Rôle des protéines de la recombinaison dans le maintien des télomères

Texte intégral

(1)Rôle des protéines de la recombinaison dans le maintien des télomères Margaux Olivier. To cite this version: Margaux Olivier. Rôle des protéines de la recombinaison dans le maintien des télomères. Génétique des plantes. Université Clermont Auvergne, 2017. Français. �NNT : 2017CLFAC038�. �tel-01807660�. HAL Id: tel-01807660 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01807660 Submitted on 5 Jun 2018. HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of scientific research documents, whether they are published or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.. L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés..

(2) UNIVERSITE CLERMONT AUVERGNE ECOLE DOCTORALE SCIENCES DE LA VIE, SANTE, AGRONOMIE, ENVIRONNEMENT ED SVSAE n° d’ordre : 725. Thèse Présentée pour l’obtention du grade de DOCTEUR D’UNIVERSITE Spécialité : Physiologie et Génétique Moléculaire Présentée et soutenue publiquement par Margaux Olivier Le 2 octobre 2017. Rôle des protéines de la recombinaison dans le maintien des télomères Président :. Dr Arturo LONDOÑO-VALLEJO, Institut Curie, Paris. Rapporteurs :. Dr Maria Teresa TEIXEIRA, IBPC, Paris Dr Stéphane MARCAND, IRCM, Fontenay-Aux-Roses. Examinatrice :. Dr Cécile RAYNAUD, IPS2, Gif-sur-Yvette. Directrice de thèse :. Pr Maria GALLEGO, GReD, Clermont-Ferrand. Co-directeur de thèse :. Dr Charles WHITE, GReD, Clermont-Ferrand. Laboratoire GReD – UMR 6293 INSERM U1103 – Université Clermont Auvergne Equipe « Recombinaison et maintenance de l'intégrité du génome ».

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(4) Remerciements Je tiens premièrement à remercier les docteurs Maria Teresa Teixeira et Stéphane Marcand pour leur disponibilité et pour leur expertise dans l’évaluation de mes travaux ; ainsi que les docteurs Cécile Raynaud et Arturo Londoño-Vallejo pour avoir accepté d’examiner ce travail en tant que membre de ce jury. Merci également à Jean-Baptiste Vannier, Investigateur principal, et Pierre Verrelle, Professeur des universités et praticien hospitalier, pour avoir pris le temps de suivre le bon déroulement de cette thèse malgré leurs charges académiques et professionnelles. Je suis reconnaissante de l’intérêt qu’ils ont porté à l’avancement de mes travaux et de leurs précieux conseils. Un mot pour Jean-Marc Lobaccaro, que je remercie pour avoir été toujours disponible pour toutes questions relatives à l’école doctorale même en n’étant plus à sa direction. Merci d’avoir été à l’écoute, compréhensif et concerné par le bon déroulement de ma thèse. Je remercie très sincèrement Maria E. Gallego et Charles I. White, co-directeurs de cette thèse. Maria, tout d’abord un grand merci pour m’avoir donné l’envie de faire de la génétique à travers les divers enseignements que tu as pu me prodiguer. Merci ensuite pour m’avoir donné ma chance en Master, pour ton accueil, ton optimisme et surtout pour le temps que tu as consacré à l’encadrement de ce travail, que se soit pour me guider ou pour la rédaction de ce manuscrit. Partager ton bureau a été un plaisir malgré quelques discussions que j’ai pu trouver longues sur le moment mais qui ont été à l’origine d’un travail efficace et qui vont sans doute me manquer. Charles, merci d’avoir facilité mon intégration au sein de l’équipe ainsi que de m’avoir transmis un peu de ta rigueur scientifique. Je te suis reconnaissante de ta disponibilité à toute épreuve, de ton investissement que se soit dans les discussions ou dans la rédaction des articles ainsi que de toute l’aide que tu as pu m’apporter (notamment en informatique et en anglais). Merci donc à vous, de m’avoir fait confiance, de m’avoir accordé une grande autonomie, et de m’avoir soutenu de manière infaillible en particulier au moment où la motivation me faisait défaut. Merci également d’avoir été aussi compréhensifs sur ma vie en dehors du laboratoire et de toujours avoir respecté mes choix personnels tout en étant heureux pour moi. J’ai beaucoup appris à vos côtés, j’espère être animée comme vous de cette passion pour la recherche. Je remercie ensuite tous les membres de la « team Recombination » d’avoir fait de cette thèse une expérience très profitable ! Simon, merci pour ta sympathie (à l’exception de tes vannes ;)). Plus sérieusement, merci d’avoir été présent à mon démarrage, d’avoir grandement contribué à la réussite de mon Master et d’avoir toujours répondu présent lors de toutes ces années. J’ai eu beaucoup de plaisir à travailler avec toi sans aucun jeu de mot et je t’en remercie !.

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(6) Chantal, ma « maman du labo » et je ne pèse pas mes mots. D’abord merci d’avoir partagé ton expérience à la paillasse sur différentes techniques, tous tes petits trucs et astuces qui m’ont surement éviter bien des soucis. Merci surtout de m’avoir pris sous ton aile, d’avoir essayé de m’aider face aux diverses questions et interrogations auxquelles j'ai pu être confrontée ; aussi bien au niveau professionnel que personnel. Un grand merci pour ton écoute, ta discrétion, ton soutien et ta présence lors de mes moments de doute et coups de gueule dans ma vie. Merci pour toute cette bienveillance à mon égard, de mon premier jour au laboratoire à celui de ma soutenance. Tu es l’une des plus belles rencontres de ma thèse, je suis heureuse d’avoir rencontré une personne aussi sincère et généreuse ! Force de caractère et énergie t’animent et font de toi la personne que tu es. Je te souhaite la retraite que tu mérites… Je te remercie, une fois de plus, pour m’avoir fait profiter des habits de ta petite-fille ! Fabienne, merci de ton aide à la paillasse concernant les croisements (même si c’est maintenant un pléonasme). Sans oublier tes conseils scientifiques, ou non, toujours très judicieux et ton soutien. Je te remercie également pour avoir donné de ton temps libre pour relire ce manuscrit. Profite bien de ta retraite et de ton petit fils ! Elisabeth, merci de m’avoir accompagné lors de mes premiers pas au laboratoire. Merci pour ta gentillesse, être ta voisine de paillasse a été un réel plaisir. Je suis ravie que tu es trouvé une ambiance de travail qui te convienne et que te sentes dans ton élément maintenant. Un jour peut être tu m’initiera à l’archeobotanique. Gunjita, with whom I ended somehow this thesis. Without you, the feeling of this end of my thesis would not really be the same. Thank you for your optimism, your “joie de vivre”, and for the support that you could bring me especially during the writing. I am writing in English but je ne devrais pas ! Thank you also for your efforts of French face the quality of my English ... I wish you to find a position that will suit you while continuing to draw joy from life like you do! ODI, merci pour ta bonne humeur ainsi que pour tes remarques et conseils pertinents notamment en réunion d’équipe. Cyril et Romain, merci pour vos conseils sur la thèse et sur la suite que vous avez pu me donner et notamment durant les fameuses pauses clopes. Merci également aux recrues plus récentes de l’équipe, Jeremy et Sébastien, j’espère que vous vous épanouirez dans cette nouvelle équipe. Seb, désolée de t’avoir incité à fumer et surtout à acheter des cigarettes. Il faut voir les bons côtés, cela nous a permis d’avoir des conversations scientifiques ou non, qui ont pour ma part permis de décompresser un peu. En résumé, merci d’avoir été une oreille attentive en particulier ces dernières semaines..

