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TECHNIQUES:
Principes de la chromatographie
Définition
La chromatographie est une méthode physique de séparationbasée sur les différentes affinités d’un ou plusieurs composés à l’égard de deux phases (stationnaire et mobile).
L'échantillon est entraîné par la phase mobile au travers de la phase stationnaire qui a tendance à retenir plus ou moins les composés de l'échantillon à l'aide de différentes interactions. L’échantillon est adsorbé puis désorbé sur la phase stationnaire, ou est plus ou moins solubledans la phase mobile.
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Types de chromatographies
Type Critère de séparation
Adsorption Polarité
Partage Solubilité
Exclusion Taille des molécules Échangeuse d’ions Charge ionique
Affinité Structure des protéines
Il est rare de pouvoir associer une méthode chromatographique à un seul phénomène.
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Types de chromatographies
Chromatographie échangeuse d’ions
Chromatographie d’exclusion
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Chromatographies d’adsorption
Phase mobile Nom
Gaz Chromatographie en phase vapeur (CPV) ou en phase
gazeuse (GC)
Liquide Chromatographie couche mince (CCM ou TLC) ou éclair Liquide Chromatographie liquide à haute
performance (CLHP ou HPLC)
Utilité de la chromatographie
Selon la quantité de produit appliqué en chromatographie, on s’en sert pour:
•Analyser< 1 mg de produit par CCM, HPLC ou CPV
•Séparer ou purifierles produits d’une réaction par chromatographie éclair ou HPLC (50 mg à 15 g)
•Doserdes produits. L’analyse quantitative se fait avec un étalon interne ou après préparation d’une courbe de calibration.
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Chromatographie d’adsorption: principe
La chromatographie d’adsorption est basée sur le partage des solutés entre l’adsorbant solide fixeet la phase mobile. Chacun des solutés est soumis à une force de rétention par adsorption et une force
d’entraînement par la phase mobile. L’équilibre qui en résulte aboutit à une migration différentielle des solutés de l’échantillon à analyser, ce qui permet leur séparation.
Les séparation sont basées sur le principe de polarité, c’est-à-dire l’existence de dipôles dans une structure moléculaire.
Adsorbants possibles (du moins polaire au plus polaire):
Papier, cellulose, amidon, carbonate de sodium, gel de silice, alumine, charbon activé.
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Adsorbants
Les adsorbants sont sous forme de granules calibrés. La séparation est meilleure, mais plus lente si les grains sont fins.
Plus un adsorbant est actif, plus il retient fortement les composés polaires. La
séparation se fait par ordre croissant de leurs forces d’interaction avec les composés polaires.
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Polarité des groupements fonctionnels neutres
Le gel de silice est polaire, il a par conséquence une plus grande affinité pour les composés polaires:
Un composé peu polaire est peu adsorbé.
Un composé polaire est très adsorbé.
R-H
R-X
R-NO2
RO
R R OR
O
R R
O
R H
O
R NR2 O
R OH O
R-NH2 R-OH Ar-OH
Polarité croissante
Les molécules chargées ne migreront habituellement pas sur gel de silice, elles sont trop polaires.
Phase mobile
Une phase mobile liquide est appelée éluant.
C’est elle qui fait migrer les composés, son choix est donc important.
Il faut que le soluté soit solubledans l’éluant.
Il est possible de faire des mélanges de
solvants pour changer sa polarité. Polarité croissante
Hexanes CCl4
Benzène, Toluène Et2O
CH2Cl2 AcOEt MeOH, EtOH AcOH
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Deux facteurs interviennent lors de l’interaction entre l’éluantet le soluté (mélange de composés à séparer):
•la solubilité: on doit être en mesure de dissoudre le soluté dans l’éluant pour que la migration se fasse.
•la polaritéde l’éluant va déterminer à quelle vitesse le composé migre.
Moins un composé est polaire, moins il s’accroche à l’adsorbant, plus il migre avec l’éluant. Choix d’un éluant peu polaire Plus un composé est polaire, plus il s’accroche à l’adsorbant, moins il migre avec l’éluant. Choix d’un éluant polaire
Choix de l’éluant
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Chromatographie sur couche mince
L’adsorbant (silice, 250 m d’épaisseur) est fixé sur une plaque (Al, verre) commercialement disponible.
Le produit/mélange de produits est déposé sur la plaque à l’aide d’un capillaire.
