Les lactobacilles vaginaux : Isolement, identification et étude des aptitudes probiotiques

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République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de !'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université de Jijel

~~4- Faculté des Sciences Exactes et

Sciences de la Nature et de la Vie Département de Biologie

Moléculaire et Cellulaire

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Mémoire de fin d'études pour l'obtention du Diplôme Master 2 en biologie

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Option : Microbiologie Appliquée

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~~ ¹ ~J ^J Intitulé

Les lactobacilles vaginaux : Isolement, identification et étude des aptitudes

probiotiques

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Membres du jury: Présenté par:

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Présidente: Dr. Akroum S. Benamoura Wissam

Examinatrice:

Mm.

Roula S. Bouhelais Fella Encadreur: Dr .ldoui T.

Année universitaire: 2011-2012

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1œmerciements :

Nous tenons âabord et avant tout à rendre hommage nous remercions ^1Jieu, qui nous a donné

^{a

yatience et {e courage your que nous yuissions acfiever ce travail

La réussite âe ce travai{ ne saurait être yossi6{e sans {e grand ayyort âe notre encadreur ^'Dr. !<foui 'I'aye6, âe sa disyoni6iilté, nous {e remercions égafement your

{e temps précieux qu'i{ nous consacré, ainsi que your ses comyétence, ses consei{s et ses suagestions.

Nous tenons aussi ^à exprimer nos profonds remerciements à :

• :M_eflé

.Jtk.roum S., dOcteur ^à l'université âe Jije{

your nous avoir fait Clîonneur dé yrésUiér {e ]Ury.

,

• :M_me 1Wufa

S., Professeur à {'université âe Jije{

your avoir acceyté de yarticiper à ce jury.

Nos cfiafeurs remercions s'adresse à nos cfiers yarents et à nos frères your ses encouragements your feur

soutient tout au fonEJ âe nos études et durant ce mémoire.

'Enfin, Le mérite dé ce travai{ revient à toutes {es yersonnes qui ont yarticiyé de _prés ou de foin à sa

réa{isation et auxque{{es â ai{feurs j'exprime âe tout cœur mes remercions

:fe{{a et tvissam

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Sommaire

Introduction ... 01

Partie 1: Etude bibliographique Chapitre 1: L'écosystème vaginal 1.1.La micro-écologie du vagin ... 02

1.1.1. L'épithélium vaginal ... 02

1.1.2. La microflore ... 02

1.1.3. Les interaction.$ hôte-microbe et les interactions entre les espèces microbiennes ... 02

I.2. La microflore va8"inale saine ... 03

1.3. Le déséquilibre de la microflore vaginal ... 04

1.3.1. Facteur de déséquilibre ... 04

1.3.2. Mécanismes des infections ... 05

1.3.3. La vaginose bactérienne ... 05

1.3.4. La vaginite à levure ... 05

Chapitre II : Les lactobacilles vaginaux II. 1. Définition et données sur les lactobacilles vaginau ... 06

11.2. Caractères généraux ... 06

Il. 2.1. Caractères morphologiques ... 07

II.2.2. Caractères métaboliques et biochimique ... 07

II.2.2. Caractères physiologiques ... 07

II.2.3. Exigences nutritionnelles ... 08

11.3. Taxonomie et classification ... 08

II.4. Les voies métaboliques des lactobacilles vaginaux ... 09

Chapitre III: L'-e:ffet probiotique des lactobacilles vaginaux III. 1. Historique sur le terme pro biotique ... 11

III. 2. Définition des pro biotiques ... 11

IIl.3. Les groupes de bactéries probiotiques et critères de sélection ... 11

IIl.4. Pouvoir inhibiteur des lactobacilles vaginaux ... 12

III. 5. Action des lactobacilles vis-à-vis des microorganismes pathogènes ... 12

IIl.5 .1. Aptitudes pro biotiques des lactobacilles vaginaux (Inhibition des pathogènes) ... 13

ill.5.1.1. La production du peroxyde d'hydrogène ... 13

IIl.5.1.2. La production des bacteriocines ... . . ... 14

111.5.1.3. La production des acides organiques ... 15

111.5.1. 4. L'arginine désaminase ... 15

111.5.1.5. La production des biosurfactants ... 15

III. 5.1.6. L'inhibition de l'adhésion des pathogènes ... 15

III. 5.1. 7. L'inhibition de l'expansion des pathogènes par la co-aggregation ... 16

Partie II : Etude expérimentale II. Matériels et méthodes 11.1. Matériel ... 17

11.1.1. Des écouvillons vaginaux ... 17

II .1.2. Les souches bactériennes ... 17

II.1.3. Disques d'antibiotiques ... 17

11.1. 4. Les sels biliaires ... 1 7 11. l.5. Les Cellules épithéliales vaginales ... 18

11.1.6. Milieux de culture ... 18

11.1. 7. Produits chimiques et réactifs ... 18

11.1.9. Appareillages ... 19

11.2. Méthodes ... 20

11.2.1. Evaluation de la microflore cultivable du vagin ... 20

II.2.1.1. Récupération des échantillons et préparation des dilutions ... 20

11.2.1.2.Flore dénombrées ... 20

11.2.1.2.l Dénombrement de la flore totale aérobie mésophile (F.T.A.M) ... 20

II.2.1.2.2. Dénombrement des entérobactéries ... .21

11.2.1.2.3. Dénombrement des levures et moisissures ... .21

II.2.1.2.4. Dénombrement des Pseudomonas ... 21

11.2.1.2.5. Dénombrement des bactéries lactiques ... 21

II.2.2. Mise en place d'une collection de lactobacilles vaginaux ... 21

II.2.2.1. Isolement et purification des lactobacilles vaginaux ... .21

11.2.2.2. Tests d'identification des lactobacilles vaginaux ... 21

11.2.2.2.1. Examen macroscopique ... .22

11.2.2.22. Examen microscopique ... 22

II.2.2.2.3. Test de croissance à différentes températures ... 22

II .2.2.2.4 .Tests biochimiques ... 22

II.2.3. Etude des aptitudes probiotiques des lactobacilles in vitro ...... 24

II.2.3.1. Recherche de peroxyde d'hydrogène ... 24

II.2.3.2. La tolérance aux acides ... 24

II.2.3.3. La tolérance aux sels biliaires ... .25

Il.2.3.4. Etude de l'aptitude à l'auto-agrégation et à la co- agrégation ... 25

Il.2.3.5. Test d'hydrophobicité ... 26

II.2.3.6. Test d'adhésion des lactobacilles aux cellules épithéliales vaginales ... 27

11.2.3. 7. Evaluation de l'activité antimicrobienne ... 27

II.2.3. 7 .1. Evaluation de l'activité inhibitrice de surnageant ... 27

II.2.3.7.2. Evaluation de l'activité inhibitrice de surnageant neutre ... 27

II.2.3.8. Etude de la sensibilité des bactéries lactiques aux antibiotiques ... 28

