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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Bury, F. (2006). Caractérisation du gène XBTBD6 codant pour une protéine à domaine BTB-POZ impliquée dans la neurogenèse chez le xénope (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des Sciences – Sciences biologiques, Bruxelles.

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DBM 00EE3

UNIVERSITE LIBRE DE BRÜAtLLtid

Faculté des Sciences

Département de Biologie moléculaire - Laboratoire d’Embryologie Moléculaire Promoteur de Thèse : Pr. E. Bellefroid

Caractérisation du gène XBTBD6

codant pour une protéine à domaine BTB-POZ impiiquée dans ia neurogenèse chez ie xénope

ULB -

lIBUO^mEQUE I

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences BURY Frédéric

Année académique 2005-2006

Caractérisation du gène XBTBD6

codant pour une protéine à domaine BTB-POZ impiiquée dans la neurogenèse chez le xénope

Thèse présentée en soutenance privée le 17 février 2006 et en soutenance publique le 19 mai 2006 devant le jury composé des :

Prof. J. URBAIN

Prof J. ROSCAM-SZPIRER Prof C. SZPIRER

Prof D. CHRISTOPHE Prof B. PEERS

Président Secrétaire Rapporteur Rapporteur Expert extérieur

Prof E. BELLEFROID Directeur de Thèse

BURY Frédéric

Département de Biologie moléculaire - Laboratoire d’Embryologie Moléculaire

Remerciements

Remerciements

Je remercie TULB pour m’avoir accueillie dans son honorable institution au sein des laboratoires de l’IBMM.

Je remercie le Docteur Bellefroid et je salue chalexxreusement tous les membres du laboratoire d’embryologie moléculaire que j’ai croisés pendant ces années de travail : Kaki, Sadia, Vincent, Pierre, Flavio, Ludivine, Angela, Gilles, Sarah, Massimo et Virginie ainsi que ceux des autres laboratoires : Françoise, Réginald et tous ceux que j’ai, par inadvertance, pu oublier.

Un remerciement particulier pour mon épouse qui m’a soutenu durant cette longue période et une pensée pour ma petite fille Marie. Enfin merci à ma famille pour son soutien lointain mais réconfortant.

1

Sommaire

Sommaire

Remerciements... 1

Sommaire... 2

Résumé...5

Liste des abréviations...6

I. INTRODUCTION... 7

1.1. Le modèle xénope... 7

1.2. Le développement embryonnaire du xénope... 8

1.2.1. Les premières étapes du développement... 8

1.2.2. L’induetion neurale chez le xénope... 8

1.2.3. Les bases moléculaires de l’induction neurale chez le xénope... 9

1.2.4. La neurogenèse primaire... 11

1.2.5. Le contrôle de la neurogenèse primaire chez le xénope... 12

1.2.5.1. La cascade d’activation des gènes proneuraux... 12

1.2.5.2. L’inhibition latérale... 13

1.3. Un système de régulation des mécanismes biologiques : l’ubiquitination... 14

1.3.1. L’ubiquitination...14

1.3.2. La cascade d’ubiquitination...15

1.3.3. Les protéines ubiquitine ligases E3 à domaine de type RING...15

1.3.4. Les complexes de type SCF...16

1.3.5. Les complexes de type BTB-Cullin-3... 18

1.4. Les protéines à domaine BTB-POZ... 20

1.5. L’implication du système d’ubiquitination dans la croissance des neurites...24

IL BUT DU TRAVAIL... 28

III. RESULTATS... 29

III. 1. Identification de la protéine de xénope XBTBD6... 29

III. 1.1. Criblage in silico de la base de données informatiques TIGR... 29

III. 1.2. Analyse de la séquence de l’ADNc XBTBD6...29

III. 1.3. Localisation subcellulaire de la protéine XBTBD6... 32

III. 1.3.1. Localisation de XBTBD6 et XBTBD3 dans les cellules COS7... 32

III. 1.3.2. Localisation de XBTBD6 dans les cellules Hela, CHO, U20S, Neuro2A,518A2e et 9L...33

111.1.4. Colocalisation de XBTBD6 avec HBTBDl et HBTBD2... 33

III. 1.4.1. Le domaine BTB-POZ est requis pour la localisation de XBTBD6 dans les corpuscules cytoplasmiques... 34

III. 1.5. XBTBD6 homodimérise et hétérodimérise avec XBTBD3 et XBTBD2... 35

III. 1.6. XBTBD6, XBTBD3 et XBTBD2 interagissent avec XCullin-3...36

III. 1.6.1. Analyse des interactions par immimoprécipitation... 36

III. 1.6.2. Localisation de XBTBD6, XBTBD3 et XCullin-3 dans le cytoplasme des cellules COS7... 37

111.2. Expression du gène XBTBD6... 37

111.3. Régulation du gène XBTBD6... 39

111.4. Etude du rôle de XBTBD6 au cours de la neurogenèse...41

2

Sommaire

111.4.1. La modulation de l’expression de XBTBD6 n’induit pas de modification du

nombre de neurones primaires...41

111.4.2. La surexpression de XBTBD6 régule négativement la croissance des neurites.... 44

1II.5. Recherche de partenaires protéiques de XBTBD6 par criblage par double hybride en levure... 46

111.5.1. Utilisation des vecteurs appâts pPC97-XBTBD6, pPC97-XBTBD6 N-term et pPC97-XBTBD6 C-term...46

111.5.2. Utilisation du vecteur appât pPC97-XBTBD6-ABTB... 50

IV. DISCUSSION et PERSPECTIVES...55

IV. 1. XBTBD6 appartient à une sous famille de protéines à domaine BTB-POZ...55

IV.2. Le gène XBTBD6 est un marqueur de la neurogenèse chez le xénope... 58

IV.3. Etude de la fonction de XBTBD6 dans la neurogenèse...59

IV.3.1. La protéine XBTBD6 pourrait fonctionner comme protéine adaptatrice dans un complexe d’ubiquitination de type BTB-Cullin-3... 59

IV.3.2. XBTBD6 régule la croissance des neurites, par quel mécanisme ?... 62

IV.3.3. Les protéines cibles de XBTBD6 restent inconnues... 64

IV. 4. Perspectives... 66

V. ANNEXES... 68

V. 1. MATERIELS ET METHODES... 68

V.1.1. Matériels... 68

V. 1.1.1. Plasmides utilisés... 68

V. 1.1.1.1. Les linéarisations pour les générations des ARNm synthétique micro­ injectables ... 73

V. 1.1.1.2. Les linéarisations pour les générations des ARN antisens pour les hybridations in situ... 65

V.1.1.2. Produits, milieux et solutions utilisés...73

V.1.1.2.1. Produits ... 73

V.1.1.2.2. Milieux de culture...75

V.1.1.2.3. Solutions ... 75

V.1.2. Méthodes... 78

V. 1.2.1. Préparation, purification et analyse des ADN plasmidiques... 78

V.1.2.1.1. Clonage ... 78

V. 1.2.1.2. Préparation des bactéries électrocompétentes...79

V. 1.2.1.3. Transformation, étalement et sélection des bactéries...79

V. 1.2.1.4. Préparation d’ADN plasmidique à partir d’une culture bactérienne... 79

V. 1.2.1.5. Préparation d’ADN plasmidique à partir d’une culture de levure...80

V. 1.2.1.6. Analyse par électrophorèse sur gel d’agarose...80

V. 1.2.1.7. Purification par phénol/chloroforme...80

V. 1.2.1.8. Séquençage... 80

V. 1.2.2. Préparation, purification et analyse des ARN... 81

V.1.2.2.1. Synthèse d’ARNm synthétique pour injection en embryons de xénope... 81

V. 1.2.2.2. Synthèse d’ARN antisens marqué à la digoxigénine pour hybridation in situ ...81

V. 1.2.2.3. Extraction des ARN totaux d’embryons et de tissus de xénope...81

V. 1.2.2.4. Analyse par protection à la RNAse (RPA)... 82

V.l .2.3. Préparation, purification et analyse des protéines... 83

Sommaire

V. 1.2.3.1. Extraction de protéines et Immunoprécipitation (BP)... 83

V. 1.2.3.2. Analyse par Western Blot... 84

V. 1.2.4. Manipulations sur levures... 84

V. 1.2.4.1. Culture de levures en milieux solides ou liquides... 84

V. 1.2.4.2. Transformation de levures par la méthode à l’acétate de lithium... 84

V. 1.2.4.3. Sélection par test colorimétrique X-Gal... 85

V. 1.2.4.4. Criblage de double hybride en levures... 85

V. 1.2.5. Manipulations sur embryons de xénopes...85

V. 1.2.5.1. Obtention d’embryons de xénopes... 85

V. 1.2.5.2. Micro-injections d’ARNm synthétique en embryons de xénopes... 86

V.1.2.5.3. Préparation des calottes animales... 86

V. 1.2.5.4. Fixation des embryons et coloration X-gal...86

V. 1.2.5.5. Hybridation in situ sur embryons de xénopes... 86

V. 1.2.5.6. Emballage en gélatine et section au vibratome des embryons...87

V. 1.2.6. Manipulations sur cellules en culture... 88

V. 1.2.6.1. Culture cellulaire et transfection transitoire... -... 88

V. 1.2.6.2. Immunocytochimie... 88

V.2. BIBLIOGRAPHIE... 89

V.3. PUBLICATION... 101

4

Résumé

Résumé

A la suite d’un criblage in silico nous avons identifié un nouveau gène codant pour une protéine à domaine BTB-POZ, XBTBD6.