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(8) Merci également à Nathalie et Michelle. Je n’ai pas beaucoup eu l’occasion de travailler avec vous, étant déjà en rédaction à votre arrivée mais je tiens à vous remercier pour avoir pris du temps pour la préparation de ma soutenance ainsi que pour la relecture de l’article. Je tiens également à remercier tous les membres de Biomove (R2 maintenant) pour leur accueil chaleureux et les bons moments que nous avons partagés. Merci : A Leticia et Angeles, pour leur bonne humeur quotidienne et communicative ainsi que pour avoir été aussi prévenantes envers moi. A Marie-Nöelle, pour les discussions pas vraiment scientifiques que l’on a pu partagées ainsi que pour avoir habiller ma fille durant toutes ces années ;). A Manu, pour son franc parler et son humour souvent incompris, ainsi que pour m’avoir mis au courant des divers événements organisés dans notre quartier. Ravie d’avoir pu partager une soirée jeux de société avec toi ! A Sam, pour sa gentillesse, sa bonne humeur, et ma remise à niveau en bioinformatique (certes « niveau licence »). A Sylvie, Sylvianne, et Marie-Claude, pour leur sympathie, leur joie de vivre ainsi que pour les discussions quotidiennes que nous avons pu partager à l’heure des repas. Sylvie, je te remercie également pour m’avoir initié aux joies de l’enseignement. A Olivier, pour avoir animé quelques pauses clopes. A Axel, pour toujours avoir eu le mot qu’il faut pour détendre l’atmosphère (Plop…), à Matthias, pour avoir participé à la bonne ambiance quotidienne du labo, à Heidi, pour son optimiste inébranlable. Votre départ a laissé un grand vide dans le labo. A Amy, d’avoir amener un peu d’idées neuves. Je te souhaite bonne chance dans cette grande aventure. A Pierre et Max, pour les fameux tours de vaisselle bien sûr ! Trio de choc ou pas… Merci à vous de m’avoir supporté tout ce temps, je suis heureuse d’avoir rencontré des personnalités en or comme les vôtres. J’ai confiance dans le fait que vous réussirez quelle que soit la voie que vous emprunterais. Pierre, merci d’être toujours motivé que se soit pour discuter science (même pendant les pauses) ou pour ces fins de soirées détonantes ! Merci d’avoir souvent empesté le frigo commun, d’avoir partagé tes goûters, d’avoir fait de nombreuses fois le traducteur, de ne jamais avoir faillit à la solidarité entre étudiants et aussi d’avoir toujours fait partager ta bonne humeur. Je te souhaite une quatrième année bien remplie, beaucoup de courage pour la fin de cette thèse à laquelle j’espère assister et te voir briller ! Max, le « plus drôle de.

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(10) Biomove » sans aucun doute, faut-il aimer l’humour sarcastique… Je ne pouvais pas m’empêcher de t’en lancer une petite. Ah, on en a partagé des choses, tu te rends compte, on a même fait un « pseudo Marathon » (inoubliable) ! Tu as subi avec le sourire mes dérives autoritaires (sur la façon de t’affirmer par exemple) et je m’excuse de t’avoir autant saoulé :) ! J’espère avoir réussi à te montrer le côté positif quand tu broyais du noir. Merci pour ces longues discussions sur tout et rien à la fois. Je t’ai découvert un peu plus tous les ans (même s’il a parfois fallu repartir à zéro), et j’espère sincèrement que notre amitié dépassera les murs de l’unité. Dernière ligne droite, vivement décembre, ne lâche rien. Je te souhaite le meilleur à toi et à Myriam. Merci à tous les membres de Biomove que je n'ai pas cité. J'ai été heureuse d'avoir pu côtoyer chacun d'entre vous et d'avoir partagé ces discussions scientifiques ou non autour d'un café ou entre deux portes de couloir. Un grand merci à mes copines Typhanie et Marjorie ! Ensemble depuis le Master, je vous remercie pour le soutien que l’on s’est mutuellement apporté depuis toutes ces années que se soit vis à vis des doutes et des appréhensions liées à la thèse ou simplement des moments difficiles de la vie. Merci aussi pour vos imaginations débordantes qui nous ont souvent conduit à bons nombres de fous rires pendant nos pauses clopes (pauses cappu pour vous). J’ai adoré ces milliards de discussions sur des sujets complétements divers (intéressants ou non) mais sur lequel vous avez un point de vue toujours très enrichissants :). Marjorie, merci pour ta franchise et ton pragmatisme, je sais toujours sur quel pied danser avec toi. Tu es pertinente dans tous ce que tu entreprends et c’est franchement remarquable. Typhanie, j’admire sincèrement ta capacité à t’adapter quel que soit ton environnement et à toujours trouver ta place. Grâce à vous j’emporte avec moi d’excellents souvenirs ! Je vous souhaite de belles découvertes dans vos projets de postdocs respectifs et j’espère sincèrement avoir de vos nouvelles (même si je sais que c’est moi qui fait défaut à ce niveau là …). Sans oublier, Aurélien et Rosyne, rencontrés au cours du Master puis « séparés » lors de la thèse. Votre spontanéité et votre franchise nous ont permis de tisser une véritable amitié qui perdure. Même loin ou sans nouvelles, on est proches et j’espère que cela ne changera pas. Auré, toujours le trait d’humour qui te permet d’être toi, on aime ou on n’aime pas, moi j’adore et je te remercie même pour cela ! Je te souhaite le meilleur pour la suite de ta carrière ainsi qu’à Laura. Rosyne, les moments difficiles qui n’arrivent pas au bon moment, on connaît. Je te remercie d’avoir était une épaule quand j’en ai eu besoin et j’espère t’avoir rendu l’appareil. Je te souhaite succès et bonheur aussi bien dans ta vie personnelle que professionnelle. Fatiha, une belle rencontre durant cette thèse. Aussi forte que folle, tu as su quand il fallait me motiver, me remonter le moral, me faire décompresser et je t’en remercie. Merci pour tous ces moments passés, on peut citer notre « remise en forme » ainsi que les soirées « FastFood » qui font plaisir aux enfants et qui, je l’espère, perdureront. Je souhaite toute la réussite que tu mérites pour ta fin de thèse mais aussi pour ta carrière..

