• Aucun résultat trouvé

Neural Precursor Cells: Interaction with  Blood‐brain barrier and Neuroprotective effect in an animal model of Cerebellar degeneration

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Partager "Neural Precursor Cells: Interaction with  Blood‐brain barrier and Neuroprotective effect in an animal model of Cerebellar degeneration"

Copied!
201
0
0

Texte intégral

(1)

   

   

Université Libre de Bruxelles  Faculté de Médecine 

 

Neural Precursor Cells: Interaction with   Blood‐brain barrier and Neuroprotective effect 

in an animal model of Cerebellar degeneration 

 

Thèse présenté en vue de l’obtention  du grade académique de  Docteur en Sciences Biomédicales 

 

Satyan Chintawar 

 

Promoteur : Professeur Massimo Pandolfo   

2009 

(2)

Neural Precursor Cells: Interaction with   Blood‐brain barrier and Neuroprotective effect 

in an animal model of Cerebellar degeneration 

   

             

   

(3)

                 

Dedicated to

(4)

               

 

Millions of people  Suffering from 

Neurodegenerative disorders

(5)

                 

And 

Dear Aai‐Baba  (my parents) 

(6)

 

ACM – astrocyte conditioned media  ACSF ‐ artificial cerebrospinal fluid  ANOVA – analysis of variance  aNPCs – adult neural precursor cells  ATP – adenosine triphosphate  AXN1 – ataxin‐1 

BBB – blood‐brain barrier 

BBB‐ECs – blood‐brain barrier endothelial cells  BDA – biotynalated dextran‐amine 

BDNF – brain‐derived neurotrophic factor  bFGF – beta fibroblast growth factor  BrdU – bromodeoxyuridine 

Calb – calbindin  CBX – carbenoxolone 

CCL2 – chemokine (C‐C motif) ligand  2  CE – coefficient of error 

CFSE – carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester  CNS – central nervous system 

CV – coefficient of variation  Cx26 – connexin26 

Cx43 – connexin43  Cxs – connexins  Cy3 – cyanine3 

DAPI – 4',6‐diamidino‐2‐phenylindole  DCN – deep cerebellar nuclei 

(7)

ECs – endothelial cells 

EGF – epidermal growth factor  FBS – fetal bovine serum  FCS – fetal calf serum  GalC – galactocerebroside 

GBSS – Gey’s balanced salt solution  GCL – granule cell layer 

GDNF – glial cell line‐derived neurotrophic factor  GFAP – glial fibrillary acidic protein 

GFP – green fluorescent protein  GJI – gap junction inhibitor  GL – granular layer 

hfNPCs – human fetal neural precursor cells  hNSCs – human neural stem cells 

HPAECs – human pulmonary artery endothelial cells  HSCs ‐ hematopoietic stem cells 

i.p. – intraperitoneal  IL‐8 – interleukin‐8 

ISNPCs – induced self‐renewing neural progenitor/stem cells  LIF – leukemia inhibitory factor 

LY – lucifer yellow 

MAP‐2 – microtubule associated protein‐2  MCP‐1 – monocyte chemoattractant protein‐1  ML – molecular layer 

mNSCs – mouse neural stem cells  NeuN – neuronal nuclei 

(8)

NSCM ‐ neural stem cell media  NSCs – neural stem cells  NT‐3 – neurotrophin‐3  OCs – organotypic cultures  PBS – phosphate buffered saline  PCL – Purkinje cell layer 

PCs – Purkinje cells  PFA – paraformaldehyde  PI – propidium iodide  PLL – poly‐l‐lysine  PN – Purkinje neuron  RD – rhodamine dextran  RNA – ribonucleic acid  RNAi – RNA interference 

RT‐PCR – real‐time polymerase chain reaction  SC medium – stem cell medium 

SCA1 – Spinocerebellar ataxia type 1  SCI – spinal cord injury 

SEM – standard error mean  SGZ – subgranular zone   siRNA – small interfering RNA  SVZ ‐ subventricular zone 

TPA – tissue plasminogen activator  wm – white matter 

wt – wild type 

(9)

 

1. General Introduction ... 1 

1.1. Cerebellum ... 2 

1.1.1. Gross anatomical division ... 2 

1.1.2. Phylogenetic and functional divisions ... 3 

1.1.3. Basic structure of the cerebellar cortex ... 4 

1.2. Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) ... 5 

1.3. Stem Cell Biology ... 6 

1.3.1. Background ... 7 

1.3.2. Adult stem cells ... 9 

1.3.3. Neurogenesis in the adult brain ... 9 

1.4. Cellular Therapy ... 12 

1.5. Interaction of NSCs and brain endothelial cells  ... 13 

1.6. References  ... 15 

2. Grafting Neural Precursor Cells promotes functional recovery in an SCA1 mouse model  ... 17 

Abstract ... 19 

Introduction ... 20 

Materials and Methods ... 22 

Isolation and culture of NPCs ... 22 

Immunocytochemistry ... 22 

Stereotaxic transplantation ... 23 

Motor behavior assessment ... 23 

     1. Accelerating rotarod test... 23 

     2. Grip strength test ... 24 

Brain processing ... 24 

     Histology and Immunofluorescence on brain sections ... 24 

(10)

Confocal imaging and image analysis ... 25 

Stereology ... 26 

Statistics ... 26 

Results ... 27 

Isolation and culture of adult murine neural precursor cells ... 27 

Transplantation of NPCs improves the motor phenotype of SCA1 mice... 27 

Rescue of mutant Purkinje cells and dendritic arbors by grafted NPCs ... 29 

Migration and homing of grafted NPCs ... 33 

Grafted NPCs restore the basal membrane potential of Purkinje cells ... 34 

Discussion ... 39 

References ... 42 

Supplemental information ... 47 

3. Communication via Gap junctions underlies early functional and beneficial interactions between       grafted neural stem cells and the host ... 58 

Summary ... 60 

Introduction ... 61 

Results ... 63 

Differentiation and integration of grafted NSCs ... 63 

Development of membrane properties ... 66 

Grafted cells integrate into calcium‐mediated functional network ... 66 

Grafted cells establish gap‐junctional couplings with organotypic culture cells ... 72 