Nous avons déterminé que la protéine XBTBD6 est une protéine cytoplasmique. Dans les cellules Hela, CHO, U20S et COS7 la protéine XBTBD6 est localisée dans des corpuscules cytoplasmiques, localisation similaire à celle des protéines XBTBD3, HBTBDl et HBTBD2. Nous avons observé que la partie N-terminale de la protéine, contenant le domaine BTB-POZ, est localisée dans la cellule comme la protéine entière ; par contre la partie C-terminale est exclusivement nucléaire. De plus, nous avons observé que XBTBD6 est localisée de façon diffuse dans le cytoplasme des cellules Neuro2A, 9L et 518A2e. Nous avons montré que la protéine XBTBD6 homodimérise et hétérodimérise avec XBTBD3 et XBTBD2 et qu’elle interagit avec l’ubiquitine ligase E3 XCullin-3. L’ensemble de ces interactions nécessite la présence du domaine BTB-POZ. Ces données montrent que les protéines BTBD6, BTBD3, BTBDl et BTBD2 possèdent des propriétés communes indiquant qu’elles appartiennent à un sous groupe de la famille des protéines à domaine BTB-POZ.

Le profil d’expression a été analysé par la technique de protection à la RNAse et par hybridation in situ. Les résultats montrent que ce gène est fortement exprimé dans le système nerveux adulte et embryonnaire. Des expériences de surexpression par micro-injection d’ARNm ont permis de placer le gène XBTBD6 dans la cascade d’activation des gènes proneuraux en aval de XNgnr-1, XNeuroD, XathS et XehfS. Ces résultats montrent que XBTBD6 est un marqueur neuronal chez le xénope.

Au cours de l’étude de la fonction du gène XBTBD6, nous avons montré que la surexpression et la perte de fonction de ce gène dans l’embryon de xénope n’induit pas de variation du nombre de neurones dans la plaque neurale. Par contre nous avons observé que la surexpression du gène XBTBD6 dans des cellules Neuro2A en différentiation régule négativement la croissance des neurites.

Nous avons élaboré un modèle de fonctionnement biochimique hypothétique où la protéine XBTBD6 fonctionnerait comme protéine adaptatrice dans un complexe d’ubiquitination permettant l’ubiquitination d’une protéine cible. Nous avons recherché les partenaires potentiels de XBTBD6 en utilisant la technique du double hybride en levure mais sans y parvenir.

5

Liste des abréviations

Liste des abréviations

3-AT 3 - Amino-1,4-Triazole MAP Microtubule Associated Protein

ARN Acide RiboNucléique MAPlb Microtubule Associated Protein Ib

ARNm Acide RiboNucléique messager MAPK Mitogen-Activated PhosphoKinases

ADN Acide DésoxyriboNucléique MEF Mouse Embryonic Fibroblast

ADNc Acide DésoxyriboNucléique complémentaire

mgcl -1 mouse genn cell-lessl AES Amino-terminal Enhancer of Split Milieu LB Milieu Luria Bertani APC/C Anaphase Promoting

Complex/Cyclosome

Milieu YPD Milieu Yeast Peptone Dextrose ASFl AntiSUencing Fonction 1 Milieu YT Milieu Yeast Triptone

babl bric à brac 1 MIPl MAP2K-Interacting Protein 1

bab 2 bric à brac 2 MIR MRLC Interacting Protein

Bcl 6 B-cell lymphoma 6 MYL2 Myosin regulatory light Chain 2

bHLH basic Hélix Loop Hélix MYOIC Myosin IC

BMB Boehringer Mannheim Blocking MYPHC Cardiac Myosin P Heavy Chain BMP4 Bone Morphogenetic Protein 4 N-CoR Nuclear CoRepressor

BR-C Broad Complex NHDF Nonnal Human Dermal Fibroblast

BSA Albumine de Sérum Bovin NRB/P Nuclear Restricted Protein/Brain CCT 8 Chaperonin Containing T complex

polypeptide 8

ORF Open Reading Frame

CYP2C8 Cytoclu-ome P450, Family 2, subfamily C, polypeptide 8

P 110 “^ Rétinoblastome Protein 110 DCC Deleted in Colorectal Cancer PAP-I Pim-1-Associated Protein-1

DEPC Diethylpyrocarbonate pb paires de bases

DETl De-Etiolated-1 PCR Polymerase Chain Reaction

DMRT5 Doublesex- and Mab-3-Related Transcription factor 5

PLZF Promyelocytic Leukemia Zinc Finger

E(spl) Enhancer of Split PPA2c Phosphatase 2c

ECS Elongin Cullin SOCS PRC Polycomb Répressive Complex

EGF Epidermal Growth Factor RNAi RNA interférence

elFl eukaryotic translation Initiation Factor 1 Robo Roundabout

eIF3 eukaryotic Initiation Factors 3 RPA RNAse Protection Assay E112 Ell-Related RNA Polymerase II,

Elongation Factor

rpm Rotation par minutes ERA Eléments de Réponse Antioxydants SCF Skpl-Cullin-F box

ESR Enhancer of Split Related shh Sonic Hedgehog

EST Expressed Sequence Tag SMRT Silencing Mediator of Retinoid and Thyroid hormon

FBLNl Fibulin 1 SOCS Suppressor of Cylokyne Signaling

FBPl Fuse Binding Protein-1 TCF T Cell Factor

FGF Fibroblast Growth Factor TGF-p Transforming Growth Factor- beta GSK3 Glycogen Synthase Kinase 3 TI Al T Inducing Apoptosis-1

H20milliQ Eau purifiée par un sy stème de t>pe MilliQ

TLK Tousled-Like Kinase

HIC Hypermethylated In Cancer Ttk Tramtrack

HRTl Hairy Related Transcription factor Ub Ubiquitine

kDa kiloDalton UTR UnTranslated Région

KTR14 Keratin 14 Wnt Wingless/Int-1

KTR4 Keratin 4 XBOIP Xenopus bc 8 Orange Interacting Protein

LRRs Leucine-Rich Repeats X-Ngm-1 Xenopus-Neurogenin-related-1 MAL2 Myelin And Lymphocyte 2 yFBP-B yFl Binding Protein isoform B

6

cbordc spiaak BOtocborde

muK viteUÏM

(surface effacée pour révéler la notochorde)

Partie postérieure Vue dorsale (surface effacée)

bourgeon caudal

Stade 15

Stade 26

Figure 1 : Représentation schématique du cycle de développement du xénope. A 23°c, la

gastrulation se passe de 10 à 15 heures après la fécondation, la neurulation est terminée après 20

heures. Le bourgeon caudal est formée après un jour et le têtard après 4 jours. Il faut attendre 6

mois avant d’avoir des xénopes de taille adulte et environ 2 à 3 ans avant qu’ils atteignent leur

maturité sexuelle (d’après Wolpert, L. 2002).

