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Application de la méthode immunoenzymatique à la détection de deux virus dans des plantes de Cymbidium
d’âges différents
André Toussaint, Josette Albouy
To cite this version:
André Toussaint, Josette Albouy. Application de la méthode immunoenzymatique à la détection de deux virus dans des plantes de Cymbidium d’âges différents. Agronomie, EDP Sciences, 1982, 2 (9), pp.901-903. �hal-02726297�
Application
de la méthodeimmunoenzymatique
à la détection de deux virus dans des
plantes
deCymbidium d’âges
différents.André TOUSSAINT Josette ALBOUY
Faculté des Sciences agronomiques de Gembloux, Chaire des Cultures ornementales 2, avenue de la Faculté
d’Agronomie, B-5800 Gembloux.
(
*
) LN.R.A., Station de Pathologie végétale, Route de Saint-Cyr, F-78000 Versailles.
RÉSUMÉ La technique immunoenzymatique ELISA permet de détecter la présence de virus (virus des anneaux Orchidées, nécrotiques de l’Odontoglossum = orsv et virus de la mosaïque du Cymbidium = CyMV) dans des broyats C
y mbidium
, d’échantillons de Cymbidium. Différents stades de la plante sont analysés : le protocorme et la plantule Virus,
1 ’
obtenus en culture in vitro, de même que le pied-mère cultivé en serre. L’utilisation de ce diagnostic, lors d’un
Méthode ELISA. contrôle sanitaire des clones avant multiplication in vitro, est envisagée.
SUMMARY The use of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of two Cymbidium viruses
Orchids, The ELISA serological method was used to detect both Odontoglossum ringspot virus (ORSV) and Cymbidium Cymbidium
, mosaic virus (CyMV) in crude extracts of Cymbidium. Tests were made both on the mother plant and on
Virus ELISA. various stages of in vitro culture of Cymbidium (protocorm, plantlet, etc.). This technique could be used to check the virological state of material before in vitro multiplication.
1. INTRODUCTION
La propagation « in vitro » des Orchidées, mise au point
par MOREL (1960, 1963), a permis un développement
considérable de la culture de ces fleurs exceptionnelles et
donné aux producteurs de nouvelles perspectives commer-
ciales. Cette technique, à l’origine élaborée dans le but d’éliminer les viroses par culture d’ébauches méristémati- ques, est actuellement utilisée avec les objectifs complé-
mentaires suivants : accélérer la multiplication des plants et
réduire le temps nécessaire à leur floraison. Le méristème, mis en culture sur milieu gélosé, se développe en formant un
protocorme qui peut évoluer en une plantule unique, ou,
par fragmentations successives, être à la base d’un cycle de multiplication végétative très efficace.
Deux virus sont fréquemment présents dans les cultures d’Orchidées de tous les pays producteurs. Il s’agit du virus
des anneaux nécrotiques de l’Odontoglossum (Odontoglos-
sum Ringspot Virus = ottsv) et du virus de la mosaïque du Cymbidium (Cymbidium Mosaic Virus = CyMV). En outre, il s’avère que plus des deux tiers des pieds-mères provenant de plusieurs établissements horticoles sont infectés simulta- nément par ces 2 virus.
L’utilisation de la culture d’apex comme base de multipli-
cation végétative in vitro (établissement de protocorme,
fragmentation de ceux-ci et obtention de plantules) ne garantit pas l’assainissement des cultures. En effet, W
ITHNER (1974) et HAKKAART (1980) précisent que le
Cy l
vtv peut être facilement éliminé par culture d’apex alors
que l’ORSVpersiste dans la descendance, et ce, indépendam-
ment des réinfections ultérieures. Les chances d’obtenir des
plantules indemnes de virus seront d’autant plus faibles que la dimension de l’explant prélevé est grande. Selon MOREL (1964), le prélèvement du méristème entouré de 1 à 2 primordiums foliaires doit avoir la taille de 0,1 à 0,2 mm.
C
HAMPAGNAT(1977) estime que le méristème ne peut être cultivé avec succès que pour autant qu’il soit entouré de quelques primordiums foliaires. Pour MULLER(1979), afin
d’assurer une croissance satisfaisante des apex, la partie
mise en culture doit comprendre le méristème recouvert de
2 à 4 écailles ainsi qu’un peu de tissu sous-jacent ; le fragment ainsi prélevé mesure 1,5 à 3 mm. Les risques
d’obtenir des protocormes virosés à partir d’un pied-mère
malade sont élevés puisque les primordiums peuvent être virosés.