Grafted human NSCs display similar patterns of gap‐junction mediated interaction ... 76 

NSCs improve survival of organotypic striatal cultures and promote a decrease in gliosis ... 76 

Blocking gap junction formation and function ... 77 

Contact‐dependent rescue of neurons in vivo by NSCs is accompanied by and dependent upon gap  junction formation ... 81 

Discussion ... 89 

(11)

NSC integration is beneficial for the host ... 92 

Experimental Procedures ... 95 

Neural Stem Cells (NSCs) ... 95 

Organotypic cultures ... 96 

Stem cell grafting into organotypic culture ... 97 

Immunohistochemistry ... 97 

Electrophysiology ... 97 

Calcium imaging ... 98 

Dye coupling ... 99 

Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) mouse model ... 100 

Nervous (nr) mouse model ... 100 

Model of contused cervical spinal cord in adult rats ... 100 

RNA interference (RNAi) ... 101 

Statistical analysis ... 101 

Acknowledgements ... 102 

References ... 103 

Supplemental material ... 111 

4.Blood‐brain barrier promotes differentiation of human fetal neural precursor cells ... 148 

Abstract ... 150 

Introduction ... 151 

Materials and Methods ... 153 

Human fetal NPCs isolation and culture ... 153 

Multipotentiality and clonal analysis ... 153 

Isolation and culture of primary endothelial cells and astrocytes ... 154 

Transendothelial migration... 154 

Immunocytochemistry and phenotypic analysis ... 155 

(12)

Results ... 157 

Generation of neurospheres from human fetal brain tissues ... 157 

Trans‐BBB‐EC migration of hfNPCs and phenotypic profile ... 158 

MCP‐1/CCL2 blockade reduces trans‐BBB migration and differentiation of hfNPCs ... 161 

hfNPCs did not migrate through but differentiate on human pulmonary artery endothelial cells only  after addition of recombinant MCP‐1... 162 

Discussion ... 166 

References ... 169 

Supplemental Data ... 171 

5. General Conclusions and Perspectives ... 176 

6. Summary ... 180 

Acknowledgements ... 183 

Curriculum Vitae ... 186 

Publications ... 187   

(13)

 

General Introduction 

                                 

1

(14)

nlike automobiles, humans get along pretty well for most of their lives with their original parts. 

But organs do sometimes fail, and we can’t go to the mechanic for an engine rebuild or a new  water pump—at least not yet. Medicine has battled back many of the acute threats, such as infection,  that curtailed human life in past centuries. Now, chronic illnesses and deteriorating organs pose the  biggest drain on human health and they will only increase in importance as the population ages as tissue  regeneration in human is limited. Some other animals possess extraordinary regenerative capabilities. 

For e.g. freshwater planarians properly regenerate a head or tail after amputation (Gurley et al., 2008). 

Adult vertebrate such as zebrafish regenerate an impressive array of structures, including spinal cord,  optic nerve, heart, and fins (Whitehead et al., 2005). Salamander can regenerate its limbs and tail, upper  and lower jaws, ocular tissues, and small section of the heart (Brockes and Kumar, 2005). Regenerative  capabilities of these animals depend upon stem cells which are key players in regeneration process and  are critically involved in the development and maintenance of mammalian tissues. 

1.1. Cerebellum 

With 100 billion nerve cells and 100 trillion connections, the brain is the most complex biological  structure. The cerebellum is a critical component of the brain that plays an important role in the  integration of sensory perception, coordination and motor control and contains more neurons and  synapses than the rest of the brain. In order to coordinate motor control, there are many neural  pathways linking the cerebellum with the cerebral motor cortex (which sends information to the  muscles causing them to move) and the spinocerebellar tract (which provides proprioceptive feedback  on the position of the body in space). The cerebellum integrates these pathways, using the constant  feedback on body position to fine‐tune motor movements.  

1.1.1. Gross anatomical divisions 

The cerebellum is a large structure at the back of the brain, immediately behind the brainstem and  below the occipital cortex and accounts for about 10% of total brain mass.  The outer, grey matter or  cortex is convoluted into many folia.  Three major transverse divisions ‐ lobes ‐ are recognized.  The  anterior lobe is most rostral, followed by posterior lobe and flocculo‐nodular lobe more caudally.  These  lobes are divided by the primary fissure and the posterolateral fissure, respectively. Independent of the  transverse, lobular arrangement, three major sagittal divisions are recognized.  The central longitudinal  strip of cortex is the vermis. On each side, the vermis is divided from the lateral cerebellar hemispheres by  the narrow pars intermedia. In man, the hemispheres are so highly developed that they obscure pars 

(15)

intermedia and much of the vermis. The cerebellar cortex overlies a core of white matter.  At the centre is  a collection of nuclei ‐ the deep cerebellar nuclei (DCN). These are the output areas of the cerebellum,  receiving inputs from the cortex and projecting out to the thalamus, red nucleus and brainstem. From  medial to lateral they are the fastigial, interpositus (in man, this is subdivided into the globose and  emboliform nuclei) and dentate nuclei. 

1.1.2. Phylogenetic and functional divisions 

The cerebellum can also be divided in three parts based on both phylogenetic criteria (the evolutionary  age of each part) and on functional criteria (the incoming and outgoing connections each part has and  the role played in normal cerebellar function). From the phylogenetically oldest to the newest, the three  parts are: 

 Vestibulocerebellum : The vestibulocerebellum regulates balance and eye movements. It receives  vestibular input from both the semicircular canals and from the vestibular nuclei, and sends fibres back  to the medial and lateral vestibular nuclei. It also receives visual input from the superior colliculi and  from the visual cortex (the latter via the pontine nuclei, forming a cortico‐ponto‐cerebellar pathway). 

Lesions of the vestibulocerebellum cause disturbances of balance and gait. 