INTRODUCTION

I. INTRODUCTION

La biologie du développement est une science qui cherche à étudier et comprendre les mécanismes biologiques permettant à une cellule unique d’évoluer pour générer un organisme adulte. La biologie moléculaire a permis, grâce à l’apparition de techniques expérimentales efficaces, d’accentuer l’orientation réductionniste qui est la base de la biologie depuis plusieurs décennies. Ainsi, aujourd’hui, les gènes peuvent être étudiés individuellement, ce qui permet aux biologistes de découvrir quels sont ceux qui contrôlent et guident les processus de développement d’un organisme.

Suivant le processus de développement étudié, le choix du modèle biologique est crucial. Ainsi dans le laboratoire d’embryologie moléculaire de l’Institut de Biologie et de Médecine Moléculaire (IBMM) de Gosselies (BELGIQUE), nous étudions les mécanismes moléculaires qui contrôlent les étapes précoces de la formation du système nerveux chez les vertébrés et pour cela nous utilisons comme modèle biologique le xénope, un petit amphibien particulièrement bien approprié pour ce type de recherche.

1.1. Le modèle xénope

Le xénope ou Xenopiis laevis est aussi appelé grenouille africaine à pattes griffues (« clawed toad » en anglais). Originaire d’Afrique australe, c’est un amphibien de la classe des anoures et de la famille des pipidae qui peut être élevé dans l’eau du robinet. Son cycle de développement est bien connu (Figure 1). L’utilisation de cet animal présentent les avantages suivants : un élevage en laboratoire relativement aisé, la possibilité d’obtenir un grand nombre d’embryons dont la taille relativement importante (1 à 2 mm de diamètre) facilite leurs manipulations et permet l’observation macroscopique en continu des différentes étapes de l’embryogenèse, les embryons sont facilement maintenus en culture, enfin la fécondation se fait in vitro en ajoutant du sperme à des oeufs pondus par une femelle traitée à l’hormone gonadotrophine chorionique humaine (HCG). Plusieurs techniques expérimentales peuvent être utilisées grâce à ce modèle. La technique d’hybridation in situ sur embryons entiers permet de visualiser de façon spatiale et temporelle l’expression des gènes au cours du développement. L’étude fonctionnelle des gènes peut être abordée par d’une part l’observation des effets de la surexpression du produit d’un gène par la technique de micro­

injection d’ARNm synthétique ; d’autre part par l’observation des effets de la perte de fonction d’un gène grâce aux techniques employant soit les morpholino-oligos antisens qui

7

Figure 2 : Représentation schématique de la célèbre expérience de Spemann et Mangold en

1924. La lèvre dorsale du blastopore d’un embryon pigmenté au stade gastrula est greffé sur la

partie ventrale d’un autre embryon albinos au même stade. L’embryon hôte développe un

deuxième axe dorsal complet avec une polarité antéro-postérieure et dorso-ventrale correcte. La

distribution des cellules pigmentées révèle la contribution respective du greffon et de l’hôte

(d’après Darribère, 2002).

INTRODUCTION

en se fixant sur l’ARNm bloquent la traduction, soit par la technique de surexpression d’une forme mutante ayant un effet dominant négatif. Enfin, il existe des banques informatisées d’EST (Expressed Sequence Tag) de xénope permettant d’analyser in silico les séquences partielles ou entières de gènes.

1.2. Le développement embryonnaire du xénope 1.2.1. Les premières étapes du développement

Lors de la fécondation, l’entrée du spermatozoïde induit un réarrangement cytoplasmique de la couche périphérique de l’œuf entraînant une rotation corticale de 30°

(Gerhart et al., 1989). Cette rotation déplace le matériel maternel du pôle végétal à l’opposé du point d’entrée du spermatozoïde ce qui déterminera l’axe dorso-ventral de l’embryon (Harland and Gerhart, 1997). L’œuf fécondé unicellulaire entre alors en division, c’est la segmentation. L’œuf devient une masse de cellules sans cavité interne, la morula, puis évolue pour devenir une blastula caractérisée par la présence du blastocoele. Les clivages continuent rapidement au sein de la blastula jusqu’au stade de la transition « mid-blastula » où les divisions ralentissent et où la transcription du génome s’initie (Newport and Kirschner, 1982). Quand la blastula se présente comme une sphère creuse, des mouvements cellulaires importants s’amorcent, c’est la gastrulation. Dans la partie dorso-postérieur de la blastula apparaît le blastopore, zone où les cellules de la zone marginale migrent à l’intérieur de l’embryon. Les cellules convergent et s’allongent en définissant xm axe antéro-postérieur permettant l’organisation des trois feuillets primordiaux, l’ectoderme, le mésoderme et l’endoderme. C’est l’ectoderme qui donnera l’épiderme, les muscles lisses et striés de la tête et du cou, une partie du squelette cartilagineux de la tête, les glandes médullo-surrénales, les placodes, le système nerveux périphérique et le système nerveux central (Gerhart et al.,

1989).

1.2.2. L’induction neuraie chez ie xénope

Le stade suivant de développement est appelé la neurulation. L’ectoderme dorsal s’épaissit définissant le territoire de la plaque neurale qui va devenir le tissu neural, le neuroectoderme. Le concept d’induction neurale a été défini par une expérience de transplantation devenue célèbre en embryologie effectuée par Spemann et Mangold en 1924 (Figure 2). L’expérience consiste à greffer un morceau de tissu provenant de la lèvre dorsale

8

INTRODUCTION

du blastopore d’un embryon pigmenté au stade gastrula sur la partie ventrale d’un autre embryon albinos au stade gastrula. Le résultat obtenu montre que l’embryon hôte développe un axe secondaire où le système nerveux central provient de l’ectoderme de l’hôte car non pigmenté tandis que le mésoderme provient de la greffe car pigmenté (Spemann and Mangold, 1924). Cette expérience montre que la lèvre dorsale du blastopore induit la transformation de l’ectoderme proche en tissu neural. Cette partie de l’embryon a été désignée centre organisateur ou organisateur de Spemann (Spemann and Mangold, 1924).

Des territoires ayant les mêmes propriétés organisatrices ont été mises en évidence chez d’autres espèces, appelées bouclier chez le poisson zèbre (Shih and Fraser, 1996), ou nœud de Hensen chez la souris (Beddington, 1994) et le poulet (Storey et al., 1992).

1.2.3. Les bases moléculaires de rinduction neurale chez le xénope

Après la mise en évidence des capacités inductrices de l’organisateur de Spemann, la recherche des bases moléculaires qui permettent cette induction a été intensivement menée.

Le premier gène découvert ayant un rôle important dans l’induction neurale code pour la protéine sécrétée BMP4 (Bone Morphogenetic Protein 4) appartenant à la super famille des protéines de type TGF-3 (Transforming Growth Factor-P). Il a été observé que ce gène était exprimé dans l’ectoderme de l’embryon au stade gastrula précoce et que son expression dans la partie dorsale disparaît pendant la gastrulation au moment de l’apparition de l’organisateur de Spemann (Fainsod et al., 1994). De plus la perte de fonction de BMP4 par micro-injection d’ARNm codant pour une forme mutante de BMP4 (Xu et al., 1995) entraîne l’induction neurale. Ces données indiquent que l’inactivation de BMP4 est associée avec l’induction neurale. De manière concomitance, il a été montré que l’organisateur de Spemann sécrète une série d’antagonistes des BMPs favorisant l’induction neurale tels que noggin (Smith and Harland, 1992), follistatin (Hemmati-Brivanlou and Melton, 1994), chordin (Sasai et al., 1994), cereberus (Bouwmeester et al., 1996) gremlin, dan et drm (Hsu et al., 1998), ogon/sizzled (Yabe et al., 2003). Ces découvertes permettent d’expliquer les résultats obtenus dans les expériences suivantes. Lorsque les cellules d’une calotte animale de gastrula sont dissociées pendant quelques heures, ceci afin d’abolir les communications paracrines, puis ensuite réagrégées, le tissu évolue vers une destinée neurale. Si la calotte animale n’est pas dissociée ou si les cellules sont réagrégées immédiatement, le tissu devient de l’épiderme (Grunz and Tacke, 1989). Complémentairement, la même expérience de dissociation de quelques heures d’une calotte animale de gastrula d’embryon préalablement micro-injecté

9

blastula

Pôle animal

Pôle végéta^

maternel zygotique

chordin CHORDIN

Epiderme

Neuroectoderme

Mesoderme

Endoderme

Figure 3 : Représentation schématique du modèle de l’induction neurale chez le xénope. Au stade blastula les tissus présomptifs de l’épiderme (en bleu), du neuroectoderme (en vert) et du mésoderme (en rouge) sont positionnés par l’activité de signaux maternels. Le facteur de transcription Veg-T (points violets) présent dans le pôle végétatif induit la formation de l’endoderme et du mésoderme. Le facteur p-catenine (points oranges) est présent dans la partie dorsale de l’embryon et induit la dorsalisation du mésoderme et de l’ectoderme. L’action conjuguée de ces facteurs induit la formation de l’organisateur de Spemann. A la transition midblastula, l’activitée transcriptionelle du zygote permet l’expression des facteurs nodal-related (Xruï). Ces facteurs induisent la transformation des tissus en endoderme et jouent un rôle dans l’induction du mésoderme en même temps que FGF qui est le principal inducteur mésodermique.