Il. 2. 4. Etude de quelques aptitudes technologiques des lactobacilles ... 28

Il. 2. 4.1. Etude du pouvoir acidifiant et détermination du pH ... 28

II.2.4. 2. Quantification de la production d'exopolysaccharides ... 29

II.2.4. 3. Croissance des lactobacilles sur milieu MRS modifié végétal ... 29

III.2. Mise en place d'une collection de lactobacilles vaginaux ... 30

III.2.1. Isolement, purification et identification des lactobacilles vaginaux ... 30

III. 2.2.1. Test de croissance à différentes températures ... .31

· IIl.2.2.2. Tests biochimiques ... 31

llI.2.2.3. Profil fermentaire des sucres ... .34

III.2.2.4. Identification de souches isolées ... 36

ill.3. Etude des aptitudes probiotiques des lactobacilles in vitro ............. .... 36

III.3.1. Recherche de peroxyde d'hydrogène ... 36

III.4.2. La tolérance des lactobacilles aux conditions acides ... 37

III.4.2. La tolérance des lactobacilles aux sels biliaires ... 39

II.3.2. Aptitude à l'auto-agrégation et à la co- agrégation ... .40

II. 3.4. Test d'hydrophobicité ... : ... .42

11.3.3. Pouvoir d'adhésion des lactobacilles aux cellules épithéliales vaginales ... .43

III.3.5. Evaluation de l'activité antimicrobienne ... .44

III.3 .5 .1. Evaluation de l'activité inhibitrice de surnageant ... .44

III.3.5.2. Evaluation de l'activité inhibitrice de surnageant neutre ... .47

III.3.6. Résistance des lactobacilles aux antibiotiques ... .47

III. 4. Etude de quelques aptitudes technologiques ... .48

III. 4.1. Le pouvoir acidifiant des lactobacilles vaginaux ... .48

III.4.2. Quantification de la production d'exo-polysaccharides ... 50

III.4.2.Croissance sur milieu MRS modifié végétal ... 51

Conclusion ...... 52 Références bibliographiques

Annexe

Liste des tableaUX- :

N° de tableau Page

Tableau 1 : Le pourcentage de différentes espèces qui composent la microflore vaginale saine . .4

Tableau 2 : Lactobacilles les plus fréquemment isolés à partir de vagins sains ... 6

Tableau 3 : Principaux caractères métaboliques et biochimiques de Lactobacillus ... 7

Tableau 4. Proposition de critères de sélection des pro biotiques à application vaginale ... 12

Tableau 5 : Nombre moyen de colonies dénombrées (UFC/ml de PV) dans le vagin de chaque prélèvement vaginaux ... 30

Tableau 06 : Test de croissance des lactobacilles à différents températures ... 31

Tableau 07: Tests d'identification biochimique des lactobacilles vaginaux ... 31

Tableau 08: Profil d'attaque des sucres par les lactobacilles vaginaux ... 35

Tableau 09: Résultats de l'identification des lactobacilles vaginaux ... 36

Tableau 10: Résultats de la recherche du peroxyded'hydrogène ... 37

Tableau 11: Pourcentage d'hydrophobicité des lactobacilles vaginaux ... .42

Tableau 12 : Résistance des lactobacilles aux antibiotiques ... .48

Tableau 13: Résultat de l'activité acidifiant des souches tests ... ... .49

Tableau 14: Quantification de la production des exopolysaccharides par les lactobacilles ... 50

Liste des figures

N° dès figürës Pâgê

Figure 01: Interactions hôte-microbe et interactions entre les espèces microbiennes

vaginaux ... 03

Figure 2 : Classification des lactobadlies ...

08

Figure 3. Voies homofermentaire et hétérofermentaire ... 10

Figure 4. Modes d'action du peroxyde d'hydrogène sur les pathogènes ... 13

Figure 5. Mode d;action des bactériocines produites par les lactobaciiles ... 14

Figure 6. Mécanisme d'inhibition de l'adhésion des pathogènes sur l'épithélium vaginal par les lactobacilles ... 16

Figure07: Inhibition des pathogènes par compétition nutritionnelle vis-à-vis de l'arginine desaminase ... 32

Figure 08: Effet de l'acidité (pH 2) sur la survie des lactobacilles vaginaux ... .38

Figure 09: Effet des sels biliaires sur la croissance de lactobacilles ... 39

Figure 10: Photo microscopie de l'auto-agrégation de la souche V2 (Gx40) ... .40

Figure 11 : Représentation graphique du pourcentage d'auto-agrégation de la souche V2 ••••••••••• .40 Figure 12: Photomicroscopie de la co-agrégation : Lactobacillus fermentum (V n) et E. coli (x40) ......................................... 4l Figure 13: Photomicroscopie de la co-agrégation : Lactobacillus fermentum (Vu) et S. aureus (x40) ............................................ 41

Figure 14: Phtomicroscopie d'adhésion de la souche V₁₀ aux cellules épithéliales du vagin (x40) ..................................... 43

Figure 15: Phtomicroscopie d'adhésion de la souche V9 aux cellules épithéliales du vagin (x40).43 Figure 16: Inhibition de la croissance d'E.coli par les lactobacilles vaginaux ... .45

Figtttë 17: Inhibitiè>n dé là èroissànèè dé Candida spp pàr lés laètobàcillés vàgirtàux ....... .45

Figure 18 : Inhibition de la croissance de S. aureus par les lactobacilles vaginaux ... .46

Figure 19: Inhibition de là èrè>isSàtièé d' E. coli ATTC pàr lés làètè>bâcilles vagmaux ... 46

Liste des photos:

N° dêS photos Page

Photo 01: Résultat du test de l' ADH ....... 32

Photo 02 : Souche acétoïne positif sur le lait écrémé ... 33

Photo 03 : Le type fermentaire sur milieu Gibson Abdel Malek ........ 33

Photo 04: Résultat de la fermentation des sucres par les lactobacilles ... 34

Photo 05: Hydrophobicité des lactobacilles vaginaux vis-à-vis du xylène ... .42

Photo 07 : Production des EPS par les lactobacilles sur gélose hypersaccharosée ... 51

Photo 08 : Production des EPS par les lactobacilles sur milieu MRS ... .51

1

Introduction

Beaucoup de femnies sont ihcommodées par des pertes vaginales malodorantes et des irritations urinaires qui sont le plus souvent dues à des infections. En effet, plus de 300 millions de femmes dans le monde souffrent de vaginose bactérienne, de vaginites à levure et d'infections du tractus urinaire étroitement liées à un déséquilibre de ia microflore vaginaie.

En précisant un déséquilibre qualitatif ou quantitatif de la flore lactobacillaire qui représentent 95% de cette microflore et qui est le principal moyen de défense contre les pathogènes, elle joue un rôle potentiellement probiotique de protection par divers mécanismes. En plus de désagréments cité précédemment, dans certains cas ces pathologies peuvent s'aggraver et engendrer des fausses couches, des infections de la partie haute de l'appareil génital ou augmenter le risque d'aequisition du virus du sida (Reid, 2001).

