complexe Pol I en plus de TbRPA12 ont été identifiées : TbRPA1 et TbRPA2 (déjà caractérisées (Smith et al., 1989a;
Schimanski et al., 2003)) ainsi que TbRPC40 et TbRPB5. Dans l’extrait de purification ont également été identifiées : une protéine de 30 kDa (Tbp30) de fonction inconnue ainsi que les histones H2A et H3. Tbp30 n’a pas semblé être en rapport stoechiométrique avec TbRPA12 et les autres sous-unités identifiées, suggérant sa présence dans une sous fraction de complexes Pol I. Des triplets KKE sont présents dans la région C-terminale de Tbp30 alors que des répétitions de type KKD/E impliquées dans des interactions protéine-protéine sont spécifiques de snoRNPs (small nucleolar RiboNucleoProteins) (Gautier et al., 1997). Il serait intéressant d’étudier la possibilité d’interaction de Tbp30 avec des protéines nucléolaires.
L’ensemble de ces protéines est présent dans les PF et dans les formes
« slender » et « stumpy » des BF. De plus, des protéines spécifiques de stade ont été repérées et nécessitent d’être identifiées afin d’évaluer le rôle qu’elles pourraient jouer dans la variation antigénique. Nous devrons pour ce faire les produire en plus grande quantité.
D’après le modèle tridimensionnel de la Pol II de levure élaboré par Cramer (Cramer et al., 2000; Cramer et al., 2001), les sous-unités que nous avons identifiées interagissent entre elles mais également avec d’autres sous-unités. Des gènes codant pour des homologues possibles d’autres sous-unités du complexe existent dans le génome du trypanosome (Table 2). L’absence de ces sous-unités pourrait rendre compte du manque d’activité transcriptionnelle de nos extraits in vitro. Cependant, chez la levure ces dernières sont toutes partagées entre les trois polymérases. Chez T.
brucei, étant donné le rôle particulier de la Pol I à savoir transcrire des gènes codant pour des protéines, il est possible que ces sous-unités n’appartiennent pas au complexe Pol I. Pour explorer cette possibilité, nous devrons mettre au point le protocole de purification en utilisant par exemple des agents « crosslinkant » et/ou une matrice d’affinité alternative et ainsi purifier le plus grand nombre d’éléments du complexe.
Certaines sous-unités qui chez la levure sont codées par un seul gène, sont codées par deux gènes différents chez le trypanosome (Table 2). TbRPB5
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fait partie de ces sous-unités mais une seule des deux sous-unités a été identifiée dans l’extrait de protéines associées à TbRPA12. Nous avons donc pensé que Tb1RPB5 pouvait être spécifique à la Pol I chez le trypanosome, d’autant plus que seule Tb2RPB5 semble être associée au complexe Pol II (Sara Devaux, doctorante au laboratoire). La comparaison des éléments associés à Tb1RPB5 et Tb2RPB5 constitue donc une priorité. Ces éléments pourraient intervenir dans l’activité transcriptionnelle étant donné que chez d’autres eucaryotes RPB5 interagit avec TFIIB, HBx et TAFII68 (Lin et al., 1997; Miyao et Woychik, 1998). Cela pourra être envisagé par « TAP tag » voire par double hybride. De plus, chez la levure, un acide aminé valine s’est révélé être essentiel au rôle joué par RPB5 dans l’activité transcriptionnelle (Miyao et Woychik, 1998). Cet acide aminé est conservé chez les deux sous-unités RPB5 du trypanosome. La mutation de ce résidu chez Tb1RPB5 ou Tb2RPB5 fait partie des perspectives.
Tout comme chez la levure, le complexe Pol I du trypanosome pourrait contenir des sous-unités spécifiques. Tbp30 ainsi que la protéine de 55 kDa mise en évidence par Schimanski et al. (Schimanski, 2003) pourraient en faire partie. Tbp30 ne semble faire partie que d’une sous fraction des complexes Pol I, et pourrait donc être impliquée dans une fonction spécialisée du complexe. L’analyse d’éléments associés à Tbp30, comme déjà suggéré, devrait éclaircir la question.
Les extraits ont également servi à immuniser des souris dans le but de produire des anticorps monoclonaux contre des épitopes de ce complexe, outils d’une valeur inestimable pour le laboratoire. Un criblage sera réalisé en IF. A l’aide de ces anticorps, nous espérons pouvoir localiser le complexe non seulement au niveau de l’ES body (Navarro and Gull, 2001) mais également au niveau des ESs inactifs. Un anticorps monoclonal dirigé contre Tbp30 permettrait de confirmer sa possible présence dans une sous fraction des complexes Pol I. Un anticorps anti-Tb1RPB5 en comparaison avec un anticorps anti-Tb2RPB5 aiderait à localiser ces sous-unités parmi les complexes Pol II, Pol I ribosomiques et Pol I transcrivant les ESs. Une étude fonctionnelle du complexe à partir d’un système de transcription in vitro (Laufer et al., 1999) pourra également être envisagée à l’aide de ces anticorps. Enfin, ces anticorps seront également utilisés afin de déterminer si tel ou tel facteur de transcription interagit avec la Pol I.