Spinocerebellum : The spinocerebellum regulates body and limb movements. It receives proprioception  input from the dorsal columns of the spinal cord (including the spinocerebellar tract) as well as from the  trigeminal nerve, as well as from visual and auditory systems. It sends fibres to deep cerebellar nuclei  which in turn project to both the cerebral cortex and the brain stem, thus providing modulation of  descending motor systems. The spinocerebellum contains sensory maps as it receives data on the  position of various body parts in space: in particular, the vermis receives fibres from the trunk and  proximal portions of limbs, while the intermediate parts of the hemispheres receive fibres from the  distal portions of limbs. The spinocerebellum is able to elaborate proprioceptive input in order to  anticipate the future position of a body part during the course of a movement, in a "feed forward" 

manner. 

Neocerebellum : The neocerebellum is involved in planning movement and evaluating sensory 

information for action. It receives input exclusively from the cerebral cortex (especially the parietal lobe)  via the pontine nuclei (forming cortico‐ponto‐cerebellar pathways), and sends fibres mainly to the  ventrolateral thalamus (in turn connected to motor areas of the premotor cortex and primary motor 

(16)

area of the cerebral cortex) and to the red nucleus (in turn connected to the inferior olivary nucleus,  which links back to the cerebellar hemispheres). The neocerebellum is involved in planning movement  that is about to occur and has purely cognitive functions as well. 

1.1.3. Basic structure of the cerebellar cortex 

Throughout its highly convoluted extent, the cerebellar cortex can be divided into three layers with the  same basic neuronal circuitry everywhere, involving five main cell types (Fig. 1). The most conspicuous  of these are the Purkinje cells (PCs), which form an orderly monolayer interposed between the granular  and molecular layers, extending their planar dendritic trees into the molecular layer above. As these  cells are the sole output neurons of the cerebellar cortex, they are central to cerebellar cortical  information processing. The granular layer below the PCs derives its name from the small, densely  packed granule neurons that send their axons into the molecular layer, where they bifurcate to become  parallel fibres (Fig. 1). These run parallel to the long axis of each folium and as a result they intersect the  fan‐like dendritic trees of many PCs. Mossy fibre afferents target granule cells and, therefore, excite the  PCs indirectly through the granule cell–parallel fibre pathway, which causes the PCs to discharge ‘simple  spikes’ (conventionalaction potentials). They also contact various types of interneuron in the cerebellar  cortex, both directly and indirectly through the parallel fibres. The other main class of cerebellar  afferent is the climbing fibres, which arise exclusively from the inferior olive, a well‐defined complex of  sub‐nuclei in the ventral part of the caudal brain stem. In marked contrast to the indirect influence of  mossy fibres, the climbing fibres make direct synaptic contact with PCs (Fig. 1). Moreover, each PC  receives input from just one climbing fibre but the contact is so extensive that climbing fibres generate  the largest depolarizing event seen in any neuron: a highly characteristic burst of impulses known as a  climbing fibre response or complex spike (Apps and Garwicz, 2005). 

   

(17)

  Fig 1. Basic structure of the cerebellar cortex. There are two main afferents to the cerebellar cortex: climbing  fibres, which make direct excitatory contact with the Purkinje cells, and mossy fibres, which terminate in the  granular layer and make excitatory synaptic contacts mainly with granule cells, but also with Golgi cells. In some  cases, the stem axons of climbing and mossy fibres also provide collaterals to the cerebellar nuclei en route to the  cerebellar cortex. The ascending axons of the granule cells branch in a T‐shaped manner to form the parallel fibres,  which, in turn, make excitatory synaptic contacts with Purkinje cells and molecular layer interneurons — that is,  stellate cells and basket cells. Typically, parallel fibres extend for several millimetres along the length of individual  cerebellar folia. With the exception of granule cells, all cerebellar cortical neurons, including the Purkinje cells,  make inhibitory synaptic connections with their target neurons. Adapted by permission from Macmillan Publishers  Ltd: Nat. Rev. Neurosci. Anatomical and physiological foundations of cerebellar information processing, copyright  2005. 

 

Cerebellar degeneration is a disease process in which neurons in the cerebellum deteriorate and die and  is most often the result of inherited genetic mutations that alter the normal production of specific  proteins that are necessary for the survival of neurons. Dysfunction or loss of neurons within it present  as feedback deficits resulting in disorders in fine movement, equilibrium, posture, and motor learning. 

 

1.2. Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) 

The word "ataxia", comes from the Greek word, "ataxis" meaning "loss of order". People with ataxia  have problems with coordination because parts of the nervous system that control movement and  balance are affected. Ataxia may affect the fingers, hands, arms, legs, body, speech, and eye  movements. The cerebellar ataxia is the most common form of ataxia and is caused by dysfunction 

(18)

either within the cerebellum or in its afferent and efferent pathways. The term Spinocerebellar ataxia  (SCA) was originally used to indicate anomalous function of the spinocerebellum, the part of the  cerebellar cortex that receives input from the spinal cord. In the current terminology, however, SCA is  used to refer to the hereditary forms, and in particular the autosomal dominant forms of degenerative  ataxias (Carlson et al., 2009). Although many of these disorders lead to dysfunction of cerebellar PCs,  other involves the deep cerebellar nuclei, brainstem nuclei, and spinal sensory as well as spinocerebellar  tracts.  

 Currently, 28 SCAs are recognized. Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) is an autosomal‐dominant  neurodegenerative disorder caused by the expansion of a CAG repeat in the SCA1 gene. The CAG repeat  encodes for a polyglutamine tract in the SCA1 gene product, ataxin‐1 (Orr et al., 1993). The number of  CAG repeats in ataxin‐1 gene is highly polymorphic in the general population, ranging from 6 to 44, the  longer (>21) repeats being interrupted by one to four CAT triplets. SCA1 patients typically have 

expansions between 39 and 82 uninterrupted CAG repeats  (Chung et al., 1993). The length of the CAG  repeat and consequently of the polyglutamine tract is inversely proportional to the age of onset and  directly to the severity of the disease (Servadio et al., 1995). SCA1 is also a member of a group of  polyglutamine disorders that includes Spinocerebellar ataxia types 2, 3, 6, 7, 17, Huntington’s disease,  Spinobulbar muscular atrophy, Dentatorubropallidoluysian atrophy. As described later in chapter 2,  SCA1 is usually a late‐onset disorder characterized by progressive cerebellar ataxia, pyramidal,  extrapyramidal and oculomotor abnormalities, peripheral neuropathy and cognitive impairment. 