La disposition d’un test virologique suffisamment sensible
est donc indispensable pour contrôler l’efficacité de la
technique de régénération et le maintien de l’état sanitaire
au cours des multiplications successives. La méthode immu-
noenzymatique ELISAsemble particulièrement bien adaptée
à ce genre de test, aussi avons-nous envisagé son application
pour la production de plants sains d’orchidées et plus spécialement pour celle du genre Cymbidium. Plusieurs types d’études sont réalisées : sur les pieds-mères au niveau
des bourgeons, sur des protocormes plus ou moins dévelop- pés et enfin sur des plantules.
II. MATÉRIEL ET MÉTHODES
Les protocormes et les plantules sont cultivés sur milieu gélosé de Knudson type C (KNUDSON, 1946). Les protocor-
mes sains proviennent d’un méristème prélevé sur un pied-
mère certifié sain. Les protocormes virosés ont pour ori-
gine, soit des méristèmes excisés sur des plantes malades,
soit des protocormes sains inoculés in vitro. L’inoculation des protocormes in vitro est réalisée sous hotte à flux laminaire stérile à l’aide d’une suspension de virus purifié et
filtré sur Millipore (MILLEX). Une goutte de virus purifié (1 mg/ml environ) est déposée sur le milieu de culture, puis
un fragment de protocorme fraîchement découpé est placé
sur cette goutte. La solution virale est obtenue par purifica-
tion du virus à partir de feuilles de Cymbidium selon la
méthode décrite par FRANCKI (1966). L’observation de la
suspension virale en microscopie électronique suivant la méthode de coloration négative à l’acétate d’uranyle permet de mettre en évidence la présence de l’ORSVet du CyMVen mélange.
Le protocole de base de l’ELISA est décrit par CLARK &
A
DAMS(1977). Les anticorps utilisés sont les immunoglobu-
lines sériques (IgG) obtenues par fractionnement de l’antisérum par chromatographie d’affinité (Protéine A- Sépharose CL 4 B - PHARMACIA). Les antisérums provien-
nent de l’« Institut für Viruskrankheiten de Pflanzen » de
Braunschweig.
Les tests sont réalisés sur des plaques de microtitration
LINBRO76 - 381 - 04. Les résultats sont chiffrés par lecture de l’absorbance à 405 nm du P. nitrophénylphosphate hydrolysé par la phosphatase alkaline (SIGMA), à l’aide d’un colorimètre (TITERTEK MULTISKAN).
Des essais préliminaires sont réalisés afin de définir les valeurs optimales des différents paramètres qui intervien-
nent dans la réalisation de la réaction immunoenzymatique
dite méthode « sandwich » (concentration des IgG utilisés
en « coating » ; dilution des solutions d’IgG marqués utilisés
en couplage avec les antigènes de l’échantillon éprouvé ;
durée de la réaction enzymatique de coloration). Les
échantillons utilisés pour ces réactions préliminaires consis-
tent en des extraits bruts de plantes infectées par l’ORSVou
par le CyMV obtenus par filtration d’un broyat de 1 g de matière fraîche dans 10 ml de tampon.
Les résultats les plus spécifiques sont obtenus, respective-
ment pour le CyMV et l’ORSV, pour un « coating » des plaques de titration à l’aide d’une solution d’anticorps à
2 wg/ml et 1 fLg/ml, une dilution des IgG marqués utilisés
pour le couplage de 1/400, soit 2,5 fLg/ml, et de 1/600, soit 1,7 pg/ml, et un temps de réaction de 150 mn et 90 mn après
addition du substrat de la réaction enzymatique (tabl. 1).
Techniquement, notons que la clarification des broyats
par centrifugation permet de faciliter la détection virale en
augmentant la réponse de l’échantillon virosé sans augmen-
TABLEAU 1
Titration du Cymv et de l’ORsv en Ecisn.
(Cy MV
- Fixation 2 ¡..tg/ml - Anticorps couplés 2,5 ¡..tg/mI).
(oRS V
- Fixation 1 wg/ml - Anticorps couplés 1.,7 wg/ml).
