HAL Id: tel-01748646
https://hal.univ-lorraine.fr/tel-01748646
Submitted on 29 Mar 2018
HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.
L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.
naturel, fonctionnalisé par un film multicouche de polyélectrolytes et cellularisé par un endothelium
autologue orienté
Estelle Paternotte
To cite this version:
Estelle Paternotte. Conception et validation d’un substitut vasculaire naturel, fonctionnalisé par un film multicouche de polyélectrolytes et cellularisé par un endothelium autologue orienté. Médecine humaine et pathologie. Université Henri Poincaré - Nancy 1, 2010. Français. �NNT : 2010NAN10105�.
�tel-01748646�
AVERTISSEMENT
Ce document est le fruit d'un long travail approuvé par le jury de soutenance et mis à disposition de l'ensemble de la communauté universitaire élargie.
Il est soumis à la propriété intellectuelle de l'auteur. Ceci implique une obligation de citation et de référencement lors de l’utilisation de ce document.
D'autre part, toute contrefaçon, plagiat, reproduction illicite encourt une poursuite pénale.
Contact : ddoc-theses-contact@univ-lorraine.fr
LIENS
Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 122. 4
Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 335.2- L 335.10 http://www.cfcopies.com/V2/leg/leg_droi.php
http://www.culture.gouv.fr/culture/infos-pratiques/droits/protection.htm
1 Ecole Doctorale Biologie-Santé-Environnement
Thèse
présentée pour l’obtention du titre de
DOCTEUR DE l’UNIVERSITE HENRI POINCARE, Nancy-I Mention : Sciences de la Vie et de la Santé
par Estelle PATERNOTTE
CONCEPTION ET VALIDATION D’UN SUBSTITUT VASCULAIRE NATUREL, FONCTIONNALISE PAR UN FILM MULTICOUCHE DE POLYELECTROLYTES ET
CELLULARISE PAR UN ENDOTHELIUM AUTOLOGUE ORIENTE
Soutenue le 27 septembre 2010
Membres du jury :
Directeur de thèse : M. Patrick MENU PU, UMR 7561 CNRS-UHP, Nancy Rapporteurs : M. Didier LETOURNEUR DR, INSERM U698, Paris
M. Simon RINCKENBACH PU-PH, CHU, Besançon Examinateurs : M. Philippe FERNANDEZ PU-PH, CHU, Bordeaux
M. Pierre LABRUDE PU, UMR 7561 CNRS-UHP, Nancy M. Jean-François STOLTZ PU-PH, UMR 7561 CNRS-UHP, Nancy M. Jean-Claude VOEGEL DR, INSERM U977, Strasbourg Membre invité : M. Bertrand LEHALLE MD, PhD, Pôle Vaisseaux, Nancy
Laboratoire de Physiopathologie, Pharmacologie et Ingénierie Articulaires UMR-CNRS 7561
Faculté de Médecine – Nancy-Université
M Me es s p pa ar re en nt ts s, , m ma a s sœ œu ur r a ai in ns si i q qu ue e l la a f fa am mi il ll le e P Pa at te er rn no ot tt te e- -H Ho on no or ré é m’ m ’o on nt t t to ou uj jo ou ur rs s f fa ai it t c co on nf fi ia an nc ce e. . I Il ls s m m’ ’o on nt t a ai id dé ée e, , s so ou ut te en nu ue e e et t e en nc co ou ur ra ag gé ée e, ,
m mê êm me e d da an ns s l le es s m mo om me en nt ts s l le es s p pl lu us s d dé él li ic ca at ts s. . Je J e l le es s r re em me er rc ci ie e p po ou ur r t to ou ut t c ce el la a! !
Pu P ui is ss se e c ce et tt te e t th hè ès se e ê êt tr re e à à l la a h ha au ut te eu ur r d de e t to ou ut t c ce e q qu u’ ’i il ls s o on nt t f fa ai it t p po ou ur r m mo oi i ! ! . .. .. .