L'utilisation des antibiotiques, comme le metronidazole, est le traitement usuel préconisé dans le cas de ces infections. Or, beaucoup de risques sont associés à cette pratique parmi lesquels l'apparition d'ëffëts sëëoïiiliiiiës, lë dévëfoppëmëïit dë microorganismes résistmts à ces antibiotiques, la limitation de l'action à un groupe de bactéries conduisant à l'inefficacité du traitement dans le cas d'infections poly-microbiennes, le risque de récidives ou encore la possibilité de développement d'infections secondaires (Gan:liner et

ai.,

^2001).

Face à ces problèmes, les gynécologues en arrivent à conseiller leurs patientes de suivi un traitement alternatif à l'usage d'antibiotiques c'est la bactériothérapie ou l'utilisation des probiotiques.

Aujourd'hui l'efficacité des probiotiques au niveau vaginal est bien reconnu et le marché de ces produits est en plein croissance mais leurs mécanismes d'action restent mystérieux.

Donc : quels sont les mécanismes mis en jeu par ces microorganismes qui font de ces derniers des probiotiques potentiels ?

Lë présëiit travail d'aëfühlilé répond au nouvëaü coïicëpt qüi est ëntraiii dë së dévëfoppër, fa bactériothérapie. L'objectif de cette étude est la mise en place d'une collection de lactobacilles vaginaux puis évaluation de leurs potentiels probiotiques.

Ce travail a été accompli en deux parties :

-. Une synthèse bibliographique qui a permis en premier temps d'élargir nos connaissances sur l'écosystème vaginal, les lactobacilles vaginaux et leurs actions pro biotique.

- Une deuxième partie focalisée sur les points suivants :

• Isolement et identification des lactobacilles du vagin ;

• Evaluation des aptitudes probiotiques in vitro ;

• Etude de quelque aptitude technologique.

Etude bibliographique Chapitre I : Ecosystème vaginal

I.1. La micro-écologie du vagin

La micro-écologie du vagin est c9mposée de trois éléments de base à prendre en considération : I.1.1. L'épithélium vaginal

Le vagin humain est bordé par un épithélium stratifié, pavimenteux et non kératinisé qui prolifère et s'épaissit en réponse à des niveaux élevés d'œstrogène. Les Glandes sécrétoires ne sont pas trouvées dans le vagin, mais les sécrétions proviennent des glandes de Bartholinet et Skene, du mucus cervical et des sites d'endomètre et de Fallope. La transsudation vaginale est contrôlée par les niveaux d'œstrogène. Les sécrétions comprennent 90-95% d'eau, sels organique et inorganique, l'urée, les carbohydrates, les mucines, les acides gras, les albumines, immunoglobulines, chélateur du fer, lysozymes et d'autres macromolécules, des leucocytes et des débris épithé~iales (Boris et Barbés, 2000).

I.1.2. La microflore

La flore vaginale locale est faite de nombreux micro-organismes qui composent la flore résidente et transitoire. La flore vaginale résidente est constituée en grande partie de micro- organismes ayant migrés depuis la région périnatale ou issus de la flore cutanée ou intestinale; il s'agit d'une flore aérobie et anaérobie mixte à prédominance anaérobie.

Cette flore vaginale est complétée de germes transitoires externes dont l'introduction dans le vagin est due à la convergence d'une multitude de facteurs de risque sociaux, épidémiologiques, organiques et individuels (Gerd, 2002).

La colonisation du vagin dés la naissance est comme suite (Bouhbot, 2007):

Chez le fœtus, la flore vaginale est nulle ;

Dès la naissance, le vagin est colonisé par des microorganismes (fèces, entourage direct: mains de la mère, du personnel soignant...) ;

Pendant l'enfance, la flore vaginale est constituée de microorganismes d'origine cutanée et fécale (colibacilles, staphylocoques ... );

Au moment de la pube1ié et pendant l'adolescence, le vagin est colonisée progressivement par une flore de femme adulte (lactobacilles, ge1mes anaérobies ... ) ;

Chez la femme adulte la flore vaginale est complète.

I.1.3. Les interactions hôte-microbe et les interactions entre les espèces microbiennes :

C'est le troisième aspect de micro-écologie qui doit être souligné (Boris et Barbés, 2000).La figure 01 illustre les interactions hôte-microbe et les interactions entre les espèces microbie1rnes vaginales.

Etude bibliographique Chapitre I : Ecosystème vaginal

• •

Pathogènes

_{• • •} • •

oOr

1

^i:r _{* Llo}

Acides

0 O ₀

Substances de

*

^{~ 0}

^O

^{Peroxyde d'hydrogène}

bactériocine like

*

^{0 0}

Lactobacillus Ç, 7\: ¹

<====>

Coaggrégation Moléculaires

B iosurfactant

Cellules épithéliales vaginales

0 ^C)

Figure 01 : Les interactions hôte-microbe et les i"nteractions entre les espèces microbiennes vaginales (Merk et al., 2004).

I.2. La microflore vaginale saine

La flore vaginale saine est composée de 5 à 6 espèces de micro-organismes avec un état d'équilibre entre les germes pathogènes et non pathogènes, ces derniers sont composés essentiellement de germes saprophytes (qui vivent sur un hôte sans entraîner de maladie) et en particulier les bacilles de Doderlein (ou lactobacilles) qui représentent environ 95 % de la flore vaginale globale, les sécrétions vaginales sont constituées de 10⁸ à 10⁹ germes/ml (Abbara, 2012).

Les espèces restantes sont essentiellement des germes anaérobies, 2 à 5 fois plus nombreuses que les germes aérobies (Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Prevotella spp, Peptostreptococcus spp) (Bouhbot, 2007). Le tableau 01, illustre le pourcentage de différentes espèces qui composent la microflore vaginale saine.

Etude bibliographique Chapitre I : Ecosystème vaginal Tableau 1 : Le pourcentage de différentes espèces qui composent

la microflore vaginale saine (Ronnqvist, 2007)

Espèces (%)

Lactobacillus spp. 88

Group B Streptococcus 16

Escherichia coli 06

Autres espèces Gram-negative 02

Gardnerella vaginalis 18

Mycoplasma hominis 06

Candida albicans 12

Prevotella spp. 28

Bacteroides ji-agilis 10

I.3. Le déséquilibre de la microflore vaginale

Lorsque les lactobacilles vaginaux sont diminués ou absents, d'autres microorganismes peuvent se développer excessivement, causant ainsi des troubles dont la vaginose bactérienne (VB) et la vaginite à levure (Dimitonova et al., 2007).

1.3.1. Facteur de déséquilibre

Les causes de déséquilibre sont multiples (Barbes et Boris, 2009) :

Hormonales dans les cas de troubles de la sécrétion glycogénique lors d'une grossesse, d'alcalinisation du milieu vaginal lors des périodes de menstruation, de la prise de contraceptifs oraux et de la ménopause ;

Physiques dues à certaines habitudes sexuelles, une mauvaise hygiène intime, l'utilisation de spermicides ;

Pathologiques dans le cas de patientes diabétiques ou immunodéficientes ;

Iatrogènes induites par des traitements aux antibiotiques à large spectre d'action, par la prise d'ovules, par l'utilisation d'antiseptiques, par la radiothérapie et par des interventions chirurgicales.