Les produits sont révélés après élution.
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Préparation d’un capillaire
Au laboratoire, les capillaires sont préparés au départ de pipettes Pasteur:
• Chauffer la partie centrale de la pipette dans la flamme d’une torche au propane en tournant le tube jusqu’à ce qu’il soit mou.
• Retirer de la flamme et étirer la pipette.
• Laisser refroidir et couper la partie fine du milieu.
Utilité des CCM
1. CCM analytiques (250 m, 2.5 x 7.5 cm)
• Vérifier la pureté d’un produit, quelques microgrammes suffisent
• Suivre l’avancement d’une réaction
• Vérifier l’efficacité d’une extraction liquide-liquide
• Déterminer l’éluant pour la chromatographie éclair sur gel de silice 2. CCM préparatives (1000 m, 20 x 20 cm)
• Purification de petites quantités de produit (jusqu’à ~100 mg sur une plaque de 20 x 20 cm). La bande qui contient le produit purifié est grattée, puis la silice est extraite avec un solvant.
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Préparation de la CCM
A B C
1. On trace un trait à ~1 cm du bord inférieur de la plaque.
On marque les futur dépôts, espacés d’environ 0.5 cm.
On identifie chaque produit qu’on fera éluer.
2. Le produit/mélange doit toujoursêtre dilué dans un solvant (Et2O, CH2Cl2, AcOEt…) assez volatil.
Dans un vial, déposer 1 goutte ou 2-3 cristaux de produit + ~0.5 mL solvant.
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Élution de la CCM
3. On utilise un capillaire pour déposer le produit sur la plaque puis on laisse évaporer le solvant. On peut spotter 2-3 fois si l’échantillon est très dilué.
4. Élution: préparer une cuve d’élutionavec
•Bécher de 250 mL avec un papier absorbant à l’intérieur
•Verre de montre
Y verser 10 mL d’éluant (ex. 8 mL Hex + 2 mL AcOEt) Placer la CCM dans la cuve en veillant à ce que la ligne soit au-dessus du liquide.
Faire éluer jusqu’à ~5 mm du bord et tracer un trait pour marquer le front de solvant.
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Révélation de la CCM
•À l’œil nu: si le produit est coloré
•À la lampe UV: les molécules qui absorbent les UV à 254 nm seront visibles (noyaux aromatiques par exemple).
•Avec un révélateur chimique:l’iode est le premier révélateur à tester, car il est non destructif. Il permet de révéler des doubles liaisons et les halogénures. L’iode est évaporé à chaud ou dans la hotte.
De nombreux autres existent: KMnO4, acide phosphomolybdique, vanilline, ninhydrine…
UV KMnO4
Mesure du R
fProduit moins polaire, moins accroché
Produit plus polaire, plus accroché
1 et 0 entre valeur solvant
de front du Hauteur
migration de
Hauteur
Rf
Le Rf(rapport frontal ou rétention frontale) est caractéristique d’un produit dans un éluant donné et pour une phase stationnaire donnée.
L l1 l2
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Influence de l’éluant
Lorsque la polarité du solvant augmente, le Rfaugmente. Le Rf augmente, puis diminue.
Pour faire une séparation de deux produits par chromatographie, on cherche un éluant qui donne le plus grand Rfpossible, avec un Rfpour le produit le moins polaire autour de 0,3.
Polarité de l’éluant
100% Hexane 95% Hexane
5% A cOEt 90% Hexane
10% AcOEt 80% Hexane
20% AcOEt 70% Hexane 30% AcOEt
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CCM bidirectionnelles
C’est une expérience qui permet de prouver si un produit décompose sur la silice, ou si un “spot” de la CCM contient en fait deux produits.
Si élué dans un autre solvant
1ère STL – Chimie – TP n°17 – Chromatographie – CORRECTION
Chromatographie sur papier
1. On observe un étalement des tâches pour les feutres de dessin : certaines tâches migrent plus que d’autres ce qui laisse apparaître pour certains feutres plusieurs couleurs. Par exemple, on remarque que le feutre de couleur violette est composé de rose et de bleu…
En revanche, on observe que les tâches des feutres de tableau ne migrent pas du tout.
2. Pourquoi les composés ne migrent pas tous à la même hauteur ? Cela dépend-il du support, de l’éluant, de la nature de l’espèce chimique ?