Les BMPs dans l’ectoderme induisent la formation de l’épiderme. Les dormées actuelles permettent de dire que le neuroectoderme apparaît grâce à l’action des antagonistes des BMPs (Noggin, Chordin) provenant de l’organisateur de Spemarm et dont l’expression est induite par l’activité de la p-catenine (dont on sait que son activité est régulée par la voie Wnt). Intervient aussi l’action du FGF qui bloquent, en association avec les antagonistes des BMPs mais aussi directement, la voie de signalisation des BMPs. Ce modèle récent du mécanisme de l’induction neurale chez le xénope remplace le modèle plus simpliste de l’induction dite par défaut, (d’après

Delaune et al., 2004). 9 {jjg

INTRODUCTION

avec de l’ARNm codant pour les effecteurs de la voie de signalisation de BMP4 comme Smadl ou Smad5 montre aue le tissu ne se neuralise pas (Wilson et al., 1997 ; Suzuki et al., 1997). L’ensemble de ces résultats a donné naissance au modèle de l’induction neurale « par défaut », où les cellules de l’ectoderme d’une gastrula ont une tendance autonome à générer du tissus neural, cette tendance est contrecarrée par l’activité des BMPs mais restaurée spécifiquement dans le territoire de la plaque neurale par les antagonistes des BMPs sécrétés par l’organisateur de Spemann (Hemmati-Brivanlou and Melton, 1997). Cependant les résultats obtenus chez le poulet montrent que les antagonistes des BMPs ne permettent pas l’induction du tissu neural dans l’épiblaste de poulet (Streit and Stem, 1999). De même chez la souris la différentiation neurale a lieu en absence de noggin ou de follistatin (McMahon et al. 1998 ; Matzuk et al., 1995). Ces données suggèrent que des mécanismes supplémentaires participent de manière complémentaire ou indépendante à l’induction neurale. Des travaux récents ont mis en évidence que le facteur de croissance FGF (Fibroblast Growth Factor) est une molécule impliquée dans l’induction neurale. En effet, il a été montré chez le xénope que la micro-injection des ARNm codant pour un mutant dominant négatif de FGF avec ceux de chordin (Pera et al., 2003) ou de noggin (Launay et al., 1996) n’induit pas la neuralisation de calottes animales isolées. Complémentairement, la micro-injection de l’ARNm codant pour la protéine Smad6, un antagoniste de la voie de signalisation des BMPs, dans un blastomère ventral sans destiné neurale n’induit pas la neuralisation des cellules dérivant de ce blastomère sauf si l’on micro-injecte simultanément l’ARNm codant pour FGF4 (Linker and Stern. 2004). Ces données indiquent que les protéines de la famille FGF jouent un rôle coopératif avec les antagonistes des BMPs au cours de l’induction neurale. Il a été montré que la voie de signalisation FGF permet l’activation de MAPK qui phosphorylent un effecteur de la voie de transduction des BMPs. la protéine Smadl. entraînant son inhibition. Il a aussi été montré que la voie de signalisation FGF est impliquée dans l’induction neurale indépendamment de sa capacité inhibitrice de la voie de signalisation des BMPs (Aubin et al., 2004 ; Delaune et al., 2005). De nouveaux travaux ont montré de plus que la voie de signalisation Wnt est aussi impliquée dans l’induction neurale. Les protéines de type Wnt sont des protéines sécrétées qui reconnaissent le récepteur transmembranaire Frizzled, l’activation de ce récepteur permet l’activation de la protéine cytoplasmique dishevelled qui elle-même inhibe la GSK3 (glycogen synthase kinase 3). La GSK3 ne peut donc plus phosphoryler la protéine 3-catenine, phosphorylation qui entraîne sa dégradation. La protéine p-catenine va alors pouvoir interagir avec la protéine TCF, une protéine de liaison à l’ADN, permettant ainsi l’expression de gènes impliqués dans le processus de neuralisation de

lü

Induction neurale

Action des gènes proneuraux

Action des gènes neurogeniques

Figure 4 ; Représentation schématique de la neurogenèse primaire dans la plaque neurale chez le xénope. L’induction neurale définie le territoire où la neurogenèse à lieu, la plaque neurale.

Au sein de la plaque neurale, l’action des gènes proneuraux définissent les régions cellulaires où vont naître les futurs neurones primaires, les domaines proneuraux. Les gènes neurogéniques vont permettre la sélection spécifique des cellules destinées à se différencier en neurones primaires et empêcher les autres cellules de devenir des neurones, c’est l’inhibition latérale.

Figure 5 : Représentation schématique de la formation du tube neural. Au sein de la plaque neurale ouverte se définissent trois domaines proneuraux où naissent les trois types de neurones primaires, les neurones moteurs (en rouge), les neurones intermédiaires (en vert), les neurones sensoriels (en bleu). Au cours de la neurulation, la plaque neurales converge en son axe médian pour former, après fermeture, le tube neural.

Figure 6 : Représentation schématique d’une section du tube neural. Trois couches cellulaires sont à distinguer. La zone ventriculaire où les cellules précurseurs de neurones sont en division active, la zone subventriculaire où les premiers neurones postmitotiques apparaissent et la zone marginale où les neurones sont en différentiation.

10 bis

INTRODUCTION

l’ectoderme ( Hansen et al., 1997 ; Carnac et al., 1996). Il a été montré que l’expression de Wnt8 murin. Wnt8 chez le xénope, ou d’un dominant négatif de GSK3, ou encore de 3- catenine induit l’induction neurale et inhibe l’expression de BMP4 (Baker et al., 1999). En conclusion, un nouveau modèle plus complet intégrant les données concernant les voies de signalisation de FGF et Wnt synthétisant les mécanismes sous-jacents de l’induction neural chez le xénope 42

a été proposé par Delaune (Figure 3). Ce modèle remplace le modèle plus simpliste de l’induction dite par défaut.

1.2.4. La neurogenèse primaire

L'élaboration du système nerveux chez les vertèbres est un processus qui se déroulé

relativement tôt pendant le développement. La sélection, la différentiation et l’organisation

des différentes populations de cellules qui constitueront le système nerveux sont des

évènements qui nécessitent des mécanismes complexes d’interactions entre différents

facteurs biologiques. La neurogenèse chez le xénope peut être divisée en deux phases. La

première phase est la neurogenèse primaire qui voit l’apparition des premiers neurones, les

neurones primaires, qui contrôlent les premiers mouvements de l’embryon. La seconde phase

s’initie approximativement vers le stade 46 du développement et consiste dans la génération

des neurones secondaires qui contribueront à la formation du système nerveux du têtard en

croissance puis de l’adulte et qui remplaceront en grande majorité les neurones primaires

(Schlosser et al., 2002). La neurogenèse chez le xénope, ainsi que chez presque tous les

vertébrés, débute dans la région postérieure de la plaque neurale où des signaux comme shh

(Sonic Hedgehog) (Franco et al., 1999), l’acide rétinoïque (RA) (Sharpe and Goldstone,

2000), les protéines de type Gli (Nguyen et al., 2005) jouent un rôle important dans la

définition des régions neurogéniques. Les neurones primaires en différentiation apparaissent

dans la partie postérieure de la plaque neurale en s’organisant en trois bandes longitudinales

et symétriques de part et d’autre de la ligne dorsale médiane de la plaque neurale. Ces trois

bandes de neurones représentent trois populations de neurones primaires, les plus latéraux

sont les neurones sensoriels, puis ce sont les neurones intermédiaires et les plus centraux sont

les neurones moteurs (Figure 4) (Chitnis et al., 1995). Chez le xénope, le neuroectoderme est

constitué par deux couches cellulaires constituant l’épithélium superficiel en surface et

l’épithélium sensoriel en profondeur. Les précurseurs des neurones primaires se trouvent

dans l’épithélium sensoriel alors que les précurseurs des neurones secondaires sont présents

Figure 7 : Représentation schématique de la cascade d’activation proneurale sous le contrôle de l’inhibition latérale. Le gène XNgnr-1 est le premier gène exprimé dans les cellules progénitrices neurales qui sont destinés à devenir des neurones. Il induit l’expression en cascade de gènes codant pour des protéines de types bHLH ou non bHLH qui permettront la différentiation neuronale. L’induction de l’expression du gène XDelta par le gène XNgnr-1 va activer la voie de signalisation Notch/ICD et entraîner le blocage de la cascade proneurale dans les cellules proches.