Titration of Cymv and oRsv by ecisa.
Concentration des virus Densité optique à 405 nm purifiés (ng/ml) Sérum CyMV Sérum ORSV
100 0,437 1,648
10 0,251 0,267
1 0,125 0,038
feuille saine 0,004 0,130
témoin tampon 0,001 0,001
ter le bruit de fond des plantes saines ; par contre, la
présence de Mercapto-éthanol à 0,01 p. 100 dans les jus de plante accroît le bruit de fond tout en réduisant la réaction
enzymatique.
III. RÉSULTATS
Différentes études sur bourgeons, protocormes et plantu-
les sont réalisées en vue de déterminer le pouvoir de
détection du test ELISA ainsi que les possibilités qu’il peut offrir à ces différents niveaux.
A. Bourgeons
Les bourgeons éprouvés renferment des méristèmes qui pourraient être excisés en vue de leur multiplication par culture in vitro. Les différents bourgeons sont prélevés sur
des jeunes pousses provenant de pieds-mères malades
montrant des symptômes d’ORSV ou de Cyvtv. Chaque
pousse possède plusieurs bourgeons ; le poids de ceux-ci peut varier de 3 à 135 mg. Sur une pousse, les bourgeons les plus externes sont les plus gros ; ils comportent de 8 à 10 primordiums. Plus ils sont internes, moins ils possèdent
de primordiums et plus ils sont petits. Afin de pouvoir
comparer la concentration en virus des différents bour- geons, ceux-ci sont broyés dans les proportions de 1 mg de matière fraîche pour 10 wl, sauf ceux dont le poids est
inférieur à 20 mg, qui sont broyés dans un volume de 200 ni
Les résultats montrent que tous les bourgeons prélevés
sur un pied-mère malade sont virosés, même les bourgeons apicaux qui sont en pleine activité mitotique (tabl. 2).
B. Protocormes et plantules
Le test est appliqué à des protocormes en voie de formation ou de multiplication. Les protocormes inoculés par le virus purifié donnent une réponse nettement positive
pour les IgG-ORSV, mais des résultats moins clairs vis-à-vis des IgG-CyMV (tabl. 3). Deux protocormes d’environ 20 mg issus de pieds-mères malades, répondent positive-
ment aux IgG-ORSV. Dans ce cas, la présence de virus est
confirmée par des observations au microscope électronique
en appliquant la méthode de la goutte.
Les plantules éprouvées proviennent de la différenciation des protocormes virosés. Ces plantules sont composées
d’une partie qui est en division active (la partie feuillée) et
d’une autre qui n’évolue plus (le protocorme). Cette
dernière semble nettement moins virosée que la partie
feuillée, et ce, aussi bien dans le cas de l’ORSV que du
CyMV. Les plantules prises dans leur ensemble (proto-
corme et feuilles) contiennent apparemment moins de virus que les protocormes non différenciés, surtout dans le cas du CyMV (tabl. 3).
IV. CONCLUSION
Les différents essais réalisés montrent l’intérêt de la méthode ELISn ; grâce à sa grande sensibilité, ce test permet
la détection de faibles concentrations virales à partir de petites quantités de matériel et est apte à être utilisé pour le contrôle du matériel cultivé in vitro.
L’indexage des jeunes végétaux cultivés in vitro rend
possible l’élimination des clones virosés avant multiplica-
tion. Ce contrôle, dont toute l’importance est démontrée
par ces premiers essais, est indispensable au niveau des
échanges commerciaux, et permettrait de décerner un label
« indemne de virus » pour les plantules à leur sortie de tube de culture, de même que pour les premiers plants.
Des essais sont actuellement poursuivis ; ils tentent de
démontrer les possibilités de régénération par prélèvement d’apex, d’expliquer le comportement de virus résiduel dans les explants cultivés in vitro (éprouvés en ELISA) et de
certifier la validité de l’indexage précoce sur l’état sanitaire
des plantes obtenues.
Reçu le 25 mars 1982.
Accepté le le’ juin 1982.
REMERCIEMENTS
Ce travail a été réalisé à la Station de Pathologie végétale de
Versailles (I.N.R.A.) lors d’un stage de A. TOUSSAINT; nous
tenons à remercier le FNRS pour le financement de ce stage.
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