Pathologically, loss of cerebellar PCs and of brain stem neurons is hallmark of the disease.  

Currently, effective therapeutics is not available to treat patients of SCA1 and other polyglutamine  diseases, largely due to the lack of understanding of the functional role of these proteins and pathogenic  mechanisms associated with the disease. In mid 1990s, collaborative efforts of Dr Harry Orr and Dr Huda  Zoghbi groups generated transgenic mice expressing the human SCA1 gene with an expanded CAG tract  (Burright et al., 1995). These mice develop a progressive motor disorder starting at 5 weeks of age, prior  to any alteration of cerebellar morphology. By 12 weeks of age, their PCs start to show a shrunken  dendritic tree, ectopically located cell bodies in the molecular layer, and an initial decline in number. 

Significant PC loss (about a third) occurs by 24 weeks of age. We investigated the potential of our  therapeutic strategy for SCA1 by testing it in the B05 transgenic model. 

     

(19)

 

1.3. Stem Cell Biology   

Stem cell research has opened one of the most fascinating chapters in the history of biology. 

Traditionally belonging to the field of developmental biology, stem cells have become of increasing  interest for biomedical research in more recent years. Tissue engineering, therapeutic cloning,  transgenic animals and gene therapy are among the most discussed applications. 

 

1.3.1. Background    

Stem cells are undifferentiated cells that can divide indefinitely. They can either divide symmetrically,  producing two identical daughter cells, or asymmetrically producing one identical and one more  differentiated daughter cell (Lin and Schagat, 1997). The least differentiated stem cell type is the  omnipotent or totipotent stem cell. It is found in early mammalian embryos (4 – 8 cell stage) and can  form any cell type or tissue including the entire fetus and the placenta (Ralston and Rossant, 2005). The  inner cell mass of the blastocyst contains pluripotent stem cells (Thomson et al., 1998). These embryonic  stem (ES) cells can be maintained in an undifferentiated state in culture, can differentiate in virtually any  kind of cell type, but are not capable of forming an entire embryo. ES cells can be differentiated into  multipotent stem cells, which are restricted to their specific lineage. These are hematopoietic, 

mesenchymal, endodermal or neural stem cells. These lineages follow specific differentiation patterns,  with increasingly specialized cells (see Fig. 2). By applying the appropriate clues in a defined order it is  possible to direct an ES cell towards a specific cell type (Bibel et al., 2004). However, the controversy  over using human embryos as a source of these cells have led to intensified research to find stem cells in  adult tissues. 

(20)

   

Fig. 2. Characteristics of Embryonic stem cells. Figure courtesy of www.situgen.com 

(21)

1.3.2. Adult stem cells   

For five decades hematopoietic stem cells have been the only adult stem cells known and investigated. 

More recently, it was discovered that numerous adult tissues contain stem cells. Normally these cells  are involved in the homeostatic self‐renewal and regenerative processes, but are occasionally activated  for repair activity (Reya and Clevers, 2005). The lumen of the intestine for example is replaced about  once a week. Blood and skin are constantly renewed, hair and nails constantly grow. All these systems  depend on small local populations of stem cells, which are highly regulated. If the specific program of  proliferation, migration and differentiation fails, the respective tissue will either become dysfunctional  or cancerous. The arrangement of these proliferative systems is surprisingly conservative for the  different tissues where adult stem cells are found. Generally a population of stem cells is harbored in a  defined niche. The stem cells proliferate slowly, maintain the size of population and produce another  population of transient amplifying precursor cells. These proliferate at a higher rate, and migrate  towards the final destination of the specific mature cell type. This results in a differentiation gradient  from the stem cell along to the migratory precursor cell to the fully differentiated cell. 

 

1.3.3. Neurogenesis in the adult brain   

It has been a common understanding that in postnatal mammals no new neurons are added to the CNS  and that any further changes can only be adopted through rewiring of the synaptic connections. In fact  this dogma originates from early works at the end of the nineteenth century describing the 

developmental and adult brain of humans and other mammals (Ramon y Cajal, 1999). These 

investigators found that the architecture of the brain appears to be fixed soon after birth. At the cellular  level, neither mitotic nor developing neurons were observed. Although there were occasional reports on  mitotic cells in the brain of adult mammals, the available experimental methods could not convincingly  prove that these new cells would differentiate into neurons and be functionally integrated. Using 

autoradiography to track 3H Thymidine, incorporated by proliferating cells during mitosis, Joseph Altman  published a series of papers in the nineteen sixties showing evidence for adult neurogenesis in the rat  and cat (for review see Gross, 2000). The scientific community did not recognize the significance of his  results. Although Altman’s experiments were repeated and combined with electron microscopy, and  additional evidence for neurogenesis in songbirds and rats was presented (Kaplan and Hinds, 1977; 

Nottebohm, 1985), the observation of neurogenesis in the adult brain did not get much attention. In  1992 Reynolds and Weiss (Reynolds and Weiss, 1992) successfully isolated NSCs from adult rodent brain  and expanded in vitro. Moreover, new techniques emerged. Instead of tritiated thymidine, 

(22)

bromodeoxyuridine (BrdU) was used as a proliferation marker. BrdU can easily be labeled with  immunohistochemical methods and investigated with brightfield and fluorescence microscopy. In  addition specific antibodies against neuronal or glial markers were developed, providing easy methods  to distinguish neurons from glia. With the help of these methods adult neurogenesis has been 

demonstrated to exist until senescence in numerous mammalian species including humans. In 1998  Evan Snyder and colleagues (Flax et al., 1998) and Ronald Mckay and colleagues (Brustle et al., 1998)  independently isolated first human NSCs from aborted fetuses that can differentiate to all cell types  found in the brain. Soon in an interesting series of experiments, a team based in California and Sweden  (Fred Gage and colleagues) (Eriksson et al., 1998) discovered that hippocampus produces new neurons  into old age raising a possibility of inducing patient’s own brain cells to regenerate cells lost to disease. 

