Voie de jonction des extrémités dépendante des protéines KU

l’établissement et à la maintenance des checkpoints intra-S et G2/M en partie car la résection des extrémités de la DSB est dépendante de ATM et fournit le signal pour le recrutement et l’activation de ATR (Jazayeri et al., 2005; Adams et al., 2006; Cuadrado et al., 2006; Myers and Cortez, 2006).

Chez A. thaliana, on ne trouve apparemment pas d’homologue fonctionnel de CDC25 (Boudolf et al., 2006). Les checkpoints du cycle cellulaire en réponse à des dommages de l’ADN semblent contrôlés par la kinase WEE1 (Wee1-Like Protein Kinase ; De Schutter et al., 2007). Elle est activée de manière dépendante de ATM et ATR selon le type de dommages induits (réplicatifs ou non). Cette kinase est responsable de l’accumulation de CDK phosphorylées ainsi que de l’arrêt du cycle cellulaire (De Schutter et al., 2007).

II. Les voies de recombinaison non homologue

La réparation des DSB par recombinaison non homologue consiste en la jonction des deux extrémités non homologues de la cassure (NHEJ). La voie canonique de NHEJ (C-NHEJ) est dépendante des protéines KU et existe chez tous les eucaryotes étudiés. Mais il existe également une ou plusieurs voies indépendantes de ces protéines. Ces variations dans les stratégies de réparation par NHEJ dépendent de nombreux éléments, tels que la complexité des extrémités des DSB, le recrutement des protéines du NHEJ et la formation ordonnée spatio-temporelle des complexes multi-protéiques.

II.1. Voie de jonction des extrémités dépendante des protéines KU

Cette voie de recombinaison est fonctionnelle à tous les stades du cycle cellulaire étant donné qu’elle ne nécessite pas de séquence homologue (pour revue Yang et al., 2016). La C-NHEJ est traditionnellement considérée comme un mécanisme générant des erreurs puisque les étapes de maturation des extrémités modifient la séquence nucléotidique au niveau de la DSB, mais ces erreurs restent à l’échelle nucléotidique (maximum une dizaine de nucléotides).

La C-NHEJ consiste en trois étapes successives : dans un premier temps, les extrémités d’ADN de la DSB doivent être reconnues et maintenues ensemble, deuxièmement, bien que

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parfois dispensable, la plupart des extrémités nécessite une maturation pour les rendre compatibles à la jonction de celles-ci, étape finale de la réaction de C-NHEJ (Figure 31).

II.1.a. Reconnaissance de la DSB

Dans les cellules eucaryotes, le complexe KU agit comme un détecteur de DSB. KU fonctionne en hétérodimère constitué d’une unité KU70 et d’une KU80. Ces deux sous-unités forment un anneau qui encercle les extrémités d’ADN (Walker et al., 2001) avec une haute affinité de séquence de manière indépendante de la séquence nucléotidique (Mimori and Hardin, 1986). De cette manière, KU protège ainsi les extrémités de la DSB de la dégradation par des exonucléases (Mimitou and Symington, 2010). De plus, KU stabilise les extrémités en les maintenant à proximité l’une de l’autre afin d’éviter les translocations chromosomiques. Cet effet a été observé in vitro, par la formation d’une boucle par un ADN linéaire dépendante de l’hétérodimère KU (Cary et al., 1997) et in vivo, par l’augmentation de la distance entre les deux extrémités d’une DSB après induction de celle-ci en cellules de mammifères déficientes pour KU (Soutoglou et al., 2007). Une autre conséquence de la liaison de KU à l’ADN est le recrutement de protéines. KU exerce cette action qu’une fois lié à l’ADN suggérant que, de façon importante, la conformation de KU est modifiée après sa liaison à l’ADN et permet ainsi l’ancrage d’autres facteurs de la C-NHEJ. Le complexe KU a été également identifié chez les levures et les plantes (Boulton and Jackson, 1996a; Tamura et al., 2002; Gallego et al., 2003).

La DNA-PKcs est le premier facteur recruté par KU après sa fixation à l’extrémité de la cassure (Uematsu et al., 2007) pour former un complexe DNA-PK (DNA-dependent Protein Kinase) actif, conduisant à l’activation et la stimulation de l’activité catalytique de la DNA-PKcs (Gottlieb and Jackson, 1993; Yaneva et al., 1997) et au déplacement de KU le long de l’ADN (Yoo and Dynan, 1999). Cette translocation autorise le positionnement de la DNA-PKcs sur l’extrémité cassée. La DNA-PKcs participe avec KU au maintien des extrémités de la DSB proches l’une de l’autre de façon indépendante de son activité catalytique qui devient nécessaire pour l’alignement de ces extrémités requis pour la jonction (Graham et al., 2016).