Ces cellules deviendront des cellules gliales ou donneront naissance à d’autres neurones plus tard au cours du développement.

11 bis

INTRODUCTION

dans les deux épithéliums. Pendant le neurulation, les deux couches cellulaires se mélangent et l’épithélium qui en résulte donnera le tube neural. Au sein du tube neural, les neurones sont organisés en couches cellulaires distinctes, la zone ventriculaire est constituée des précurseurs neuraux qui se divisent activement, la zone subventriculaire contient les premiers neurones post-mitotiques et la zone marginale correspond à la zone où les neurones vont se différencier (Figure 5 et 6).

1.2.5. Le contrôle de la neurogenèse primaire chez ie xénope 1.2.5.1. La cascade d’activation des gènes proneuraux

Les cellules pluripotentes présentes dans le neuroectoderme sont sélectionnées et se différencient en neurones grâce à l’activation d’une cascade de gènes appelés gènes proneuraux. Les premiers gènes proneuraux ont été mis en évidence chez la drosophile, ce sont les gènes codant pour des facteurs de transcription de type bHLH (basic Hélix Loop Hélix) comme les groupes des gènes achete-scute et atonal-related. Chez les vertébrés l’expression de ces gènes déclenchent la différentiation des cellules progénitrices neurales en neurones.(Campos-Ortega, 1998). Chez le xénope, les homologues des gènes achete-scute connus sont les gènes Xashl et Xash3. Des expériences d’hybridation in situ ont montré que le gène Xashl est exprimé dans les tissus nerveux en développement (Ferreiro et al., 1993) et que le gène Xash3 est exprimé au sein de la plaque neurale durant la neurogenèse. De plus la surexpression du gèneXash3 par micro-injection d’ARNm induit la différenciation neuronale (Ferreiro et al., 1994). Les homologues des gènes atonal-related de xénope sont les gènes Xathl, Xath3, Xath5, XNeuroD et XNgnr-1 (Xenopus Neurogenin related-1). Des expériences d’hybridation in situ ont montré que ces gènes sont exprimés dans le système nerveux en développement (Kim et al., 1997; Takebayashi et al., 1997; Kanekar et al., 1997;

Lee et al., 1995; Ma et al., 1998). Ces gènes codant pour des protéines de type bHLH fonctionnent dans une cascade d’activation mettant enjeu des boucles de rétrocontrôle ainsi que l’action de gènes codant pour d’autres types de facteurs comme les protéines de type HLH (Hélix Loop Hélix) Xeb£2 (Dubois et al., 1998) et Xebf3 (Pozzoli et al., 2001) ou comme les protéines à doigts à zinc XMytl (Belleffoid et al., 1996) et XNKL (Lamar et al., 2001) (Figure 7). Des expériences de surexpression par micro-injection d’ARNm de XNgnr- 1 suivit par une analyse par hybridation in situ montrent que XNgnr-1 induit l’apparition de neurones ectopiques. Le même type d’expérience montre que XNgnr-1 induit l’expression des gènes XNeuroD et de Xath3. De plus XNeuroD et Xath3 induisent réciproquement leur

12

Figure 8 : Représentation schématique de la voie de signalisation XNotch-1. La liaison du ligand XDelta au récepteur XNotch-1 entraîne le clivage enzymatique de la partie intra­

cytoplasmique Notch/ICD. En absence de Notch/ICD, le facteur de transcription XSu(H) est associé à un complexe répresseiu (Co-rep.) qui bloque l’expression des gènes E(spl)R ; en présence de Notch/ICD, le complexe répresseur est déplacé puis remplacé par un complexe activateur (Co-act.) qui induit l’expression des gènes E(spl)R bloquant l’expression du premier gène important de la cascade proneurale, XNgnr-1.

précurseurs neuronaux inhibition latérale différentiation cellulaire

indifférenciés neurones (rouge)

et cellules gliales (vert) Figure 9 : Représentation schématique du mécanisme d’inhibition latérale. Au sein d’un groupe de précurseurs neuronaux non différenciés, une cellules entre dans le processus de différenciation neuronale. L’expression des gènes proneuraux est activée et le mécanisme d’inhibition latérale médiée par la voie de signahsation Notch est déclenché. L’inhibition latérale permet d’établir autour d’im neurone différencié un ensemble de cellules maintenues à l’état indifférencié.

12 bis

INTRODUCTION

expression (Perron et al., 1999). L’accomplissement de cette cascade d’activation des gènes proneuraux mène à la différentiation des précurseurs neuronaux en neurones, alors que dans d’autres cellules cette voie est inhibée par un processus biologique appelé l’inhibition latérale.

1.2.5.2. L’inhibition latérale

Le mécanisme d inhibition iateraie est initie par i activation des genes proneuraux dans les précurseurs neuraux destinés à se différencier en neurones. La protéine XNgnr-1 induit l’expression du gène XDelta-J (Chitnis and Kintner, 1996) codant pour une protéine transmembranaire possédant des répétitions de domaines de type EGF (Epidermal Growth Factor) (Rebay et al., 1991). Les interactions cellulaires permettent, au ligand XDelta-1, la reconnaissance sur la surface membranaire de la cellule voisine du récepteur XNotch-1 (Goffman et al., 1990). L’interaction du ligand et du récepteur entraîne le clivage du domaine intracellulaire de XNotch-1 (Notch/ICD) (DeStrooper et al., 1999). Le peptide Notch/ICD est ensuite transloqué dans le noyau où il interagit avec des facteurs de transcription à doigts à zinc. Chez le xénope, Notch/ICD interagit avec le facteur XSu(H) (Suppressor of Hairless) (Wettstein et al., 1997). En absence du peptide Notch/ICD, le facteur XSu(H) est associé à un complexe répresseur transcriptionnel (Kao et al., 1998). L’interaction entre Notch/ICD et XSu(H) déplace le complexe transcriptionnel et permet le recrutement de facteurs qui initient l’expression des gènes de la famille E(spl) (Enhancer of Split). Chez le xénope il s’agit des gènes de la famille E(spl)R (Enhancer of Split Related) (Wettstein et al., 1997). Ces gènes inhibent la transcription du gène XNgnr-1 bloquant ainsi la cascade d’activation des gènes proneuraux dans la cellule, lui interdisant ainsi la différenciation neuronale (Figure 8 et 9).

Des expériences de surexpression par micro-injection d’ARNm suivit par l’analyse par hybridation in situ des embryons injectés montrent que l’injection d’une forme mutante correspondante au domaine intracellulaire du récepteur XNotch-1 (Notch/ICD), permettant de mimer l’activation constitutive du récepteur XNotch-1, bloque de manière drastique la neurogenèse (Wettstein et al., 1997). Inversement, l’injection d’un peptide correspondant à une forme tronquée de XDelta-1 (XDelta-1 ®*“) agissant comme mutant dominant négatif augmente le nombre de neurones dans les domaines proneuraux (Chitnis et al, 1995). Au cours de la neurogenèse, le mécanisme d’inhibition latérale permet de réguler la destinée cellulaire des précurseurs neuraux.

13

Figure 10 : Diagramme Ribbon de la molécule d’ubiquitine. Le programme informatique Ribbon 3.0® (U AB Center for Macromolecular Crystallography) permet de représenter la molécule d’ubiquitine en 3 dimensions et de mettre en exergue les sites fonctionnellement importants. Les 7 résidus lysines sont colorés en rouge et les poches hydrophobes qui jouent un rôle dans les interactions interprotéiques de l’ubiquitine sont colorées en jaune (Pickart, C., 2004).

