Correction mai 2006
Pour répondre à ce sujet, il fallait connaître un peu de la biologie des eumycètes et des stratégies d'infections des plantes par les champignons.
- Pour l'identification de l'ADNc, il a fallu construire une banque d'ADNc (extraction et purification des ARNm, retro-transcription et clonage dans un vecteur) et cribler la banque. Le plus logique est d'utiliser un criblage différentiel en utilisant des sondes provenant d'ARN extraits à partir de plantes infectées et de cultures en boite de Pétri.
Une fois l'ADNc exprimé différentiellement obtenu, il a été séquencé et la séquence comparée avec les banques de données. La protéine codée ressemble à une hydrophobine. Alternativement, on pourrait imaginer que Kim et coll. ont amplifié spécifiquement par RT-PCR les messagers correspondant aux hydrophobines en utilisant comme amorce des oligonucléotides dégénérés construits en comparant les séquences des hydrophobines qui se trouvent dans les banques; notez que maintenant que la séquence complète du génome de Magnaporthe grisea est connue, il suffit de faire une recherche in silico pour obtenir les séquences de toutes les hydrophobines présents chez ce champignon! (4 points)
- Pour mesurer l'expression de MHP1, il suffit de tester par Northern blot la présence du messager du gène codant MHP1 dans des extraits d'ARN obtenus à partir de mycélium croissant sur boite et de mycélium croissant in planta. (2 points)
- Pour connaître le rôle du gène codant MHP1, il faut l'inactiver. Chez M. grisea, il vaut mieux le déléter à l'aide d'une cassette d'inactivation: celle ci est un fragment d'ADN linéaire contenant un gène marqueur (conférant une résistance à un antibiotique par exemple) flanqué par les régions entourant le gène MHP1. L'ADN est introduit par transformation dans les cellules de M. grisea et les transformants sélectionnés sur la résistance à l'antibiotique. Il faut valider que le gène est bien délété, en analysant par Southern Blot la structure du gène dans les souches mutantes potentielles. Il faut ensuite comparer le comportement du mutant inactivé pour le gène codant MHP1 à celui de la souche sauvage. Visiblement, les mycéliums poussent de manière identique
sur boite de Petri mais l'observation au microscope montre que la souche mutante différencie mal ses conidies. En mettant les conidies mutantes à germer, on voit que les
% de germination est faible et que lorsqu'elles sont incubées, les conidies du mutant présentent une baisse rapide de viabilité, ce qui n'est pas observé dans la souche sauvage. Enfin, l'inoculation de plants de riz par les souches sauvage et mutante montre que la première attaque le riz et finit par le tuer alors que la seconde laisse le riz intact (ou au moins peu altéré). (4 points)
- Pour voir le "mouillage" d'une souche, il suffit de mettre une goutte d'eau sur le mycélium et d'observer si elle s'étale (le mycélium se mouille) ou au contraire si elle forme une sphère qui roule (le mycélium est hydrophobe et ne se mouille pas). Le résultat est qu'en absence de détergent les deux mycéliums ne se mouillent pas mais qu'après ajout d'un peu de détergents, seul le mycélium mutant se mouille. (2 points)
Les conclusions que l'on peut tirer:
- Les hydrophobines sont des petites protéines de la paroi du champignon et qui le protègent contre la dessiccation. MHP1 est intéressante car elle protège visiblement plus spécifiquement les conidies (bien qu'elle doive être présente dans le mycélium car son absence rend les souches mutantes plus mouillables). Les conidies se propagent via l'atmosphère, milieu sec par excellence! Il est possible que MHP1 protège mieux que des hydrophobines présentes dans le mycélium (si la paroi est complètement hydrophobe alors il n'y a plus d'échange avec le milieu!). Ceci montre un bon exemple d'évolution de paralogues possédant des fonctions proches et permettant des adaptations fines. En l'occurrence pour M. grisea, la possibilité de se disperser via l'air pour infecter les plans voisins, les conidies étant les propagules de dispersion et à l'origine de la formation de l'appressorium qui permet de pénétrer la plante. Il n'y a donc rien d'étonnant que le mutant déficient pour MHP1 soit non infectieux. (3 points)
- On peut espérer utiliser les connaissances acquises sur cette hydrophobine pour mettre au point des stratégies de lutte contre M. grisea mais aussi contre les autres eumycètes pathogènes se dispersant via les conidies, car il est probable que ceux-ci ont aussi des hydrophobines apparentées à MHP1. Cette protéine intervenant à différentes étapes du
cycle infectieux (dispersion et pénétration), il faudrait essayer d'inhiber son action. Cela ne sera pas simple car il faut un inhibiteur spécifique (inhiber les hydrophobines en général risque de causer des dommages considérables aux autres champignons!). Enfin, ceci marchera contre les champignons pénétrant par les feuilles via une dispersion conidienne mais pas ceux qui pénètrent par les racines: notez que c'est le cas de M.
grisea qui peut pénétrer les racines via des hyphopodia! Enfin, il est évident que l'utilisation de détergents dans les champs est à prohiber ! (5 points)