E E x x p p r r e e s s s s i i o o n n l l i i b b r r e e
Au cours de cette thèse, j’ai rencontré beaucoup de personnes différentes, qui, chacune à sa manière, a influencé le déroulement de mes travaux. Je leur dois beaucoup (énormément pour certaines même !), car c’est en partie grâce à elles que j’écris ces mots aujourd’hui.
Notre histoire a commencé en 2006, lorsque j’ai intégré le laboratoire d’Ingénierie cellulaire et tissulaire, UMR-CNRS 7563, dirigé par le Monsieur le Professeur Jean-François Stoltz pour mon stage de M1. Il m’a soutenue dans les moments importants. Je lui témoigne ici toute ma vive reconnaissance.
J’ai été accueillie par Monsieur le Professeur Patrick Menu à la tête de l’équipe
« Ingénierie vasculaire ». Depuis, bien du chemin a été parcouru. M. Menu est devenu mon directeur de thèse ; et moi, son étudiante en thèse ! Je le remercie très chaleureusement pour son soutien, ainsi que pour tous les conseils qu’il a su me prodiguer au cours de notre travail.
Il a su m’apprendre l’autonomie. Qu’il trouve en ces mots l’expression de mon entière reconnaissance.
C’est avec M. Stoltz et M. Menu que ma thèse a commencé, elle va s’achever dans quelques semaines avec les membres de mon jury. Je tiens donc à les remercier d’avoir accepté de juger ce travail :
- Monsieur Didier Letourneur, directeur de recherche ; - Monsieur Jean-Claude Voegel, directeur de recherche ; - Monsieur le Professeur Philippe Fernandez ;
- Monsieur le Professeur Simon Rinckenbach.
La vie au laboratoire n’est pas toujours un long fleuve tranquille, mais j’avoue que j’ai beaucoup apprécié les personnes que j’ai côtoyées. « Le labo », c’est comme une grande famille. J’en remercie chacun de ses membres et je vais vous en présenter ici quelques-uns.
En premier lieu : le chef de famille. Ici LES chefs de familles : M. Menu « le directeur de thèse » et M. Labrude « le grand–directeur de thèse ». Ils managent en tandem leur équipe.
Je les remercie profondément tous les deux ; et particulièrement M. le Professeur Pierre Labrude pour le temps qu’il m’a consacré et pour toutes les réflexions que nous avons eues ensemble. Son incroyable culture et sa grande ouverture d’esprit ont largement contribué à faire avancer ces travaux. Qu’il en soit remercié et qu’il trouve ici l’expression de toute mon admiration la plus sincère.
Mmes Gentils, Cauchois et Guerber. Ce sont les « mamans du labo ». Elles nous
écoutent, nous conseillent, nous guident. Elles assurent le soutien logistique… et
psychologique ! Je les remercie infiniment pour leur aide. En particulier Mme Monique
Ma grande sœur : Caroline Gaucher-Di Stasio. Je la remercie d’avoir initié mes premiers pas dans la recherche !
Nicolas Salmon : mon frère (jumeau !) de thèse. Il s’agit de mon collègue de bureau et voisin de paillasse. Non !... en fait il s’agit à présent d’un très bon ami ! J’ai beaucoup apprécié ces 3 années de dur labeur passées avec toi. Heureusement que tu étais là ! Ta bonne humeur perpétuelle et ta gentillesse ont égaillé mes manip ! Ton humour va me manquer ! … ainsi que nos réflexions sur LE sens de la vie ! Je ne te souhaite que le meilleur pour la suite !
J’ai également eu la chance d’avoir des petits frères et sœurs : des stagiaires. Tunay, tu as été « mes petites mains ». J’ai beaucoup apprécié de travailler avec toi. Après deux stages à mes cotés, j’ai finalement réussi à te convertir à la thèse ! Aude, Emilie et Camille : je vous remercie pour votre bonne humeur et les bons moments passés dans notre bureau. Je vous souhaite à tous les quatre un avenir plein de réussite.