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(12) Ah, ma famille… Merci à vous d’avoir supporté mes sautes d’humeur pendant toutes ces années et de m’avoir toujours encouragé à continuer et à donner le meilleur de moi-même. Merci : A ma maman, responsable de la personne que je suis aujourd’hui, aussi têtue que déterminée. Je te remercie pour ta présence infaillible à mes côtés. Merci pour ses encouragements (tu dirais peut être « coup de pied au cul ») en particulier ces derniers mois lorsque les doutes sur la finalisation de cette thèse ont été plus que présents. Un coup de fil et ça repart ! Cela vaut autant pour l’aspect professionnel et personnel… Je te remercie tout particulièrement pour le temps que tu as passé à la relecture de l’intégralité de mon manuscrit (mon charabias) afin d’éliminer les fautes d’orthographes que je ne voyais même plus. Enfin, un immense merci pour toute la logistique de ma soutenance, pour avoir fait de ce moment un souvenir exceptionnel ! A mon papa, pour m’avoir fait confiance et ne pas avoir cesser de m’encourager tout au long de ces années, ainsi que pour ta présence le jour de ma soutenance. A ma sœur, pour « Coline Santé » bien sûr, une aide inestimable qui m’a permis de finaliser l’écriture de ce manuscrit, mais pas seulement ! Pour sa présence tout au long de ces années d’étude, sa confiance en moi inconditionnée, sa joie de vivre communicative… On a toujours été là l’une pour l’autre dans toutes les situations que l’on a pu vivre et j’espère que ça continuera ! Comme promis, un petit mot pour Naged pour sa relecture « spéciale parenthèse » ! Plus sérieusement merci d’avoir su me faire rire et décompresser un peu avec ton humour bien à toi, que je comprends parfaitement, dans les dernières semaines de la rédaction de ce manuscrit. A mes frères, Lucas et Antoine, toujours plus au moins à coté de la plaque concernant mon parcours universitaire mais toujours derrière moi et ça, c’est l’essentiel ! Sans oublier, à ma belle famille, Marielle, Jean-Louis, Lindsay et Mendy, que je remercie pour leur grande gentillesse. Marielle, ton écoute, ta compréhension et ton soutien ont, plus d’une fois, était d’une grande aide. Je suis ravie de faire parti de votre famille ! A Dévin, pour m’avoir accompagné quotidiennement au cours de cette grande et longue (très longue) aventure. Je ne vais pas m’étendre, je sais que tu n’aimes pas çà… Mais merci pour m’avoir toujours laissé privilégier ma thèse, merci pour ta patience (qui a tout de même des limites et heureusement), et merci pour ta confiance en moi. Des années de hauts et de bas qui ont renforcé à jamais notre relation. J’espère être un exemple de persévérance pour mes filles, Eliya et Kissa, que je remercie pour l’amour inconditionnel qu’elles me portent au quotidien..

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(14) Ces travaux ont été financés par le ministère de l’Enseignement supérieur et de la Recherche et ont fait l’objet d’articles soumis ou en cours de soumission :. Simon Amiard, Margaux Olivier, Elisabeth Allain, Kyuha Choi, Richard Smith-Unna, Ian R. Henderson, Charles I. White & Maria E. Gallego. Telomere stability and development of c tc1 mutants are rescued by inhibition of EJ recombination pathways in a telomerasedependent manner. Nucleic Acids Research. 2014 (Article I). Margaux Olivier, Olivier Da Ines, Simon Amiard, Heïdi Serra, Chantal Goubely, Charles I. White & Maria E. Gallego. The Structure-Specific Endonucleases MUS81 and SEND1 Are Essential for Telomere Stability in Arabidopsis. The Plant Cell. 2016 (Article II). Margaux Olivier, Cyril Charbonnel, Simon Amiard, Charles I. White & Maria E. Gallego. RAD51 compensates replicative telomere loss in cells lacking telomerase. En préparation (Article III).

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(16) Une partie de ces travaux a été présentée aux congrès suivants :. Communications orales. Telomere Biology in Health and Disease Meeting : RAD51 compensates replicative telomere loss in cells lacking telomerase. Paris, France, 19-21 Octobre 2016. Plant Genome Stability and Change Conference : RAD51 compensates replicative telomere loss in cells lacking telomerase. Kanagawa, Japon, 7 – 10 Juillet 2016. Journées de l’Ecole Doctorale des Sciences de la Vie, Santé, Agronomie, Environnement (JED SVSAE) : RAD51 compense les pertes télomériques associées à l’absence de la télomérase. Clermont-Ferrand, France, 21 – 22 Mai 2015. 11th French Replication, Recombination and Repair (3R) Meeting : RAD51 compensates telomere loss due to the absence of telomerase. Presqu’île de Giens, France, 4 – 7 Mai 2015. Communications affichées. Telomeres, telomerase and disease, EMBO Conference : RAD51 compensates replicative telomere loss in cells lacking telomerase. Liège, Belgique, 26 Avril – 1 Mai 2016. Telomeric chromatin and telomere fragility, EMBO Workshop : RAD51 compensates telomere loss due to the absence of telomerase. Singapour, Singapour, 7 – 10 Décembre 2015. Journées Cytogénétique & Polyploïdie : A potential new pathway of telomere elongation in Arabidopsis. Clermont-Ferrand, France, 22 – 23 Mai 2014.