Figure 11 : Représentation schématique de la cascade d’ubiquitination d’un substrat. Une molécule d’ubiquitine est liée de manière covalente à une protéine substrat par un mécanisme mettant en jeu trois enzymes. Une enzyme d’activation de l’ubiquitine El, une enzyme de conjugaison de l’ubiquitine E2 et une enzyme de ligation de l’ubiquitine E3. L’action successive de cet ensemble d’enzymes permettra la génération d’une chaîne de plusieurs ubiquitines liée à la protéine substrat, ce qui entraînera sa dégradation par le protéasome 26S (d’après Passmore L. et

Barford, D., 2004). ,

INTRODUCTION

1.3. Un système de régulation des mécanismes biologiques : rubiquitination.

1=3.1. L’ubiguitination

L’ubiquitination des protéines est considérée comme un mécanisme biologique

régulateur comparable à celui de la phosphorylation (Pickart and Fushman, 2004). Le peptide

d’ubiquitine (Ub) est constitué par 76 résidus d’acides aminés pour un poids moléculaire de

8 kDa. C’est une protéine qui a été extrêmement bien conservée au cours de l’évolution

puisqu’il n’y a que 3 résidus d’acides aminés sur 76 qui différent entre la protéine humaine et

celle de la levure. Les gènes codants pour l’ubiquitine sont présents en plusieurs copies dans

le génome et leur traduction génère des chaînes de polypeptides d’ubiquitines fusionnés par

leur extrémité C-terminale. Ce sont des enzymes de déubiquitination qui clivent les

polymères et génèrent des monomères d’ubiquitines (Dworkin-Rastl et al., 1984; Ozkaynak

et al., 1984). La liaison de l’ubiquitine au substrat protéique se fait en plusieurs étapes

successives nécessitant de l’énergie et utilisant des enzymes spécifiques (Hershko et al.,

1983). Le groupe carboxyl de la glycine, positionné à l’extrémité C-terminale de l’ubiquitine,

est lié de manière covalente à un résidu lysine du substrat par une liaison isopeptidique. Un

nouveau peptide d’ubiquitine peut se lier à l’ubiquitine précédemment associée au substrat

générant ainsi une chaîne de polyubiquitine. L’ubiquitine possède 7 résidus lysines (K6, Kl 1,

K27, K29, K33, K48 et K63) et tous peuvent se lier à une autre ubiquitine (Peng et al., 2003)

(Figure 10). La fixation d’une ubiquitine (une monoubiquitination) ou d’une chaîne

d’ubiquitines (une polyubiquitination) entraîne différentes fonctions régulatrices (Hicke,

2001 ; Pickart, 2000). La liaison d’une chaîne de polyubiquitine, d’au moins quatre

ubiquitines, sur le résidu lysine 48 (K48) permet d’orienter le substrat vers le système de

dégradation protéolytique du protéasome 26S (Thrower et al., 2000). La liaison d’une unique

molécule d’ubiquitine ou d’une chaîne polyubiquitine via les résidus lysines 6 (K6) et 63

(K63) n’entraîne pas la dégradation du substrat par le protéasome 26S mais altère son activité

en modifiant sa localisation (Pickart and Fushman, 2004) ou ses propriétés d’interactions

protéiques (Sigismund et al., 2004). La combinaison de ces types d’ubiquitination donne à la

cellule un moyen important de contrôle des différents processus biologiques. Les mécanismes

qui mènent à l’ubiquitination d’un substrat ont été intensément étudiés et cela a permis

d’élaborer un modèle pour la cascade d’ubiquitination.

Figure 12 : Représentation des différents types de complexes contenant les protéines ubiquitine ligase E3 à domaine de type RING.

14 bis

INTRODUCTION

1.3.2. La cascade d’ubiquitination

L’ubiquitination des protéines est un processus complexe qui met en jeu une succession d’enzymes spécifiques. Il y trois types d’enzymes, les enzymes d’activation El, les enzymes de conjugaison E2 et les enzymes de ligation E3. L’ubiquitine est liée à un résidu cystéine de l’enzyme El par une liaison thiolesther, cette association permet l’activation de la molécule d’ubiquitine. Le transfert de l’ubiquitine de l’enzyme El à l’enzyme E2 se fait aussi par la formation d’une liaison thiolesther entre l’ubiquitine et un résidu cystéine de l’enzyme E2. L’enzyme E2 se lie de façon temporaire à l’ubiquitine permettant le transfert de la molécule d’ubiquitine sur le substrat. L’enzyme E3 permet le rapprochement spatial de l’enzyme E2 avec son substrat (Passmore and Barford, 2004) (Figure 11). Il n’y a que deux types d’enzymes El, les enzymes E2 sont les plus représentées mais leur nombre est limité (environ 40) par contre il y a de très nombreuses formes d’enzymes de type E3 (plus de 1000). Il est possible néanmoins de diviser la famille des protéines de type ubiquitine ligase E3 en deux sous familles en fonction de motifs protéiques caractéristiques, d’une part les protéines E3 à domaine HECT qui combinent les activités E2 et E3 et d’autre part les protéines E3 à domaine RING qui permettent l’ubiquitination en positionnant la protéine E2 à proximité du substrat. C’est cette dernière sous famille qui nous intéressera le plus pour cette étude.

1.3.3. Les protéines ubiquitine ligases E3 à domaine de type RING

Deux principaux types de protéines ubiquitine ligase E3 sont aujourd’hui identifiés et

caractérisés au sein de leur complexe fonctionnel qui présentent entre eux de fortes

similarités (Figure 12-A). Le complexe protéique de type APC/C (Anaphase Promoting

Complex/Cyclosome) (Figure 12-B) et le type de complexe SCF (Skpl-Cullin-F box)

(Figure 12-C). Le complexe APC/C d’ubiquitination a été découvert en étudiant le cycle

cellulaire. Il a été montré que ce complexe permet le contrôle de F anaphase en initiant

l’ubiquitination et la dégradation de la sécurine, une protéine qui contrôle la séparation des

chromosomes pendant l’anaphase. De plus ce complexe est un élément de régulation de la

mitose cellulaire car il initie la dégradation de membres de la famille des régulateurs du cycle

cellulaire de type cycline, les cyclines B1 et B2 (Sudakin et al. 1995 ; King et al., 1995). Les

travaux qui ont suivit ont caractérisé les différents composants du complexe d’ubiquitination

APC/C. C’est l’association des protéines Apc2 et Apcl 1 qui donne la fonction enzymatique

d’ubiquitination mais sans spécificité (Tang et al., 2001). L’association spécifique du substrat

INTRODUCTION

au complexe Apc2/Apcll se fait via une protéine adaptatrice dont on connaît trois représentants, les protéines Cdc20, Cdhl et Amal (Harper et al., 2002; Zachariae and Nasmyth, 1999; Cooper et al., 2000). Ces trois protéines adaptatrices interagissent avec Apc2 grâce à un domaine d’interaetion protéique de type Cbox (Schwab et al., 2001) et ont en eommun la capacité de permettre la reconnaissance spécifique de substrats grâee à des régions d’interactions entre protéines de type WD40 en répétition. Il a été montré que les protéines adaptatrices Cdc20, Cdhl et Amal permettent la reeormaissance et la dégradation spécifique respeetivement de la sécurine (Pdsl) (Lim et al., 1998), de la cyeline B2 (Clb2) (Schwab et al., 1997) et de la cyeline B1 (Clbl) (Cooper et al., 2000).

Concernant le complexe SCF, il a été montré initialement chez la levure S. cerevisiae qu’il permet l’entrée en phase S et ceei par la dégradation du facteur Sicl qui est un inhibiteur de la cyeline B kinase (Schwob et al., 1994; Verma et al., 1997). SCF est un complexe macromoléculaire contenant au moins quatre sous unités : l’ubiquitine ligase E3 Cullin-1 (Cull ou Cdc53), la protéine Hrtl à domaine RING (aussi appelée Rocl ou Rbxl), la protéine de liaison Skpl et un membre de la famille des protéines Fbox (Tyers and Jorgensen, 2000). En plus de Cullin-1, il existe aussi les CuIlin-2, Cullin-3, Cullin-4 et CuIlin-5. Elles possèdent toutes l’activité d’ubiquitine ligase E3 mais les sous unités qui constituent les complexes dans lesquelles elles fonetionnent ne sont pas ou partiellement connus. Au sein du groupe qu’il défini, le eomplexe SCF est le prototype d’un modèle de complexe protéique dont le point eommun est la présence d’un élément catalytique eomposé par une protéine de la famille des Cullins et par la protéine Hrtl à domaine RING. Les autres sous unités qui permettent la sélection du substrat varient suivant les complexes mais conservent des similarités structurelles importantes.