Ce travail est le fruit de nombreuses collaborations. J’ai été accueillie par chacun de mes collaborateurs à bras ouverts. Qu’ils trouvent l’expression de ma gratitude en les quelques lignes ci-dessous :
- Mme Anne-Laure Leblanc et M. Jérome Béyrend, gérants de l’animalerie centrale.
Merci de vous être occupés de mes petits patients ;
- les membres du laboratoire de Physiologie : Monsieur le Professeur François Marchal, Mme Noëlle Bertin et M. Bruno Demoulin, pour m’avoir « prêté » leurs lapins ;
- Monsieur le Docteur Bertrand Lehalle, merci de m’avoir enseigné l’art du pontage ! - l’équipe de Monsieur le Docteur Patrick Lacolley pour m’avoir accueillie dans ses locaux pour les manipulations de biologie moléculaire et l’expérimentation animale. Tout particulièrement, merci à Madame le Docteur Anna Kearney-Schwartz pour l’auscultation hebdomadaire de mes lapins.
- l’équipe de Monsieur le Professeur François Plénat ; et plus spécifiquement Mmes Bonnet et Thiébaut, respectivement technicienne en chef et technicienne, pour leur incroyable travail d’histologie ;
- Monsieur le Docteur Dominique Dumas et M. Sébastien Hupont, responsables du plateau d’imagerie, pour leur aide au confocal ;
- un grand merci à nos secrétaires : Mmes Reppel, Lorcin et Vanzo pour avoir su déchiffrer nos commandes.
Enfin (je garde le meilleur pour la fin !), Nicolas, tu es toujours là pour moi. Merci
pour ton soutien, tes encouragements et surtout pour tous tes petits mots… d’amour !!
1
SOMMAIRE ... 1
LISTE DES ABREVIATIONS ... 10
LISTE DES FIGURES ... 12
LISTE DES TABLEAUX ... 17
INTRODUCTION GENERALE ... 18
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE ... 22
I. Anatomie du système vasculaire: structure et composition ... 23
I I. .1 1. . M Mi is se e e en n p pl la ac ce e d du u s sy ys st tè èm me e v va as sc cu ul la ai ir re e ... 24
I.1.1. Développement chez l’embryon : vasculogenèse ... 24
I.1.2. Développement chez l’adulte : angiogenèse ... 24
I I. .2 2. . L Le es s d di if ff fé ér re en nt ts s t ty yp pe es s d de e v va ai is ss se ea au ux x ... 25
I.2.1. Les veines ... 25
I.2.2. Les artères ... 25
I.2.3. Cas particulier du cordon ombilical ... 26
I I. .3 3. . C Co om mp po os si it ti io on n d de e l la a p pa ar ro oi i d de es s v va ai is ss se ea au ux x ... 27
I.3.1. L’adventice ... 27
I.3.2. La média ... 28
I.3.3. L’intima ... 29
II. Fonctionnalité du système vasculaire : les cellules vasculaires ... 29
II I I. .1 1. . L Le es s c ce el ll lu ul le es s m mu us sc cu ul la ai ir re es s l li is ss se es s .. . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 3 30 0
2
II.1.2. Caractérisation phénotypique ... 30
II.1.3. Fonctions ... 31
I II I. .2 2. . L Le es s c ce el ll lu ul le es s e en nd do ot th hé él li ia al le es s . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 3 33 3 II.2.1. Description ... 33
II.2.2. Caractérisation phénotypique ... 34
II.2.2.1 Marqueurs extracellulaires ... 34
II.2.2.2 Marqueurs intracellulaires ... 35
II.2.3. Fonctions ... 36
II.2.4. Contraintes mécaniques ... 37
III. Pathologies vasculaires et chirurgie du pontage associé ... 38
II I II I. .1 1. . L L’ ’a ar rt té ér ri io op pa at th hi ie e o ob bl li it té ér ra an nt te e .. . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 3 39 9 III.1.1. Définition ... 39
III.1.2. Epidémiologie ... 40
III.1.3. Physiopathologie... 40
III.1.4. Conséquences et complications ... 41
III.1.5. Prise en charge ... 42