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(18) Résumé Les télomères sont des structures nucléoprotéiques spécialisées qui assurent l’intégrité des extrémités des chromosomes linéaires. Ils sont composés d’une séquence d’ADN qui leur est propre, sont associées à des protéines spécifiques, et sont maintenus par la télomérase. Leur fonction est d’empêcher le raccourcissement progressif des extrémités des chromosomes dû à la réplication ainsi que leur reconnaissance par les mécanismes de réparation des cassures double brin. La réparation des cassures double-brin consiste en deux mécanismes généraux : la recombinaison non-homologue et la recombinaison homologue. L’activation de ces voies de recombinaison en réponse à la déprotection télomérique est un mécanisme de survie cellulaire, mais qui conduit fréquemment à une instabilité génomique. Nous avons testé l’implication des voies de recombinaison non-homologue dans la prise en charge des télomères déprotégés par inactivation de chacune de ces voies. La génération d’un multiple mutant ne présentant pas de voies de recombinaison non-homologue fonctionnelles a permis de restaurer la capacité des plantes à se développer normalement en présence de télomères déprotégés. Nos résultats ont mis en évidence une compétition entre les voies de recombinaison non-homologue et la télomérase en absence de protection télomérique. L’étude des homologues de la protéine GEN1 – impliquée dans la résolution de structures d’ADN branchées lors de la recombinaison homologue – a permis d'identifier l'homologue fonctionnel de GEN1 chez Arabidopsis et de mettre en évidence un rôle télomérique de cette protéine. En effet, cette nucléase s’avère essentielle à la stabilité des télomères en favorisant leur réplication. L’inhibition de la recombinaison homologue en absence de télomérase entraine l’apparition précoce et significative d’instabilité chromosomique. L’induction d’un stress réplicatif exacerbe cette instabilité télomérique, indiquant que la recombinaison homologue facilite la réplication des télomères en absence de télomérase. Nos données indiquent que la télomérase participe également au déroulement correct de la réplication des télomères. De façon inattendue, le rôle positif de la recombinaison homologue est dépendant de l’hélicase RTEL1.. Abstract Telomeres are specialized nucleoprotein structures that ensure the integrity of the ends of linear eukaryotic chromosomes. They are composed of a particular DNA sequence, associated with specific proteins and are maintained by telomerase. Their function is to prevent the progressive shortening of chromosome due to replication and to protect chromosome ends from recognition by cellular double-strand break repair proteins. Double-strand break repair involves two general mechanisms: non-homologous recombination and homologous recombination. Activation of these recombination pathways in response to unprotected telomeres is a cell survival mechanism, which frequently leads to genomic instability. We tested the involvement of non-homologous recombination pathways in fusions of unprotected telomeres by inactivation of each of these pathways. The generation of a triple KO mutant without nonhomologous recombination restores the normal growth and development of the plants with deprotected telomeres. These results show a competition between non-homologous recombination pathways and telomerase in the absence of telomeric protection. Study of GEN1 homologues – involved in the resolution of branched DNA structures during homologous recombination – permitted identification of the functional GEN1 homologue of Arabidopsis and the demonstration of a telomeric role of this protein. Indeed, this nuclease proves to be essential to the stability of the telomeres by promoting their replication. Inhibition of homologous recombination in absence of telomerase leads to the early and significant appearance of chromosomal instability. Induction of replicative stress exacerbates this telomere instability, indicating that homologous recombination facilitates telomere replication in the absence of telomerase. Our data indicate that telomerase also contributes to correct replication of telomeres. Unexpectedly, the positive role of the homologous recombination in telomere stability is dependent on the RTEL1 helicase.. Mots-clés Télomères, recombinaison, réplication, instabilité, télomérase, Arabidopsis thaliana.

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(20) Liste des abréviations 53BP1 9/1/1 A A-NHEJ ADN Akt AKTIP ALT AP APB Apollo ARN ASF1 ATM ATR ATRIP ATRX B-NHEJ BFB BIR BLM BRCA2 BrDU BTR C c-Ab1 c-myc C-NHEJ CBF5 Ccq1 Cdc13 CDC25 CDC45 CDK ChIP CHIP CHK CldU CO CO-FISH COM1 CRISPR CST CtBP. p53 Binding Protein 1 RAD9/RAD1/HUS1 Adenine Alternative-NHEJ Acide Désoxyribonucléique Protein Kinase B AKT-Interacting Protein Alternative Lengthening of Telomeres Apurinic/Apyrimidic sites ALT-associated PML bodies 5' exonuclease Apollo Acide Ribonucléique Anti-Silencing Factor 1 Ataxia-Telangiectasia Mutated Ataxia Telangiectasia and Rad3 related ATR-Interacting Protein α-Thalassemia/mental Retardation syndrome X-linked Backup-NHEJ Breakage-Fusion-Bridge Break-Induced Replication Bloom syndrome protein Breast Cancer 2 5-Bromo-2’-desoxyuridine BLM/TopoIIIα/RMI1/RMI2 Cytosine co-enzyme A biosynthesis 1 Myc Proto-Oncogene Protein Canonical-NHEJ Centromere-Binding Factor 5 Coiled-coil quantitatively-enriched protein 1 Cell division control protein 1 Cell Division Cycle 25 Cell Division Cycle 45 Cyclin-Dependant Kinase Chromatin Immunoprecipitation C-terminus of HSC70-Interacting Protein Checkpoint kinase Chloro-deoxyuridine Crossing-over Chromosome Orientation-FISH Completion of meiotic recombination protein 1 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats CTC1/STN1/TEN1 C-terminal-Binding Protein.

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(22) CTC1 CTCF CtIP Cvi D-loop DAXX DDR dHJ DNA-PK DNA-PKcs Dna2 Dnl4 DNMT dNTP dRP DSB DSBR EdU EME1 ERCC1 Est ETAA1 Exo1 FANC FBH1 FEN1 FISH FT G GAR1 GEN1 HDR H HJ hnRNPA1 HOP2 HOT1 HP1 HR HR HU ICL IdU JHS1 K KU. Conserved Telomere Maintenance Component 1 CCCTC-binding Factor CtBP-Interacting Protein Cape Verde Islands DNA Displacement-loop Death-domain-Associated protein DNA Damage Response double Holliday Junction DNA-dependent Protein Kinase DNA-dependent Protein Kinase catalytic subunit Dna2 nuclease/helicase DNA ligase 4 DNA-Methyltransferase Désoxyribonucléoside Triphosphate 5’-desoxyribose-5-phosphate Double Strand Break Double Strand Break Repair 5-Ethynyl-2’-deoxyuridine Essential Meiotic Endonuclease 1 Excision Repair Cross Complementing protein 1 Ever shorter telomeres Ewing’s Tumour-Associated Antigen 1 Exonuclease 1 Fanconi Anemia Complementation F-box DNA Helicase 1 Flap Endonuclease 1 Fluorescente In Situ Hybridization Fragile Telomere Guanine Glycine and Arginine Rich domain 1 Gen endonuclease homolog 1 Homology-Directed Repair Histone Holliday Jonction heterogeneous nuclear Ribonucleoprotein A1 Homologous-Pairing protein 2 Homeobox Telomere-binding protein 1 Heterochromatin Protein 1 Homologous Recombination Homologous Recombination Hydroxyurée Interstrand Cross-Link Iododeoxyuridine Jing He Sheng 1, Lysine ATP-dependent DNA helicase II subunit KU.

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(24) Lif1 Lig4 LSD1 Mcm2/7 MDC1 me me3 Mec1 MKRN1 MMC MMEJ MMS Mms4 MND1 MRE11 MRX Msh MTS MUS81 NAF1 NAP57 NBS1 NCO Nd-0 NF-κB NHEJ NHP2 NMD NOP10 OB-fold p53 PARP1 PCNA PFGE PI3K PICh PIF1 PIKK PKB PKC PML PNKP Pol POT1 Poz1 PP. Ligase-interacting factor 1 ADN ligase 4 Lysine-Specific Demethylase 1 Minichromosome maintenance 2/7 Mediator of DNA damage Checkpoint protein 1 methylation trimethylation Mitosis entry checkpoint protein 1 Makorin Ring Finger Protein 1 Mitomycine C Microhomology-mediated end-joining Methyl Methanesulfonate Methyl methane sulfonate sensitivity 4 Meiotic Nuclear Division protein 1 Meiotic recombination 11 Mre11/Rad50/Xrs2 Mut S Homologs Multiple Telomeric Signal MMS- and UV- Sensitive protein 81 Nuclear Assembly Factor 1 ribonucleoprotein Nopp140-Associated Protein of 57 kDa Nijmegen Breakage Syndrome 1 Non Crossing-over Niederzenz Nuclear Factor-kappa B Non-Homologous End-Joining Nucleolar Protein Family A Member 2 Nonsense-Mediated RNA Decay Nucleolar Protein 10 Oligonucleotide/Oligosaccharide-Binging fold Tumor Protein p53 Poly(ADP-Ribose) Polymerase 1 Proliferating Cell Nuclear Antigen Pulse Field Gel Electrophoresis Phosphatidylinositol 3-Kinase Proteomics of Isolated Chromatin segments Petite Integration Frequency 1 PI3K-like protein Kinase Protein Kinase B Protein Kinase C Promyelocytic Leukaemia Polynucleotide Kinase/Phosphatase Polymérase Protection Of Telomeres 1 Pot1 associated protein Poz1 Polymerase α/Primase.