Finalement, nous avons montré in vitro et in vivo que TbRPA1 était phosphorylée. De plus, la présence d’une activité kinase dans notre extrait a été démontrée. Il s’agit maintenant d’analyser le rôle joué par la phosphorylation de TbRPA1. Pour ce faire, nous planifions de définir les acides aminés phosphorylés par spectrométrie de masse et d’identifier la kinase impliquée. Les peptides ciblés connus pourront être utilisés comme proie pour purifier la kinase par affinité. En se référant à
la littérature, il pourrait s’agir de la CKII. Des tests de sensibilité spécifiques peuvent être entrepris afin de s’en assurer.
Dans le futur, la voie privilégiée sera de rendre plus performantes les purifications des complexes Pol I et Pol II afin de disposer de complexes fonctionnels et d’atteindre la « RNA factory ». Cela pourra être envisagé par l’addition d’agents
« crosslinkant » ou par l’intermédiaire d’autres méthodes de purification. D’autres sous-unités pourront être « taggées » et du « crosslinking » sur des unités de transcription pourra être envisagé.
Matériel
&
Méthodes
9. L’analyse de la maturation des transcrits d’ESs par PCR.
Comme énoncé dans les résultats, la méthode utilisée a été décrite par Vanhamme et al. (Vanhamme et al., 2000). Les trypanosomes sanguicoles utilisés provenaient du clone Etat 1.2CS de la lignée Etat 1 de T. b. rhodesiense. Suite à son extraction, l’ARN a été traité à la Dnase I avant de servir de substrat à des réactions RT-PCR. L’ARN polyadénylé a été séparé du non polyadénylé par chromatographie sur une colonne oligo(dT). Les produits PCR ont ensuite été clonés en bactéries et séquencés. Le séquençage des clones a été réalisé en utilisant le « Thermosequenase Radiolabeled Terminator Cycle Sequencing Kit » (USB). Les amorces qui ont été utilisées sont les suivantes (Fig. 22-23) :
1. 5’-ACGGTGTGGCTGACGTCTCGAACCG-3’ ; 2. 5’-CCACGGGATAAAGCGTAGATGAG-3’ ; 3. 5’-TAGAACAGTTTCTGTACTATATTG-3’ ;
4. 5’-CACGTGAATCCTCAATTTTGTAAAGGGTTTCAGGTCC-3’ ; 5. 5’-GGGTGCAAGTTGATGCGC-3’.
10. L’étude de la chromatine.
10.1. Immunoprécipitations de chromatine (Collas et al., 1999).
Les noyaux ont été isolés selon le protocole mis au point au laboratoire (Murphy et al., 1987). La membrane nucléaire a ensuite été placée 15 min à 4°C dans un tampon de digestion (sucrose 250 mM, Tris-HCl (pH 7.5) 50 mM, MgCl2 5 mM, CaCl2 1 mM) auquel nous avons ajouté du Triton X-100 0,1 % ainsi que des inhibiteurs de protéases afin d’être solubilisée. Le tout déposé sur un coussin de sucrose 1 M a été centrifugé à 1000 g pendant 20 min à 4°C. Le culot a ensuite été resuspendu dans du tampon de digestion à raison de 250 µg d’ADN/ml. Après avoir placé le mélange réactionnel 2 min à 30°C, la nucléase de microcoque a été ajoutée à raison de 0,05 unités/250 µg d’ADN. La réaction d’une durée de 10 min effectuée à 30°C a été arrêtée par ajout d’EDTA 5 mM et transfert de l’échantillon sur glace. Ce dernier a alors été centrifugé à 16500 g pendant 10 min à 4°C. Un premier surnageant (S1) correspondant à la chromatine soluble a été obtenu. Le culot dialysé toute la nuit à 4°C dans du tampon de lyse (Tris-HCl (pH 7.5) 1 mM, EDTA 0,2 mM, inhibiteurs de
Matériel et méthodes
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protéases) a de nouveau été centrifugé et un second surnageant correspondant à de la chromatine solubilisée a été obtenu (S2). S1 et S2 ont constitué l’«input » (I) pour les IPs.