II.1.b. Maturation des extrémités de la DSB

En théorie, une DSB présentant des extrémités simples peut directement être réparée après sa reconnaissance. Les DSB présentant des extrémités contenant des configurations particulières (mésappariement, présence de base simple brin, extrémité modifiée de façon covalente, …) nécessitent des facteurs additionnels pour générer des extrémités compatibles à la jonction. Selon la nature de ces extrémités, plusieurs activités enzymatiques peuvent participer à cette étape telles que des kinases, des phosphatases, des nucléases, des hélicases ou encore des polymérases. Entre la reconnaissance initiale de la cassure par KU et l’étape finale de jonction, on peut donc avoir une flexibilité considérable dans les facteurs impliqués dans la réparation. On trouve, entre autres, la PNKP (Polynucleotide Kinase/Phosphatase), les nucléases Artemis chez les mammifères et Mre11 chez S. cerevisiae, ainsi que les ADN polymérases (Pol μ et Pol λ), qui peuvent être nécessaires (pour revue Mahaney et al., 2009).

La PNKP catalyse la phosphorylation des extrémités 5’-OH et élimine les groupements phosphate des extrémités 3’ (Chappell, 2002). Artemis agit sur différents substrats dont les extrémités en épingle à cheveux et les extrémités 3’ et 5’ sortantes (Ma et al., 2002). Elle interagit avec la DNA-PKcs qui est en charge de sa phosphorylation afin de permettre son recrutement à la cassure ainsi que l’induction de son activité endonucléasique (Ma et al., 2002) dépendante de la présence de KU (Chang et al., 2015). La protéine Mre11 est requise pour la C-NHEJ chez S. cerevisiae (Boulton and Jackson, 1998) mais pas son activité nucléase (Chen et al., 2001a). Il a été proposé que le complexe MRN, dont fait parti Mre11, serve de plateforme pour les facteurs de la C-NHEJ afin de stimuler la jonction. Les lacunes nucléotidiques, éventuellement générées au cours de la maturation des extrémités, sont comblées par les ADN polymérases Pol μ et Pol λ chez les mammifères (Capp et al., 2006; Andrade et al., 2009). Chez S. cerevisiae et A. thaliana, ces lacunes sont prises en charge par les ADN polymérases Pol IV (Wilson and Lieber, 1999) et Pol λ (Roy et al., 2013), respectivement. Enfin, KU lui-même semble également jouer un rôle direct dans la maturation de certaines extrémités via son activité lyase 5’-dRP/AP (5’-desoxyribose-5-phosphate / apurinic/apyrimidic sites ; Roberts et al., 2010; Strande et al., 2012) qui élimine les sites abasiques.



II.1.c. Jonction des extrémités de la DSB

Suite à leur maturation, les deux extrémités de la DSB sont reliées par la formation d’une liaison covalente entre les deux molécules. Cette dernière étape de la C-NHEJ est catalysée par le complexe XRCC4/Ligase IV (Grawunder et al., 1997). XRCC4 ne possède pas d’activité enzymatique, en interagissant de façon stable avec la ligase IV (Critchlow et al., 1997) elle permet de la stabiliser et de stimuler son activité (Grawunder et al., 1997). Il semble que le complexe KU, en plus d’intervenir dans la détection de la cassure et la maturation des extrémités, soit également impliqué indirectement dans cette dernière étape en permettant le recrutement du complexe XRCC4/Ligase IV potentiellement par l’interaction directe de KU70 et XRCC4 (Mari et al., 2006). Cependant d’autres interactions ont également été mises en évidence notamment entre XRCC4 et PNKP (Koch et al., 2004) ainsi qu’entre la ligase IV et Artemis (De Ioannes et al., 2012) ; pouvant également être impliquées dans le recrutement de ce complexe aux extrémités de la DSB. Il persiste une grande incertitude quant à l’ordre de recrutement des facteurs de la C-NHEJ après la fixation de KU. Cela n’est pas surprenant étant donné qu’en fonction de la situation, différentes enzymes sont nécessaires à la maturation des extrémités.

Le rôle du complexe XRCC4/Ligase IV a été dans un premier temps déterminé chez la levure S. cerevisiae (complexe Dnl4/Lif1, DNA ligase 4/Ligase-interacting factor 1 ; Teo and Jackson, 1997; Herrmann et al., 1998). Bien que l’étape de maturation des extrémités d’une DSB reste encore assez obscure chez A. thaliana (e.g. pas d’orthologue d’Artemis, aucun rôle éventuel de Mre11), les extrémités sont liées par le même complexe XRCC4/Ligase IV (West et al., 2000).

Le complexe responsable de la jonction des extrémités de la DSB comprend également la protéine XLF. Elle est capable d’interagir avec XRCC4 de façon à stimuler l’activité de l’ADN ligase IV (Ahnesorg et al., 2006). Des études in vitro ont suggéré que XLF stimulerait la réparation d’un sous-ensemble de DSB impliquant des mésappariements ou des extrémités non-cohésives (Tsai et al., 2007). Encore une fois, le complexe KU est le principal acteur impliqué dans son recrutement au niveau du site de la cassure (Yano et al., 2008).

XLF représente l’homologue de la protéine Nej1p, régulant la NHEJ chez S. cerevisiae (Callebaut et al., 2006). A priori, A. thaliana ne possède pas d’orthologue de la protéine XLF.