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(26) pre-RC R-loop RAD RAP1 RdDM Rdh54 RECQ4A RFC Rif RMI RMN RNAPII RPA Rrm3 RTEL1 RTR Sae2 Saw1 SCE SDSA SEND1 Sgs1 SILAC SIR siRNA SLX SMARCAL1 SMC SMH Sp1 SSA SSB STN1 STORM STR SUMO SUV39H1 T T-loop T-SCE TAR Taz1 TBP1 TCAB1 TEBPα/β. pre-Replication Complex RNA Displacement-loop Radiation sensitivity abnormal Repressor/Activator site-binding Protein 1 RNA-Dependant DNA Methylation Rad homologue 54 RecQ-like protein 4A Replication Factor C Rap1-interacting factor RecQ-Mediated genomic Instability Résonance Magnétique Nucléaire ARN polymérase II Replication Protein A rDNA recombination mutation protein 3 Regulator of Telomere Elongation helicase 1 ; RECQ4A/TOP3α/RMI1/RMI2 Sporulation in the absence of SPO eleven protein 2 Single-strand annealing weakened 1 Sister Chromatid Exchange Synthesis-Dependent Strand Annealing Single-strand DNA Endonuclease 1 Slow growth suppressor 1 Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture Silent Information Regulators small interference RNA Synthetic lethal of unknown function protein SWI/SNF-related Matrix-associated Actin-dependent Regulator of Chromatin subfamily A-Like protein 1 Structural Maintenance of Chromosomes Single Myb Histone Specificity protein 1 Single-Strand Annealing Single Strand Break Suppressor Of Cdc Thirteen Homolog 1 STochastic Optical Reconstruction Microscopy Sgs1/Top3/Rmi1 Small Ubiquitin-related Modifier Suppressor of Variegation 3-9 Homolog 1 Thymidine Telomere-loop Telomere-Sister Chromatid Exchange Transcription-Associated Recombination Telomere length regulator Taz1 TATA-box-Binding Protein 1 Telomerase Cajal Body protein 1 Telomere-Binding Protein subunit alpha/beta.

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(28) Tel1 TEN1 TER TERC TERRA TERT THO TIFs TIN2 Tlc1 Top3 TopBP1 TPE TPP1 Tpz1 TR TRB TRD TRF TRFL TRP1 Trt1 UPF1 WEE1 WRN WT1 XLF XPF XPG XRCC Yen1. Telomere length regulation protein 1 Telomere length regulation protein TEN1 homolog Telomerase RNA Telomerase RNA Component Telomeric Repeat-containing RNA Telomerase Reverse Transcriptase Thp2/Hpr1/Tho2/Mft1/Tex1 Telomere dysfunction-Induced Foci TRF1-Interacting Nuclear protein 2 Telomerase component 1 topoisomérase III DNA Topoisomerase II Binding Protein 1 Telomere Position Effect Tripeptidyl-Peptidase 1 Protection of telomeres protein Tpz1 Telomerase RNA Telomere Repat Binding Telomere Rapid Deletion Telomeric Repeat-binding Factor 2 TRF-Like Telomere Repeat-binding Protein 1 Telomerase reverse transcriptase 1 Up-frameshift 1 Wee1-Like Protein Kinase Werner syndrome helicase Wilms Tumor 1 XRCC4 Like Factor Xeroderma Pigmentosum group F-complementing protein Xeroderma Pigmentosum group G-complementing protein X-ray Repair Cross-Complementing protein Holliday junction resolvase Yen1.

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(30) Notations. Notations des organismes A. thaliana C. elegans D. melanogaster H. sapiens O. fallax O. nova S. cerevisae S. pombe T. thermophila. Arabidopsis thaliana Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster Homo sapiens Oxytrichia fallax Oxytrichia nova Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe Tetrahymena thermophila. Notations des génotypes Les allèles sauvages des gènes sont indiqués en caractères majuscules et en italique (GENE). Les allèles mutants des gènes sont indiqués en caractères minuscules et en italique (gène).. Notations des protéines Les protéines sont indiquées en caractères majuscules (PROTEINE) ; à l’exception des protéines de levure qui sont indiquées en caractères minuscules avec seulement la première lettre de la protéine en majuscule (Protéine)..

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(32) Table des illustrations Figure 1 : Organisation de l’ADN chez les eucaryotes Figure 2 : Structure primaire des extrémités des chromosomes linéaires Figure 3 : « End replication problem » Figure 4 : Mécanisme de formation de l’extrémité 3’ simple brin après réplication des télomères Figure 5 : Organisation des télomères en T-loop Figure 6 : Structure des G-quadruplexes Figure 7 : Structure du i-motif Figure 8 : R-loop et conséquences biologiques Figure 9 : Composition protéique des télomères de mammifères Figure 10 : Composition protéique des télomères de la levure fissipare Figure 11 : Composition protéique des télomères de la levure bourgeonnante Figure 12 : Composition protéique des télomères d’Arabidopsis Figure 13 : Représentation schématique du transcriptome télomérique Figure 14 : Mécanismes putatifs des événements de TAR Figure 15 : Exemples de télomères fragiles Figure 16 : Conséquences d’un arrêt de la fourche de réplication au niveau télomérique. Figure 17 : Résolution des G-quadruplexes chez les mammifères Figure 18 : Résolution de la T-loop chez les mammifères Figure 19 : Résolution des R-loops chez les mammifères Figure 20 : Modèle de l’élongation processive des télomères par la télomérase chez les mammifères Figure 21 : Structure de la télomérase humaine Figure 22 : « Protein-counting model » Figure 23 : Modèles moléculaires du mécanisme ALT Figure 24 : Production des cercles télomériques Figure 25 : T-SCE inégal au niveau télomérique Figure 26 : Modèle d’établissement de la voie ALT Figure 27 : Conséquences de l’absence de la télomérase chez S. cerevisiae Figure 28 : Activation de ATM et signalisation des DSB chez les mammifères Figure 29 : Activation de ATR chez les mammifères Figure 30 : Régulation du cycle cellulaire suite à une DSB Figure 31 : Réparation d’une DSB par C-NHEJ chez les mammifères.