Les IPs ont été réalisées en mettant en jeu 20 µg d’anticorps, 400 µg de mélange (S1+S2) et 500 µl de tampon IP (NaCl 50 mM, Tris-HCl (pH 7.5) 20 mM, EDTA 5 mM, inhibiteurs de protéases). L’ensemble a été mis au contact de protéine A-Sépharose pendant 30 min à 4°C. Une brève centrifugation (1 pulse) a permis de récolter la fraction « unbound » (U). L’échantillon a alors été soumis à 3 lavages (Tris-HCl (pH 7.5) 50 mM, EDTA 10 mM ) avec du NaCl en quantité croissante (50 mM, 100 mM et 150 mM). Une fois les lavages terminés, une élution dans le tampon d’IP complété avec du SDS 1 % a été réalisée. Une seconde élution avec du SDS 0,5 % a suivi. Le produit des deux élutions a constitué la fraction « bound » (B).
L’ADN des fractions I, U et B (Fig. 29), a été purifié par deux extractions au phénol-chloroforme suivis d’une extraction au chloroforme pour être précipité à l’EtOH à l’aide de glycogène comme entraîneur. Le Southern blot a été réalisé suivant la méthode standard (Sambrook et al., 1989).
Les clones 20S71 (VSG121) et SW1 (VSG221) de T. brucei proviennent de la lignée 427. La sélection du site d’expression ainsi que le marquage de l’ES du VSG121 par les gènes de luciférase et de résistance à la phléomycine, ont été décrits par Navarro et Cross (Navarro et Cross, 1998).
10.2. Purification des anticorps dirigés contre TbH4.
Les peptides TbH4 et TbH4-Ac qui ont servi à immuniser des lapins ont été utilisés pour purifier les sérums par chromatographie. Les peptides ont été couplés à une résine « Affi-Gel 10 » (BioRad) fixant les protéines basiques. La résine a été équilibrée dans du tampon Hepes (Hepes (pH 7.5) 25 mM, NaCl 150 mM) avant que n’y soit ajouté le peptide d’intérêt dilué dans le même tampon. Les deux couplages ont été réalisés avec une concentration en peptide identique. Le mélange peptide/résine a été placé sur une roue pendant trois heures. Toutes les manipulations ont été réalisées à 4°C. Nous avons ensuite ajouté à l’échantillon de l’éthanolamine à 0,1 M final (pH 8.0) dans du tampon Hepes comme solution de blocage (1 h sur roue). Après avoir laissé décanter l’échantillon, le surnageant a été enlevé très délicatement.
Quelques lavages avec le tampon Hepes ont été effectués avant de reprendre le tout dans du tampon Hepes doté d’azide 0,2 %. La résine a été stockée à 4°C.
Les sérums dilués 10X dans du tampon Hepes ont ensuite été purifiés par passages sur leurs résines respectives durant toute une nuit. L’élution a été réalisée à
l’aide de trois tampon différents : 1. Tampon Hepes ; 2. Tampon Hepes NaCl 500 mM ; 3. Glycine 0,1 M pH 2,8. Le dernier tampon acide a été neutralisé à l’aide de Tris-HCl (pH 8.0) 1M. Plusieurs échantillons récoltés pour chacun des tampons ont ensuite été testés en Western blot pour la présence d’anticorps à l’aide d’anticorps secondaires anti-IgGs de lapin couplés à l’alkaline phosphatase, selon la méthode standard (Sambrook et al., 1989).
Afin de pouvoir séparer les différentes formes acétylées des histones, des suspensions de noyaux (après avoir été isolés (Murphy et al., 1987), les noyaux sont resuspendus dans un tampon constitué de glycérol 25 %, de MgCl2 5 mM, de DTT 1 mM et de Tris-HCl (pH 7.4) 50 mM) ont été reprises dans un tampon de charge (stock 2X (4 ml): 2,5 ml d’urée 8M, 400 µl d’acide acétique 100 %, 800 µl de pyronine 0,2
% poids/Vol, H2O) avant d’être déposées sur un gel TAU (Triton-Acide acétique-Urée).
Ce gel a été préparé comme suit : gel de séparation (100 ml) (45 g urée, 37,5 ml acrylamide 40 %, 5,25 ml bis-acrylamide 2 %, 0,4 ml Triton X-100, 5,4 ml d’acide acétique 100 %, H2O ) qui est filtré et dégazé et auquel est ajouté, avant d’être coulé, 250 µl de Riboflavine 0,027 %, 92,3 µl de NH4OH 26 % et 125 µl de Temed; gel de
« stacking » (40 ml) (3,9 ml acrylamide 40 %, 3,36 ml bis-acrylamide 2 %, 2,16 ml d’acide acétique 100 %, H2O) qui est filtré et dégazé et auquel est ajouté, avant d’être coulé, 100 µl de Riboflavine 0,027 %, 36,9 µl de NH4OH 26 % et 50 µl de Temed. La migration des histones a eu lieu dans le tampon de migration (Stock 5X concentré dans 1 L : 37, 5 g de glycine, 285 ml d’acide acétique 100 %), à polarité inversée à 20 mA toute la nuit à 4°C. Dans le but de réaliser un Western blot de ce gel, le gel ainsi que la membrane de type PVDF (PolyVinylidene DiFluoride (HYBOND-P
« Amersham »)) ont été équilibrés dans du MetOH 100 % et puis dans de l’acide acétique 0,7 %. Le transfert, à polarité inversée, s’est fait dans de l’acide acétique 0,7
% à 4°C pendant 30 min et ce à 100 V.