I II II I. .2 2. . L Le es s s su ub bs st ti it tu ut ts s v va as sc cu ul la ai ir re es s . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 4 42 2 III.2. 1. Substituts biologiques ... 44
III.2.1.1. Les substituts traités : les bioprothèses ... 44
III.2.1.2. Les substituts non traités : les greffes vasculaires ... 45
III.2.1.2.1. Les autogreffes ... 45
III.2.1.2.2. Les allogreffes ... 45
III.2.2. Substituts synthétiques... 46
III.2.2.1. Le polyéthylène téréphtalate (PET) ... 46
III.2.2.2. Le polytétrafluoroéthylène expansé (PTFEe) ... 47
3 II I II I. .3 3. . L Le e c ca ah hi ie er r d de es s c ch ha ar rg ge es s d du u s su ub bs st ti it tu ut t v va as sc cu ul la ai ir re e i id dé éa al l d de e p pe et ti it t c ca al li ib br re e . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 5 50 0
IV. Ingénierie vasculaire ... 51
IV I V. .1 1. . M Ma at tr ri ic ce es s s sy yn nt th hé ét ti iq qu ue es s c co om mp po os si it te es s .. . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 5 53 3 IV.1.1. Matrices synthétiques composites biodégradables ... 54
IV.1.2. Matrices synthétiques composites permanentes ... 54
IV I V. .2 2. . R Re ec co on ns st ti it tu ut ti io on n v va as sc cu ul la ai ir re e : : p pr ro ot th hè ès se es s à à p pl lu us si ie eu ur rs s é ép pa ai is ss se eu ur rs s . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 5 55 5 IV I V. .3 3. . M Ma at tr ri ic ce es s n na at tu ur re el ll le es s . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 5 58 8 IV.3.1. Matrice à base d’intestin grêle ... 58
IV.3.2. Matrice vasculaire décellularisée et acellularisée ... 59
IV I V. .4 4. . S Su ub bs st ti it tu ut ts s v va as sc cu ul la ai ir re es s e en nd do ot th hé él li ia al li is sé és s .. . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 6 60 0 IV.4.1. Les matrices utilisées pour l’endothélialisation ... 60
IV.4.2. Les cellules ... 61
IV.4.2.1. Les cellules matures ... 62
IV.4.2.1.1. Les cellules endothéliales... 62
IV.4.2.1.2. Les cellules endothéliales circulantes ... 62
IV.4.2.2. Les cellules souches (CS) ... 63
IV.4.2.2.1. Les CS embryonnaires ... 64
... IV.4.2.2.2. Les CS pluripotentes induites ... 66
IV.4.2.2.3. Les CS fœtales ... 67
IV.4.2.2.4. Les cellules souches adultes (CSA) ... 67
IV.4.2.2.4.1. Les CSA mésenchymateuses ... 68
IV.4.2.2.4.2. Les CSA hématopoïétiques ... 70
IV.4.2.2.4.3. Les CSA endothéliales ... 72
a. Rôle des EPC ... 72
b. Isolement et caractérisation des EPC ... 73
c. Mobilisation des EPC ... 75
d. Facteurs intervenant dans la mobilisation
4
tissulaire vasculaire ... 80
IV.4.3. Les revêtements de surfaces ... 80
V. Film multicouche de polyélectrolytes... 82
V. V .1 1. . D Dé ép pô ôt t d de es s f fi il lm ms s : : t te ec ch hn ni iq qu ue e d du u c co ou uc ch he e p pa ar r c co ou uc ch he e ( (« « l la ay ye er r b by y l la ay ye er r » ») ) . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 8 83 3 V. V .2 2. . M Mo od de e d de e c cr ro oi is ss sa an nc ce e . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 8 84 4 V V. .3 3. . B Bi io oc co om mp pa at ti ib bi il li it té é d de es s f fi il lm ms s m mu ul lt ti ic co ou uc ch he e d de e p po ol ly yé él le ec ct tr ro ol ly yt te es s . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 8 85 5 V V. .4 4. . I In nt te er ra ac ct ti io on ns s m mi is se es s e en n j je eu u l lo or rs s d de e l la a c co on ns st tr ru uc ct ti io on n d du u f fi il lm m . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 8 85 5 V.4.1. Interactions électrostatiques ... 86