Malgré la multiplicité des causes, l'origine réelle des déséquilibres de la microflore vaginale reste inco1mue dans la majorité des cas (Mardh, 1993).

I.3.2. Mécanismes des infections

Le mécanisme des infections vaginales peut s'expliquer par une cascade de changements de population. Les facteurs cités précédemment induisent en parallèle une augmentation du pH et une diminution des lactobacilles, laissant alors à la plupaii des pathogènes la possibilité de se développer.

En effet, le pH est un bon indicateur de l'équilibre ou du déséquilibre de la microflore:

En absence d'infection, le pH est voisin de pH 4 sauf en période de menstruation où il augmente (Rousseau, 2004).

Un pH vaginale élevé dans la gamme de pHS,O à pH6,5 suggère un diagnostic de pathogènes bactériens (Caillouette et al., 2005).

Dans le cas infectieux de vaginite à levure, le pH est inférieur à pH 4 (Lepargneur et Rousseau, 2002).

Etude bibliographique Chapitre I : Ecosystème vaginal

I.3.3. La vaginose bactérienne

La vaginose bactérienne (VB) est l'infection génitale basse la plus fréquente chez la femme, relevant d'une altération de l'écosystème vaginal, elle voit le remplacement de la flore normale où dominante, les lactobacilles par d'autres espèces bactériennes de cette flore qui se multiplient anormalement (Menard et Bretelle, 2011). La cause précise de ce remplacement n'est pas connue, mais le rôle de certains facteurs a été mis en évidence:

disparition des lactobacilles probiotiques (producteurs de H₂0₂₎ ou pe1ie de la capacité d'adhésion, traitements antibiotiques, antiseptiques et toilette gynécologique drastique (Lefevre , 2001).

Trois des quatre critères suivants sont nécessaires pour pouvoir poser le diagnostic de

«vaginose bactérienne» (Mardh, 1993 ; Rousseau, 2004):

Pe1ies vaginales souvent homogènes ; Positivité de la recherche de nitrosamines ; pH vaginal 2: 4,5 ;

La présence de cellules épithéliales vaginales ponctuées de bactéries ( « clue cells » ).

I.3.4. La vaginite à levure

La présence d'une surcroissance de la levure dans le vagin porte le nom de «la vaginite à levure» (Beaudry L., 2008). C'est une infection mycosique très répandue qui affecte une large proportion de femmes. L'agent pathogène est généralement Candida albicans, une levure commensale de la muqueuse vaginale (Amouri et al., 2010) ..

Lorsque l'infection débute dans le vagin, les mycéliums levuriens produisent des lésions et de l'inflammation. Les pertes vaginales sont abondantes, inodore, épaisse, de couleur. blanchâtre et ont l'aspect du lait caillé adhérant aux parois du vagin et du col de l'utérus (Beaudry , 2008).

Etude bibliographique Chapitre II : Les lactobacilles vaginaux Il. 1. Définition et données sur les lactobacilles vaginaux:

Le Lactobacillus acidophilus vaginalis ou bacille de Doderleïn est l'un des principales espèces pro biotique qui est présente naturellement (isolés ou associés) dans la flore vaginale. Quelques centaines de millions de ces germes par millilitre constituent un biofilm protecteur sur la muqueuse vaginale et sont garants de l'équilibre local (Lachlak, 2006).

Elles portent le nom du gynécologue allemand Albert Doderleïn qui l'a découverte en 1892.

Le bacille de Doderleïn est une bactérie saprophyte qui se nourrit aux dépens des cellules mortes de la cavité vaginale. Sa présence est signe de bonne santé. Son absence ouvre la porte à des infections opportunistes (Lachlak, 2006).

Les lactobacilles les plus fréquemment retrouvés dans les vagins de femmes normales sont respectivementL. crispatus (48,3 %), L.jensenii (25,3 %), L. gasseri (23,5 %), L. iners (20,5 %).

En raison des variations naturelles, toutes les femmes ne sont pas sensibles aux mêmes lactobacilles. De très nombreuses autres espèces de lactobacilles peuvent être retrouvées avec une fréquence plus basse : L. rhamnosus, L. reuteri, L. fermentum .... (Bohbot, 2007).

Le tableau 2, nous donne une idée sur les espèces les plus fréquemment isolés à partir de vagins

sains.

Tableau 2 : Les lactobacilles les plus fréquemment isolés à partir du vagins sains (Verhelst et al., 2005)

L. crispatus 48,3

L.jensenii 25,3

L. gasseri 23,5

L. iners 20,5

L. vaginalis 11,6

L. reuteri 1,4

L. fermentum 1,1

L. rhamnosus 0,9

11.2. Caractères généraux

Les lactobacilles vaginaux sont très hétérogènes au plan de leur morphologie, de leur métabolisme et de leur phylogénie. Cette hétérogénéité est reflétée par les valeurs de G + C (%) qui varient de 32 à 55% (Madigan et Martinko, 2007).

Etude bibliographique Chapitre II : Les lactobacilles vaginaux

..

IL 2.1. Caractères morphologiques :

Les souches de lactobacilles sont des bactéries à Gram positif. Généralement les cellules se présentent sous la forme de bacilles longs et fins (parfois incurvés) d'autres plus courts et courbés, leur dimensions est de 0,5-1,2µm /1-lOµm. Les lactobacilles sont non sporulés, généralement immobiles (pour les souches mobiles, la ciliature est péritriche ). Isolé, parfois groupé en paire ou en chaine (Prescott et al., 2001).

La taille du génome des Lactobacillus est comprise entre 1,9 - 3,3 Mb (Madigan et Martinko, 2007).

11.2.2. Caractères métaboliques et biochimique

Les lactobacilles possèdent un métabolisme fermentatif et présentent des exigences nutritionnelles complexes (Madigan et Martinko, 2007). La production d'acide lactique issue du métabolisme fermentaire représente au moins 50% des produits de fermentation.

En outre, elles ne liquéfient pas la gélatine, ne produisent pas l'indole ni l'hydrogène sulfureux. Le manganèse joue un rôle important pour les bactéries lactiques en les protégeant de la toxicité de l'oxygène de même, elles produisent des quantités abondantes d'acide lactique par fermentation de substances hydrocarbonées. Leurs caractères métaboliques et biochimiques sont résumes dans le tableau 3.

Tableau 3: Principaux caractères métaboliques et biochimiques de Lactobacillus (Federighi , 2005).

Homo/ hétéro D fennentaire

(+):positif;(-): négatif; (D): dépendent des souches.

11.2.2. Caractères physiologiques

Les lactobacilles sont des microorganismes micro- aérophiles ou anaérobies. La croissance sur des milieux solides est généralement stimulée par une réduction de la tension en oxygène et par l'adjonction de 5 à 10 % de dioxyde de carbone (Prescott et al., 2001).