10.3. Etirement de la chromatine.
Les cellules reprises dans du PBS (tampon phosphate (pH 7.4) 20 mM, NaCl 150 mM) ont été déposées sur des lames « silanisées » (Nuovo, 1994). La lame équilibrée en PBS a ensuite été baignée dans du tampon d’extraction (PBS, Triton X-100 0,5 %, NaCl 0,5 M) pendant 5 min. 10 ml du même tampon a alors été déversé à l’aide d’une pipette sur la lame maintenue en biais de manière à étirer la chromatine. La fixation s’est faite à l’aide de formaldéhyde 0,36 % final. Après déshydratation, nous avons tout d’abord réalisé l’IF. L’anticorps anti Tb-H4 a été ciblé par un anticorps secondaire anti-IgGs de lapin (H+L) couplé au CYTM3. Une nouvelle fixation au formaldéhyde 2 %
Matériel et méthodes
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final a eu lieu avant de déshydrater la lame. L’étape suivante a été d’ajouter la sonde pour le FISH. La sonde tubuline a été décrite par Ersfeld et al. (Ersfeld et al., 1998).
C’est avec le « DIG-Nick translation Mix » (Roche) que nous avons marqué la sonde.
Suite à l’ajout de la sonde, une dénaturation a été opérée en plaçant la lame 5 min à 85°C et l’hybridation a ensuite eu lieu toute la nuit à 37°C. Le lendemain, les lames ont été lavées successivement dans du SSC 2X (Stock 20X (pH 7.0) 1 L: 175,3 g de NaCl, 88,2 g de citrate de sodium, H2O) complété de formamide 50 % à 37°C pendant 15 min, dans du SSC 2X à 50°C pendant 5 min, dans du SSC 0,2 X à 50°C pendant 15 min et dans du SSC 4X à température ambiante pendant 5 min. Un anticorps de mouton anti-Digoxigenin a été utilisé comme anticorps secondaire. Après lavages de la lame, un anticorps tertiaire anti-IgGs de mouton (H+L) couplé à la fluorescéine a servi à la détection. La lame a dès lors été déshydratée et nous y avons déposé la solution de montage (Tris-HCl (pH8) 20 mM, glycérol 80 %, DAPI (4,6-DiAmino-2- PhénylIndole) 0,1 µg/ml, diazibicyclo octane 20 mg/ml).
10.4. Electroélution de chromatine.
Les culots de trypanosomes, après avoir été centrifugés, ont été repris dans du tampon PSGS (2 L : 1 L de PS 2X, 88g de sucrose, 30 g de glucose anhydre ; PS (pH 8.0) 2X : NaH2PO4.H2O 2,5 mM, Na2HPO4.2H2O 47,5mM, NaCl 36,5 mM) complété de LMP (Low Melting Point) agarose 1 % (Vol./Vol.). Des petits blocs d’agarose englobant les cellules (2 x 108 cellules/bloc) sont coulés sur glace à l’aide d’un moule. Les cellules ont été lysées et les noyaux perméabilisés en incubant les blocs deux fois 10 min dans un tampon de lyse, le tout sur glace. En réalité, deux tampons de lyse ont été testés : LB1 (Weipoltshammer et al., 1999) et LB2 (Nonidet P40 0,5 %, Pipes 100 mM, MgSO4 1 mM, EDTA 0,1 mM, pH 6.9). Les blocs ont été lavés 4 fois pendant 10 min dans du tampon physiologique (PB) complété avec de l’inhibiteur de Rnase (2,5 U/ml) et des inhibiteurs de protéases (Weipoltshammer et al., 1999). Les blocs ont été soumis à l’action des enzymes de restriction adéquates dans du PB à 33°C pendant 20 min. Après la restriction, les blocs ont été placés dans les puits d’un gel d’agarose 0,8
% doté d’inhibiteur de Rnase (2,5 U/ml). La migration a été effectuée à 50 V dans du tampon PB 70 %. Après environ 4 heures de migration, le gel a été traité à la Rnase A (Tris-HCl (pH 8) 10 mM, EDTA 1 mM, RNase A 0,5 µg/ml) et à le protéinase K (Tris- HCl (pH 8) 10 mM, EDTA 1 mM, protéinase K 5 µg/ml) pendant une heure à température ambiante. Le Southern blot a été réalisé selon la méthode standard (Sambrook et al., 1989).
