La pepsine hydrolyse aussi bien les caséines à pH 5 qu’à pH 2, contrairement aux protéines du blanc d’œuf et du standard hémoglobine

100 0 1000 10000 2

4 6 8 10 12

Protéines de Blanc d’Oeuf

Temps (s)

D e g ré d ’h y d ro ly se ( % )

100 0 1000 10000

2 4 6 8 10 12

Caséines

Temps (s)

D e g ré d ’h y d ro ly se ( % )

La pepsine hydrolyse aussi bien les caséines à pH 5 qu’à pH 2, contrairement aux protéines du

blanc d’œuf et du standard hémoglobine

LÉA SALELLES ^A , STEVEN LE FEUNTEUN ^A , JULIANE FLOURY ^A

A. STLO, INRA, AGROCAMPUS OUEST, Rennes, France

Fig.4 : Agrégats de caséines dans

observés au microscope confocal (sonde Syto9, obj X20, Z-

stack)

Cinétiques de protéolyse par la pepsine de caséines et de blanc d’œuf dans des fluides gastriques simulés de différents pH

• Les cinétiques d’hydrolyse des protéines sont correctement simulées par des lois de puissance, sauf pour les caséines aux pH 4 et 5 (Fig. 1).

• Les degrés d’hydrolyse à 2h et les vitesses initiales suivent des tendances similaires en fonction du pH (Fig. 2-3).

• L’activité de la pepsine en fonction du pH sur le blanc d’oeuf n’est pas une courbe en cloche contrairement à ce qui est classiquement observé (Fig.2).

• La pepsine a un maximum d’activité à pH 3-4 sur les caséines (Fig. 2-3), mais elle reste active jusqu’à pH 6 (non loin du pH initial du lait ~).

 

Morphologie et taille des agrégats de caséines avant hydrolyse

Discussion

• Les cinétiques d’hydrolyse suivent, dans leur majorité, des profils en loi de puissance en fonction du temps.

• Le lait n’a presque pas besoin d’être acidifié dans l’estomac pour que l’hydrolyse des caséines (~ 80% des protéines du lait de vache) ne commence, puisque l’activité de la pepsine est quasi- optimale dès pH 5.

• Les agrégats de caséines à pH 3-5, qui sont autant sensibles à l’action de la pepsine que ceux à pH 1 et 2, semblent plus irréguliers et gonflés. La structure des agrégats semblent donc être un paramètre tout aussi important que le pH réactionnel pour comprendre les cinétiques d’hydrolyse des caséines par la pepsine.

1. Fruton et al. (2006); Cornish-Bowden Biochem. J.

113 (1969)

2. Brodkorb et al. Nat. Protoc. 14 (2019) ; Minekus et al.(2014)

3. Dalgleish & Corredig, 2012

www6.rennes.inra.fr/stlo

0 1 2 3 4 5

0 50 100 150 200 250

pH

S M D ( μ m )

Transformation des suivis de titration en pH-STAT en degré d’hydrolyse (Fig.1) :

DH : degré d’hydrolyse (%) V : Volume de titrant (L)

C : concentration de la solution titrante (mol/L) htot : nombre de liaisons équivalent par g de protéine (mol/g)

m : masse de substrat protéique (g) α : coefficient de dissociation

Les coefficients de dissociation varient en fonction du pH et sont estimés par une mesure des degrés d’hydrolyse à 2h utilisant une méthode non dépendante du pH, la méthode OPA.

�� ⁺₃ ^¿/ �� ₂ −1

�_{��� � /���}⁻ +�_¿

¿

¿

�� ( % )= � ∗ �

� ∗ h��� ∗ 1

 

¿

Conditions d’hydrolyse :

Conditions salines gastriques , 37°C, pH fixes, pepsine 2000 U/mL, substrat 0,5% en protéines dans 30 mL de bol de réaction.

Caséine préacidifiée à pH 4 pour former des agrégats en conditions fixes.