V.4.2. Liaisons hydrophobes ... 86
V.4.3. Liaisons Hydrogène ... 86
V. V .5 5. . E Ex xp pe er rt ti is se e d du u l la ab bo or ra at to oi ir re e . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 8 87 7 V V. .6 6. . A Am mb bi it ti io on n e et t p pr ro oj je et t d de e d dé év ve el lo op pp pe em me en nt t .. . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 8 89 9 OBJECTIFS DE L’ETUDE ... 90
MATERIEL ET METHODES ... 92
I. Culture cellulaire et tissulaire ... 93
I. I .1 1. . C Cu ul lt tu ur re e c ce el ll lu ul la ai ir re e . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 9 93 3 I.1.1. Réactifs et milieux de culture ... 93
I.1.2. Isolement des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine ... 95
I.1.2.1. Dons de cordon ombilical ... 95
I.1.2.2. Constitution de la primo-culture ... 96
I.1.3. Isolement des cellules progénitrices endothéliales ... 98
I.1.3.1. Cadre éthique de l’expérimentation animale ... 98
I.1.3.2. Anesthésie de l’animal ... 98
I.1.3.3. Prélèvement du sang ... 98
5
I.1.3.5. Isolement des EPC ... 99
I.1.4. Passage en subculture ... 100
I I. .2 2. . P Pr ré ép pa ar ra at ti io on n d de es s m ma at tr ri ic ce es s v va as sc cu ul la ai ir re es s .. . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 10 00 0 I.2.1. Milieux de conservation des vaisseaux ... 100
I.2.1.1. Milieux de conservation des artères ombilicales ... 100
I.2.1.2. Milieu de conservation des veines saphènes ... 101
I.2.2. Isolement et conservation des vaisseaux ... 101
I.2.2.1. Isolement et conservation des artères ombilicales ... 101
I.2.2.2. Isolement et conservation des veines saphènes ... 101
I.2.3. Décongélation et traitement des artères ombilicales ... 102
I.2.3.1. Décongélation des artères ombilicales ... 102
I.2.3.2. Traitement des artères ombilicales ... 102
I.2.4. Modification de la surface luminale par un film multicouche de polyélectrolytes ... .103
I.2.4.1. Solutions de polyélectrolytes ... 103
I.2.4.2. Dépôt des polyélectrolytes dans les vaisseaux ... 103
... I.2.4.3. Ensemencement des cellules sur la surface luminale des matrices artérielles ... 105
a. Ensemencement des CE et ensemencement des CE et cellules endothéliales-like ... 105
b. Ensemencement des EPC ... 105
I.2.5. Stimulations mécaniques : contraintes de cisaillement ... 106
II. Méthodes de caractérisation et d’investigation ... 108
I II I. .1 1. . C Ca ar ra ac ct té ér ri is sa at ti io on n h hi is st to ol lo og gi iq qu ue e e et t i im mm mu un no oh hi is st to oc ch hi im mi iq qu ue e .. . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 10 08 8 II.1.1. Histologie ... 108
II.1.1.1. Réactifs ... 108
6
II.1.1.3. Déshydratation et inclusion dans la paraffine ... 108
II.1.1.4. Coupe et étalement ... 109
II.1.1.5. Colorations histologiques ... 109
II.1.1.5.1. Réactifs ... 110
II.1.1.5.2. Déparaffinage ... 110
II.1.1.5.3. Coloration à l’hématoxyline-éosine-safran ... 110
II.1.1.5.4. Coloration selon la méthode de Weighert ... 111
II.1.1.5.5. Réaction de Von Kossa ... 111
II.1.1.5.6. Montage et observation des lames ... 112
II.1.2. Immunohistochimie ... 112
II.1.2.1. Réactifs ... 112
II.1.2.2. Anticorps ... 112
II.1.2.3. Déparaffinage et démasquage des sites antigéniques ... 113
II.1.2.4. Marquage et révélation ... 113
II I I. .2 2. . C Ca ar ra ac ct té ér ri is sa at ti io on n p pa ar r m mi ic cr ro os sc co op pi ie e c co on nf fo oc ca al le e à à b ba al la ay ya ag ge e l la as se er r .. . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 11 14 4 II.2.1. Description de l’appareillage ... 114