More recently Steven Goldman and colleagues (Nunes et al., 2003) have isolated multipotent progenitor  cells from the adult human brain opening the possibility of implantation strategies of cell‐based 

neurological therapy. Since then NSCs garnered the interest of not only developmental community but  also neural repair, gene therapy and transplant communities once it was recognized that NSCs can be  expanded ex vivo and once reimplanted into the mammalian brain can reintegrate into neural circuitry  (Snyder et al., 1992). 

Now it is accepted that neurogenesis persists in a mammalian brain throughout adulthood and has been  clearly demonstrated at least in two locations under normal conditions: the subventricular zone (SVZ) of  lateral ventricles and subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus in the hippocampus (Bonfanti and  Peretto, 2007; Ihrie and Alvarez‐Buylla, 2008; Zhao et al., 2008). (see Fig.3) 

       

(23)

   

Fig. 3 Adult Neurogenesis : (A) Depictions of sagittal and coronal views of mouse brain in areas where 

neurogenesis occurs. Red areas indicate the germinal zones in the adult mammalian brain: the subgranular zone  (SGZ) of the dentate gyrus in the hippocampus and the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles. Neurons  generated in the SVZ migrate through the rostral migratory stream and are incorporated into the olfactory bulb. 

(B–E) Neurogenesis revealed by BrdU incorporation in the olfactory bulb (B), rostral migratory stream (C), SVZ (D),  and dentate gyrus (E). Inset in (C) is a sagittal view of rostral migratory stream before reaching the olfactory bulb,  and inset in (E) is a high‐magnification view of the area indicated by the arrow in (E). Colors indicate the following: 

red, BrdU; green, NeuN. (F and G) Newborn neurons in the olfactory bulb and dentate gyrus labeled by retrovirus‐

mediated expression of green fluorescent protein (GFP). Insets are high‐magnification views of the cells indicated  by arrows. Colors indicate the following: red, NeuN; green, GFP; blue, DAPI. Reprinted from Cell, 132, 4, Chunmei  Zhao, Wei Deng and Fred H. Gage, Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis, 645‐60,  Copyright (2008), with permission from Elsevier. 

 

(24)

1.4. Cellular Therapy 

Cells are the functional unit of the human body. Many of the diseases that afflict humans are caused by  cell damage or because cells die and are lost. Many examples include‐‐ Congestive heart failure where  heart cells are alive but lost the ability to contract, Type 1 diabetes where insulin producing cells are  lost, Alzheimer’s and Parkinson’s disease where particular types of neurons are lost. Muscular 

dystrophies are the result of death of muscle cells and tissues. Spinal cord injuries, Retinitis pigmentosa  are some other examples. Many diseases which are the product of breakdown in the cell which is not  then regenerated, treatment approaches by either stimulating endogenous cell genesis or provide them  exogenously are possible to imagine. In SCA1, Purkinje neuron dysfunction is followed by their death. 

Cellular therapy using tissue‐specific cells either isolated from patients himself or donors or derived  from pluripotent stem cells holds promise for treatment of many devastating diseases and injuries 

Adult mammalian brain having limited capacity of regeneration in discrete areas often fail to regenerate  the injured or insulted tissue because of an inhospitable environment that contains growth inhibitory  proteins and also considerably due to the intrinsic property acquired by precursor cell during 

development (Goldberg et al., 2002). Due to lack of inherent ability of the brain to recruit PCs lost during  the disease and the poor knowledge of the developmental roadmap for generating PCs from 

endogenous stem cells, grafting stem cells in SCA1 mice would be an appropriate therapeutic approach. 

Bone marrow contains multipotent hematopoietic stem cells (HSCs) that continuously produce blood  cells throughout our lifetime. HSC transplantation (established since 1960s) has proven to be a life‐

saving therapy for diseases refractory to other treatments (Bertz et al., 2002) and have provided “proof  of principle” that stem cells can restore loss of function (Parkman, 1986). Patients with extensive burns  can be treated with stem cells residing in their own skin. For implantation in B05 mice, it is conceivable  to implant NSCs, which can only generate neural and glial cells (Fig. 4) and are safe as compared to  pluripotent stem cells which can inflict tumor formation (Roy et al., 2006). Translating this approach is  relatively straightforward as it involves autologous transplantation and excludes harmful 

immunosuppressive therapy. Moreover, there are limitations and ethical issues involved in isolating  NSCs from aborted fetal tissues.  In addition, murine adult NSCs transplantation has proven safe and  effective in number of animal models of neurological diseases and injury (see chapter 2).  

(25)

  Fig 4. Neural stem cells (NSCs) differentiation pattern. NSCs are undifferentiated cells originating in the central  nervous system. They have the potential to give rise to offspring cells that grow and differentiate into neurons and  glial cells. Figure courtesy of www.sigma‐aldrich.com 

 

In the first manuscript (chapter 2), we report the data on grafting adult neural precursor cells (NPCs) in a  B05 mouse model mimicking human SCA1 and the detailed investigation where we demonstrate that  NPCs are neuroprotective if implanted only in animals that had already suffered a significant PC loss at  the time of transplantation. Recent published data suggests that neural stem/precursor cells promote  recovery in animal models via a number of indirect bystander effects. A comprehensive knowledge of  how transplanted NPCs exert their therapeutic effect is still lacking. In the second manuscript (chapter  3), we discuss on the possible mechanism of neuroprotective effect of NPCs in SCA1 mice. 