1.3.4. Les complexes de type SCF

On eompte aujourd’hui quatre modèles de complexes de type SCF. Le modèle prototype du complexe SCF, le complexe ECS, le complexe Ddbl-Cullin4 et le complexe BTB-Cullin-3.

Le eomplexe SCF (Figure 12-C) comporte l’ubiquitine ligase E3 Cullin-1 qui permet l’ancrage des différents éléments du complexe. Par sa partie N-terminale, Cullin-1 interagit avee la protéine de liaison Skpl, eette dernière s’associe à une protéine adaptatrice de la famille des protéines Fbox qui reeonnaît spéeifiquement le substrat. Les protéines Fbox contiennent un domaine de 40 résidus d’acides aminés formant le domaine Fbox, e’est ee

16

INTRODUCTION

domaine qui permet l’interaction avec la protéine de liaison Skpl et permet l’association avec l’ubiquitine ligase E3 Cullin-1. La partie restante de la protéine présente ime région permettant le recrutement spécifique du substrat. Cette région est constituée par la répétition de motifs riches en leucine (LRRs) ou la répétition des motifs WD40. Par sa partie C terminale, Cullin-1 interagit avec la protéine Hrtl formant ainsi le domaine eatalytique qui recrute l’enzyme activatrice E2, en l’occurrence Cdc34 (Tyers and Jorgensen, 2000). De nombreux complexes SCF ont été caractérisés dans le détail, nous citerons comme exemples représentatifs le complexe SCF constitué de la protéine adaptatrice cdc4 contenant la répétition des motifs LRRs qui permet l’ubiquitination et la dégradation de la protéine Sicl (Verma et al., 1997). Sur le même modèle il existe les complexes SCF constitués par les protéines adaptatrices Met30 et P-TrCP contenant la répétition des motifs WD40 et permettant respectivement la dégradation du facteur de transcription Met4 (Patton et al., 2000) et de l’inhibiteur de NF k B, I k B œ (Winston et al., 1999). Il existe aussi le complexe SCF constitué par la protéine adaptatrice Grr contenant la répétition des motifs LRRs et permettant la dégradation des cyclines Clnl et Cln2 (Hsiung et al., 2001). Enfin, il existe le complexe SCF contenant la protéine adaptatrice particulière Skp2 qui a la capacité de reconnaître plusieurs substrats différents comme le facteur de transcription E2F1 (Marti et al., 1999), les inhibiteurs de cyclines kinases p27, P21 et P57 (Bomstein et al., 2003; Carrano et al., 1999; Tateishi et al., 2001), le facteur d’initiation de la réplication Cdtl (Li et al., 2003), le suppresseur de tumeurs pl30 (Tedesco et al., 2002) et le facteur de transcription Myc (Kim et al., 2003).

La structure du complexe de type ECS (Figure 12-D) est similaire à celle décrite dans

le complexe SCF, l’ubiquitine ligase Cullin-2 interagit par sa partie N-terminale avec

l’elongine B elle-même interagissant avec l’elongine C (Aso et al., 1995). C’est l’elongine C

qui s’associe via un domaine SOCS (Suppressor of Cytokyne Signaling) avec la protéine

adaptatrice de type SOCS-box qui reconnaît le substrat via un domaine d’interaction

protéique de type VHL, WD40 ou Ankyrine. Le premier complexe ECS caractérisé fut le

complexe contenant la protéine adaptatrice nommée Suppresseur de tumeur (VHL)

permettant l’ubiquitination et la dégradation du facteur de transcription HIFI a (Ivan et al.,

2001) . D’autres protéines adaptatrices de types SOCS-box constituant des complexes de type

ECS sont connues. Comme nous l’avons fait pour les complexes de types SCF, nous citerons

les plus caractéristiques. Nous avons déjà cité le complexe contenant la protéine VHL qui

ubiquitine et dégrade le facteur de transcription HIFI a (Ivan et al., 2001). Dans un autre

INTRODUCTION

complexe ECS, la protéine adaptatrice SOCSl interagit spécifiquement avec deux protéines, le facteur d’échange nucléotidique guanine spécifique (VAV) (DeSepulveda et al., 2000) et la protéine kinase JAK2 (Frantsve et al., 2001). Dans le cadre de cette étude, il nous paraît particulièrement intéressant de citer l’exemple du complexe ECS constitué par la protéine adaptatrice Neuralized qui permet l’ubiquitination et la dégradation par le protéasome 26S du ligand Delta (Lai et al., 2001 ; Deblandre et al., 2001). Nous pouvons voir avec ce dernier complexe, un exemple de régulation de la neurogenèse par le système couplant l’ubiquitination et la dégradation par le protéasome 26S. Il semble raisonnable de supposer que d’autres facteurs biologiques ayant un rôle dans la neurogenèse soient régulés par le même système associant ubiquitination et protéasome en utilisant l’un des types de complexes décrits ici.

Le complexe Ddbl-Cullin-4 (Figure 12-E) est pour le moment peu documenté, nous savons néanmoins que le complexe Ddbl-Cullin-4 associé avec la protéine adaptatrice DETl (De-etiolated-1) permet l’ubiquitination et la dégradation par le protéasome 26S du facteur de transcription Jun (Wertz et al., 2004). De même il a été montré que Ddbl-Cullin-4 permet la dégradation d’une protéine réparatrice de l’ADN endommagé Ddb2 (Shiyanov et al., 1999) et permet chez la levure la dégradation du facteur de rétention nucléaire de la réductase de ribonucléotides Spdl (Liu et al., 2003).

1.3.5. Les complexes de type BTB-Cullin-3

Le complexe B l B-Cullm-3 (Figure 12-F) a été mis en évidence au cours de ces deux dernières années. Dans ce type de complexe la protéine ubiquitine ligase E3 est de type Cullin-3. Elle interagit par sa partie N-terminale avec une protéine adaptatrice contenant un domaine de type BTB-POZ. Nous reparlerons dans cette introduction plus longuement de ce type de domaine. Ces protéines adaptatrices à domaine BTB-POZ combinent en une seule protéine, d’une part la fonction de protéine de liaison à l’ubiquitine ligase E3 via le domaine BTB-POZ (rôle de la protéine Skpl pour le complexe SCF et du dimère elongine B et C pour le complexe ECS) et d’autre part la fonction adaptatrice de reconnaissance spécifique du substrat grâce à des motifs d’interactions protéiques variés présents dans la protéine.

Le complexe BTB-Cullin-3 le mieux caractérisé est celui mettant en jeu chez le C. elegam l’association Cullin-3 et la protéine adaptatrice MEL-26 contenant un domaine BTB-POZ à l’extrémité C-terminale et un domaine MATH à l’extrémité N-terminale. Ce complexe permet la dégradation via le système d’ubiquitination et dégradation par le

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Figure 13 ; Distribution du domaine BACK au sein du groupe des protéines connues du génome humain contenant les domaines BTB-POZ et Kelch. Chez l’homme, la majorité des domaines BACK sont trouvés dans les protéines associant les domaines BTB-POZ et Kelch. Le domaine BACK est toujours trouvé en simple copie et associé à l’un des domaines déjà cités (Stogios et al., 2004).

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INTRODUCTION

protéasome 26S de la protéine Mei-1 qui contrôle le passage de la méiose à la mitose (Pintard et al.2003 ; Xu L and Wei Y, 2003). Récemment, il a été montré que le complexe associant Cullin-3 et la protéine adaptatrice Spop contenant un domaine BTB-POZ et un domaine MATH permet la dégradation de la protéine Bmil et de l’histone MacroH2Al. Ces protéines sont constitutives respectivement des complexes PRC (Polycomb Répressive Complex) et MacroH2A, ces deux complexes étant impliqués dans l’inactivation du chromosome X (Hemandez-Munoz et al., 2005). Les deux exemples précédents fondent un groupe basé sur les caractéristiques structurelles de la protéine adaptatrice, celle ci contenant un domaine MATH présent à l’extrémité N terminale et un domaine BTB-POZ à l’extrémité C terminale.