II.2.2. Visualisation du film multicouche de polyélectrolytes ... 115
II.2.2.1. Réactifs ... 116
II.2.2.2. Protocole ... 116
II.2.3. Visualisation du noyau ... 116
II.2.3.1. Réactifs ... 116
II.2.3.2. Protocole ... 116
II.2.4. Visualisation du phénototype cellulaire par immunocytologie... 116
II.2.4.1. Principe ... 116
II.2.4.2. Réactifs ... 117
II.2.4.3. Anticorps ... 117
7
II.2.4.5. Immunomarquage intracellulaire ... 119
II.2.5. Suivi des cellules à long terme ... 119
II.2.5.1. Réactifs ... 119
II.2.5.2. Marquage à la PKH-26 ... 120
II I I. .3 3. . C Ca ar ra ac ct té ér ri is sa at ti io on n p pa ar r b bi io ol lo og gi ie e m mo ol lé éc cu ul la ai ir re e : : q qP PC CR R . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 12 21 1 II.3.1. Extraction des ARN totaux ... 121
II.3.1.1. Réactifs ... 121
II.3.1.2. Protocole d’extraction ... 121
II.3.2. Quantification des ARN totaux extraits ... 123
II.3.3. Intégrité des ARN ... 123
II.3.4. Rétrotranscription des ARN ... 123
II.3.5. qPCR ... 124
II.3.5.1. Principe ... 124
II.3.5.2. Choix des amorces ... 125
II.3.5.3. Réactifs ... 126
II.3.5.4. Protocole de qPCR ... 126
III. Evaluation in vivo du substitut : suivi post-implantation ... 128 I
II II I. .1 1. . C Ca ad dr re e é ét th hi iq qu ue e d de e l l’ ’e ex xp pé ér ri im me en nt ta at ti io on n a an ni im ma al le e . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 12 28 8 II I II I. .2 2. . C Ch ho oi ix x d du u m mo od dè èl le e a an ni im ma al l .. . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 12 28 8 II I II I. .3 3. . A An ne es st th hé és si ie e d de e l l’ ’a an ni im ma al l . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 12 28 8 II I II I. .4 4. . R Ré éa ac ct ti if fs s . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 12 28 8 II I II I. .5 5. . T Te ec ch hn ni iq qu ue e d du u p po on nt ta ag ge e t te er rm mi in no o- -l la at té ér ra al l . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 12 29 9 I
II II I. .6 6. . E Ec ch ho ot tr ra ac ck ki in ng g v va as sc cu ul la ai ir re e .. . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 13 33 3 I
II II I. .7 7. . P Pr ré él lè èv ve em me en nt t d de es s s su ub bs st ti it tu ut ts s . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 13 34 4
II I II I. .8 8. . E Eu ut th ha an na as si ie e d de es s l la ap pi in ns s .. . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 13 34 4
8 RESULTATS ET DISCUSSION ... 136 I. Fonctionnalité cellulaire et impact du cisaillement sur une matrice vasculaire naturelle fonctionnalisée et endothélialisée ... 138
I. I .1 1. . R Ré és su ul lt ta at ts s e ex xp pé ér ri im me en nt ta au ux x . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 13 38 8 I.1.1. Elaboration d’une matrice acellulaire... 138 I.1.2. Vérification du dépôt du film multicouche de polyélectrolytes ... 142 I.1.3. Endothélialisation des artères ... 144 I.1.4. Impact du film MPE (PAH-PSS)
3-PAH sur le comportement des cellules
endothéliales ... 146 I.1.5. Impact du film MPE (PAH-PSS)
3-PAH sur la rétention des CE après cisaillement ... 148 I
I. .2 2. . D Di is sc cu us ss si io on n . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 15 52 2 I. I .3 3. . C Co on nc cl lu us si io on n .. . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 15 56 6