Quelques espèces ne cultivent qu'en anaérobiose lors de l'isolement (L.equicursoris).

La température optimale de croissance est généralement comprise entre 30 et 40°C (Madigan et Martinko, 2007), certaines souches de lactobacilles dites « thermophiles » restent viables à 55 °C (Tailliez, 2004). Ces bactéries résistent très bien aux conditions acides et peuvent se développer au pH proche de 4.

Etude bibliographique Chapitre II : Les lactobacilles vaginaux

11.2.3. Exigences nutritionnelles

Les lactobacilles sont en principe incapable d'effectuer la synthèse des acides aminés, et doivent par conséquent faire appel à des sources exogènes pour assurer leur métabolisme ce qui explique leur polyauxotrophie (Leveau et Bouix, 1993) :

Lactobacillus est caractérisé par son exigence aux multiples vitamines, bien plus que l'homme.

Les vitamines les plus communément indispensables aux microorganismes sont la thiamine (B1),

la biotine et la pyrodoxine (B6) (Madigan et Martinko, 2007).

Les bases purines et pyrimidines ne sont pas vraiment essentielles au métabolisme des bactéries lactiques. Cependant, les cations ont un rôle dans la résistance à l'oxygène dans les différentes réactions métaboliques et dans la nutrition des bactéries lactiques.

11.3. Taxonomie et classification:

La taxonomie a longtemps reposé sur les critères morphologiques et biochimiques permettant de différencier les espèces et de caractériser des variantes au sein d'une même espèce.

Selon le Bergy's manuel, les lactobacilles sont classés comme suit (figure 2):

Domaine : bactéria

Embranchement :

i

Firmicutes Classe : bacilli

i

i .

Ordre : Lactobaczllales Famille: Lactobacil/aceae

t

Genre : Lactobacillus

i

Espèces :

i

L. crispatus

L. vaginalis L. rhamnosus L. acidophilus

Figure 2 : Classification des lactobacilles (Whitman et al., 2009)

Ce genre regroupe plus de 70 espèces. Le genre Lactobacillus est quantitativement le plus

important des genres du groupe des bactéries lactiques. Orla- Jensen (1919) a proposé de diviser le genre Lactobacillus en trois sous genres: Thermobacterium, Bêtabacterium, Streptobacterium.

Etude bibliographique Chapitre II : Les lactobacilles vaginaux

Les lactobacilles homofermentaires stricts, regroupent les espèces de l'ancien sous-genre Thermobacterium, qui dégrade les hexoses en acide lactique. Ce groupe est constitué d'environ 25 espèces, la plupart des espèces sont thermophiles (Orla-Jensen, 1919).

Les lactobacilles hétéro fermentaires stricts, regroupent les espèces de l'ancien sous-genre Betabacterium, utilisant la voie du pentose phosphates pour la fermentation des hexoses en acide lactique, en acide acétique ou en éthanol et C02 (voie hétérofermentaire). C'est un groupe qui rassemble des espèces relativement hétérogènes, surtout mésophiles (Orla-Jensen, 1919;

Corrieu et Luquet, 2008).

Les lactobacilles hétérofermentaires facultatifs, regroupent les espèces de l'ancien sous genre Streptobacterium, métabolisent les hexoses en acide lactique par la voie homofermentaire et dégradent les pentoses par voie Hétérofermentaire (Kandler et Weis, 1986; Stiles et Holzapfel, 1997). Il est constitué d'une vingtaine d'espèces, majoritairement mésophiles (Corrieu et Luquet, 2008).

11.4. Les voies métaboliques des lactobacilles vaginaux

Les lactobacilles peuvent réaliser deux types de fermentation lactique selon les espèces (Federighi, 2005):

Homolactique : glucose lactate

C'est la voie d'Embden Meyerhoff Parnas ou l'acide lactique est le seul produit de la fermentation du glucose

Hétéro lactique : glucose lactate + éthanol ou acétate + _C02.

C'est la voie de Pentoses Phosphates ou la fermentation du glucose aboutit à la formation de l'acide lactique et d'autres composés : éthanol, C02, et d'autres acides organiques.

Le métabolisme est qualifié d'homolactique lorsqu'au moins 90 % du glucose consommé est converti en lactate. En condition ·de croissance non optimale (par exemple en limitation de carbone ou sur certains sucres), le métabolisme des bactéries homofermentaires peut se diversifier vers un métabolisme appelé mixte, avec production, en plus du lactate, de formate, de C02, d'acétate et d'éthanol (Bousquet et al. 1996)

La figure 3, illustre les deux principales voies métaboliques chez les lactobacilles.

Etude bibliographique Chapitre II : Les lactobacilles vaginaux

HOMOFERMENTAIRE HETEROFERMENTAIRE

Glucose

_l Gr

glucose-6-P glucose-6-P

1

l

...

xylulose-5-P

glycéraldéhyde-3-P

-

l

~

1aœ !

^acétyle-P :: Acétate

lactate éthanol

!

Figure 3. Voies homofermentaire et hétérofermentaire simplifiées.

(Rousseau, 2004).

Etude bibliographique Chapitre ID: Effet probiotique des lactobacilles vaginaux

III. 1. Historique sur le terme probiotique

Le terme probiotique, qui signifie "vie", est dérivé de la langue grec. Il a d'abord été utilisé par ' -Lilly et Stillwell en 1965 pour décrire «des substances sécrétées par un micro-organisme qui

stimule la croissance d'un autre » et donc a été contrasté avec le terme antibiotique.

En 1971, Sperti appliqué le terme à des extraits de tissus qui stimulent la croissance microbienne.

b\_ Parker a été le premier à utiliser le terme probiotique dans le sens où il est utilisé aujourd'hui.

11

a défini les probiotiques comme "organismes et substances qui contribuent à l'équilibre microbien intestinal".

En 1992, Havenaar et al. ont élargi la définition des probiotiques à l'égard de l'hôte et de l'habitat de la microflore comme suit: "Un mono-ou viable culture mixte de micro-organismes qui s'appliquaient à l'animal ou l'homme, affecte bénéficiaire de l'hôte en améliorant les propriétés de la microflore indigène".

Salminen et Schaafsma ont élargi la définition des probiotiques encore plus loin en plus de limiter les effets sur la santé proposées aux influences sur la microflore indigène. Selon Salminen, un probiotique est « une culture microbienne en direct ou un produit laitier de culture qui influence bénéfiquement sur la santé et la nutrition de l'hôte» (Schrezenmeir et Vrese M., 2001).

III. 2. Définition des probiotiques

La définition officielle retenue par la FAO (Food and Agriculture Organization) est la suivanet :

« les probiotiques sont des micro-organismes vivants qui, lorsqu'ils sont administrés en quantités adéquates, exercent une action bénéfique sur la santé de l'hôte» (Normand et al., 2006;

Guglielmotti et al., 2007 ).