10.5. Isolement de complexes ADN/matrice nucléaire.
L’isolement des noyaux a été réalisé suivant le protocole mis au point au laboratoire (Murphy et al., 1987) avec cependant quelques modifications au niveau des tampons : tampon A sans MgCl2 mais avec du PMSF 0,2 mM, de la spermidine (trihydrochloride) 5 mM, de la spermine (tétrahydrochloride) 2 mM et du K-EDTA (pH 7.4) 20mM ; tampon B sans MgCl2 mais avec de la digitonine 0,1 %, du PMSF 0,2 mM, de la spermine 2 mM et du K-EDTA (pH 7.4) 20 mM. La resuspension s’est faite très délicatement et sauf indication, toutes les manipulations ont été réalisées à 4°C.
Suite au traitement avec le tampon B, les noyaux ont été centrifugés 10 min à 2600 g et repris dans du tampon B sans K-EDTA. Pour éliminer les flagelles, les noyaux ont de nouveau été centrifugés mais cette fois à 250 g pendant 8 min. Le surnageant a servi à l’isolement des complexes ADN/matrice nucléaire. 10 unités de DO à 260 nm pour 100 µl d’échantillon (Mirkovitch et al., 1984) ont été traités au LIS, tampon décrit par de Lange, auquel a été ajouté du sucrose 0,5 M (de Lange, 1992). Avant le traitement au LIS, les échantillons ont été placés 20 min à 37°C (Mirkovitch et al., 1984). 19 volumes de LIS ont été déposés dans les échantillons de manière graduelle et très lentement (de Lange, 1992). Suite à une incubation de 10 min à température ambiante, les échantillons ont été centrifugés pendant 20 min à 2600 g et le surnageant a été enlevé très délicatement. Les culots ont été lavés une fois avec le tampon de lavage 1 (sucrose 500 mM, KCl 20 mM, NaCl 70 mM, Tris-HCl (pH 7.4) 20 mM, digitonine 0,1 %, PMSF 0,2 mM), deux fois avec le tampon de lavage 2 (sucrose 500 mM, KCl 20 mM, NaCl 70 mM, Tris-HCl (pH 7.4) 20 mM, PMSF 0,2 mM) et deux fois avec le tampon de restriction adéquat complété avec du PMSF 0,2 mM. Les centrifugations ont été réalisées à 16000 g pendant 10 min à 4°C. Les traitements aux endonucléases de restriction ont eu lieu comme décrits par de Lange (de Lange, 1992). Les culots séparés des surnageants ont ensuite été traités à la protéinase K également comme l’a décrit de Lange (de Lange, 1992). Cependant le traitement des culots a été précédé d’un lavage dans le tampon sans protéinase K et sans SDS.
J’ajouterai que diverses concentrations en EDTA ont été testées dans notre cas. L’ADN a finalement été récupéré par extraction au phénol-chloroforme suivi de deux extractions à l’éther et d’une précipitation à l’EtOH.
Matériel et méthodes
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11. Les clonages.
11.1. TbTFIIS1.
La banque de données TIGR (http://www.tigr.org) a été criblée en utilisant la séquence du facteur TFIIS de levure comme proie. Les amorces 5’- CGGTTCGTCGGCTGATC-3’ et 5’-TATTCCGGGCGGGCGC-3’ ont été créées sur base d’une séquence homologue ne couvrant cependant qu’une partie de l’ORF (17B19.TF M13 For end of clone 17B19 ; « Sheared DNA library ») afin de l’amplifier par PCR à partir d’ADN génomique de trypanosome. Une banque λZAP-ADNc du clone LiTat 1.3 de T. b. gambiense a été criblée à l’aide de ce produit PCR. TbTFIIS1 a alors été cloné dans le vecteur phagemide pBKCMV (Stratagene). La séquence de ce clone est identique à la séquence accessible sur le site de la base de données GeneDB dont le numéro ID est Tb11.02.2600 excepté les substitutions des acides aminés V par M en position 43 et I par T en position 162.
11.2. TbTFIIS2.
Afin d’amplifier TbTFIIS2 par PCR, nous avons dessiné des amorces à partir de la séquence accessible sur le site de la base de données GeneDB dont le numéro ID est Tb927.2.3580. Les amorces 5’-CCGGAATTCATGCTTCAAGAAAGAGTA-3’ et 5’- CCGCTCGAGCTAATTCTCTGACCAATTATG-3’ ont permis d’amplifier à partir d’ADN génomique de la lignée procyclique 29:13 l’ORF dans son intégralité. Cette dernière a été clonée dans le plasmide pGen (Shpakovski et al., 1995). Le séquençage partiel de l’ORF a permis de détecter certaines substitutions d’acides aminés : T par S en position 43, Q par E en position 91, T par I en position 190, T par A en position 266 et D par N en position 338.