1.5. Interaction of NSCs and brain endothelial cells 

Stem cell therapy has been shown to have considerable therapeutic potential for neurodegenerative  diseases; however, most experiments in animals have been performed by injecting cells directly into the  injured parenchyma with limited migration. Intravascular administration of stem cells would be 

attractive to achieve distribution in the whole brain, important especially in diffuse neurodegenerative  and neuroinflammatory diseases. In addition, it has several other advantages as it is minimally invasive  and avoids post‐surgical trauma and the possibility of repetitive injections. However, it is unknown if  systemically injected NSCs can penetrate intact blood‐brain barrier (BBB) endothelium if inflamed  parenchyma present an attractive signal. Furthermore, there are several published reports suggesting 

(26)

endothelium instructing stem cell fate and survival and thus are key players in a stem cell niche (in brain  as well as other organs). In this study (chapter 4), we wished to explore whether NPCs can get across an  intact BBB endothelium and how their proliferation and differentiation properties are affected by this  interaction using an established in vitro model of human BBB (Fig. 4) 

 

  Fig. 4. Human in vitro BBB model. Schematic illustration of the preparation of in vitro model of BBB. Temporal lobe  specimens from young adults undergoing surgery for the treatment of epilepsy were obtained from the hospital’s  operating room. BBB endothelial cells (BBB‐ECs) were isolated and expanded (described in chapter 4) in 

endothelial cell medium. For transendothelial migration assay, Boyden chambers were pre‐coated with gelatin and  BBB‐ECs were seeded on the membrane in endothelial cell medium and astrocyte conditioned medium and  allowed to form a monolayer. In Boyden chamber, upper compartment represent blood and lower compartment  represent brain.   

 

Overall, this study focuses on the suitability of adult NSCs for the treatment of cerebellar degenerative  diseases, SCA1 in particular and the importance of NSC‐brain endothelium crosstalk for the maintenance  of brain stem cell niche. 

     

(27)

1.6. References   

Apps R, Garwicz M (2005) Anatomical and physiological foundations of cerebellar information  processing. Nat Rev Neurosci 6:297‐311. 

Bertz H, Illerhaus G, Veelken H, Finke J (2002) Allogeneic hematopoetic stem‐cell transplantation for  patients with relapsed or refractory lymphomas: comparison of high‐dose conventional  conditioning versus fludarabine‐based reduced‐intensity regimens. Ann Oncol 13:135‐139. 

Bibel M, Richter J, Schrenk K, Tucker KL, Staiger V, Korte M, Goetz M, Barde YA (2004) Differentiation of  mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nat Neurosci 7:1003‐1009. 

Bonfanti L, Peretto P (2007) Radial glial origin of the adult neural stem cells in the subventricular zone. 

Prog Neurobiol 83:24‐36. 

Brockes JP, Kumar A (2005) Appendage regeneration in adult vertebrates and implications for  regenerative medicine. Science 310:1919‐1923. 

Brustle O, Choudhary K, Karram K, Huttner A, Murray K, Dubois‐Dalcq M, McKay RD (1998) Chimeric  brains generated by intraventricular transplantation of fetal human brain cells into embryonic  rats. Nat Biotechnol 16:1040‐1044. 

Burright EN, Clark HB, Servadio A, Matilla T, Feddersen RM, Yunis WS, Duvick LA, Zoghbi HY, Orr HT  (1995) SCA1 transgenic mice: a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG  trinucleotide repeat. Cell 82:937‐948. 

Carlson KM, Andresen JM, Orr HT (2009) Emerging pathogenic pathways in the spinocerebellar ataxias. 

Curr Opin Genet Dev 19:247‐253. 

Chung MY, Ranum LP, Duvick LA, Servadio A, Zoghbi HY, Orr HT (1993) Evidence for a mechanism  predisposing to intergenerational CAG repeat instability in spinocerebellar ataxia type I. Nat  Genet 5:254‐258. 

Eriksson PS, Perfilieva E, Bjork‐Eriksson T, Alborn AM, Nordborg C, Peterson DA, Gage FH (1998)  Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nat Med 4:1313‐1317. 

Flax JD, Aurora S, Yang C, Simonin C, Wills AM, Billinghurst LL, Jendoubi M, Sidman RL, Wolfe JH, Kim SU,  Snyder EY (1998) Engraftable human neural stem cells respond to developmental cues, replace  neurons, and express foreign genes. Nat Biotechnol 16:1033‐1039. 

Goldberg JL, Klassen MP, Hua Y, Barres BA (2002) Amacrine‐signaled loss of intrinsic axon growth ability  by retinal ganglion cells. Science 296:1860‐1864. 

Gross CG (2000) Neurogenesis in the adult brain: death of a dogma. Nat Rev Neurosci 1:67‐73. 

Gurley KA, Rink JC, Sanchez Alvarado A (2008) Beta‐catenin defines head versus tail identity during  planarian regeneration and homeostasis. Science 319:323‐327. 

Ihrie RA, Alvarez‐Buylla A (2008) Cells in the astroglial lineage are neural stem cells. Cell Tissue Res  331:179‐191. 

Kaplan MS, Hinds JW (1977) Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light  radioautographs. Science 197:1092‐1094. 

Lin H, Schagat T (1997) Neuroblasts: a model for the asymmetric division of stem cells. Trends Genet  13:33‐39. 

Nottebohm F (1985) Neuronal replacement in adulthood. Ann N Y Acad Sci 457:143‐161. 

Nunes MC, Roy NS, Keyoung HM, Goodman RR, McKhann G, 2nd, Jiang L, Kang J, Nedergaard M, 

Goldman SA (2003) Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the  subcortical white matter of the adult human brain. Nat Med 9:439‐447. 

Orr HT, Chung MY, Banfi S, Kwiatkowski TJ, Jr., Servadio A, Beaudet AL, McCall AE, Duvick LA, Ranum LP,  Zoghbi HY (1993) Expansion of an unstable trinucleotide CAG repeat in spinocerebellar ataxia  type 1. Nat Genet 4:221‐226. 

(28)

Parkman R (1986) The application of bone marrow transplantation to the treatment of genetic diseases. 

Science 232:1373‐1378. 

Ralston A, Rossant J (2005) Genetic regulation of stem cell origins in the mouse embryo. Clin Genet  68:106‐112. 

Ramon y Cajal, S. Texture of the nervous system of man and the vertebrates (Trans. Pasik, P & Paqsik, T     from the 1899‐1904 Spanish edn) (Springer, Vienna, 1999). 