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(34) Figure 32 : Réparation d’une DSB par A-NHEJ chez les mammifères Figure 33 : Réparation d’une DSB par SSA chez les mammifères Figure 34 : Mécanisme moléculaire de la voie SDSA Figure 35 : Etapes précoces et communes aux voies de SDSA et DSBR Figure 36 : Mécanisme moléculaire de la voie DSBR Figure 37 : Spécificité de substrat des endonucléases structure spécifique eucaryotes Figure 38 : Mécanisme moléculaire du BIR Figure 39 : Fonctions attribuées au mécanisme BIR Figure 40 : Modèles proposés quant à l’implication de RAD51 dans la recombinaison de type BIR Figure 41 : Contrôle de la fidélité de la réparation des fourches de réplication endommagées Figure 42 : Modélisation du cycle BFB Figure 43 : Modèle de l’organisation hiérarchique des voies de réparation chez Arabidopsis Figure 44 : Potentiels problèmes de réplication aboutissant à un pont anaphasique Figure 45 : Actions potentielles de RAD51 au niveau des fourches de réplication Figure 46 : Conservation de la protéine RTEL1 chez Arabidopsis. Figure 47 : RAD51 ne participe pas aux pertes télomériques observées en absence de RTEL1 et de la télomérase. Tableau Tableau 1 : Séquence et longueur des répétitions télomériques chez différents organismes modèles. Annexes Annexe 1 : Cycle de vie d’Arabidopsis Annexe 2 : Représentation schématique du génome d’Arabidopsis Annexe 3 : Action de RAD51-GFP, dominant négatif de RAD51.

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(36) Table des matières. .

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(38) Synthèse bibliographique __________________________________ 1 Introduction ___________________________________________________ 2 Chapitre I : Généralités sur les télomères ___________________________ 4 I. Historique _________________________________________________________________ 4 II. L’ADN télomérique _________________________________________________________ 7 II.1. Généralités _____________________________________________________________________ 7 II.2. Extrémité simple brin _____________________________________________________________ 9 II.3. Structures secondaires des télomères_________________________________________________ 11 II.3.a. La T-loop _________________________________________________________________ 11 II.3.b. Les G-quadruplexes _________________________________________________________ 12 II.3.c. Le i-motif _________________________________________________________________ 15 II.3.d. Les R-loops ________________________________________________________________ 16. III. Les protéines des télomères _________________________________________________ 18 III.1. Chez les mammifères ___________________________________________________________ 18 III.1.a. Le télosome _______________________________________________________________ 18 III.1.b. Le complexe CST __________________________________________________________ 21 III.1.c. Le complexe KU ___________________________________________________________ 23 III.1.d. Les autres protéines _________________________________________________________ 24 III.2. Chez Schizosaccharomyces pombe______________________________________________________ 25 III.2.a. Le télosome _______________________________________________________________ 25 III.2.b. Le complexe Stn1/Ten1 _____________________________________________________ 26 III.2.c. Le complexe KU ___________________________________________________________ 27 III.3. Chez Saccharomyces cerevisiae ________________________________________________________ 27 III.3.a. Le télosome _______________________________________________________________ 27 III.3.b. Le complexe SIR ___________________________________________________________ 29 III.3.c. Le complexe Ku____________________________________________________________ 30 III.4. Chez Arabidopsis thaliana _________________________________________________________ 32 III.4.a. Les protéines de type TRF ____________________________________________________ 32 III.4.b. Les protéines de type POT1 __________________________________________________ 34 III.4.c. Le complexe CST___________________________________________________________ 35 III.4.d. Le complexe KU ___________________________________________________________ 36. IV. Transcription des télomères _________________________________________________ 38 IV.1. Environnement chromatinien _____________________________________________________ 38 IV.2. Les ARN TERRA ______________________________________________________________ 39 IV.2.a. Biogenèse & structure _______________________________________________________ 39 IV.2.b. Fonctions ________________________________________________________________ 40 IV.2.c. Régulation ________________________________________________________________ 42 IV.3. Transcription et recombinaison ____________________________________________________ 45. V. Maintien des télomères _____________________________________________________ 46. .

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(40) V.1. Réplication des télomères _________________________________________________________ 46 V.1.a. Implication dans le bien être de la cellule __________________________________________ 46 V.1.b. Mécanisme ________________________________________________________________ 47 V.1.c. Le challenge de la réplication ___________________________________________________ 48 V.1.d. Facteurs clés _______________________________________________________________ 50 V.2. Maintien par la télomérase ________________________________________________________ 55 V.2.a. Expression et fonction _______________________________________________________ 55 V.2.b. Structure __________________________________________________________________ 57 V.2.c. Partenaires _________________________________________________________________ 58 V.2.d. Régulation _________________________________________________________________ 59 V.3. Maintien par recombinaison _______________________________________________________ 61 V.3.a. Les cellules de mammifères ____________________________________________________ 61 V.3.b. Chez la levure ______________________________________________________________ 66 V.3.c. Chez Arabidopsis thaliana_______________________________________________________ 68. Chapitre II : Mécanismes de réparation de l’ADN __________________ 70 I. Signalisation d’une DSB _____________________________________________________ 70 I.1. Recrutement et action des PIKK au niveau d’une DSB ___________________________________ 71 I.1.a. DNA-PKcs _________________________________________________________________ 71 I.1.b. ATM _____________________________________________________________________ 71 I.1.c. ATR ______________________________________________________________________ 72 I.2. Le variant d’histone H2AX ________________________________________________________ 74 I.3. Régulation du cycle cellulaire _______________________________________________________ 75. II. Les voies de recombinaison non homologue ____________________________________ 76 II.1. Voie de jonction des extrémités dépendante des protéines KU _____________________________ 76 II.1.a. Reconnaissance de la DSB _____________________________________________________ 77 II.1.b. Maturation des extrémités de la DSB ____________________________________________ 78 II.1.c. Jonction des extrémités de la DSB _______________________________________________ 79 II.2. Voies de jonction des extrémités indépendantes des protéines KU __________________________ 80 II.2.a. Reconnaissance de la DSB _____________________________________________________ 81 II.2.b. Maturation des extrémités de la DSB ____________________________________________ 81 II.2.c. Jonction des extrémités de la DSB _______________________________________________ 82. III. Les voies de recombinaison homologue _______________________________________ 84 III.1. Single-Strand Annealing (SSA)_____________________________________________________ 84 III.1.a. Mécanisme moléculaire ______________________________________________________ 84 III.1.b. Acteurs protéiques __________________________________________________________ 85 III.2. Synthesis-Dependent Strand Annealing (SDSA) _______________________________________ 88 III.2.a. Mécanisme moléculaire ______________________________________________________ 88 III.2.b. Acteurs protéiques __________________________________________________________ 89 II.3. Double Strand Break Repair (DSBR) ________________________________________________ 92 III.3.a. Mécanisme moléculaire ______________________________________________________ 92 III.3.b. Acteurs protéiques __________________________________________________________ 92. .