11.3. TbRPA12.
Le clonage de TbRPA12 s’est déroulé de manière tout à fait identique à TbTFIIS1.
Les amorces utilisées pour créer la sonde qui allait servir au criblage de la banque d’ADNc ont été les suivantes : 5’-CCGATGAGGGTCAAACAG-3’ et 5’- CTGCCAATGGTTGCAGCG-3’. Ces amorces ont été dessinées à partir de la séquence homologue obtenue dans TIGR, couvrant une partie de l’ORF (8P8.TR M13 Rev end of
clone 8P8 ; « sheared DNA library »). La séquence de TbRPA12 clonée dans pBKCMV s’est avérée identique à celle accessible sur le site de GeneDB dont le numéro ID est Tb11.01.2190.
11.4. Analyse des séquences et comparaison.
Les séquençages des différents clones ont été réalisés en utilisant le
« Thermosequenase Radiolabeled Terminator Cycle Sequencing Kit » (USB). L’ADN et l’ARN correspondant à ces gènes ont été analysés selon les méthodes standards (Sambrook et al., 1989).
Les alignements ont été concrétisés en utilisant le programme CLUSTALW. Ces analyses ont été rendues possibles grâce au travail du consortium responsable du séquençage du génome du trypanosome qui a généré les banques de données accessibles sur TIGR (http://www.tigr.org) et GeneDB (http://www.genedb.org).
11.5. Anticorps dirigés contre TbTFIIS1 et TbRPA12.
Des produits PCR de TbTFIIS1 (nt 4-642) et TbRPA12 (nt 4-456) ont été clonés dans le plasmide d’expression pGEX-5X-1 ((Smith et Johnson, 1988), Amersham) inductible en bactéries avec de l’IPTG (IsoPropyl-thio beta D ThioGalactoside).
TbTFIIS1 et TbRPA12 ont été respectivement amplifiés par les couples d’amorces suivants :
5’-CCGGAATTCGGTAAGGATTCCAATGATGGG-3’ et 5’-CCGCTCGAGCTAATAGCGACGCCATTTGTG-3’ ;
5’-CCGGAATTCAGTGCACCAATGGCTCGCAGGGATTAC-3’ et 5’-AAAGCTCTCGAGTTATGAGTTGAGCTGCCACTCCGAG-3’.
Les ORFs complètes de ces gènes excepté le codon d’initiation ont été clonées en fusion avec la séquence de la GST située en amont. Le produit d’expression obtenu a ensuite servi à immuniser des lapins.
12. Les trypanosomes et leurs transfections.
La lignée procyclique 29:13 utilisée pour le RNAi a été cultivée à 27°C dans du milieu de culture SDM79 (Brun et Jenni, 1977) complété avec 15 % de sérum de bovin
Matériel et méthodes
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fœtal, 25 µg/ml d’hygromycine et 15 µg/ml de généticine (Wirtz et al., 1999). Les cellules au stade procyclique de la lignée EATRO 1125 de T. brucei ont été cultivées dans le même milieu de culture mais cette fois complété avec 10 % de sérum de bovin fœtal. La lignée sanguicole 13:90 utilisée pour le RNAi a été cultivée à 37°C avec 5 % CO2 dans du milieu de culture HMI9 complété avec 10 % de sérum de bovin fœtal, 10
% de sérum Plus (Hirumi et Hirumi, 1989), 1 µg/ml de généticine et 1 µg/ml d’hygromycine (Wirtz et al., 1999). La lignée 328:114 également utilisée en RNAi a été cultivée de la même manière dans le même milieu de culture mais cette fois complémenté uniquement avec 1 µg/ml de généticine (Wirtz et al., 1999). Le clone AnTat 1.3A de la lignée EATRO 1125 a été maintenue après transfection dans du milieu HMI9 avant d’être injectée en souris.
La transfection des cellules au stade procyclique a été accomplie par électroporation de 5 µg d’ADN plasmidique linéarisé dans 2 x 107 cellules resuspendues dans du ZPFM (Zimmerman PostFusion Medium) (Bellofatto et Cross, 1989) à l’aide d’une cuvette de 0,4 cm et de l’électroporateur « BioRad Gene Pulser II » (2 pulses de 1,5 kV et 25 µF de capacitance). Les cellules au stade sanguicole ont été transfectées par életroporation de 10 µg d’ADN plasmidique linéarisé dans 107 cellules resuspendues dans du Cytomix 0,6X (van den Hoff et al., 1992) en utilisant une cuvette de 0,2 cm et l’électroporateur « Electro Square Porator » (BTX) (1 pulse de 1190 V, 252 µsec).