Reya T, Clevers H (2005) Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature 434:843‐850. 

Reynolds BA, Weiss S (1992) Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult  mammalian central nervous system. Science 255:1707‐1710. 

Roy NS, Cleren C, Singh SK, Yang L, Beal MF, Goldman SA (2006) Functional engraftment of human ES  cell‐derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase‐immortalized  midbrain astrocytes. Nat Med 12:1259‐1268. 

Servadio A, Koshy B, Armstrong D, Antalffy B, Orr HT, Zoghbi HY (1995) Expression analysis of the ataxin‐

1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals. Nat Genet 10:94‐

98. 

Snyder EY, Deitcher DL, Walsh C, Arnold‐Aldea S, Hartwieg EA, Cepko CL (1992) Multipotent neural cell  lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum. Cell 68:33‐51. 

Thomson JA, Itskovitz‐Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM (1998)  Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282:1145‐1147. 

Whitehead GG, Makino S, Lien CL, Keating MT (2005) fgf20 is essential for initiating zebrafish fin  regeneration. Science 310:1957‐1960. 

Zhao C, Deng W, Gage FH (2008) Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis. Cell  132:645‐660.

 

(29)

   

 

Grafting Neural Precursor Cells promotes functional recovery in an  SCA1 mouse model 

Abbreviated Title: Neural Precursor cells are neuroprotective in an SCA1 mouse model 

Satyan Chintawar1, Raphael Hourez, Ajay Ravella, David Gall2David Orduz2  

Myriam Rai1, Don Patrick Bishop2, Stefano Geuna 3, Serge N Schiffmann2, Massimo Pandolfo1 

1Laboratory of Experimental Neurology, 2Laboratory of Neurophysiology, 

Université Libre de Bruxelles, Route de Lennik 808, 1070 Brussels, Belgium. 

3Department of Clinical and Biological Sciences and Cavalieri Ottolenghi Scientific Institute, 

University of Turin, Orbassano (TO), 10043 Italy 

§ contributed equally 

J Neurosci. 2009 Oct 21;29(42):13126‐35 

2

(30)

 

Correspondence should be addressed to MP.  

Prof. Massimo Pandolfo Chef de Service Service de Neurologie Hôpital Erasme ‐ Université Libre de  Bruxelles Route de Lennik 808 1070 Brussels Belgium Phone +32‐2‐555‐3429 Fax +32‐2‐555‐3942 

Email: massimo.pandolfo@ulb.ac.be 

Number of figures : 7  Number of tables : 2 

Contents of supplemental material : Methods and figures of qRT‐PCR, western blotting, confocal 

profiling image for colocalization, dissector image for stereological PC count, detailed description of  experimental procedures and image acquisition tools, softwares used, and 4 videos 

Number of pages : 35 

Number of words for Abstract : 200 

Introduction : 691 

Discussion : 1105 

Keywords : Neural precursor, Cerebellum, Neuroprotection, Migration, Purkinje cells, Degeneration 

Acknowledgements 

We thank Dr JM Vanderwinden for expertise and technical assistance to microscopy and we wish to 

thank Ana Lopes da Cruz for animal technical assistance. This work was supported by the Belgian 

Scientific Research Funds (FNRS). 

 

 

(31)

 

Abstract 

 

The B05 transgenic SCA1 mice, expressing human ataxin‐1 with an expanded polyglutamine tract in  cerebellar Purkinje cells (PCs), recapitulate many pathological and behavioral characteristics of the  neurodegenerative disease spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1), including progressive ataxia and PC  loss. We transplanted neural precursor cells (NPCs) derived from the subventricular zone of GFP‐

expressing adult mice into the cerebellar white matter of SCA1 mice when they showed absent (5  weeks), initial (13 weeks) and significant PC loss (24 weeks). Only in mice with significant cell loss,  grafted NPCs migrated into the cerebellar cortex. These animals showed improved motor skills as  compared to sham‐treated controls. No grafted cell adopted the morphological and 

immunohistochemical characteristics of PCs, but the cerebellar cortex in NPC‐grafted SCA1 mice had a  significantly thicker molecular layer and more surviving PCs. Perforated patch clamp recordings revealed  a normalization of the PC basal membrane potential, which was abnormally depolarized in sham‐treated  animals. No significant increase in levels of several neurotrophic factors was observed, suggesting, along  with morphological observation, that the neuroprotective effect of grafted NPCs was mediated by direct  contact with the host PCs. We postulate that a similar neuroprotective effect of NPCs may be applicable  to other cerebellar degenerative diseases. 

(32)

 

Introduction 

 

Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) is one of the hereditary neurodegenerative disorders caused by the  expansion of a CAG trinucleotide repeat, which is translated into a polyglutamine (polyQ) tract in the  corresponding protein (Orr and Zoghbi, 2007). It is an autosomal dominant usually late‐onset disorder  characterized by progressive cerebellar ataxia associated with variable degrees of pyramidal, 

extrapyramidal, and oculomotor abnormalities, peripheral neuropathy and cognitive impairment. 

Pathologically, loss of cerebellar Purkinje cells (PCs) and of neurons in the brain stem are typical findings  (Watase et al., 2002). The mutated gene in SCA1, AXN1, encodes the ataxin‐1 protein, which is thought  to be involved in transcription regulation and RNA processing. Ataxin‐1 is localized in the nucleus of  neurons, in the cytoplasm of non‐neuronal cells, and both in the nucleus and cytoplasm of cerebellar  PCs. The nuclear localization of ataxin‐1 has been shown to be essential for pathology. The pathogenesis  of SCA1 involves a toxic gain‐of‐function effect of the expanded polyQ tract along with dominant‐

negative effects due to altered functionalities of the mutated protein (Bowman et al., 2007).  