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(42) III.4. Break-Induced Replication (BIR)___________________________________________________ 96 III.4.a. Mécanisme moléculaire ______________________________________________________ 96 III.4.b. Acteurs protéiques __________________________________________________________ 97. IV. Télomères non fonctionnels et mécanisme de réparation des DSB _________________ 99 IV.1. Déprotection télomérique ________________________________________________________ 99 IV.1.a. Diminution de la taille des télomères ____________________________________________ 99 IV.1.b. Perturbation des protéines télomériques ________________________________________ 101 IV.2. Signalisation du télomère non fonctionnel ___________________________________________ 101 IV.3. Devenir d’un télomère non fonctionnel _____________________________________________ 103. Projets de recherche ____________________________________ 105 Résultats _____________________________________________ 108 Article I_____________________________________________________ 109 Article II ____________________________________________________ 131 Article III ___________________________________________________ 153. Discussion et perspectives _______________________________ 196 I. Projet I : Devenir d’un télomère déprotégé ______________________ 197 II. Projet II : Rôle des nucléases MUS81 et SEND1 au niveau télomérique _ 203. III. Projet III : Rôle de la recombinase RAD51 au niveau télomérique _ 208 Conclusion __________________________________________________ 223. Annexes ______________________________________________ 224 Références ____________________________________________ 228. .

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(44) Synthèse bibliographique. .

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(88) ! . Introduction Au cœur de la cellule, unité fonctionnelle minimale du vivant, l’ADN (Acide Désoxyribonucléique) est le support de l’information génétique et présente une organisation compactée dans le noyau sous forme de chromosome (Figure 1). Les chromosomes portent donc une information précieuse qui doit à la fois être lue et utilisée par la cellule, mais aussi protégée pour être transmise à l’identique à la descendance. Pourtant l’ADN est en permanence soumis à des stress d’origine exogène et endogène, sources de dommages de nature variée sur l’ADN, notamment des cassures double brin (DSB, Double Strand Break). Ces DSB sont les plus délétères car, non ou mal réparées, une seule de ces lésions peut entraîner un arrêt du cycle cellulaire conduisant à la mort cellulaire ou à la tumorigenèse. Il est alors surprenant d’observer chez les eucaryotes ainsi que chez certains procaryotes (Borrelia, Agrobacterium tumefaciens), la présence de chromosomes linéaires. De par leur linéarité même, ces chromosomes possèdent des extrémités naturelles qui s’apparentent au premier abord à des DSB de l’ADN. Ces régions, nommées télomères (Figure 1), sont spécialisées afin de ne pas être traitées comme des dommages. En effet, en réponse à des dommages de l’ADN, un réseau coordonné de cascades de signalisation se met en place à l’échelle cellulaire. Après détection des lésions de l’ADN, les points de contrôle du cycle cellulaire sont activés afin de retarder la progression de celui-ci et permettre la réparation des dommages via le recrutement de la machinerie de réparation de l’ADN. Cet ensemble de processus constitue la réponse aux dommages de l’ADN ou DDR (DNA Damage Response). Les télomères présentent donc une organisation particulière qui leur est propre, aussi bien au niveau nucléotidique que protéique, permettant de se distinguer d’une DSB. La désorganisation de cette architecture télomérique conduit à la reconnaissance des télomères, alors appelés « non-fonctionnels » ou « déprotégés », comme une DSB engendrant la prise en charge de ceux-ci par le(s) système(s) cellulaire(s) de réparation de l’ADN. La compréhension de l’implication de ces systèmes de réparation ainsi que des conséquences de leur action lorsque l’intégrité des télomères est compromise est en pleine expansion. Mes travaux de thèse se sont focalisés autour de cette thématique chez la plante modèle Arabidopsis thaliana.. . .

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(92) ! . A. thaliana a émergé comme un système puissant pour l’étude la réparation de l’ADN. En tant qu’eucaryote supérieur génétiquement maniable, A. thaliana présente un génome entièrement séquencé et affiche une tolérance exceptionnellement élevée à l’instabilité génomique qui accompagne les dommages de l’ADN y compris le dysfonctionnement des télomères. Son cycle de vie est présenté en Annexe 1. Après avoir décrit l’ensemble des caractéristiques spécifiques des télomères, les mécanismes permettant leur maintien seront présentés. La mise en place de la réponse aux dommages de l’ADN sera abordée et les deux principales voies de réparation des DSB développées par la cellule (recombinaison non-homologue ou jonction des extrémités (NHEJ, Non-Homologous. End-Joining). et. recombinaison. homologue. (HR,. Homologous. Recombination) seront ensuite exposées. Enfin, la prise en charge des télomères déprotégés par de tels mécanismes sera détaillée.. . .

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(97) . Chapitre I : Généralités sur les télomères I. Historique C’est dans les années 1930, alors même que la nature ADN des chromosomes n’est pas encore connue, que les généticiens Herman Müller et Barbara McClintock apportent les premières démonstrations de l’existence d’extrémités particulières aux chromosomes. En effet, tous deux observèrent que les chromosomes ayant subi des DSB sont instables et sujets à des réarrangements (délétions, inversions) ainsi qu’à des fusions entre eux alors que les extrémités des chromosomes sont exemptées de tels événements (Müller, 1938 chez Drosophila melanogaster ; McClintock, 1939 chez Zea mays). Ainsi, l’existence d’une structure particulière au niveau des extrémités naturelles des chromosomes, permettant à ces extrémités d’être reconnues différemment d’une cassure et d’être stabilisées, fut admise. Le concept de « télomère », issu du grec τέλος, télos (« fin ») et μέρος, meros (« partie »), fut alors énoncé pour la première fois par Müller. Dans les années 1960, Leonard Hayflick a observé que les cellules humaines en culture arrêtent de proliférer après un nombre limité de divisions cellulaires (Hayflick and Moorhead, 1961; Hayflick, 1965), phénomène connu sous le nom de limite de Hayflick. Le lien entre les télomères et les observations de Hayfick a été suggéré par Alexei Olovnikov en 1973 grâce au développement des connaissances sur la réplication. En effet, après l’élucidation de la structure de l’ADN (Watson and Crick, 1953) et la découverte des ADN polymérases (Bessman et al., 1958), le problème de la réplication des extrémités se posa. L’unidirectionnalité de la réplication de l’ADN impose une réplication incomplète de la fin des chromosomes (« End Replication problem »). James Watson et Alexsei Olovnikov ont identifié indépendamment ce problème et soulignent qu’une telle réplication incomplète des chromosomes devrait conduire à un raccourcissement progressif des télomères à chaque division cellulaire (Watson, 1972; Olovnikov, 1973). Olovnikov propose que les cellules somatiques ne sont pas capables de compenser ce raccourcissement, et induisent un arrêt de leur prolifération cellulaire lorsque la taille des télomères devient trop petite, introduisant alors le terme de sénescence réplicative. Il émet . .