ID.3. Les groupes de bactéries probiotiques et critères de sélection Il existe 4 grands groupes de probiotiques (Dupont C., 2001):

- Les ferments lactiques: Ils sont capables de produire l'acide lactique par la fermentation de certains sucres comme le lactose; les lactobacilles à savoir Lactobacillus bulgaris, Lactobacillus acidophilus et Lactobacillus casei: et les coques tel que Enterococcus et Streptococcus ;

- Les bifidobactéries d'origine humaine ou animale, elles appartiennent à la flore intestinale normale ;

- Les différentes levures de type Saccharomyces ;

- Les autres bactéries sporulées, dont Bacillus subtilis et cereus.

Cependant, les critères de sélection des probiotiques à application vaginale ont été proposés et ils sont groupés dans le tableau 04.

Etude bibliographique Chapitre ID: Effet probiotique des lactobacilles vaginaux

Tableau 04. Proposition de critères de sélection des probiotiques à application vaginale (Famularo et al., 2001 ; Cordo~ 2001)

~ - Souche isolée du vagin d'une femme saine ;

~ r"'1

rl.l E--4

-

Historique de non pathogénicité ;

~;

-

Pas de transmission possible de gènes de résistance aux antibiotiques ;

~~

-

^{Pas de} dégradation excessive du mucus.

E--4

u u

;~

rl.l

-

^Adhésion aux cellules vaginales et persistance dans le vagin,

~

rl.l

~ ^-

Production de substances antimicrobiennes (notamment peroxyde

~

d'hydrogène) et antagonisme vis-à-vis des pathogènes (notamment

~o compétition d'adhésion);

;~

~-

-

Effets sur la santé documentés.

uz

0

J;il;i

rl.l

Stabilité au cours des procédés de production et dans le produit fini ;

~

-

~

-

conservation des propriétés probiotiques après production ;

~~

^- Relargage rapide des souches en dehors de la matrice après introduction dans

r.l 0 le vagin.

~,..;;i

;a~

u= _u

~ E--4

111.4. Pouvoir inhibiteur des lactobacilles vaginaux

Une association bénéfique des micro-organismes sur l'hôte humain a probablement été d'abord suggérée par Doderlein, qui a proposé que les bactéries vaginales produisent de l'acide lactique à partir de sucres pour empêcher ou inhiber la croissance des bactéries pathogènes (Holzapfel et al., 2001). Fondamentalement, les lactobacilles présentent deux mécanismes pour interférer avec les agents pathogènes (Boris et Barbés, 2000):

L'adhérence sur le mucus vaginal, formant une barrière qui empêche la colonisation par des agents pathogènes ou de la concurrence pour les récepteurs des cellules épithéliales ; La production de composés antimicrobiens tels que le peroxyde d'hydrogène, l'acide lactique, les bactériocine, et éventuellement les biosurfactants.

III. 5. Action des lactobacilles vis-à-vis des microorganismes pathogènes

Le rôle des espèces de lactobacilles dans le tractus urogénital féminin comme barrière à l'infection est d'û.n intérêt considérable. Ces microorganismes sont censés contribuer à la maîtrise de la microflore vaginale (Boris et Barbés, 2000).

Ces bactéries jouent un rôle protecteur en inhibant la croissance, l'adhésion ou l'expansion d'autres micro-organismes. Pour ce faire, différents mécanismes sont déployés dont notamment

Etude bibliographique Chapitre ID: Effet probiotique des lactobacilles vaginaux

la sécrétion d'acides organiques, la production de substances antimicrobiennes (peroxyde d'hydrogène, bactériocines, biosurfactants), la compétition vis-à-vis des nutriments (arginine désaminase), la compétition vis-à-vis des sites récepteurs (adhésion à l'épithélium) et la co- agrégation (Lepargneur et Rousseau 2002).

111.5.1. Aptitudes probiotiques des lactobacilles vaginaux (Inhibition des pathogènes) 111.5.1.1. La production du peroxyde d'hydrogène

La production du peroxyde d'hydrogène (H202) par certaines souches de Lactobacillus est l'un des mécanismes qui contribue à la régulation de l'écosystème vaginal.

Les souches de Lactobacillus qui sont capables de produire _H202 sont les micro-organismes prédominants dans la région vaginale de la femme en bonne santé. L'absence de ces micro- organismes est liée à une incidence plus élevée d'infections, principalement causée par Gardnerella vaginalis.

Eschenbach et al. (1989) ont conclu dans leurs études que la production de ce métabolite oxydatif peut représenter un mécanisme antimicrobien de défense non spécifique de l'écosystème vaginal normal. En outre, la production de H202 peut être l'un des facteurs responsables de la prédominance de lactobacilles dans le vagin et qui est important pour le maintien de l'équilibre écologique surtout chez les femmes enceintes (Ocana et al., 2006; Kaewsrichan et al., 2006).

La toxicité de H202 est due au pouvoir oxydant de la molécule elle-même ou de ses métabolites OH (radical hydroxyle) et 02- (anion superoxyde) produits par des agents réducteurs (ions halogénures du type

en

et des enzymes peroxydases qui sont présentes dans le fluide vaginal.

Les réactions sont décrites dans la figure 4.

Ces molécules peuvent agir sur les protéines (inactivation des enzymes cytoplasmiques), les lipides membranaires (augmentation de la perméabilité membranaire) et les acides nucléiques (induction de mutations del' ADN). Par contre, l'autodestruction des lactobacilles est évitée pour ceux possédant une NADH peroxydase qui transforme le peroxyde d'hydrogène (Ocana et al., 1999; Rousseau, 2004).

Ladobacille

0i oxydase :flavoprotéinique

~o~=

/f ,./_,/'

Ions halogénures

+ Peroxydases

B10.Z

Pathogène

* inactivation des enzymes

*augmentation de la perméabilité

* mutations de I' ADN

Figure 4. Modes d'action sur les pathogènes de H202 et de ses dérivés

produits par les Lactobacillus (Ocana et al., 1999; Lepargneur et Rousseau, 2002).

Etude bibliographique Chapitre ID: Effet probiotique des lactobacilles vaginaux

111.5.1.2. La production des bacteriocines

Les bactériocines sont des produits protéiques de synthèse ribosomique bactériens, modifiés ou non, qui sont sécrétés à rextérieur de la cellule. Elles ont un spectre d'action bactéricide restreint, caractérisé par l'inclusion d'au moins quelques souches semblables à la bactérie productrice et contre lesque1les,. ceUe-ci a un mécanisme de protection spécifique {Jack et al, 1995).

Les lactobacilles produisent de nombreuses bactériocines différentes ayant des activités similaires, ce qui peut empêcher la prolifération des autres micro-organismes dans le vagin, y compris E. coli et G. vaginalis (Karaoulu et al., 2003).

La production de bactériocine a été décrite comme un mécanisme antagoniste qui pourrait être exercée par les lactobacilles dans le tractus vaginal (Ocana et al., 1999).