Compétences
travaillées Indicateurs de réussite Niveau
S’APPROPRIER Comprendre la problématique de ce TP. 2
REALISER Déterminer des rapports frontaux. 3
ANALYSER Observer des chromatogrammes. 3
VALIDER
Trouver le « meilleur éluant » lors d’une chromatographie sur papier. 3
Identifier les molécules polaires et apolaires. 3
Faire le lien entre molécules (a)polaires et solvants (a)polaires. 3
Comparer la chromatographie sur papier et la CCM. 3
ETRE AUTONOME Travailler sans l’aide de mon professeur. Non évalué
(E3) : Un mélange 50/50 eau-éthanol : on observe des traînées pour tous les dépôts.
(E4) : De l’eau salée : le bleu s’est bien séparé du jaune ; les tâches migrent à des hauteurs différentes.
(E5) : Du cyclohexane : aucune espèce n’a migré.
4. On peut dire que le colorant vert est composé de bleu et de jaune.
5. Le colorant vert n’a pas de code : c’est un mélange de jaune E102 et bleu patente E131.
6.
𝑅
𝑓=
ℎ𝐻
avec h : distance parcourue par l’espèce chimique H : distance parcourue par l’éluant
Seuls les chromatogrammes avec les éluants eau et eau salée sont exploitables.
Bleu jaune
Eau pure Rf = 0,9 Rf = 0,9
Eau salée Rf = 0,9 Rf = 0,6
7. On remarque que le rapport frontal n’est pas le même pour le jaune lorsque l’éluant est l’eau pure ou l’eau salée. Donc le coefficient Rf dépend de l’éluant utilisé.
8. Conclusion : le meilleur éluant est l’eau salée car le bleu et le jaune migrant avec l’éluant et leur rapport frontal est très différent : l’eau salée a un bon pouvoir séparateur. Le bleu a plus d’affinité avec l’eau salée que le jaune car il est plus soluble dans l’eau salée.
9.
On remarque qu’une espèce chimique polaire a plus d’affinité avec un éluant polaire et inversement.
10. On remarque que le jaune est très peu soluble dans l’éthanol, ce qui explique la non migration de ce colorant lorsque l’éthanol et l’éluant.
Conclusion : La migration d’une espèce chimique dépend de sa solubilité et de son affinité (polaire ou apolaire) avec l’éluant.
Chromatographie sur couche mince CCM
11. On observe que le jaune a migré davantage que le bleu, les deux colorants se sont tout de même séparés.
12. La phase fixe a une influence : plus l’espèce chimique a une affinité avec le support, moins elle va parcourir de distance. On en conclut que le bleu a plus d’affinité avec la silice et le jaune a plus d’affinité avec le papier.
Chromatographie sur colonne On observe que la séparation entre les deux colorants se fait difficilement.
L’éthanol n’est pas le bon éluant.
On observe que le bleu se sépare très lentement du jaune, le jaune migre en premier.
Les observations avec une plaque CCM nous indiquent que le jaune a plus d’affinité avec la silice que le bleu.
On remarque la même chose.
CONCLUSION
13. La chromatographie est une méthode physique de séparation de mélanges ; elle est basée sur les différences d’affinité des substances à l’égard de deux phases, l’une stationnaire ou fixe, l’autre mobile.
Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des composants entraînés par la phase mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur désorption successives sur la phase stationnaire, soit de leur solubilité différente dans chaque phase.
L’éluant, autrement appelé phase mobile, solubilise et entraîne le long du support (ou phase fixe) les colorants. Chaque espèce chimique composant ces colorants sera plus ou moins bien solubilisée par la phase mobile et plus ou moins bien retenus par la phase fixe lors de la migration. Cette différence de migration dépend de la nature même des espèces chimiques (assimilées aux couleurs ici).
Il existe donc une compétition entre les 2 effets des phases :
• entraînement de la part de la phase mobile
capillarité, le long de la phase fixe en entraînant les constituants du mélange. C’est le phénomène d’élution, qui permet la séparation des constituants du mélange à analyser.
Chaque constituant migre d’une certaine hauteur, caractéristique de la substance, que l’on appelle rapport frontal ou rétention frontale (Rf) : hauteur de la tache Rf / hauteur du front du solvant.
Chaque tache correspond à un constituant et on l’identifie par comparaison du Rf avec un témoin (une même substance migre à la même hauteur dans des conditions opératoires identiques ; même Rf).