The first SCA1 mouse model, developed by Burright et. al. in the mid ‘90s (Burright et al., 1995), was  based on a multicopy transgene expressing a mutated human ataxin‐1 with an expanded polyQ tract (30  copies of a transgene encoding ataxin‐1 with 82 glutamines in the B05 line, used in the present study)  under the control of the PC‐specific Pcp2 promoter. This mouse model develops a progressive motor  disorder starting at about 5 weeks of age, before the appearance of any alteration of cerebellar 

morphology. Pathological abnormalities of PCs, in the form of a shrunken dendritic tree and migration of  the cell body into the molecular layer, become clearly visible by 12 weeks of age, along with an initial  decline in PC number. A significant PC loss (about a third) occurs by 24 weeks of age.  

No treatment is currently available for SCA1. Patients experience progressive limitations in their 

activities, lose the ability to walk, and eventually become bedridden and fully dependent. In the present  study, we wished to explore the potential of neural stem cell transplantation as a therapeutic approach  for SCA1 by testing it in the B05 transgenic model. We considered that, even if effective treatments will  be developed with better understanding of SCA1 pathogenesis, stem cell therapy remains an attractive  option, as it may provide additional neuroprotection and possibly promote regeneration. In addition,  relatively few studies (5) have addressed the effects of stem cell transplantation in cerebellar disorders  as compared to studies in diseases affecting other brain areas, including several neurodegenerative 

(33)

 

(Corti et al., 2007 and 2008; McBride et al., 2004; Redmond et al., 2007; Roberts et al., 2006; Yasuhara  et al., 2006), neuroinflammatory (Pluchino et al., 2003) and other neurological insults (Jeong et al., 2003; 

Cummings et al., 2005;  Karimi‐Abdolrezaee  et al., 2006; Lee et al.,  2007a and 2007b).  

For our transplantation experiments, we used neural progenitor cells (NPCs) derived from the  subventricular zone (SVZ) of adult mice. NPCs are a mixture of neural stem cells and early progenitor  cells that can be isolated from specific regions of the adult mammalian brain (the subventricular zone of  the lateral walls of lateral ventricles and the subgranular zone in the dentate gyrus of hippocampus)  (Gritti et al., 1996; Taupin and Gage, 2002; Gage 2002; Lie et al., 2004). NPCs possess the potential of  generating mature neural and glial progenies (multipotentiality) and their stem cell component has an  indefinite self‐renewal property. The donor mice we used have the same strain background as the B05  mice (FBV/N), eliminating any requirement for immunosuppression in grafted animals, and express the  green fluorescent protein (GFP) in all their cells, providing a simple marker to trace transplanted cells. 

Kidney fibroblasts from the same strain were used in control transplantation experiments to evaluate  any general, non NPC‐specific effect of grafted cells. 

Our results indicate that transplanted NPCs survived and integrated into the recipient cerebellar cortex  only in animals that had already suffered a significant PC loss at the time of transplantation. In these  mice, NPCs induced behavioral amelioration, promoted survival of PCs, improved cerebellar 

morphology, and restored a normal PC excitability. 

(34)

 

Materials and Methods 

 

Isolation and culture of NPCs    

NPCs were derived from the SVZ of adult mice as described in Gritti et al. (Gritti et al., 1999) and  modified as follows. Four to eight weeks old FVB/N mice expressing GFP under β‐actin promoter  (Jackson Lab, USA) were anesthetized by Avertin (i.p.) and sacrificed by cervical dislocation. Brains were  removed and the thin layer of tissue surrounding the ventricles was cut, dissected into small pieces and  cultured in media containing 20 ng/ml recombinant human EGF and 10 ng/ml recombinant human bFGF  (Peprotech, NJ, USA). Big spherical clusters were ready to dissociate 7‐10 days after isolation. 

Neurospheres were mechanically dissociated every 4‐5 days and plated in fresh growth medium. They  were assessed for self‐renewal and multipotentiality as described earlier (Chintawar et al., 2009) (see  supplemental methods). NPCs of passage 4‐8 were used for transplantation. For detailed procedure for  isolation and characterization of NPCs, refer to supplementary information. 

 

Immunocytochemistry   

Undifferentiated and differentiated NPC cultures seeded on matrigel were fixed with 4% 

paraformaldehyde and incubated with 0.1% Triton X 100 for 15 min. Cultures were then incubated  overnight at 4°C with primary antibodies: nestin, (Chemicon, USA) as marker for undifferentiated cells,  MAP‐2 (Sigma, Belgium) as marker for neurons, GalC (Chemicon, USA) as marker for oligodendrocytes,  and GFAP (DakoCytomation, Denmark) as marker for astrocytes. Antibodies were detected using Cy3‐

conjugated IgGs. No antibody was needed for GFP, as the native GFP signal was detectable. In all the  cultures, DAPI (4',6‐diamidino‐2‐phenylindole) was used to counterstain cell nuclei. Slides were  mounted using Fluorsave (Calbiochem, Germany). 

   

Références

Documents relatifs

This kind of incomplete information is common in many tropical forest inventory data sets with high variability in the levels of botanical determination of the trees [53].We used

Kernels based on paths achieve equivalent or even better results than those on non-linear patterns, where the path kernel up to length h dominates on most datasets with symbolic

Watermarking schemes then are required to respect the Kerckhoffs’ principle [17] (i.e. a secret key is shared between the encoder and the decoder and is the only secret parameter

We now demonstrate the phase-locked temporal modulation of this induced electron current to achieve tunability of resulting CEP-locked THz emission... Temporal characterisation of

L’accès à ce site Web et l’utilisation de son contenu sont assujettis aux conditions présentées dans le site LISEZ CES CONDITIONS ATTENTIVEMENT AVANT D’UTILISER CE SITE WEB.

We are interested here in the fluctuations of the work injected into the LC when it is driven away from an equilibrium state to another using a small change of the voltage (i.e.

Возмож- но и одновременное употребление обоих этих операторов (всегда в после- довательности tùn tɛ̀dɛ ) для выражения плюсквамперфектного значения. Отметим при этом, что:

L’accès à ce site Web et l’utilisation de son contenu sont assujettis aux conditions présentées dans le site LISEZ CES CONDITIONS ATTENTIVEMENT AVANT D’UTILISER CE SITE WEB.