13. Le RNAi.
Pour être invalidés par RNAi, TbTFIIS1, TbTFIIS2 et TbRPA12 ont été clonés en HindIII-XhoI dans le vecteur pZJM (Wang et al., 2000). L’ORF entière de TbTFIIS1 (nt 1-642) a été amplifiée par PCR en utilisant les amorces suivantes :
5’-CCCAAGCTTATGGGTAAGGATTCCAATGAT-3’ et 5’-CCGCTCGAGCTAATAGCGACGCCATTTGTG-3’.
Ces amorces ont permis d’ajouter les sites de restrictions HindIII et XhoI aux extrémités de l’ORF. Un fragment de TbTFIIS2 (nt 25-859) a été amplifié par PCR à l’aide des amorces suivantes :
5’-CCCAAGCTTATTAACGACCGTGTCTGGCT-3’ et 5’-CCGCTCGAGTCGTTTGTGAACTGGAAATGGT-3’.
Ces amorces ont également permis de positionner aux extrémités de l’ORF les sites de restrictions précédemment cités. Concernant TbRPA12, un site de restriction XhoI a été ajouté à la position 457 de l’ORF par PCR. Les amorces qui ont été utilisées sont les suivantes :
5’-CCGGAATTCAGTGCACCAATGGCTCGCAGGGATTAC-3’ et
5’-AAAGCTCTCGAGTTATGAGTTGAGCTGCCACTCCGAG-3’.
Le fragment HindIII-XhoI couvrant les nucléotides 183-456 a été cloné. Le clonage de TbTFIIS1 dans p2T7Ti-177 a été réalisé de la même manière.
Les lignées 29:13, 13:90 ont été transfectées avec le vecteur pZJM. 16 h après la transfection, la phléomycine a été ajoutée au milieu à raison de 2,5 µg/ml et 1 µg/ml, respectivement pour les formes procyclique et sanguicole. 16 h après la transfection de la lignée sanguicole 328:114 avec le plasmide p2T7Ti-177, l’hygromycine a été ajoutée à raison de 1 µg/ml. L’intégration de la construction a été vérifiée par Southern blot. La synthèse d’ARN double brin a été induite par ajout de doxycycline à 1 µg/ml (Duchefa). Chaque jour, nous avons compté et dilué les trypanosomes à 5 x 105 cellules/ml ou 105 cellules/ml, respectivement pour les cellules au stade procyclique et pour les cellules au stade sanguicole.
Concernant le RNAi in vivo, 6 souris ont été injectées avec 5 x 106 trypanosomes de la lignée 13:90 pZJM-TbTFIIS1. La moitié des souris a été abreuvée avec de l’eau complétée de doxycycline à raison de 1 mg/ml.
Lors des tests de sensibilité du double mutant RNAi à l’acide mycophénolique (stock 50 mg/ml dilué dans du MetOH et conservé à 4°C), cette toxine a été ajoutée au milieu de culture à deux concentrations différentes à savoir 0,1 µg/ml et 0,01 µg/ml.
14. La purification « TAP tag ».
L’ORF du TAP tag (Puig et al., 2001) a été fusionnée à l’extrémité C-terminale de TbRPA12 dans le vecteur pTSARib (Xong et al., 1998) à l’aide des amorces suivantes :
5’-CCGCTCGAGCATGAGTGCACCAATGGCTCGC-3’ et
5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTGAGTTGAGCTGCCACTCCGA-3’.
Cette construction a été linéarisée par SphI et transfectée dans les formes procyclique et sanguicole de la lignée EATRO 1125, menant à son intégration dans le génome sous le contrôle du promoteur ribosomique. Les cellules transfectées ont été sélectionnées par ajout de 25 µg/ml ou 1 µg/ml d’hygromycine, respectivement pour les cellules au stade procyclique et pour les cellules au stade sanguicole. Les lysats de cellules résistantes à l’hygromycine ont été analysées par Western blot avec des IgGs de lapin couplés à la peroxydase et anti-peroxydase pour l’expression de la protéine
« taggée ». La lignée procyclique a fait l’objet d’une transmission cyclique dans les mouches pour générer des populations métacycliques qui ont été injectées à des souris pour générer des trypanosomes sanguicoles (en collaboration avec Jan Van den Abbeele, Institut de Médecine tropicale, Anvers). Les trypanosomes (3 x 109 cellules et
Matériel et méthodes
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6 x 109 cellules, respectivement pour les cellules au stade procyclique et au stade sanguicole) ont été centrifugés et lavés dans du PSGS avant d’être incubés pendant 1 h à 4°C dans 10 ml de tampon de lyse (KCl 100 mM, MgCl2 5 mM, DTT 0,5 mM, glycerol 17 %, NP40 0,5 %, Tris-HCl (pH 8.0) 10 mM, inhibiteurs de protéases). Suite à une centrifugation à 20000 g à 4°C, le surnageant a été récolté et ajusté à la concentration en NaCl correcte avant de faire l’objet des deux phases successives de purification d’affinité à 4°C (Puig et al., 2001). L’éluat obtenu a été précipité à l’acétone à –20°C. Le précipité a ensuite été repris dans du tampon échantillon avant d’être chargé sur un gel gradient 4-12 % Bis-Tris (NuPAGETM, Invitrogen) pour être analysé par SDS-PAGE.