Le mode d'action est réalisé en deux étapes. La première est une étape d'adsorption de la bactériocine, à des récepteurs spécifiques ou non, sur la surface de la cellule grâce à son caractère hydrophobe marqué. La seconde étape est la formation de pores causée par an enchaînement de réaction qui altère la perméabilité membranaire. Ce phénomène entraîne alors une perturbation du transport membranaire et une dissipation de la force ionique inlnl>ant ainsi la production d'énergie et 1a biosynthèse des protéines ou des acides nucléiques. Cela conduit à la mort de la cellule (Lelay, 2009). La figure 5, illustre le mode d'action des bactériocines produites par les lactobacilles sur les pathogènes

Bactériocine

...,___.... ( ()

C0

8

0

Pathogène

1

Figure 5. Mode d'action des bactériocines produites par les lactobacilles sur les pathogènes (Ocana et Nader, 2004).

Le terme bactériocine-like est appliqué à des substances antagonistes qui ne sont pas complètement définis ou qui ne répondent pas aux critères typiques de bactériocines (Ocana et al., 1999).

Un grand nombre de ces substances ont été signalés à être produit par les lactobacilles, inhibant une large gamme de bactéries Gram-positives et négatives ainsi que les champignons.

~

Etude bibliographique Chapitre ID: Effet probiotique des lactobacilles vaginaux

œre reUe ~qui a :moim1tre une activité

m

1-illro oomre ~a cdi ~et les espèces Enterococcus' mais le role de ces -substances in 17ÎVO reste à être élucidé {Boris et

Barbés,

2000).

111.5.1.3. La production des acides organiques

En métabolisant le glycogène emmagasiné dans les cellules de l'exocol utérin, les Iactobacilles produisent de l'acide lactique (Abbara, 2012). D'autres acides organiques peuvent être produits par fermentation lactique comme l'acide acétique qui est 10 fois moins concentré que l'acide lactique dans le milieu vaginal (Rousseau, 2004).

Ces acides produits permettent le maintien du pH du milieu vaginal entre pH 4 et pH 4,5. Cette acidité joue un rôle bactériostatique empêchant la prolifération de la plupart des germes vaginaux pathogènes excepté le Candida albicans (Abbara , 2012).

111.5.1. 4. L'arginine désaminase

Les lactobacilles peuvent inhiber certains pathogènes par compétition nutritionnelle comme dans le cas des souches possédant l'activité arginine désaminase. Cette enzyme catalyse la transformation irréversible de l'arginine en citrulline et ammonium apportant ainsi du carbone, de l'azote et de l'énergie aux cellules. Elle réduit donc la disponibilité en arginine dans le milieu pour les pathogênes qui la métabolisent normalement via l'arginine décarboxylase en polyamines caractéristiques de la vaginose bactérienne (F amularo et al., 2001 ), la figure suivante représente le mécanisme d'action des L'arginine désaminase.

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Figure07: Inhibition des pathogènes par compétition nutritionnelle vis-à-vis de L' arginine désaminase.

111.5.1.5. La production des biosurfactants

Les biosurfactants sont des composés libérés par les Iactobacilles vaginaux avec une tendance distincte à s'accumuler au niveau des interfaces des différentes catégories de biosurfactants sont distingués en basant sur leurs structures chimiques; Le plus souvent isolés et les plus largement étudiées sont les glycolipides. Le rôle physiologique principal des biosurfactants est de faciliter le passage des substrats immiscible à l'eau et ils peuvent également présenter une activité antibiotique contre les microbes divers (Boris ët Barbés, 2000).

Etude Expérimentale Matériel et Méthodes

II. Matériel et Méthodes

L'intégralité de ce travail a été réalisée au laboratoire de microbiologie à l'Université de Jijel.

Notre travail avait pour objectifs de recouvrir les points suivants :

• Evaluation de la microflore vaginale cultivable, par dénombrement sur milieux solides ;

• Mise en place d'une collection de lactobacilles vaginaux ;

• Evaluation de quelques aptitudes probiotiques in vitro des souches isolées : Résistance au milieu acide, aux sels biliaires, activité antimicrobienne, activité inhibitrice de surnageant, le pouvoir d'adhésion aux cellules épithéliales du vagin et le pouvoir d'auto- agrégation et de co- agrégation ;

• Etude de quelques aptitudes technologiques des souches isolées.

11.1. Matériel

Au cours de cette étude, nous avons utilisé le matériel suivant : 11.1.1. Des écouvillons vaginaux

L'étude a été conduite sur la cavité vaginale des femmes apparemment saines. Pour l'évaluation de la microflore cultivable, screening des lactobacilles qui ont un effet probiotique. On a utilisé un échantillon global, composé de six prélèvements vaginaux (EG= 6).

II .1.2. Les souches bactériennes

Un groupe de bactéries ayant comme origine les infections urogénitales a été utilisé pour l'étude des interactions in vitro et de l'effet inhibiteur de surnageant des lactobacilles. Il s'agit de gemes et des espèces suivantes :

Escherichia coli ; Staphylocoque aureus ; Candida spp.

On s'est servi également au cours de cette étude de deux souches de références représentées par les espèces suivantes :

Escherichia coli : souche productrice de P-lactamase.

Staplzylocoque aureus: résistance à la pénicilline.

11.1.3. Disques d'antibiotiques

Pour étudier le comportement des lactobacilles vaginaux vis-à-vis des antibiotiques utilisés pour le traitement des infections vaginal, quatre types d'antibiotiques ont été utilisés pour réaliser un antibiogramme sur milieu solide, il s'agit de la Streptomycine (lOµg), Pénicilline G (6µg), Ampicilline (25µg) et Gentamycine (lOµg).

11.1.4. Les sels biliaires

Les sels biliaires (Institut Pasteur d'Alger) ont été utilisées pour l'étude du pouvoir des lactobacilles vaginaux à résister à cet inhibiteur dans un milieu liquide.

Etude Expérimentale

1 ·

^{Matériel et Méthodes}

Il.1.5. Les Cellules épithéliales vaginales

Pour étudier !'habilité des lactobacilles isolés du vagin des femmes à adhérer in vitro à la paroi des cellules épithéliales, deux échantillons prélevés de la cavité vaginale ont été procurés auprès du responsable du laboratoire de gynécologue de l'hôpital Mohamed Saddik Ben Yahia, Jijel.

Les cellules épithéliales du vagin ont été récupérées auprès de deux femmes : L'une mariée, maman de cinq enfants, âgée de 45 ans,

L'autre mariée, maman de deux enfants, âgée de 36 ans,

Il.1.6. Milieux de culture

Pour la réalisation des différentes parties expérimentales, nous avons utilisé les milieux de cultures suivants :

• Les géloses

• Gélose MRS (Man-Rogosa-Sharpe) préparée au laboratoire : pour la culture des bactéries lactiques;

• Gélose PCA: Pour le dénombrement de la F.T.A.M;

• Gélose VRBG : Pour le dénombrement des entérobactéries ;

• Gélose MRS additionnée de 6 grammes du citrate d'ammonium: Pour la recherche de la citratase (préparée au laboratoire) ;

• Gélose Mueller Hinton: Pour réaliser le test d'antibiogramme;

• Gélose Sabouraud : Pour le dénombrement des champignons ;

• Gélose Columbia additionnée du sang de cheval : Pour le dénombrement des Pseudomonas.