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(102) . l’hypothèse que les télomères agiraient comme « tampon » pour protéger les gènes situés en amont (Olovnikov, 1973). Le mécanisme d’action de ces extrémités, de nos jours communément appelés télomères, pour assurer les fonctions de protection et de tampon reste inexpliqué jusqu’à ce que leur structure moléculaire soit caractérisée. Elizabeth Blackburn fut la première à s’intéresser à la structure qui permettait de telles actions. Elle a utilisé le protozoaire cilié Tetrahymena thermophila qui présente la particularité de posséder plusieurs milliers de molécules linéaires d’ADN ribosomique (minichromosomes), dont elle a pu isoler et séquencer les extrémités. Elle a ainsi montré que leurs extrémités sont composées de la répétition en tandem de la séquence CCCCAA/GGGGTT (Blackburn and Gall, 1978). La décennie suivante permit l’identification des séquences télomériques dans de nombreux autres organismes (pour revue Wellinger and Sen, 1997 ; voir chapitre I-II.1). Par la suite, continuant à s’intéresser aux télomères et plus particulièrement à leur synthèse, Elizabeth Blackburn et Carol Greider ont mis en évidence la ribonucléoprotéine capable de synthétiser des répétitions télomériques chez T. thermophila (Greider and Blackburn, 1985; 1987), nommée télomérase. Cette étude servit de base pour l’identification de la télomérase chez d’autres organismes et notamment chez l’humain (Morin, 1989). Les avancées sur l’Homme ont permis à Howard Cooke de mesurer pour la première fois la taille des télomères humains. Examinant les télomères des chromosomes sexuels, il s’aperçut que, curieusement, ceux-ci étaient plus longs dans les cellules germinales que dans les cellules somatiques (Cooke and Smith, 1986). Pour expliquer cela, en accord avec le modèle d’Alexsei Olovnikov, il suggéra que la télomérase était inactive dans les cellules somatiques, qui de ce fait subissaient une érosion progressive de leur ADN télomérique. Les télomères étant nécessaires à l’intégrité du génome, leur raccourcissement a été proposé pour limiter la capacité de prolifération des cellules et conditionner leur durée de vie en provoquant l’entrée en senescence lorsqu’une taille critique était atteinte. L’idée de cette « horloge télomérique » suscita un grand intérêt : dès le début des années 1990, le raccourcissement progressif des télomères au cours des divisions cellulaires fut confirmé en culture primaire (Harley et al., 1990) ; et une corrélation positive étroite entre la longueur des télomères et les capacités prolifératives des cellules fut démontrée (Allsopp et al., 1992). Le . .

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(107) . résultat clé reliant les télomères à la senescence n’a été apporté que dans la fin des années 1990, par la réintroduction du composant catalytique TERT (Telomerase Reverse Transcriptase) dans des cellules primaires humaines. Cela permit de contourner la sénescence réplicative et de conférer une croissance immortelle à ces cellules (Bodnar et al., 1998). En outre, cette relation entre une perte de substance des télomères et la sénescence cellulaire avait aussi été démontrée chez la levure, où l’on avait observé qu'en inactivant le système de maintenance des télomères, on imposait aux cellules une durée de vie limitée (Lundblad and Szostak, 1989). Chez l’Homme, la télomérase est active dans les tissus de la lignée germinale, mais pas dans les tissus somatiques. Par contre celle-ci est réactivée dans la plupart des lignées cellulaires immortalisées in vitro ainsi que dans les lignées tumorales (Kim et al., 1994). Remarquablement, il a été découvert que certaines lignées immortelles, dans une proportion bien plus faible, présentaient la capacité d’allonger leur télomères sans activité télomérase détectable (Bryan et al., 1995). Ce nouveau mécanisme de maintenance des télomères a été nommé ALT pour « Alternative Lengthening of Telomeres ». Ces données, suggérant qu’il est nécessaire de maintenir ou d’allonger les télomères soit par la télomérase soit par ALT pour acquérir une capacité de prolifération indéfinie, supportent l’hypothèse que le raccourcissement des télomères conduit à la senescence des cellules humaines. Le mécanisme moléculaire sous-jacent du ALT n’est alors pas connu, mais les auteurs proposent qu’il peut être dû à de la recombinaison nonréciproque entre les répétitions télomériques résultant en un gain de répétitions sur les télomères courts. Cette hypothèse fut basée sur le fait que dans des cultures liquides de levure sans télomérase, une sous-population mineure de cellules échappe à la sénescence de façon dépendante de la protéine de la recombinaison Rad52 (Radiation sensitivity abnormal 52 ; Lundblad and Blackburn, 1993). Cette hypothèse fut confirmée en 2000 (Dunham et al., 2000). Ces découvertes importantes ont été suivies d’études plus affinées permettant une meilleure compréhension du fonctionnement de ces séquences chez toute sorte d’organismes modèles. A l’heure actuelle, les télomères sont considérés comme des structures nucléoprotéiques complexes dont l’organisation et l’intégrité sont essentielles au bon fonctionnement de la cellule. Il est actuellement admis que les télomères sont formés par de l’ADN télomérique ainsi que des protéines liant cet ADN directement ou indirectement pour former une structure protectrice . .

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(124) . contre les nucléases et la reconnaissance erronée de ces structures comme des cassures chromosomiques non réparées. Ces composants ainsi que les systèmes spécifiques mis en place pour le maintien de ces structures seront détaillés dans la suite de ce chapitre. Il n’en demeure pas moins que de nombreux mystères autour des télomères et de leur fonctionnement persistent comme nous pourrons le voir au cours de ce manuscrit.. II. L’ADN télomérique II.1. Généralités Typiquement, les télomères sont composés de nombreuses répétitions double brin en tandem d’un court motif ADN de 2 à 8 paires de bases selon les organismes (Tableau 1), dont l’un des brins est riche en guanines (G). Bien que non codante, la séquence nucléique est relativement conservée chez différents organismes (Tableau 1), ce qui est en faveur de son importance fonctionnelle. En effet, certaines caractéristiques sont retrouvées dans la plupart des eucaryotes. Tout d’abord, les G sont distribuées de façon asymétrique sur les deux brins de la double hélice. Puis, le brin riche en G est plus long que son complémentaire riche en cytosines (C) de telle sorte que les télomères portent une extension simple brin en 3’ riche en G, nommée « G-overhang », essentielle à l’architecture télomérique (Figure 2). En revanche, le nombre de répétitions varie selon les espèces, les individus, les cellules et même entre les différents chromosomes d’une même cellule. Les répétitions télomériques sont précédées par une région dite subtélomérique. Ces régions sont extrêmement dynamiques et par conséquent peu conservées. En effet, leurs séquences et longueurs varient entre les espèces, la seule propriété ubiquiste de ces séquences est qu’elles sont composées d’une mosaïque de séquences répétées. Chez Saccharomyces cerevisiae, elles contiennent des séquences répétées nommées « core X » et « élément Y ’ » séparées par un stretch de répétitions télomériques (TTAGGG), en position distale et proximale respectivement par rapport aux répétitions télomériques. Le « core X » est présent sur tous les chromosomes tandis que « l’élément Y’ » peut être présent en un nombre variable de copies allant de 0 à 4 par subtélomère selon les souches sur environ la moitié des télomères (pour revue Louis, 1995;. .

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