15. L’identification de protéines par spectrométrie de masse.
Les bandes protéiques ont été découpées du gel pour être soumises à une digestion à la trypsine (Shevchenko et al., 1996). Les petides obtenus ont ensuite été purifiés, concentrés et soumis à la spectrométrie de masse en utilisant l’outil Q-TOF (Micromass, Manchester, UK). Les éléments de séquences générés ont été utilisés pour réaliser une recherche « peptide sequence tag » dans nrdb (Mann et Wilm, 1994) ou pour entreprendre une recherche dans BLAST.
16. La coloration de protéines phosphorylées.
La coloration des protéines phosphorylées a été concrétisée selon le protocole du kit « Pro-Q® Diamond Phosphoprotein Gel Stain » (Molecular Probes). Le gel a été incubé dans la solution de décoloration (acétonitrile 20 %, acétate de sodium (pH 4.0) 50 mM) deux fois 1 h et ensuite toute la nuit. Le gel a alors été scanné en utilisant le
« typhoon » (Amersham) scanner (laser-excitation : green-532 nm ; emission filter 580 BP 30). Le même gel a ensuite été coloré avec le colorant quantitatif « SYPRO®
Ruby Protein Gel Stain » (Molecular Probes) et de nouveau scanné avec le « typhoon » (laser-excitation : green-532 nm ; emission filter 610 BP 30). Les signaux ont été quantifiés et analysés avec le logiciel « Image Quant TL » (Amersham).
17. Le test d’activité kinase.
Les éluats de la purification TAP tag ont été soumis à des tests d’activité kinase.
Le tampon a pour ce faire été ajusté à la composition adéquate du test (MgCl2 2 mM, NaCl 150 mM, Tris-HCl (pH 7.5) 45 mM). 10 µCi d’ATP [γ-32P] ou d’ATP [α-32P] ont été ajoutés à l’échantillon pour une incubation d’1 h à 30°C. L’échantillon a ensuite été précipité à l’acétone à –20°C et analysé par SDS-PAGE avant d’être coloré et autoradiographié.
18. La production d’anticorps monoclonaux.
Les anticorps monoclonaux ont été produits par fusions cellulaires entre des cellules de rate et des cellules de myélome de souris. 3 injections de l’antigène à intervalles d’environ dix jours ont été réalisées dans la souris avant de tester le sérum total. Ensuite, la rate de la souris, stimulée une quatrième fois 3 à 4 jours avant la fusion cellulaire, a été prélevée. Les cellules spléniques ont alors été lavées dans du milieu de culture sans sérum et comptées. Les cellules de myélome murin (SP20 ou NSO) ont été récupérées à partir d’une culture cellulaire, lavées dans du milieu sans sérum et comptées. Les cellules de rate (max. 108) et de myélome ont été mélangées (dans un rapport 5/1 ou 10/1 ) et centrifugées. Sur le culot a été ajouté goutte à goutte l’agent fusionnant (polyéthylèneglycol ou PEG) chauffé à 37°C (1 ml de PEG 1500/108 cellules de rate). Les cellules ont été remises en suspension très délicatement et l’isotonicité du milieu a été rétablie progressivement en ajoutant du milieu sans sérum chauffé à 37°C, de manière à doubler le volume de la suspension cellulaire à intervalles réguliers. Les cellules ont par après été centrifugées et le culot a été resuspendu délicatement dans du milieu de culture contenant 10 % de sérum de veau fœtal (FCS). Les cellules ont été incubées 1 h à 37°C et resuspendues de temps en temps. Suite à l’incubation, les cellules ont de nouveau été centrifugées pour être resuspendues dans du milieu de culture complété de FCS (10 %) et de HAT (hypoxanthine-aminoptérine-thymidine=milieu sélectif). Elles ont ensuite été réparties dans des plaques de culture 96 puits à raison de 104 à 5 x 104 cellules/100µl par puits.
Des macrophages péritonéaux de souris ont également été ajoutés dans les puits afin d’éliminer les cellules mortes et de favoriser la croissance cellulaire des hybrides par le biais de la sécrétion de cytokines.
La présence d’anticorps spécifiques de l’antigène a été testée dans les surnageants environ deux semaines après la fusion.
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