• Gelose hypersaccharosé : Pour la recherche de la production de polysaccharides (préparé au laboratoire) ;

• Les bouillons et milieux liquides

• Bouillons MRS (Man-Rogosa-Sharpe) préparé au laboratoire: pour la culture des bactéries lactiques ;

• Bouillon hypersaccharosé : pour le dosage des exo-polysaccharides ;

• Milieu Moeller additionnée del' Arginine : Pour l'identification des bactéries lactiques.

• Autres milieux

• Milieu Gibson Abdelmalek : Pour la recherche de type fermentaire (préparé au laboratoire) ;

• Milieu MEV AG sans sucre: Pour la réalisation des profils de fermentation des sucres ;

• Lait écrémé: Pour chercher la production de l'acétoine, et aussi pour le dosage d'acide lactique;

• Les sucres : Amidon 10%, Arabinose 20% , Cellubiose 10%, Dextrine 6%, Dulcitol 6%, Galactose 20%, Glucose 20%, Glycérol, Inositol 6%, Levulose 20%, Maltose, Mannose 20%, Méthyle de mannose, Raffinose 20%, Salicine 6%, Sorbitol 20%, Sorbose 20%, Trehalose 6% et Xylose 20%.

Etude Expérimentale Matériel et Méthodes

Il.1.7. Produits chimiques et réactifs

Lors de cette étude, les produits et les réactifs suivants ont été utilisés :

• Colorants

• Violet de Gentiane ; Fuschine ; Lugol et alcool : pour réaliser la coloration de Gram;

• Cristal Violet 0.5% : Pour la coloration des cellules épithéliales ;

• Teinture de tournesol additionné au milieu Gibson Abdelmalek;

• Phénol phtaléine 1 % : Indicateur de couleur lors du dosage de l'acidité.

• Acides et bases

• La soude dornic (N/9): Pour la détermination de l'acidité;

• Acide sulfurique O.lN: Pour le dosage des exopolysaccharides.

• Réactifs

• Réactif de Vogues Proskaeur; VPI (solution alcoolique) et VPII (solution aqueuse de soude 16%): pour la mise en évidence de la production de l'acétoine.

• Alcools

• Phénol et l'éthanol: Pour le dosage des exopolysaccharides.

• Produits chimiques et autres

• HCL (IN) et la soude NaOH (IN) : pour l'ajustement du pH;

• Tween 80 additionné au bouillon MRS ;

• Eau oxygénée : Pour la mise en évidence la présence du peroxyde d'hydrogène ;

• Xylène: Pour le test d'hydrophobicité;

• Trypsine et la Pancréatine: Pour l'étude de la résistance aux enzymes pancréatiques;

• Sels biliaires (Institut Pasteur d'Alger);

11.1.8. Tampons

La réalisation de la présente étude a nécessité les tampons suivants :

• Tampon PBS, pH 7.2: Pour le lavage des cellules bactériennes;

• Tampon Phosphate urée sulfate magnésium, pH 6.5: Pour réaliser le test d'hydrophobicité ;

• Eau physiologique stérile: Pour la préparation des dilutions décimales ;

• Tampon acide citrique Na₂HP04, pH 7.2: Pour la conservation et le lavage des cellules épithéliales vaginales.

Il.1.9. Appareillages

L'appareillage utilisé est le suivant :

• Agitateur magnétique (MEIDOL pH.MR 3001);

• Autoclave (SHI A VX electronic) ;

• Bain marie (GERHARD'!) ;

• Balance (DENYER instrument Xp-600) ;

• Barreau magnétique (Bensen) ;

• Centrifugeuse (Bioblock Scientific centrifugeuse 55702);

• Cellules de Mallassez ;

• Compteur de colonies ;

• Etuve (37°C, 44°C) (WTB binder);

Etude Expérimentale Matériel et Méthodes

• Four pasteur (Controls);

• Hotte (Totelstar) ;

• Microscope otique (OL YMPUS) ;

• Microfiltres ;

• Micropipettes (Microlit);

• pH mètre (microprocessor);

• Réfrigérateur (Condor Hisense) ;

• Seringues (2.5 et 5 ml) ;

• Spectrophotomètre (UV Shimandzu);

• Vortex électrique (Minishaker IKA).

Il.2. Méthodes

Il.2.1. Evaluation de la microflore cultivable du vagin

Il.2.1.1. Récupération des échantillons et préparation des dilutions

Les conditions de choix des femmes : Des femmes menstrues entre 25 et 41 ans qui ne chrésentent aucun signe d'infectio~ ni de type vaginite, ni vaginose ont été choisies, ainsi qu'une

sérologie négative vis-à-vis d'infections virales du type hépatite et VIH. " ~ .. \~y .

~

L'échantillon global: L'échantillon global sur lequel on a mené notre travail est composé de six échantillons élémentaires (n=6). Les échantillons ont été obtenus avec précaution par un écouvillonnage de la paroi vaginale pendant 30 secondes évitant tout contact avec la vulve. Les échantillons ont été immédiatement introduits dans 3 ml de bouillon nutritif, conservé jusqu'à l'arrivée au laboratoire (temps de transport <3 h), puis agité vigoureusement par le vortex pendant une minute pour suspendre les bactéries attachées. La suspension bactérienne résultante a été incubée pendant 15 à 30 minutes à 37°C et celle-ci a été considérée comme une solution mère.

Avant d'entamer les techniques de recherche et de dénombrement des flores cultivables, les échantillons à analyser doivent subir des dilutions décimales. A l'aide d'une pipette stérile on a prélevés et introduit aseptiquement 1 ml de la solution mère dans un tube à essai contenant 9 ml d'eau physiologique stérile, on obtient alors la dilution 10-^1, à partir de cette dernière on refait la même opération pour aboutir à la dilution 10-

__.,,,..

⁸ (ldoui et al., 2009).

Il.2.1.2. Flores dénombrées

Pour avoir une idée générale sur la microflore du v~ on a procédé aux dénombrements des flores suivantes selon les techniques décrites par Ison et Hay (2002) et Idoui et al. (2009):

11.2.1.2.1 Dénombrement de la flore totale aérobie mésophile (F.T.A.M)

Le dénombrement de la FT AM s'effectue par ensemencement en masse du milieu PCA.

L'ensemencement de ce milieu est réalisé à laide de 1 ml des dilutions.

La méthode de référence préconise l'ensemencement en surface au râteau de deux boittes de gélose PCA par 1 ml pour la dilution I

o-

⁸ Après incubation à 37°C pendant 24h on dénombre toutes les colonies lenticulaires (30- 300 colonies). Le nombre totale est la moyenne du nombre de colonies foie l'inverse de la dilution choisie (UFC/ml).