 

Journées Francophones de Nutrition 2019

Conclusion:

Les cinétiques d’hydrolyse par la pepsine en fonction du pH diffèrent entre un substrat de type protéines globulaires comme les protéines du blanc d’œuf, et les caséines du lait. Ces profils d’activité de la pepsine en fonction du pH sont également différents de celui du standard hémoglobine. En outre, contrairement à ce qui est généralement admis, la pepsine peut hydrolyser certains substrats à des pH ≥ 5.

0 100 200 300 400 500 600

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

pH1 pH2 pH3 pH4 pH5 Diamètre des agrégats (μm)

S p h é ri ci té

Modèle en loi de puissance

p

H a b R2

2 0.46 0.31 0.9988 3 0.80 0.27 0.9997 4 1.28 0.21 0.9150 5 1.28 0.20 0.7424 6 0.70 0.18 0.9745 p

H a b R2

2 0.46 0.31 0.9988 3 0.80 0.27 0.9997 4 1.28 0.21 0.9150 5 1.28 0.20 0.7424 6 0.70 0.18 0.9745  Modèle en loi de

puissance

pH a b R2

2 0.29 0.42 0.9970 3 0.23 0.40 0.9997 4 0.16 0.40 0.9990 5 0.38 0.22 0.9614

pH a b R2

2 0.29 0.42 0.9970 3 0.23 0.40 0.9997 4 0.16 0.40 0.9990 5 0.38 0.22 0.9614

0 1 2 3 4 5 6 7

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80

0.53

0.74

0.65

0.44

0.35

blanc d'œuf pH

V it e ss e i n it ia le ( D H /m in )

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0

6.9 6.9 8.4 8.3

6.8

3.3 2.1

0.4 14.4

12.2

8.1

5.6

2.6

0.7 0.0 0.0

DH Blanc d'œuf pH

D e g ré d 'h y d ro ly se ( % )

Fig. 2 : Degrés d'hydrolyse à 2h de réaction Fig.3 : Vitesse d’hydrolyse dans les 5 premières minutes de réaction

Fig.1 : Degrés d’hydrolyse du blanc d’oeuf et des caséines par la pepsine en fonction du temps mesurés par pH-STAT.

Courbes moyennes ± écart-type sur 3 répétitions. Les lignes simples représentent les modèles ajustés sur la moyenne des répétitions.

Les caséines se présentent en structures supramoléculaires, appelées micelles, qui s’agrègent à pH acide. Pour notre étude, des agrégats ont toujours été formés à pH 4 avant les hydrolyses.

Fig. 5 : Diamètre de Sauter (d ₃₂ ) des agrégats mesurés en morphogranulométrie

Fig. 6 : Indice de sphéricité des agrégats en fonction de leur taille mesurés en morphogranulométrie

Les agrégats de caséines à pH 4 et 5, en comparaison avec à pH 1 et 2, semblent :

• Plus irréguliers (Fig. 4), suggérant une plus grande quantité d’interface avec le milieu.

• Plus grands (Fig. 5), et donc plus gonflés.

• Avec des profils de sphéricité différents (Fig. 6).

pH1

150 µm

pH 3

150 µm

pH 5

150 µm

pH 2 ^{150 µm} pH 4

150 µm

lea.salelles@inra.fr ;

juliane.floury@agrocampus-ouest.fr pH 3

Introduction

La pepsine sécrétée dans l’estomac est la première protéase rencontrée par les protéines au cours de la digestion. L’estomac acidifie lentement les bols alimentaires et il est généralement admis que la pepsine n’est active qu’à pH acide (pH≤ 5), avec un maximum d’activité autour de pH 2 ¹ , notamment sur l’hémoglobine, substrat de référence pour mesurer son activité. Ce comportement en fonction du pH n’a cependant pas été validé sur des mélanges de protéines alimentaires telles que les caséines, principales protéines du lait, ou les protéines du blanc d’œuf.

L’objectif principal de cette étude est de comparer les profils d’activité de la pepsine porcine en fonction du pH sur les caséines du lait de vache et les protéines du blanc d’œuf et d’étudier leurs cinétiques de digestion gastrique sur 2h par pH-STAT.

Ces structures présentant plus d’interfaces

accessibles à la pepsine se corrèlent bien avec leur

forte sensibilité à l’hydrolyse pour ces pH élevés

(Fig. 2 et 3).