De la même manière, il est possible de distinguer un autre groupe de protéines adaptatrices. Il a été montré qu’il existe chez l’homme un complexe où la protéine Cullin-3 est associée à la protéine adaptatrice Keapl. La protéine Keapl contient un domaine BTB- POZ à l’extrémité N-terminale immédiatement suivit par un domaine BACK dont la fonction est encore inconnue. C’est une étude bioinformatique du laboratoire de G. Privé qui a mis en évidence la présence prééminante du domaine BACK dans les protéines contenant un domaine BTB-POZ associé à un domaine Kelch (Figure 13). Il n’y a pas de fonction connue pour ce type de domaine mais sur la base de l’analyse de sa structure, il a été suggéré que ce domaine permette l’orientation de la protéine adaptatrice dans le complexe d’ubiquitination (Stogios and Privé, 2004). A l’extrémité C-terminale de la protéine Keapl se trouve un domaine de type Kelch dont la principale propriété est d’interagir avec les filaments d’actine (Adams et al., 2000). Il a été montré que Keapl permet la dégradation du facteur de transcription Nrf2. C’est un facteur de transcription qui active plusieurs gènes qui codent pour des protéines aux propriétés antioxydantes et pour des enzymes impliquées dans le métabolisme des xénobiotiques. En réponse à un stress oxydatif, le facteur Nrf2 transloque du cytoplasme vers le noyau et se fixe aux éléments de réponse antioxydants (ERA) présents dans les promoteurs des gènes cibles. En situation normale, le facteur est séquestré dans le cytoplasme par la protéine Keapl qui entraîne son ubiquitination puis sa dégradation par le protéasome 26S (McMahon et al., 2003 ; Zhang and Hannink, 2003 ; Kobayashi et al., 2004 ; Furukawa and Xiong, 2005). La protéine gigaxonine a fait l’objet de travaux récents. Cette protéine contient les différents domaines BTB-POZ, BACK et Kelch. Initialement, il a été montré que la mutation de cette protéine entraîne l’apparitîon d’une maladie neurodégénérative grave caractérisée par l’accumulation de neurofilaments dans les axones (Kuhlenbaumer et al., 2002). Il a été montré que cette protéine est impliquée dans le contrôle de l’organisation des microtubules via son interaction avec MAPI b (Microtubule Associated

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Protein Ib) et que la protéine MAPI b permet la stabilisation structurelle des neurones en maintenant l’intégrité du cytosquelette (Ding et al., 2002). Les travaux de double hybride en levure et d’immunoprécipitation de Furukawa ont montré que gigaxonine interagit avec Cullin-3 (Furukawa et al., 2003) mais c’est tout récemment qu’a été montré la fonction adaptatrice de gigaxonine dans un complexe BTB-Cullin-3 permettant l’ubiquitination de MAPI b suivit par sa dégradation par le protéasome (Allen et al., 2005). On peut donc définir un autre groupe de protéines adaptatrices contenant un domaine BTB-POZ immédiatement suivit par un domaine BACK présent à l’extrémité N-terminale et un domaine Kelch à l’extrémité C-terminale.

Il n’existe à ce jour que ces quatre exemples de complexes BTB-Cullin-3 associés à leurs substrats qui sont caractérisés mais il semble probable que de nombreux eomplexes BTB-Cullin3 permettant la dégradation de protéines cibles n’ont pas encore été caractérisés.

En effet, un criblage double hybride en levure effectué avec la protéine Cullin-3 de C elegans comme appât a permis d’obtenir 11 protéines BTB-POZ comme partenaires d’interactions, le même type de criblage ehez l’homme a permis d’obtenir 13 protéines BTB-POZ (Furukawa et al., 2003).

1.4. Les protéines à domaine BTB-POZ

Le domaine BTB-POZ (Broad-complex, Tramtrack and Bric à brac and Pox virus and Zinc fingers) (Godt et al., 1993 ; Bardwell and Treisman, 1994) est un domaine d’environ 120 résidus d’aeides aminés. Ce domaine est présent dans les protéines de nombreuses espèces indiquant une forte conservation au cours de l’évolution. Ce domaine a été initialement identifié dans un groupe de facteurs de transcription comprenant Ttk (Tramtrack) (Harrison and Travers, 1990), BR-C (Broad Complex) (DiBello et al., 1991), les protéines babl et bab2 (bric à bracl et bric à brac2) (Godt et al., 1993), Bcl6 (B-cell lymphoma 6) (Ye et al., 1993) et PLZF (Promyelocytic Leukemia Zinc Finger) (Chen et al., 1993). La réalisation du projet de séquençage du génome humain a mis en évidence l’existence de 204 protéines distinctes contenant un domaine BTB-POZ. Environ 20% de ces protéines codent pour des facteurs de transcription à doigts à zinc, 20% codent pour des protéines contenant le motif Kelch de liaison à l’actine et une grande majorité reste sans classification nette. Nous nous intéresserons dans cette introduction essentiellement aux protéines à domaine BTB-POZ associé à un domaine à doigts à zinc ainsi qu’aux protéines contenant un domaine BTB-POZ associé à un domaine Kelch. Les protéines à domaine BTB-POZ associé à un domaine à

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doigts à zinc sont à l’origine de la découverte du domaine BTB-POZ et de la caractérisation de ses propriétés biochimiques. Le domaine BTB-POZ suscite l’intérêt grandissant de la communauté scientifique, une base de données spécialisée dans la compilation des séquences des protéines à domaine BTB-POZ est en cours d’élaboration par le laboratoire du docteur G.

Privé de l’institut sur le cancer du « Princess Margaret Hospital » à Toronto. Cette base de données est accessible sur Internet à l’adresse suivante ; (http://xtal.uhnres.utoronto.ca/prive/proiects.htm).

La propriété biochimique commune des domaines BTB-POZ est de permettre des interactions entre protéines, ces interactions peuvent être Thomodimérisation ou l’hétérodimérisation avec des protéines contenant un domaine BTB-POZ (Collins et al., 2001). Il a aussi été montré que le domaine BTB-POZ pouvait permettre l’élaboration d’oligomères comme c’est le cas pour la protéine GAGA (Espinas et al., 1999). Les principaux travaux ayant permis de mettre en évidence les caractéristiques fonctiormelles de ce domaine provierment de l’étude des domaines BTB-POZ des facteurs de transcription PLZF et Bcl6, facteurs contenant un domaine à doigts à zinc de type C

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. Il a été montré que la dimérisation de PLZF, médiée par le domaine BTB-POZ, est nécessaire pour que le dimère acquière une conformation fonctionnelle (Licht et al., 1996). De plus, il a été montré que les domaines BTB-POZ des facteurs de transcription PLZF et Bcl6 peuvent recruter directement les co-répresseurs SMRT (Silencing Mediator of Retinoid and thyroid hormone) et N-CoR (Nuclear CoRepressor) qui sont des composants du complexe répresseur multi protéique mSin3A/HDAC (Hong et al., 1997 ; David et al., 1998 ; Ahmad et al., 2003).

Cependant cette propriété n’est pas générale puisque les facteurs de transcription à domaine BTB-POZ comme HIC (Hypermethylated In Cancer) et yFBP-B (yFl Binding Protein isoform B) agissent en tant que répresseur transcriptioimel sans interagir avec les co-répresseurs SMRT et N-CoR. Enfin des travaux complémentaires sur PLZF et BcI6 ont montré que des mutations de résidus d’acides aminés dans les domaines BTB-POZ de ces protéines entraînent l’inhibition de leur activité transcriptionnelle. Ces données suggèrent que l’intégrité du domaine BTB-POZ est critique pour maintenir les fonctions protéiques (Melnick et al., 2002).

Les facteurs de transcription à domaine BTB-POZ sont impliqués dans im large éventail de fonctions biologiques. A titre d’exemple nous pouvons citer la protéine PLZF qui est un inhibiteur de la croissance cellulaire. Ce facteur de transcription bloque la prolifération et la différentiation des cellules myéloïdes (Shaknovich et al., 1998) en réprimant l’expression du gène codant pour le régulateur du cycle cellulaire cycline A (Yeyati et al..

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