II. Transfert et validation de la technique de recouvrement par des films multicouches de polyélectrolytes sur un vaisseau de référence : la veine saphène humaine ... 157
II I I. .1 1. . R Ré és su ul lt ta at ts s e ex xp pé ér ri im me en nt ta au ux x . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 15 57 7 II.1.1. Caractérisation in vitro de la veine saphène fonctionnalisée ... 157 II.1.2. Evaluation in vivo de la perméabilité de la veine saphène fonctionnalisée
par un film MPE ... 159 II I I. .2 2. . D Di is sc cu us ss si io on n . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 16 61 1 II I I. .3 3. . C Co on nc cl lu us si io on n . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 16 62 2
III. Evaluation in vivo d’un substitut endothélialisé ... 163
II I II I. .1 1. . R Ré és su ul lt ta at ts s e ex xp pé ér ri im me en nt ta au ux x .. . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 16 63 3
III.1.1. Evaluation in vivo du substitut ... 163
9 II I II I. .2 2. . D Di is sc cu us ss si io on n .. . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 17 74 4 II I II I. .3 3. . C Co on nc cl lu us si io on n . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 18 80 0
IV. Endothélialisation de la matrice artérielle par des cellules progénitrices
endothéliales : évaluation in vitro et in vivo ... 181
I IV V. .1 1. . R Ré és su ul lt ta at ts s e ex xp pé ér ri im me en nt ta au ux x . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 18 81 1 IV.1.1. Caractérisation in vitro ... 181
IV.1.1.1. Cellularisation à l’aide de cellules endothéliales-like ... 181
a. Evaluation du recouvrement cellulaire ... 181
b. Evaluation de la rétention des cellules endothéliales-like en condition dynamique ... 183
IV.1.1.2. Cellularisation à l’aide de cellules endothéliales-like ... 185
IV.1.2. Caractérisation in vivo ... 186
IV.1.3. Caractérisation post-explantation ... 187
I IV V. .2 2. . D Di is sc cu us ss si io on n .. . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 18 89 9 IV I V. .3 3. . C Co on nc cl lu us si io on n . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 1 19 92 2 CONCLUSION GENERALE ... 193
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 196
ANNEXE ... 215
LISTE DES TRAVAUX ... 220
10
° : degré
°C : degré Celcius
% : pourcentage
τ : contrainte de cisaillement µ : viscosité
µL : microlitre
acétyl-LDL :
dil-acetyled low density lipoprotein /lipoprotéine dil-acétylée de faible densité
ADN : acide désoxyribonucléique
ADNc : acide désoxyribonucléique complémentaire ADMA : diméthylarginine asymétrique
AMM : autorisation de mise sur le marché AOD : artère ombilicale désendothélialisée ARN : acide ribonucléique
α-SM-actine : α- smooth muscle actin / α-actine de muscle lisse
ATP : adénosine triphosphate AVC : accident vasculaire cérébral BSA : sérumalbumine bovine C : cellule
CD : cluster de différenciation CE : cellule endothéliale
CE-like : cellule endothéliale-like CEC : cellule endothéliale circulante Ci : cisaillement
CLSM :
confocal laser scanning microscopy /microscopie confocale
cm
2: centimètre carré
CML : cellule musculaire lisse CS : cellule souche
CSA : cellule souche adulte
CSH : cellule souche hématopoïétique
CSM : cellule souche mésenchymateuse DMSO : diméthylsulfoxyde
EBM-2: endothelial basal medium-2 EDTA: ethylene diamine tetraacetic acid EGF : epidermal growth factor
eNOS : endothelial nitric oxide synthase EPC : cellule progénitrice endothéliale EPO : érythropoïétine
F : film
FGF : fibroblast growth factor g : gramme
g : gravité
